WO2020116954A2 - 중공형 케이지를 포함하는 생체적합 구조체 및 이의 제조방법 - Google Patents

중공형 케이지를 포함하는 생체적합 구조체 및 이의 제조방법 Download PDF

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Definitions

  • the open chamber may be provided on the surface of a portion of the side of the cage. Referring to FIG. 3, when the cage is formed of a square column, the open chamber may be provided on the surface of the side surface of the square column. However, the installation position of the open chamber is not limited to the top, bottom, and side surfaces, and the open chamber may be provided at various points of the hollow cage.
  • Another aspect includes the steps of manufacturing a hollow cage comprising one or more chambers on the top and bottom surfaces; And loading a mixture solution of a hydrogel and a bioactive material into the chamber.
  • Figure 13b is a photograph confirming the degree of bone formation in the defect site after transplanting the scaffold of Example 2/3 to the rabbit tibia.
  • the biogel was preheated at 37° C. for 30 minutes according to the manufacturer's recommendations. After mixing the BMP-2 and the preheated biogel solution uniformly at 250 ng/ml each, the biogel and BMP-2 mixed solution was loaded into the cage through the rectangular hole of the scaffold prepared in Example 1 above. The cage loaded with the biogel and BMP-2 mixed solution was gelled by immersing in a casting buffer (Medifab co. ltd, Seoul, Korea) at 4° C. for 20 minutes. The scaffold was then prepared by washing the cage with PBS buffer.
  • a casting buffer Medifab co. ltd, Seoul, Korea
  • Example 2 containing the biogel As a result, as shown in Table 3, in the case of Example 2 containing the biogel, it was confirmed that the newly formed bone volume was significantly increased 2.2 times as compared with Comparative Example 2.

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Abstract

표면에, 내부로 함입되어 있고 생리활성 물질을 담지하는 하나 이상의 개방형 챔버를 포함하는 중공형 케이지를 포함하는 생체적합 구조체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 일 양상에 따른 생체적합 구조체는 챔버내에 하이드로겔 및 생리활성 물질 혼합 용액을 포함함으로써, 골 형성 촉진물질의 초기 방출 안정성을 가지면서 장기간 지속적으로 방출되기 때문에 골 결함 부위에서의 골 형성을 향상시킬 수 있다.

Description

중공형 케이지를 포함하는 생체적합 구조체 및 이의 제조방법
중공형 케이지(hollow cage)를 포함하는 생체적합 구조체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 출원은 2018년 12월 07일 출원된 대한민국 특허출원 제10-2018-0157468호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
뼈의 중요한 손상을 회복하는 것은 정형외과 의사에게 중요한 과제 중 하나이다. 자가이식(autograft) 및 동종이식(allograft)의 적용은 제한된 공급, 기증자의 합병증 및 질병 전파의 위험으로 인해 제한된다. 따라서, 뼈의 생체 적합성을 가진 개선된 대체물을 디자인하기 위해 조직 공학자들은 다양한 물질로 만든 합성 3D 뼈 스캐폴드를 만들고 세포 또는 성장인자를 결합함으로써, 정상 뼈 조직의 성장을 유도하려는 시도를 하고 있다.
형질전환 증식인자-β 슈퍼 패밀리(transforming growth factor-β super family)의 구성원인 BMP-2(Bone morphogenetic protein-2)는 골아세포의 분화 및 성숙을 촉진하여 뼈의 성장과 발달 및 연골 재건 과정에 관여한다. 따라서, 효과적인 뼈 재생을 위해서는 효과적인 생체활성 및 공간-시간 존재에 대한 제어가 필수적이므로, 뼈 재생에 필요한 정상적인 생리학적 메커니즘을 자극하기 위해, 적용 부위에서 충분한 농도를 유지하는 생체 재료 캐리어를 개발하려는 시도가 있었다. BMP-2 및 콜라겐 스폰지의 결합능이 높기 때문에 BMP-2에서 콜라겐 스폰지에 흡착하거나 콜라겐 스폰지를 소킹(soaking)하는 담체 접근법이 가장 일반적으로 사용된다. BMP-2를 운반하기 위해 수산화 인회석(hydroxyapatite) 및 인산삼석회(tricalcium phosphate)를 포함한 바이오 세라믹(bioceramics)이 널리 연구되어 왔다. 그러나, 이들은 변형(modify)할 수 있는 능력이 부족하고, BMP-2의 지속적인 방출은 변형하기가 어렵다는 문제점이 있다.
따라서, 합성 생분해성 고분자는 기계적 성질, 미세구조 및 분해 속도가 조성물 및 제조 기술에 의해 크게 조절될 수 있다는 장점이 있는 바, 뼈 조직공학 응용분야에서 광범위하게 연구될 필요가 있다.
일 양상은 표면에, 내부로 함입되어 있고 생리활성 물질을 담지하는 하나 이상의 개방형 챔버를 포함하는 중공형 케이지를 포함하는 생체적합 구조체를 제공하는 것이다.
다른 양상은 표면에, 내부로 함입되어 있고 하이드로젤 및 생리활성 물질 혼합 용액이 담지된 개방형 챔버를 포함하는 중공형 케이지를 포함하는 생체적합 구조체를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상면 및 하면에 하나 이상의 챔버를 포함하는 중공형 케이지를 제조하는 단계; 및 상기 챔버에 하이드로겔 및 생리활성 물질 혼합 용액을 로딩하는 단계;를 포함하는 생체적합 구조체의 제조방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 표면에, 내부로 함입되어 있고 생리활성 물질을 담지하는 하나 이상의 개방형 챔버를 포함하는 중공형 케이지를 포함하는 생체적합 구조체를 제공한다.
구체적으로, 상기 개방형 챔버는 로딩된 생리활성 물질의 체내 방출을 위한 것으로서, 상기 챔버는 케이지의 상단 및 하단의 일 직선상에 형성될 수 있으며, 동일하거나 서로 다른 크기로 하나 이상 형성된 것일 수 있다. 상기 챔버는 한 변의 길이가 각각 0.001 내지 10 ㎜, 0.001 내지 5 ㎜, 0.001 내지 3.5 ㎜, 1 내지 2.5 ㎜, 또는 1 내지 1.5 ㎜인 사각형일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 개방형 챔버는 상기 케이지에 형성되는 것으로, 상기 개방형 챔버는 외부와 연통되도록 외부로 열려있는 홈 형상으로 이루어질 수 있다. 상기 개방형 챔버는 사각형 홈 형상으로 이루어지는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니며 외부로 열려있는 다양한 홈 형상으로 이루어질 수 있다. 상기 개방형 챔버가 형성되는 상기 중공형 케이지는 원기둥 형상, 사각기둥 형상, 삼각기둥 형상, 오각기둥 형상, 육각기둥 형상 또는 부정형의 형상으로 이루어질 수 있다.
상기 개방형 챔버는 상기 케이지의 상면과 하면의 일부분의 표면에 구비될 수 있으며, 상기 개방형 챔버는 하나 이상이 상기 케이지의 상면과 하면의 일부분의 표면에 구비될 수 있다. 구체적으로, 도 2를 참조하면, 상기 케이지가 원기둥으로 형성된 경우, 상기 개방형 챔버는 원기둥의 상면과 하면의 표면에 구비될 수 있다.
상기 개방형 챔버는 상기 케이지의 측면의 일부분의 표면에 구비될 수도 있다. 도 3을 참조하면, 상기 케이지가 사각기둥으로 형성된 경우 상기 개방형 챔버는 사각기둥의 측면의 표면에 구비될 수 있다. 다만, 상기 개방형 챔버의 구비 위치는 상면, 하면, 측면으로 한정되는 것은 아니며 상기 개방형 챔버는 상기 중공형 케이지의 다양한 지점에서 구비될 수 있다.
일 구체예에 따르면 상기 개방형 챔버는 2 이상의 층(layer)을 형성하면서 상기 케이지에 구비될 수 있다. 도 3을 참조하면, 복수 개의 상기 개방형 챔버가 하나의 선으로 나열되면서 하나의 층을 형성하고, 다시 복수 개의 상기 개방형 챔버가 하나의 선으로 나열되면서 다른 하나의 층을 형성할 수 있다. 복수 개의 상기 개방형 챔버가 형성하는 층은 2 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 상기 개방형 챔버는 복수 개의 층을 형성할 수 있다.
상기 개방형 챔버 내에 생리활성 물질을 담지하는 방법은 주사기를 이용하여 직접 로딩하거나 또는 3D 바이오프린팅을 이용하여 적층 방식으로 로딩하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 챔버가 동일한 크기로 하나 이상 형성된 경우, 생체적합 구조체 전체 면적의 강도를 균등하게 유지할 수 있을 뿐만 아니라, 생체적합 구조체 전체 면적에 대해 생리활성 물질의 방출을 균일하게 조절할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 챔버가 서로 다른 크기로 하나 이상 형성될 경우, 상기 챔버는 2 이상의 층(layer)를 형성할 수 있다. 상기 챔버는 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상 또는 8 이상의 층을 형성할 수 있다. 상기 챔버가 2 이상의 층을 형성하는 경우, 생체적합 구조체 하나에 대하여 부위별로 강도의 조절이 가능할 뿐만 아니라, 챔버의 크기에 따라 생리활성 물질의 방출 속도를 조절할 수 있다.
상기 중공형 케이지는 원기둥 형상, 사각기둥 형상, 삼각기둥 형상, 오각기둥 형상, 육각기둥 형상 또는 부정형의 형상을 가질 수 있다. 상기 중공형 케이지는 전술한 상기 형상에 제한되지 않으며 이식할 부위의 형상을 포함하여 3D 프린트로 구현할 수 있는 모든 형상을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 원기둥 형상 케이지의 지름Х높이는 0.001 내지 15 Х 0.001 내지 15 ㎜, 10 내지 13 Х 1 내지 4 ㎜, 8 내지 13 Х 1.5 내지 3.5 ㎜, 8 내지 10 Х 1.5 내지 2.5 ㎜, 또는 6 내지 8 Х 1.5 내지 2.5 ㎜일 수 있다. 이때, 원기둥 형상을 갖는 케이지의 크기가 상기 범위 미만인 경우, 목표 부위에 생리활성 물질이 효과적으로 전달되지 못하는 문제점이 있고, 상기 범위를 초과하는 경우, 체내 삽입이 힘들다는 문제점이 있다.
다른 양상은 표면에, 내부로 함입되어 있고 하이드로젤 및 생리활성 물질 혼합 용액이 담지된 개방형 챔버를 포함하는 중공형 케이지를 포함하는 생체적합 구조체를 제공한다.
본 명세서 내 "생체적합 구조체"라 함은 실질적으로 인체에 독성이 없고 화학적으로 불활성이며 면역원성이 없는 구조체를 의미하는 것으로, 상기 구조체는 바이오 프린터를 이용하여 정밀 구조 제어된 3차원 형태의 인공장기, 스캐폴드(즉, 바이오지지체), 약물전달체 등으로 제조되어 생체 적용될 수 있다.
상기 중공형 케이지는 고분자 물질로 제조될 수 있다. 구체적으로, 상기 고분자 물질은 생체적합성 또는 생분해성 물질일 수 있다.
본 명세서 내 "생체적합성 물질"은 실질적으로 인체에 독성이 없고 화학적으로 불활성이며 면역원성이 없는 물질을 의미하고, 본 명세서 내 "생분해성 물질"은 생체 내에서 체액 또는 미생물 등에 의해서 분해될 수 있는 물질을 의미한다.
이때, 생체적합성 또는 생분해성 물질로는 히알루론산, 폴리에스테르, 폴리하이드록시알카노에이트(PHAs), 폴리(락트산), 폴리(α-하이드록시액시드), 폴리(β-하이드록시액시드), 폴리(3-하이드로식부티레이트-co-발러레이트; PHBV), 폴리(3-하이드록시프로프리오네이트; PHP), 폴리(3-하이드록시헥사노에이트; PHH), 폴리(4-하이드록시액시드), 폴리(4-하이드록시부티레이트), 폴리(4-하이드록시발러레이트), 폴리(4-하이드록시헥사노에이트), 폴리(에스테르아마이드), 폴리카프로락톤, 폴리락타이드, 폴리글리코라이드, 폴리(락타이드-co-글리코라이드; PLGA), 폴리디옥사논, 폴리오르토에스테르, 폴리에테르에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리(글리콜산-co-트리메틸렌 카보네이트), 폴리포스포에스테르, 폴리포스포에스테르 우레탄, 폴리(아미노산), 폴리사이아노아크릴레이트, 폴리(트리메틸렌 카보네이트), 폴리(이미노카보네이트), 폴리(타이로신 카보네이트), 폴리카보네이트, 폴리(타이로신 아릴레이트), 폴리알킬렌 옥살레이트, 폴리포스파젠스, PHA-PEG, 에틸렌 비닐 알코올 코폴리머(EVOH), 폴리우레탄, 실리콘, 폴리에스테르, 폴리올레핀, 폴리이소부틸렌과 에틸렌-알파올레핀 공중합체, 스틸렌-이소브틸렌-스틸렌 트리블록 공중합체, 아크릴 중합체 및 공중합체, 비닐 할라이드 중합체 및 공중합체, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐 에테르, 폴리비닐 메틸 에테르, 폴리비닐리덴 할라이드, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리비닐리덴 클로라이드, 폴리플루오로알켄, 폴리퍼플루오로알켄, 폴리아크릴로니트릴, 폴리비닐 케톤, 폴리비닐 아로마틱스, 폴리스틸렌, 폴리비닐 에스테르, 폴리비닐 아세테이트, 에틸렌-메틸 메타크릴레이트 공중합체, 아크릴로니트릴-스틸렌 공중합체, ABS 수지와 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체, 폴리아마이드, 알키드 수지, 폴리옥시메틸렌, 폴리이미드, 폴리에테르, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴산-co-말레산, 키토산, 덱스트란, 셀룰로오스, 헤파린, 알기네이트, 이눌린, 녹말 또는 글리코겐을 사용할 수 있고, 히알루론산, 폴리에스테르, 폴리하이드록시알카노에이트(PHAs), 폴리(α-하이드록시액시드), 폴리(β-하이드록시액시드), 폴리(3-하이드로식부티레이트-co-발러레이트; PHBV), 폴리(3-하이드록시프로프리오네이트; PHP), 폴리(3-하이드록시헥사노에이트; PHH), 폴리(4-하이드록시액시드), 폴리(4-하이드록시부티레이트), 폴리(4-하이드록시발러레이트), 폴리(4-하이드록시헥사노에이트), 폴리(에스테르아마이드), 폴리카프로락톤, 폴리락타이드, 폴리글리코라이드, 폴리(락타이드-co-글리코라이드; PLGA), 폴리디옥사논, 폴리오르토에스테르, 폴리에테르에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리(글리콜산-co-트리메틸렌 카보네이트), 폴리포스포에스테르, 폴리포스포에스테르우레탄, 폴리(아미노산), 폴리사이아노아크릴레이트, 폴리(트리메틸렌 카보네이트), 폴리(이미노카보네이트), (타이로신 카보네이트), 폴리카보네이트, 폴리(타이로신 아릴레이트), 폴리알킬렌 옥살레이트, 폴리포스파젠스, PHA-PEG, 키토산, 덱스트란, 셀룰로오스, 헤파린, 알지네이트, 이눌린, 녹말 또는 글리코겐을 사용할 수 있다.
상기 하이드로겔은 알지네이트 및 젤라틴이 혼합된 것일 수 있다. 구체적으로, 생리활성 물질이 챔버 내에 로딩되어 목표 부위에 효율적으로 전달될 필요가 있다. 따라서, 상기 하이드로겔은 생리활성 물질의 초기 폭발적 방출을 억제하고, 장기간에 걸쳐 지속적으로 방출될 수 있도록 하는 역할을 한다.
또한, 상기 생리활성 물질은 골 형성 촉진물질일 수 있다. 구체적으로, 골 형성 촉진 물질은 골 혈성 단백질(Bone morphogenic protein, BMP), 혈소판유래증식인자(Platelet derived growth factor; PDGF), 형질전환성장인자베타(Transforming growth factor beta; TGF-beta), 염기성 섬유모세포생장인자(basic fibroblast growth factor; bFGF), 인슐린유사성장인자-1(Insulin like growth factor 1; IGF-1), 락토페린(lactoferin) 및 비스포스포네이트(Bisphosphonate)일 수 있다. 이때, 상기 비스포스포네이트는 에티드로네이트(Etidronate), 클로드로네이트(Clodronate), 틸루드로네이트(Tiludronate), 파미드로네이트(Pamindr onate), 알렌드로네이트(Alendronate), 리세드로네이트(Risendronate), 이반드론네이트(Ibandronate), 졸렌드로네이트(Zolendronate)일 수 있다.
또한, 상기 하이드로겔 용액은 골 형성 촉진물질의 초기 방출 속도를 조절하기 위한 것으로, 상기 하이드로겔 및 생리활성 물질은 0.5 내지 9.5:9.5 내지 0.5의 중량비(w/w)로 혼합될 수 있으며, 0.5 내지 8:8 내지 0.5, 0.5 내지 5:5 내지 0.5, 0.5 내지 3.5: 3.5 내지 0.5, 또는 1 내지 1.5:1.5 내지 1일 수 있다. 이때, 하이드로겔 및 생리활성 물질의 혼합 비율이 상기 범위 미만인 경우, 초기 방출 속도가 저하되므로, 생리활성 물질이 목표 부위에 효율적으로 전달되지 못한다는 문제점이 있고, 상기 범위를 초과하는 경우, 생리활성 물질이 초기에 폭발적으로 증가하므로, 목표 부위에 지속적인 전달이 어렵다는 문제점이 있다.
일 구체예에서, 상기 개방형 챔버에는 세포 또는 조직이 추가로 담지될 수 있다. 상기 세포는 예를 들어, 결손 부위에 이식하고자 하는 세포, 조직 또는 다른 세포로 분화시키고자 하는 세포, 또는 조직 재생에 사용하고자 하는 세포를 포함할 수 있다. 상기 세포는 예를 들어 줄기세포, 감각세포, 뇌세포, 생식세포, 상피세포, 면역세포, 연골세포, 골세포, 암세포 또는 그들의 조합일 수 있다. 상기 줄기세포는 분화능을 갖는 세포를 의미할 수 있으며, 상기 분화능을 갖는 세포는 예를 들어 아세포, 간세포, 섬유아세포, 근육아세포, 성체줄기세포, 중간엽줄기세포, 지방유래 중간엽줄기세포, 골수유래 중간엽줄기세포, 신경유래 중간엽줄기세포, 태반유래 중간엽줄기세포, 또는 제대혈줄기세포 또는 그의 조합일 수 있다.상기한 바와 같이, 일 구체예의 생체적합 구조체의 챔버 내에 하이드로겔 및 골 형성 촉진물질 혼합 용액이 로딩된 경우, 골 형성 촉진물질의 초기 방출 안정성을 갖는 특징이 있으므로, 목표 부위에 골 형성 촉진물질이 점차적으로 누적될 수 있는바, 뼈가 규칙적으로 형성되고, 골 밀도가 증가하는 이점이 있다.
다른 양상은 상기 생체적합 구조체를 포함하는 생체조직 수복용 조성물; 생체조직 수복을 위한 상기 생체적합 구조체의 용도; 및 개체에 상기 생체적합 구조체를 이식하는 단계를 포함하는 생체조직을 수복하는 방법을 제공한다.
본 명세서 내 "생체조직"은 조직 대체제, 구체적으로 상기 생체적합 구조체가 이식되어 조직 수복 기능을 발휘할 수 있는 조직으로서, 조직공학 분야에서 통상적으로 알려진 조직을 의미할 수 있으며, 예를 들어, 골 조직일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서 내 "개체"는 조직 수복을 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
다른 양상은 상면 및 하면에 하나 이상의 챔버를 포함하는 중공형 케이지를 제조하는 단계; 및 상기 챔버에 하이드로겔 및 생리활성 물질 혼합 용액을 로딩하는 단계;를 포함하는 생체적합 구조체의 제조방법을 제공한다.
일 구체예의 제조방법은 상면 및 하면에 하나 이상의 챔버를 포함하는 중공형 케이지를 제조하는 단계를 포함한다. 상기 중공형 케이지의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 상기 중공형 케이지는 재료를 용융헤드를 통해 분출시켜 적층시키는 FDM(Fused Deposition Modeling) 방법을 통해 수행될 수 있다. 이때, 상기 재료는 생체적합성 또는 생분해성 고분자 물질일 수 있다.
일 구체예의 제조방법은 상기 챔버에 하이드로겔 및 생리활성 물질의 혼합 용액을 로딩하는 단계를 포함한다. 상기 하이드로겔 및 생리활성 물질의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 상기 혼합 용액의 로딩은 당업계 공지된 방법으로 수행될 수 있다.
또한, 상기 하이드로겔 및 생리활성 물질 혼합 용액은 상기 하이드로겔을 예열(warming up)한 후, 생리활성 물질을 추가하여 혼합할 수 있다. 구체적으로, 상기 예열은 4 내지 75℃에서 수행될 수 있으며, 25 내지 60℃, 35 내지 45℃, 또는 35 내지 40℃일 수 있다. 이때, 예열 온도가 상기 범위 미만인 경우, 하이드로겔이 충분히 용융되지 않으므로, 생체적합 물질과의 혼합이 어렵다는 문제점이 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우, 하이드로겔이 용매화되어 생리활성 물질 혼합 용액을 챔버 내에 로딩하기 어렵다는 문제점이 있다.
일 양상에 따른 생체적합 구조체는 표면에, 내부로 합입되어 있고 생리활성 물질을 담지하는 하나 이상의 개방형 챔버를 포함하는 중공형 케이지를 포함하는 것으로서, 상기 챔버 내에 하이드로겔 및 골 형성 촉진 물질을 로딩하였는 바, 골 결함 부위에서의 골 형성을 가능하게 할 수 있다. 또한, 상기 중공형 케이지는 골 형성 촉진물질의 폭발적인 초기 방출을 억제하고 장기간에 걸쳐 지속적으로 방출할 수 있도록 하는바 골 결함 치료에 있어서, 약물을 효과적으로 전달할 수 있으며 결함 부위에 규칙적인 골 형성을 가능하게 한다.
도 1은 일 양상의 케이지 스캐폴드를 나타낸 것이다. (a)는 솔리드 웍스(SolidWorks) CAD 소프트웨어를 사용하여 앞면과 뒷면에 각각 6개의 구멍이 있는 디스크 모양의 케이지를 나타낸 것이고, (b)는 3D 프린팅된 케이지에 약 35μL의 바이오겔을 채운 모습을 나타낸 것이다.
도 2는 일 구체예에 따라 원기둥 형상을 가지는 중공형 케이지의 단면도를 나타낸다.
도 3은 일 구체예에 따라 사각기둥 형상을 가지는 중공형 케이지의 단면도를 나타낸다.
도 4는 In vitro에서 BMP-2 방출 양상을 나타낸 그래프이다.
도 5는 일 구체예의 스캐폴드 및 바이오겔의 생체적합성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6a는 바이오겔을 함유한 케이지에서 방출된 BMP-2의 in vitro ALP 활성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6b는 바이오겔을 함유한 케이지에서 방출된 BMP-2의 ALP 염색 결과를 나타낸다.
도 7a 는 In vitro에서 골 형성 분화 관련 유전자 ALP에 대한 BMP-2 방출 프로파일의 영향을 평가한 그래프이다.
도 7b는 In vitro에서 골 형성 분화 관련 유전자 Runx-2에 대한 BMP-2 방출 프로파일의 영향을 평가한 그래프이다.
도 7c는 In vitro에서 골 형성 분화 관련 유전자 BSP에 대한 BMP-2 방출 프로파일의 영향을 평가한 그래프이다.
도 7d는 In vitro에서 골 형성 분화 관련 유전자 OCN에 대한 BMP-2 방출 프로파일의 영향을 평가한 그래프이다.
도 8은 케이지 시스템 내에서 골 형성의 micro-CT 이미지를 재구성한 사진이다.
도 9는 랫트 임계적 크기의 두개골 결함 모델의 조직학 이미지를 나타낸 사진이다.
도 10은 케이지 시스템 내에서 골 형성의 micro-CT 3D 이미지를 재구성한 사진이다.
도 11은 랫트의 이소성 모델에서의 조직학 이미지를 나타낸 사진이다.
도 12는 토끼 경골(Rabbit Tibia)의 결손부위에 일 구체예에 따른 스캐폴드를 제조하여 이식하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 13a는 토끼 경골에 실시예 1의 스캐폴드를 이식한 후, 결손부위의 골형성 정도를 확인한 사진이다.
도 13b는 토끼 경골에 실시예 2/3의 스캐폴드를 이식한 후, 결손부위의 골형성 정도를 확인한 사진이다.
도 13c는 토끼 경골에 실시예 4의 스캐폴드를 이식한 후, 결손부위의 골형성 정도를 확인한 사진이다.
도 13d는 토끼 경골에 비교예 5의 스캐폴드를 이식한 후, 결손부위의 골형성 정도를 확인한 사진이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[준비예]
FDM 3D 프린트를 위해 사용한 순수한 PLA 필라멘트(filmanet)는 MakerBot (New York City, NY, USA)에서 구입하였다. 알지네이트 및 젤라틴 기반의 바이오겔은 MediFab co. ltd. (Seoul, Korea)에서 공급받았다. 기타 모든 화합물질은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, 별도로 명시하지 않는 한 취득한 대로 사용하였다.
[실시예]
실시예 1. 스캐폴드 디자인 및 제작
직사각형 구멍이 있는 중공형 케이지를 솔리드 모델링 소프트웨어(SolidWorks®, Dassault Systemes SolidWorks Corp.)를 사용하여 디자인하였고, 스테레오리소그래피(stereolithography) (.stl) 파일로 저장하였다. 이후, 3D 프린터 소프트웨어를 이용해 상기 파일을 3D 프린팅 코드로 변환하였으며, 3D 프린터에 상기 파일을 입력하였다. 프린터에는, PLA 필라멘트를 3D 프린터(ReplacatorTM2, Makerbot)에 공급하기 위해 카트리지를 설치하였다. 또한, 용융 PLA 필라멘트는 가열된 금속 노즐(지름, 0.2 mm, 수평 및 수직으로 이동)을 통해 205 ℃에서 압출하였고 수용기에 배치하여 스캐폴드를 제조하였다.
실시예 2. 바이오겔 및 BMP-2 혼합 용액이 로딩된 스캐폴드의 준비
제조사의 권고에 따라 바이오겔을 37 ℃에서 30분 동안 예열하였다. BMP-2 및 예열된 바이오겔 용액을 각각 250 ng/㎖씩 균일하게 혼합한 후, 바이오겔 및 BMP-2 혼합 용액을 상기 실시예 1에서 제조한 스캐폴드의 직사각형 구멍을 통해 케이지에 로딩하였다. 바이오겔 및 BMP-2 혼합 용액이 로딩된 케이지를 캐스팅 버퍼(Medifab co. ltd, Seoul, Korea)에 4 ℃에서 20분 동안 이머징(immersing)함으로써, 겔화 하였다. 이후, PBS 버퍼를 사용하여 케이지를 세척함으로써 스캐폴드를 제조하였다.
실시예 3. 바이오겔 및 BMP-2 혼합 용액이 로딩된 스캐폴드의 준비 2
DPBS로 3회 세척한 손으로 UV 하에서 상기 실시예 1에서 제조한 스캐폴드를 살균하였다. 이후, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 혼합한 바이오겔 및 BMP-2 혼합 용액을 케이지 안으로 로딩하여 스캐폴드를 제조하였다.
실시예 4. 바이오겔, BMP-2 및 중간엽 줄기세포 혼합 용액이 로딩된 스캐폴드의 준비
DPBS로 3회 세척한 손으로 UV 하에서 상기 실시예 1에서 제조한 스캐폴드를 살균하였다. 이후, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 혼합한 바이오겔, BMP-2 및 중간엽 줄기세포 혼합 용액을 케이지 안으로 로딩하여 스캐폴드를 제조하였다.
[비교예]
비교예 1. 바이오겔이 로딩된 스캐폴드
상기 실시예 1에서 제조한 스캐폴드에 바이오겔 250 ng/㎖을 로딩하였다는 점을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 스캐폴드를 제조하였다.
비교예 2. BMP-2가 로딩된 스캐폴드
상기 실시예 1에서 제조한 스캐폴드에 BMP-2 40 μL를 로딩하였다는 점을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 스캐폴드를 제조하였다.
비교예 3. 바이오겔이 로딩된 스캐폴드 2
상기 실시예 1에서 제조한 스캐폴드에 바이오겔 250 ng/㎖을 로딩하였다는 점을 제외하고는, 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 스캐폴드를 제조하였다.
비교예 4. BMP-2가 로딩된 스캐폴드 2
상기 실시예 1에서 제조한 스캐폴드에 BMP-2 40 μL를 로딩하였다는 점을 제외하고는, 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 스캐폴드를 제조하였다.
비교예 5. 중간엽 줄기세포가 로딩된 스캐폴드
상기 실시예 1에서 제조한 스캐폴드에 중간엽 줄기세포(mesenchyma stem cell, MSCs) 1 x 106 cell/㎖을 로딩하였다는 점을 제외하고는, 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 스캐폴드를 제조하였다.
[실험예]
In vitro 분석
(1) BMP-2 방출양 측정
실시예 2 및 비교예 2에 따른 스캐폴드를 Trans-well system(SPL Lifesciences, Korea)의 상단 구획에 넣었다. 하부구획 내의 방출매질(HBSS)은 여러 시점에서 재생(refresh)되었다. 방출은 방출 매질에서 BMP-2(2.5 ㎍/㎖)의 양을 ELISA로 측정하여 결정하였다. 데이터는 전체 입력(total input)의 누적 방출량으로 표시하였다. In vitro BMP-2 방출양 측정 결과는 도 4에 나타냈다.
도 4에 나타난 바와 같이, 비교예 2의 경우, BMP-2가 급속하게 방출되어 BMP-2의 90 %가 대부분 3시간 후에 방출되었고, 2일 후의 BMP-2 농도가 검출 한계 이하에 도달하였음을 확인할 수 있었다. 반면, 실시예 2의 경우, BMP-2가 최초 4일 동안 폭발적으로 방출되었고, 2차적으로 서방 방출하는 독특한 프로파일을 형성함을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 약 85%의 BMP-2가 1기(phase 1)에서 점증적으로 방출되었고, 이후의 방출속도가 점차적으로 감소하였다. 즉, BMP-2 혼합 바이오겔 용액이 로딩된 스캐폴드는 약물의 폭발적인 초기 방출을 억제하고, 약물을 장기간에 걸쳐 지속적으로 방출할 수 있도록 함으로써, 골 결함 치료에 있어서, 약물을 효과적으로 전달할 수 있다.
(2) 생체적합성 측정
Cellrix® 생존율 측정 키트(Medifab co. ltd, Korea)를 사용하여 실시예 1~2 및 비교예 1에 따른 스캐폴드의 생체적합성 및 독성을 측정하였다. 상기 실시예 1~2 및 비교예 1에서 제조한 임플란트를 mMSCs 1x103 세포를 24-웰 플레이트에 분주하고, 0.5 ㎖ MEM 알파 배지(Gibco, Lifetechnologes)에서 배양하였다. 정착 후 다음 날, 상기 실시예 1~2 및 비교예 1에 따른 임플란트 공극(pore) 크기가 8 ㎛인 세포 배양물 인서트에서 세포가 분주된 배지에 첨가하였다. 각 측정점에서, 인서트와 케이지를 제거하고, 상기 키트를 첨가하여 혼합하였다. 배양 30분 후, 450 ㎚의 파장에서 흡광도를 2회 측정하였다. 양성대조군으로 BMP-2를 사용하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 대조군의 세포수는 배양 시간에 따라 지속적으로 증가하였고, 실시예 1~2 및 비교예 2~3의 경우에도 비슷한 세포 증식 양상을 나타냄을 확인할 수 있었다. 즉, 실시예 1~2 및 비교예 2~3에 따라 제조된 스캐폴드는 세포 독성을 나타내지 않고, 생체적합성이 우수함을 확인할 수 있다.
(3) ALP 분석(assay) 및 염색(staining)
실시예 1~2 및 비교예 1~2에 따른 스캐폴드에서 방출된 BMP-2의 생체 활성을 결정하기 위해, mMSCs의 ALP 활성을 분석하였다. 구체적으로, 골 형성 분화의 초기 마커인 알칼리포스파타제(Alkaline phosphatase, ALP) 활성을 무색의 p-니트로페닐포스페이트(p-nitrophenylphosphate)가 유색의 p-니트로페놀(p-nitrophenol)로 전환되는 것을 활용하여 분석하였다. 세포를 DPBS로 2회 세척하고, 0.2% Triton X-100으로 용해시켰다. 세포 용해물은 p-니트로페닐포스페이트(p-nitrophenylphosphate)를 기질로 사용하여 ALP 활성을 분석하였다. 실온에서 30분 동안 세포를 배양한 후, 방출된 p-니트로페놀(p-nitrophenol)의 양으로 생체 활성을 결정하였다. 색 변화는 405 ㎚에서 분광계로 측정하였다. 양성대조군으로 BMP-2를 사용하였다.
ALP 염색을 위해, 세포를 DPBS로 세척하고, 패스트 블루(fast blue) PR 염을 각 웰에 첨가하였다. 이후, 실온에서 10분 동안 배양하고, 광학 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, mMSCs의 ALP 단백질 활성은 실시예 1 및 비교예 1에서 증가하지 않았는바, 골 형성 분화에 있어서 스캐폴드 및 바이오겔 자체는 큰 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있었다. 그러나, 실시예 2 및 비교예 2의 경우, 전체 배양 기간에 걸쳐 ALP 단백질 활성이 현저하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, BMP-2 자체 및 비교예 2의 경우, 초기(7일) 시점에서 ALP 활성을 유의적으로 증가시키는 반면, 실시예 2의 경우, 배양 14일까지 ALP 활성을 지속적으로 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 실시예 2에 따른 스캐폴드에서 방출된 BMP-2는 적어도 2주 동안 생체 활성을 나타낼 수 있다.
(4) 골 형성 분화(osteogenic differentiation) 분석
실시예 1~2 및 비교예 1~2에 따른 스캐폴드에서 방출된 BMP-2가 골 형성 분화에 미치는 영향을 분석하였다. 구체적으로, 유전자 발현은 특정 프라이머 세트를 사용하여 실시간 PCR로 평가하였으며, 사용된 프라이머 세트를 하기 표 1에 나타냈다. 총 RNA는 RNeasy mini kit (Quiagen, USA)를 사용하여 3일, 7일 및 14일 차에 in vitro 배양물로부터 분리하였고, High capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Intron Biotechnology, korea)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 역전사 시켰다. cDNA 합성 후, ALP, Runx-2, OCN 및 BSP에서 실시간 PCR(real-time PCR)(LightCycler® instrument, Roche)을 수행하였다. GAPDH는 내인성 대조군(endogenous control)으로 사용되었다.
유전자 정방향 프라이머 역방향 프라이머
ALP ACC ATT CCC ACG TCT TCA CAT TT AGACATTCTCTCGTTCACCGCC
RUNX-2 ATT TCT CAC CTC CTC AGC CC CAA CAG CCA CAA GTT AGC GA
BSP CGA ATA CAC GGG CGT CAA TG GTA GCT GTA CTC ATC TTC ATA GGC
OCN GGC GCT ACC TGT ATC AAT GG TCAGCCAACTCGTCACAGTC
GAPDH CCT GTT CGA CAG TCA GCC G CGACCAAATCCGTTGACTCC
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 골 형성 마커 유전자의 발현 수준은 실시예 2 및 비교예 2에서 모두 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, BMP-2 자체 및 비교예 2의 경우, 초기(7일) 시점에서 유전자의 발현을 유의적으로 증가시키는 반면, 실시예 2의 경우, 배양 14일까지 유전자의 발현을 지속적으로 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 실시예 2에 따른 스캐폴드에서 방출된 BMP-2는 적어도 2주 동안 골 형성 분화 활성을 나타낼 수 있다.
In vivo 분석
(1) 랫트 두개골 결함(Rat calvarial defect)
랫트 두개골 결함 동물 모델의 사용과 관련된 절차는 국제 동물 보호 및 사용위원회(SSBMC IACUC No. 2016-0044)에 의해 승인되었다. 8 주령의 수컷 Sprague-Dawley (SD) 랫트(200-220 g) 41 마리가 동물 실험에 사용되었다. 모든 동물에 음식 및 물을 충분히 제공하였고, 특정 병원균이 없는 상태에서 자유롭게 보관하였다. 실험은 1주 간의 안정 기간 후에 수행하였다. 수술은 Xylazine(10 ㎎/㎏)과 혼합된 Zoletil(20 ㎎/㎏)을 랫트의 복강 내에 주사하여 마취시킨 후, 반 무균 상태 하에서 수행하였다. 수술 부위를 면도하고 포비돈 요오드 용액(povidone iodine solution)으로 멸균하였다. 이후, 두피를 세로로 절개하고 골막을 해부하였다. 시중에 판매되고 있는 trephine burr을 사용하여 8 ㎜의 두개골 결함을 만들었다. trephine burr의 속도를 최소화하고 열손상을 최소화하기 위해, 결함 부위를 정상 식염수로 관개했다. 또한, 경막(dura mater)의 손상 없이 시상 정맥동(sagittal sinus)의 출혈과 골 치유의 장애를 예방하기 위해 신중히 보존하였다. 결함이 생성된 후, 실시예 1~2 및 비교예 1~2에서 제조된 스캐폴드를 삽입하였다. 이후, 절개된 두피를 봉합하였다. 랫트에 100 ㎎/㎏의 세파졸린(cefazollin)을 주입하고, 암흑:광 주기를 12:12로 조절한 온도 및 습도 조건 하에서 보관하였다. 모든 동물은 이식 후 8주 동안 CO2 챔버에서 깊은 마취를 시킨 후, 희생되었다. 이후, 동물에 삽입하였던 임플란트를 말초 벽면(peripheral parietal), 골정골 간(interparietal) 및 전두(frontal)와 함께 조심스럽게 수확하였다. 모든 샘플은 micro-CT 평가 및 조직학적 평가를 위해 10% 포르말린에 고정시켰다.
1-1) 마이크로 CT(Microcomputed tomography) 촬영 및 분석
Skyscan 1172 micro-CT scanner (Bruker, Belgium)를 사용하여 단층 투명 영상을 획득하였다. 구체적으로, 상기 (1)에서 수확한 샘플을 9.85 ㎛ 픽셀(pixel), 0.5 mm Al 필터(filter), 59 kV의 에너지, 169 ㎂의 전류, 및 0.4º의 회전 단계에서 스캔하였다. 이후, 단면영상을 NRecon package (Bruker, Belgium)로 재구성하고, CT Analyzer software (CT-An, Bruker, Belgium)로 분석하였다. 새롭게 형성된 골의 역가(threshold value)를 원시 골(native bone)을 기준으로 설정하였다. 결함 부위를 기준으로 생성된 직경 8 ㎜의 원형 관심 영역(regions of interest, ROI)에서 골소질 골 두께(Trabecular bone thickness, Tb.Th), 골 부피(Bone volume, BV) 및 골밀도(Percent bone volume, BV/TV)를 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타냈다:
골 단위부피당 표면적: BS.BV(Bone surface/ Bone volume)
골 소질 간격: Tb.Sp(Trabecular Separation)
골 소질 수: Tb.N(Trabecular Number)
골 소질의 연결도: Tb.Pf(trabecular bone pattern factor)
구조형태지수, 판상 및 주상 골 소질의 비: SMI(Structure model index)
이방성 정도: DA(Degree of Anisotropy).
그룹(수) 골밀도(BV.TV) 골 단위부피당 표면적(BS.BV) 골 소질 두께(Tb.Th) 골 소질 간격(Tb.Sp) 골 소질 수(Tb.N) 골 소질의 연결도(Tb.Pf) 구조형태지수, 판상 및 주상골 소질의 비(SMI) 이방성 점도(DA)
평균(SD)
실시예 1(9) 3.224(2.054) 20.145(2.36) 0.195(0.022) 1.74(0.313) 0.166(0.129) 5.023(9.724) 2.026(20.21) 2(0.473)
실시예 2(9) 23.414(4.518) 16.73(1.799) 0.164(0.012) 0.726(0.168)ab 1.434(0.304)ab -17.572(4.28)ac -3.962(1.533)abc 1.718(0.137)b
비교예 1(11) 2.945(1.276) 19.631(4.044) 0.178(0.034) 2.025(0.282) 0.169(0.077) -6.693(8.014) -0.424(1.697) 2.275(0.482)
비교예 2(12) 20.886(7.67)ab 17.049(2.918) 0.194(0.031) 0.701(0.366)ab 1.104(0.437)ab 5.34(15.973) 1.935(3.825) 1.802(0.207)b
a. 실시예 1과 비교, p<0.05
b. 비교예 1과 비교, p<0.05
c. 비교예 2와 비교, p<0.05
그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 실시예 2 및 비교예 2의 경우, 실시예 1 및 비교예 1에 비해 골밀도가 약 10배 높고, Tb.N 및 Tb.Th가 높았으며, Tb.Sp가 낮은 것을 확인할 수 있었다. 또한, 바이오겔을 포함한 실시예 2의 경우, 비교예 2에 비해 골밀도가 높았으며, Tb.Pf 및 SMI가 유의적으로 낮은 것을 확인할 수 있었다. 즉, 상기와 같은 매개변수의 차이는 느린 방출을 위해 BMP-2를 함유할 수 있는 바이오겔을 첨가하는 것은 상당히 높은 연속성과 밀폐된 공동(enclosed cavities)를 갖는 새로운 골 형성을 증가시킬 수 있음을 나타낸다.
또한, 도 8에 나타난 바와 같이, 실시예 1 및 비교예 1에서는 수술 후 8주째 골의 결함에 있어서, 골 형성이 매우 적은 것을 확인할 수 있었다.반면, 실시예 2 및 비교예 2에서는 많은 양의 새로운 골의 성장이 유도되었음을 확인할 수 있다. 또한, 미네랄화(mineralized)된 조직이 잘 분산되어 형성되었으며, 두개골의 비탈회(undecalcified) 단면을 마이크로-CT 결과로 재확인할 수 있었다.
1-2) 조직학적 평가(Histological assessment)
상기 (1)에서 수확한 샘플을 10% 포르말린에 고정시키고, 80% 내지 100% 에틸 알코올에서 순차적으로 탈수시키고 Technovit 7200 resin (EXAKT, Germany)에 침투 및 내장(embed)시켰다. 이후, 상기 레진을 polymerization system (EXAKT, Germany)으로 응고시켰다. 경화된 레진 블록을 절삭 시스템(EXAKT, Germany)을 이용하여 200 ㎛ 두께의 절편으로 절편하고, 분쇄 시스템(EXAKT, Germany)을 사용하여 50 ㎛의 두께로 분쇄하였다. 이후, 분쇄된 조각을 Hematoxylin & Eosin으로 염색하여 관찰하였다. 현미경 및 디지털 카메라를 사용하여 스캐폴드 내에 골 형성 여부를 관찰하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 실시예 2 및 비교예 2에서는 많은 양의 새로운 골의 성장이 유도되었음을 확인할 수 있었다.
(2) 랫트 이소골화 모델(Ectopic ossification model)
랫트 이소골화 동물 모델의 사용과 관련된 절차는 국제 동물 보호 및 사용위원회(SSBMC IACUC No. 2016-0044)에 의해 승인되었다. 12 주령의 SD 랫트(375-400g) 12 마리가 실험에 사용되었다. 동물 모니터링, 안정화 및 사료 공급은 상기 (1)과 동일한 방법에 의해 수행되었다. 상기 (1)과 동일한 방법으로 랫트를 마취시키고, 랫트 등의 털을 제거한 후, 노출된 피부를 포비돈 요오드 용액으로 멸균하였다. 약 7㎝ 길이의 피부를 절개하고, 장늑근(iliocostal muscle)을 손가락 및 거즈를 사용하여 노출시켰다. 수술용 메스(scalpel) 및 지혈제(hemostats)를 사용하여 양측 근육에 길이 10 ㎜ 및 깊이 10 ㎜의 파우치(pouch) 4개를 만들었다. 같은 면에 있는 파우치는 저촉을 방지하기 위하여 약 15 ㎜ 가량 분리하였다. 상기 실시예 1~2 및 비교예 1~2에서 제조한 스캐폴드를 이식한 후, 근육 층을 바이클(Vicryl)로 봉합하고 피부를 나일론(Nylon)으로 봉합하였다. 모든 동물들을 상기 (1)과 동일한 방법으로 수술 6주 후에 희생시켰다. micro-CT 평가 및 조직학적 평가를 위해 양측 장늑근을 수확하고, 10% 포르말린에 고정시켰다.
2-1) 마이크로 CT(Microcomputed tomography) 촬영 및 분석
상기 (2)에서 수확한 샘플을 9.85 ㎛ 픽셀(pixel), 49 kV의 에너지, 200 ㎂의 전류, 및 0.7 ㎛의 회전 단계에서 매개변수를 수정하여 상기 실시예 8-1과 동일한 장치로 스캔하였다. 이후, 상기 1-1)과 동일한 방법으로 마이크로 CT 영상을 처리하였으며, 스캐폴드가 무선주파수(radio)에서 반투명하므로, 새로운 골의 부피만 측정하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타냈다.
파라미터 비교예 2 (n=12) 실시예 2 (n=12)
골 부피 2.663 ± 3.116 5.926 ± 2.539*
그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이, 바이오겔을 포함하는 실시예 2의 경우, 비교예 2에 비하여 새로 형성된 골 부피가 2.2배 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 10에 나타난 바와 같이, 실시예 2의 새롭게 형성된 골 부위가 비교예 2의 부위보다 상당히 크고 결함 중심 및 구심 주위에 구심적 양상(centripetal fashion)으로 배열되어 있음을 확인할 수 있었다. 반면, 비교예 2의 골의 형태는 불규칙적으로 형성되어 있을 뿐만 아니라, 스캐폴드 외부에서 불규칙하게 관찰되었다.
2-2) 조직학적 평가(Histological assessment)
상기 (2)에서 수확한 샘플을 사용하였다는 점을 제외하고는, 상기 상기 1-2)와 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 실시예 2 및 비교예 2의 경우, 새롭게 골 조직이 형성된 것을 확인할 수 있었고, 특히, 실시예 2의 경우, 스캐폴드 내에서의 골 형성이 명확하게 관찰되었다. 이는 BMP-2 생체활성의 유지 및 연조직으로 덮여있고, 유체에 둘러싸인 골 결함과 같은 환경에서도 바이오겔이 도입된 케이지에서 BMP-2가 장기간 지속적으로 방출되었기 때문인 것으로 사료된다. 따라서, 일 양상에 따른 바이오겔 혼합 BMP-2 용액이 로딩된 스캐폴드는 골 결함을 효과적으로 치료할 수 있다.
(3) 토끼 경골(Rabbit Tibia)의 결손부위에서의 골 형성 확인
상기 실시예 1, 2, 4 및 비교예 5에서 제조한 스캐폴드를 토끼 경골의 결손부위에 이식한 후, 골 형성 정도를 확인하였다. 구체적으로, 토끼 경골에 상기 실시예 1, 2, 4 및 비교예 5에서 제조한 스캐폴드를 각각 이식하고 4주 후 샘플을 수확하였다. 수확한 스캐폴드 샘플을 9.85 ㎛ 픽셀(pixel), 0.5 ㎜ Al 필터(filter), 59 kV의 에너지, 169 ㎂의 전류, 및 0.4º의 회전 단계에서 스캔하였다. 이후, 단면영상을 NRecon package (Bruker, Belgium)로 재구성하고, CT Analyzer software (CT-An, Bruker, Belgium)로 분석하였다. 새롭게 형성된 골의 역가(threshold value)를 원시 골(native bone)을 기준으로 설정하였다. 결함 부위를 기준으로 스캐폴드 내부에 생성된 골과 외부에 생성된 골을 관심 영역(regions of interest, ROI)으로 하여 골 부피(Bone volume, BV) 및 골밀도(Percent bone volume, BV/TV)를 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 4에 나타냈다.
그룹(수) 골 부피비(BT/TV)
실시예 1(8) 3.85±1.19
실시예 2(10) 6.61±2.82
실시예 4(10) 7.90±2.73
비교예 5(12) 5.43±1.64
그 결과, 표 4에 나타난 바와 같이 스캐폴드에 BMP-2와 MSCs를 동시에 로딩한 실시예 4의 경우 가장 우수한 골형성 유도를 보였다. 또한 실시예 2의 경우 바이오겔에 봉입되어 주입된 BMP-2가 서서히 방출되면서 결손부위의 외곽에서부터 골이 형성되어 스캐폴드 안쪽으로 형성되는 현상이 관찰되었으며(도 13b), 비교예 5의 경우 바이오겔에 봉입된 MSCs가 분화하여 골조직을 형성하므로 결손부인 스케폴드 안쪽에서 주로 골이 형성되는 양상이 관찰되었다(도 13d). 또한, 실시예 4의 경우 BMP-2와 MSCs의 골형성이 그대화 되면서 스캐폴드의 내외부에서 골이 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 바이오겔, BMP-2 및 MSCs가 혼합된 용액이 로딩된 스캐폴드에서 매우 우수한 골치료 효과를 나타냄을 알 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (16)

  1. 표면에, 내부로 함입되어 있고 생리활성 물질을 담지하는 하나 이상의 개방형 챔버를 포함하는 중공형 케이지를 포함하는 생체적합 구조체.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 케이지의 상면과 하면 일부분의 표면에 상기 하나 이상의 개방형 챔버를 포함하는 것인 생체적합 구조체.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 챔버는 2 이상의 층(layer)으로 형성된 것인 생체적합 구조체.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 개방형 챔버는 한 변의 길이가 0.001 내지 10 ㎜인 사각형인 것인 생체적합 구조체.
  5. 표면에, 내부로 함입되어 있고 하이드로젤 및 생리활성 물질 혼합 용액이 담지된 개방형 챔버를 포함하는 중공형 케이지를 포함하는 생체적합 구조체.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 중공형 케이지는 고분자 물질로 제조된 것인 생체적합 구조체.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 하이드로겔은 알지네이트 및 젤라틴이 혼합된 것인 생체적합 구조체.
  8. 청구항 5에 있어서, 상기 생리활성 물질은 골 형성 촉진물질인 것인 생체적합 구조체.
  9. 청구항 5에 있어서, 상기 골 형성 촉진물질은 골 혈성 단백질(bome morphogenic protein, BMP), 혈소판유래증식인자(Platelet derived growth factor; PDGF), 형질전환성장인자베타(Transforming growth factor beta; TGF-beta), 염기성 섬유모세포생장인자(basic fibroblast growth factor; bFGF), 인슐린유사성장인자-1(Insulin like growth factor 1; IGF-1), 락토페린(lactoferin) 및 비스포스포네이트(Bisphosphonate)로 구성된 군으로부터 선택된 것인 생체적합 구조체.
  10. 청구항 5에 있어서, 상기 하이드로겔 및 생리활성 물질은 0.5:9.5 내지 9.5:0.5의 중량비(w/w)로 혼합된 것인 생체적합 구조체.
  11. 청구항 5에 있어서, 상기 생리활성 물질의 방출 누적율은 20% 내지 99%인 생체적합 구조체.
  12. 청구항 5에 있어서, 상기 개방형 챔버에 세포 또는 조직이 추가로 담지된 것인 생체적합 구조체.
  13. 청구항 5에 있어서, 상기 생리활성 물질의 초기 방출 안정성을 갖는 것인 생체적합 구조체.
  14. 상면 및 하면에 하나 이상의 챔버를 포함하는 중공형 케이지를 제조하는 단계; 및
    상기 챔버에 하이드로겔 및 생리활성 물질 혼합 용액을 로딩하는 단계;를 포함하는 생체적합 구조체의 제조방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 하이드로겔 및 생리활성 물질 혼합 용액은 상기 하이드로겔을 예열(warming up)한 후, 생리활성 물질을 추가하여 혼합한 것인 생체적합 구조체의 제조방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 예열은 4 내지 75℃에서 수행되는 것인 생체적합 구조체의 제조방법.
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