KR20180082970A

KR20180082970A - 폴리도파민으로 코팅된 폴리(락틱-코-글리콜산) 마이크로스피어 및 이를 이용한 세포 표면 개질 방법

Info

Publication number: KR20180082970A
Application number: KR1020180003155A
Authority: KR
Inventors: 정지헌; 응웬티엔티엡; 팜탄텅
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2017-01-11
Filing date: 2018-01-10
Publication date: 2018-07-19
Also published as: KR102080689B1

Abstract

본 발명은 폴리도파민으로 코팅된 폴리(락틱-코-글리콜산) 마이크로스피어를 이용하여 췌장 소도 세포 등 세포 표면을 개질하는 방법에 관한 것으로, 종래 세포 표면 개질 방법 보다 공정이 간단하며, 많은 양의 표적 약물 봉입이 가능하여 세포의 미세 환경 주변으로 약물 방출을 연장시킬 수 있고, 다중 효과를 얻기 위해 면역억제제 또는 항혈액응고제와 같은 여러 유형의 약물 또는 생리활성물질을 함께 전달할 수 있다.
따라서, 상기와 같은 효과를 갖는 본 발명의 세포 표면 개질 방법은 세포의 이식률을 향상시키고, 비특이적 면역반응을 감소시키는 이점을 가지고 있어 새로운 세포 의약품 전달 시스템으로 활용될 수 있다.

Description

폴리도파민으로 코팅된 폴리(락틱-코-글리콜산) 마이크로스피어 및 이를 이용한 세포 표면 개질 방법{Polydopamine coated poly(lactic-co-glycolic acid) microsphere and cell surface modification method using thereof}

본 발명은 폴리도파민으로 코팅된 폴리(락틱-코-글리콜산) 마이크로스피어, 상기 마이크로스피어를 이용한 세포 표면 개질 방법 및 상기 마이크로스피어로 표면 개질된 세포를 이용한 당뇨병 치료에 관한 것이다.

당뇨병(diabetes mellitus, DM)은 췌장 β-세포의 인슐린 분비 이상이나 인슐린 작용기관 또는 장기의 수용체 이상 등으로 인한 고혈당 증상과 이에 따른 합병증을 특징으로 하는 질병이다. 당뇨병 치료를 위해 주로 인슐린 주사 요법과 함께 운동요법, 식이요법이 시행되고 있으나, 완치가 불가능하고 합병증 위험이 여전히 존재하는 등 치료에 한계가 있다.

최근에는 췌장 이식 및 췌장 소도 세포 이식을 통한 당뇨병 치료가 시행되고 있는데, 췌장 이식의 경우 공여자의 절대 부족, 높은 수술 합병증, 지속적인 면역억제제 투여를 비롯한 이식 후 관리의 어려움 등의 문제점이 있다. 이에 비해, 췌장 소도 세포 이식은 분리한 췌장 소도 세포의 체외 배양 및 면역 조절 등의 시험관 내 조작이 가능하다는 장점이 있다. 또한, 이종 이식의 면역 반응이 극복될 경우 돼지 등을 이용한 무한한 췌장 소도 세포의 공급이 가능하고, 비교적 간편한 시술로 합병증 없이 쉽게 이식이 가능하다는 장점이 있다.

그러나, 췌장 소도 세포 이식이 성공적으로 이루어지기 위해서는 효과적인 췌장 소도 세포의 분리법 개발 및 분리 과정에서 발생하는 췌장 소도 세포 손상의 최소화, 이식 과정에서 발생하는 비특이적 염증 과정에 의한 세포 손상과 이로 인한 생착 실패의 최소화, 이식 후 발생하는 면역 반응에 의한 세포 손상의 극복 및 췌장 소도 세포 공급원의 확보 등의 문제점이 선결되어야 한다. 특히, 췌장 소도 세포 이식 후 초기 염증 반응은 기능적인 부적합이나 세포 괴사 및 고사에 의한 췌장 소도 세포의 파괴를 초래하므로, 실제 필요한 췌장 소도 세포 보다 더 많은 양의 췌장 소도 세포를 이식해야만 하는 문제점이 있다.

마크로 캡슐화(macro encapsulation)는 이식된 췌장 소도 세포의 접목을 위해 하이드로겔(hydrogel) 구조를 이용하는 개념이다. 이 방법은 매우 간단함에도 불구하고 많은 양의 하이드로겔이 혈관 재생의 결핍으로 인해 이식된 세포에 저산소증 상태를 유발하여 그 결과, 피하로 이식된 췌장 소도 세포가 혈당 변동을 나타내는 문제점이 있다.

최근, 췌장 소도 세포의 표면 변형의 우수성이 보고되고 있다. 매크로 및 마이크로 캡슐화와 비교하여 볼 때, 표면 개질된 췌장 소도 세포에서 산소 및 영양소의 수송이 극적으로 증가하였으며, 췌장 소도 세포는 크기 변화가 적어 문맥 및 신장 캡슐과 같이 다양한 부위로 이식 가능함이 확인되었다. 그러나, 간문맥으로 췌장 소도 세포를 이식하는 경우, 이식된 췌장 소도 세포가 혈액에 직접 노출되어 혈소판, 보체 등 혈액 응고 시스템의 활성화로 인해 췌장 소도 세포 주위에 혈액 응고가 일어나게 되고 췌장 소도 세포가 급격히 파괴되는 초급성 혈액 매개성 염증반응(instant blood mediated inflammatory reaction, IBMIR)이 발생할 수 있다.

따라서, 성공적인 췌장 소도 세포 이식을 위해서는 효율적인 췌장 소도 세포의 표면 개질 방법을 개발하고 비특이적 면역반응을 억제하는 방법이 필요한 실정이다.

대한민국 등록특허 제 10-1583360호(2016.01.07 공개)

본 발명의 목적은 폴리도파민으로 코팅되며 폴리(락틱-코-글리콜산) (poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA) 고분자로 이루어진 마이크로스피어 및 상기 마이크로스피어 내 약물 또는 생리활성물질을 봉입시킨 것을 특징으로 하는 마이크로스피어를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 마이크로스피어의 제조방법 및 상기 마이크로스피어를 이용한 세포 표면 개질 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 마이크로스피어로 표면이 개질된 세포를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폴리도파민으로 코팅되며 폴리(락틱-코-글리콜산) (poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA) 고분자로 이루어진 마이크로스피어 및 상기 마이크로스피어 내 약물 또는 생리활성물질을 봉입시킨 것을 특징으로 하는 마이크로스피어를 제공한다.

또한, 본 발명은 PLGA 마이크로스피어와 약물 또는 생리활성물질을 교반시켜 상기 마이크로스피어 내 약물 또는 생리활성물질을 봉입시키는 제 1단계, 상기 약물 또는 생리활성물질이 봉입된 PLGA 마이크로스피어의 고분자 현탁액과 도파민 용액을 반응시키는 제 2단계 및 상기 반응시킨 반응물을 원심분리하여 폴리도파민으로 코팅된 PLGA 마이크로스피어를 획득하는 제 3단계를 포함하는 마이크로스피어의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 PLGA 마이크로스피어와 약물 또는 생리활성물질을 교반시켜 상기 마이크로스피어 내 약물 또는 생리활성물질을 봉입시키는 제 1단계, 상기 약물 또는 생리활성물질이 봉입된 PLGA 마이크로스피어의 고분자 현탁액과 도파민 용액을 반응시키는 제 2단계, 상기 반응시킨 반응물을 원심분리하여 폴리도파민으로 코팅된 PLGA 마이크로스피어를 획득하는 제 3단계 및 상기 폴리도파민으로 코팅된 PLGA 마이크로스피어와 세포를 반응시켜 세포의 표면을 개질하는 제 4단계를 포함하는 세포 표면 개질 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 마이크로스피어로 표면이 개질된 세포를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 폴리도파민으로 코팅된 폴리(락틱-코-글리콜산) 마이크로스피어를 이용하여 췌장 소도 세포 등 세포 표면을 개질하는 방법에 관한 것으로, 종래 세포 표면 개질 방법 보다 공정이 간단하며, 많은 양의 표적 약물 봉입이 가능하여 세포의 미세 환경 주변으로 약물 방출을 연장시킬 수 있고, 다중 효과를 얻기 위해 면역억제제 또는 항혈액응고제와 같은 여러 유형의 약물 또는 생리활성물질을 함께 전달할 수 있다.

따라서, 상기와 같은 효과를 갖는 본 발명의 세포 표면 개질 방법은 세포의 이식률을 향상시키고, 비특이적 면역반응을 감소시키는 이점을 가지고 있어 새로운 세포 의약품 전달 시스템으로 활용될 수 있다.

도 1(A)는 폴리도파민으로 코팅된 PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid) 마이크로스피어를 이용한 췌장 소도 세포 표면 개질 방법을 모식도로 나타낸 것이며, 도 1(B)는 폴리도파민으로 코팅된 마이크로스피어에서 폴리도파민의 퀴논 그룹과 췌장 소도 세포 표면에서 세포 외 콜라겐 매트릭스의 아민 그룹과의 결합 메커니즘을 모식도로 나타낸 것이다.
도 2는 면역억제제(FK506)가 봉입되며 폴리도파민으로 코팅된 PLGA 마이크로스피어를 이용한 췌장 소도 세포 개질 효과를 모식도로 나타낸 것이다.
도 3은 FK506이 봉입된 PLGA 마이크로스피어의 특성을 (a) 주사 전자 현미경(SEM) 이미지, (b) X-선 분말 회절 분석(XRD) 스펙트럼 및 (c) 푸리에 변환 적외선 분광학(FT-IR) 스펙트럼으로 확인한 것이다.
도 4는 폴리도파민으로 코팅된 PLGA 마이크로스피어의 특성을 (a-b) 도파민 산화 시간(1시간 및 7시간)에 따른 SEM 이미지, (c) 도파민 산화 시간 1시간째에 폴리도파민으로 코팅된 마이크로스피어에서 추출된 폴리도파민 캡슐의 TEM 이미지, (d) FT-IR 스펙트럼 및 (e) FK506의 시험관 내 방출로 확인한 것이다.
도 5는 비개질 췌장 소도 세포 및 개질된 췌장 소도 세포를 (a) 형광 이미지, (b) 공초점 이미지, (c) pD-Cou/M으로 개질된 췌장 소도 세포의 상대적인 형광 강도 및 (d) SEM 이미지로 확인한 것이다.
도 6은 췌장 소도 세포 표면에서 시간에 따른 마이크로스피어의 안정성을 (a) SEM 이미지 및 (b) 공초점 이미지로 확인한 것이다.
도 7은 마이크로스피어로 개질된 췌장 소도 세포의 생존율 및 기능을 (a) 생존/사멸 분석, (b) CCK-8 분석, (c) 웨스턴 블랏, (d-e) 글루코스 자극 인슐린 분비(GSIS) 분석 및 자극 지수(SI) 값으로 확인한 것이다.
도 8은 이식된 췌장 소도 세포의 생체 내 효과를 (a) 대조군 췌장 소도 세포(n=5), (b) pD-M(506 미봉입)으로 개질된 췌장 소도 세포(n=7), (c) 대측성 신장 캡슐 하에 이식된 비개질 췌장 소도 세포 및 pD-M의 등가량(n=4), (d) pD-M(F1)으로 개질된 췌장 소도 세포(n=12), (e) pD-M(F2)으로 개질된 췌장 소도 세포(n=6), (f) pD-M(F3)으로 개질된 췌장 소도 세포(n=3) 및 (g) pD-M(F4)으로 개질된 췌장 소도 세포(n=3)로 이식된 당뇨병 C57BL/6 마우스의 비 공복 혈당 수치, (h) 각 군의 이식 생존율, (i) 당뇨병 마우스(▲, 빨간선, n=2), 정상 마우스(●, 검은선, n=1) 및 pD-M(F1)으로 개질된 췌장 소도 세포 수혜자(◆, 파란선, n=4)의 이식 후 20일째 복막 내 당 부하 검사(IPGTT)로 확인한 것이다.
도 9는 (a) 대조군 췌장 소도 세포(n=5), (b) pD-M(FK506 미봉입)으로 개질된 췌장 소도 세포(n=7), (c) 대측성 신장 캡슐 하에 이식된 비개질 췌장 소도 세포 및 pD-M의 등가량(n=4), (d) pD-M(F1)으로 개질된 췌장 소도 세포(n=12), (e) pD-M(F2)으로 개질된 췌장 소도 세포(n=6), (f) pD-M(F3)으로 개질된 췌장 소도 세포(n=3) 및 (g) pD-M(F4)으로 개질된 췌장 소도 세포(n=3)로 이식된 마우스의 체중 변화를 백분율로 나타낸 것이다.

본 발명의 발명자들은 폴리도파민으로 코팅된 폴리(락틱-코-글리콜산) (poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA) 마이크로스피어를 이용하여 췌장 소도 세포의 표면 개질 방법 개발하였으며, 폴리도파민의 퀴논(quinone) 그룹이 췌장 소도 세포를 둘러싸고 있는 세포 외 콜라겐 매트릭스의 아민 그룹과 상호작용하는 것을 확인하였고, 상기 폴리도파민으로 코팅된 PLGA 마이크로스피어로 개질된 췌장 소도 세포가 인체 독성을 나타내지 않는 것을 확인하며 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 폴리도파민(polydopamine)으로 코팅되며 폴리(락틱-코-글리콜산) (poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA) 고분자로 이루어진 마이크로스피어 및 상기 마이크로스피어 내 약물 또는 생리활성물질을 봉입시킨 것을 특징으로 하는 마이크로스피어를 제공한다.

바람직하게는, 상기 마이크로스피어의 평균 직경은 1 내지 1000 μm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

바람직하게는, 상기 약물 또는 생리활성물질은 면역억제제, 항혈액응고제, 항염증제, 항산화제 및 호르몬제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

바람직하게는, 상기 약물 또는 생리활성물질은 화학 약품, 단백질, 펩타이드, 항체, 유전자, siRNA 및 microRNA로 이루어진 군에서 선택된 형태로 제공될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

바람직하게는, 상기 면역억제제는 타크로리무스(Tacrolimus), 시클로스포린(Cyclosporin), 시롤리무스(Sirolimus), 에베롤리무스(Everolimus), 리다포롤리무스(Ridaforolimus), 템시롤리무스(Temsirolimus), 유미롤리무스(Umirolimus), 조타롤리무스(Zotarolimus), 레프루노미드(Leflunomide), 메토트렉세이트(Methotrexate), 리툭시맙(Rituximab), 루플리주맙(Ruplizumab), 다클리주맙(Daclizumab), 아바타셉트(Abatacept) 및 벨라타셉트(Belatacept)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

바람직하게는, 상기 항혈액응고제는 아르가트로반(Argatroban), 쿠마린(Cumarin), 헤파린(Heparin), 저분자량헤파린(Low molecular weight heparin), 히루딘(Hirudin), 다비가트란(Dabigatran), 멜라가트란(Melagatran), 클로피도그렐(Clopidogrel), 티클로피딘(Ticlopidine) 및 압시시맙(Abciximab)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

바람직하게는, 상기 항염증제는 아세토아민펜, 아스피린, 이부프로펜, 디크로페낙, 인도메타신, 피록시캄, 페노프로펜, 플루비프로펜, 케토프로펜, 나프록센, 수프로펜, 록소프로펜, 시녹시캄 및 테녹시캄으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

바람직하게는, 상기 제 2단계는 PLGA 마이크로스피어의 고분자 현탁액과 도파민 용액을 1:1.5 내지 3의 부피비로 첨가하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

바람직하게는, 상기 제 2단계는 15 내지 40℃, pH 8 내지 9의 조건에서 30분 내지 2시간 동안 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

또한, 본 발명은 PLGA 마이크로스피어와 약물 또는 생리활성물질을 교반시켜 상기 마이크로스피어 내 약물 또는 생리활성물질을 봉입시키는 제 1단계, 상기 약물 또는 생리활성물질이 봉입된 PLGA 마이크로스피어의 고분자 현탁액과 도파민 용액을 반응시키는 제 2단계, 상기 반응시킨 반응물을 원심분리하여 폴리도파민으로 코팅된 PLGA 마이크로스피어를 획득하는 제 3단계 및 상기 폴리도파민으로 코팅된 PLGA 마이크로스피어와 세포를 반응시켜 세포 표면을 개질하는 제 4단계를 포함하는 세포 표면 개질 방법을 제공한다.

바람직하게는, 상기 제 4단계의 세포는 특정 세포에 제한되지 않으며, 췌장 소도 세포, 줄기세포, 간세포, 섬유아세포, 림프구, 혈관내피세포, 신경세포, 법랑아세포, 각질세포, 지방세포, 차골세포, 섬모세포, 대식세포, 수상세포, 뇌의 뉴런, 난세포, 신방근세포로 등 다양한 세포에서 선택할 수 있다.

바람직하게는, 상기 제 4단계는 15 내지 40℃에서 5 내지 15분씩 2 내지 5회 반복 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

상기 약학 조성물은 이식 부위에 따라 여러 경로로 이식이 가능하며, 간, 신장, 위, 복강, 고환, 안강, 골수 피하 등 생체 내 모든 부위에 이식이 가능하다.

상기 약학 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 시약 준비

폴리(락틱-코-글리콜산)(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA, MW=38-54 kDa, 50:50 LA:GA)은 에보니크(Evonik Industries AG, Darmstadt, Germany)에서 구입하였으며, HBSS(Hank’s balanced salt solution), RPMI 1640 배지, Histopaque-1077, 폴리비닐알코올(poly(vinyl alcohol), PVA, MW=31-50 kDa) 및 도파민 하이드로클로라이드(dopamine hydrochloride)는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich, Korea)에서 구입하였다. 콜라게나제 P(collagenase P)는 로슈(Roche diagnostic GmBH, Mainheim, Germany)에서 구입하였으며, 디클로로메탄(dichloromethane, DCM)은 준세이(Junsei, Korea)에서 구입하였다. 우태아혈청(fetal bovine albumin, FBS) 및 인산완충식염수(phosphate buffer saline, PBS)는 하이클론(Hyclone)에서 구입하였으며, 세포 생존/세포 독성 분석 키트(live/dead cell viability/cytotoxicity assay kit)는 라이프 테크놀로지스(Life Technologies, Oregon, USA), CCK-8(cell counting kit-8)은 도진도(Dojindo Laboratories, Japan)에서 구입하였다. 면역억제제인 FK506은 한미약품(Seoul, Republic of Korea)에서 제공받았다.

실시예 2 : 폴리 ( 락틱 -코- 글리콜산 )( poly (lactic-co- glycolic acid, PLGA ) 마이크로스피어 제조

PLGA 마이크로스피어는 용매-증발법을 이용하여 제조하였다. 간략하게, PLGA 40 mg을 디클로로메탄 0.5 ml에 녹인 후, 1% PVA 5 ml을 첨가하고 균질기(homogenizer, T25 digital ULTRA-TURRAX^®, IKA-Werke GmbH & Co. KG)를 이용하여 17,400 rpm에서 5분 동안 균질화시켰다. 다음으로, 얻어진 에멀젼에 1% PVA 10 ml을 첨가하여 안정화시키고, 4시간 동안 교반하여 용매를 완전히 증발시켰다. 이후, 탈이온수로 5회 세척 및 원심분리하여 마이크로스피어를 획득하고, 획득한 마이크로스피어는 동결 건조하여 -20℃에 보관하였다.

FK506이 봉입된 마이크로스피어(FK506-M)를 제조하기 위해, PLGA 마이크로스피어를 용해한 디클로로메탄 용액에 FK506을 첨가하고, 에멀젼 단계 전, 완벽하게 혼합하여 제형화 하였다. 제제에서 FK506의 이론적인 봉입 함량은 5% 및 10%였다.

생체 내 면역 거부 반응으로부터 이식된 췌장 소도 세포를 보호하는 데에 있어서 약물 방출량 및 약물 방출 시간이 영향을 미치는지 여부를 평가하기 위해, 다양한 유형의 PLGA를 사용하여 다양한 봉입량으로 FK506을 봉입하였다. 하기 표 1의 제제 M(F1)과 M(F2)을 참조하여 보면, DLG 4A(LA:GA 50:50, acid-terminated, Evonik)는 M(F2)에서 FK506에 대한 봉입 능력을 향상시켰다(3.33 ± 0.07% 및 6.71 ± 0.11%). 제제 M(F3) 및 M(F4)는 M(F1)과 유사한 약물 봉입 능력을 가지는 PLGA 고분자를 사용하여 FK506의 방출 시간을 연장시키려는 목적으로 제조되었다(3.36 ± 0.05% 및 3.31 ± 0.07%). 흥미롭게도, 하기 표 1과 같이, 모든 제제에서 FK506 캡슐화 효율이 미미하게 다른 것을 확인할 수 있었다.

또한, 췌장 소도 세포 표면에서 마이크로스피어의 접합 효율을 분석하기 위해, PLGA 마이크로스피어에 형광물질인 쿠마린-6(coumarine-6)를 1.5% 함량으로 봉입하였으며(Cou-M), 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 이용하여 분석하였다.

실시예 3 : 폴리도파민으로 코팅된 PLGA 마이크로스피어 제조

폴리도파민으로 코팅된 PLGA 마이크로스피어(polydopamine coated microspheres, pD-Ms)는 알칼리성 완충액(bicarbonate, pH=8.5, 10 mM)을 이용하여 상온에서 제조하였다. 간략하게, 도파민 하이드로클로라이드를 10 mM 중탄산염 완충액(pH 8.5)에 용해하고, PLGA 마이크로스피어 현탁액을 첨가한 후, 일정 시간 동안 일정 속도로 교반하였다. 반응 혼합물에서 도파민 하이드로클로라이드의 농도는 1 mg/ml이었으며, 마이크로스피어의 농도는 0.5 mg/ml이었다. 상기 과정에서 도파민은 산화되고 중합되어 마이크로스피어 표면에 폴리도파민 코팅층을 형성하게 된다. 이후 탈이온수로 5회 세척 및 원심분리하여 폴리도파민으로 코팅된 마이크로스피어를 획득하고, 상기 획득한 마이크로스피어는 동결 건조하여 -20℃에 보관하였다.

실시예 4 : PLGA 마이크로스피어의 특징 분석

입자 고정 및 백금(platinum) 코팅 단계에 따른 마이크로스피어의 크기 및 표면 지형을 관찰하기 위해, 주사 전자 현미경(scanning electron microscope, SEM; S-4100, Hitachi, Japan)을 사용하였다. 또한, 아세토니트릴을 이용하여 폴리도파민으로 코팅된 마이크로스피어의 코어로부터 PLGA 중합체를 제거한 후, 폴리도파민 캡슐을 분석하기 위해, 투과 전자 현미경 시스템(TEM 120kV, H-7600; Hitachi, Japan)을 사용하였다.

그 결과, 도 3a를 참조하여 보면, PLGA 마이크로스피어를 주사 전자 현미경으로 분석한 결과, 평균 직경이 1 내지 8 μm였으며, 마이크로스피어의 크기는 FK506이 봉입되었을 때, 잘 조절되는 것을 확인하였다. 그러나, M(F2)에서 볼 수 있듯이, 높은 약물 봉입 함량은 입자 표면을 어둡게 하고 표면 조도를 변화시키는 것을 관찰하였다.

다음으로 폴리도파민으로 코팅된 PLGA 마이크로스피어의 특성을 분석하였으며, 특성에 영향을 미치는 변수들 중 도파민 반응 시간이 중요한 바, 도파민의 최종 농도를 1 mg/ml로 유지시키면서 1 내지 7시간 동안 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 4a 및 도 4b를 참조하여 보면, 반응 시간 증가는 접합되지 않은 폴리도파민 나노입자의 양을 증가시켰고, 100 내지 200 μm의 입자 크기를 가지는 것을 확인하였다. 상기 나노입자는 마이크로스피어 및 췌장 소도 세포 사이의 반응을 방해하는 것으로 사료된다. 따라서, 상기 문제는 반응 시간을 1시간으로 적용하여 해결할 수 있다.

마이크로스피어의 표면에 폴리도파민 코팅층이 형성되었는지 여부를 확인하기 위해, 아세토니트릴로 PLGA 코어를 제거한 후, 투과 전자 현미경 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 4c를 참조하여 보면, 매우 얇은 밀봉 막과 그 표면에 결합한 작은 미립자의 두 부분으로 구성되는 유연한 폴리도파민 캡슐을 확인할 수 있었다.

시료로부터 분자의 작용기를 분석하기 위해, 푸리에 변환 적외선 분광학(fourier transform infrared(FT-IR) spectroscopy, Nicolet Nexus 670 FT-IR spectrometer, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)을 수행하였다. 또한, PLGA 마이크로스피어에 봉입된 FK506의 위상 상태(phase state)를 분석하기 위해, X’Pert PRO MPD 회절계(PANalytical, Almelo, the Netherlands)를 이용하여 X-선 분말 회절 분석(X-ray powder diffraction, XRD)을 수행하였다. FK506이 봉입된 PLGA 마이크로스피어 또는 PLGA 마이크로스피어(대조군)를 분석하기 위해, 40 kV의 전압 및 30 mA의 전류에서의 구리 양극(Cu Kα 방사선) 및 주위 온도에서 10 내지 70도 사이의 2θ 검출기 해상도를 사용하였다.

그 결과, 도 3b를 참조하여 보면, FK506이 10°에서 30°까지 날카로운 피크를 갖는 고도로 결정화된 구조를 갖는 반면, 마이크로스피어 내로 일단 봉입되면 스펙트럼 상에서 어떠한 피크의 관찰도 없이 분자적으로 분산된 것을 확인하였다.

또한, 도 3c를 참조하여 보면, FT-IR 스펙트럼 결과에서 PLGA 마이크로스피어와 비교하였을 때, FK506이 봉입된 PLGA 마이크로스피어는 새로운 피크의 형성을 나타내지 않았다. 상기 결과는 FK506과 PLGA 사이의 화학적 상호작용이 없음을 의미한다.

또한, 폴리도파민으로 코팅된 마이크로스피어에서 세포 표면에 접합된 폴리도파민의 존재를 FT-IR로 확인한 결과, 도 4d를 참조하여 보면, 폴리도파민 스펙트럼은 3500 내지 3000 cm^-1 범위에서 넓은 피크를 보였고, 하이드록시기(-OH)의 신축 진동이 관찰된 반면, 폴리도파민으로 코팅된 마이크로스피어의 스펙트럼은 하이드록시기의 신축 진동이 관찰되지 않는 것을 확인하였다. 폴리도파민 및 폴리도파민 코팅된 마이크로스피어의 스펙트럼은 2400 내지 2250 cm^-1 범위에서 피크를 보였다. 상기 결과로부터 폴리도파민이 마이크로스피어에 물리적으로 접합되어 있음을 확인하였다.

FK506에 대한 다양한 PLGA 마이크로스피어 제제의 봉입 용량(loading capacity, LC) 및 캡슐 효율(encapsulation efficiency, EE)을 결정하기 위해, 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC) 시스템을 사용하여 제제에서의 약물 농도를 정량화 하였다. 간략하게, FK506이 봉입된 PLGA 마이크로스피어를 아세토니트릴에 용해하고, 원심분리 후 상등액을 취하였다. 분석 컬럼은 Inertsil 컬럼(4.6 x 150 mm, 5 μm)을 이용하였으며, 아세토니트릴 및 0.1% 인산(phosphoric acid)이 85:15 비율로 구성된 이동상을 이용하였고, 1 ml/분의 유속 및 210 nm의 파장, 60℃의 칼럼 온도 조건으로 실험을 수행하였다. 봉입 용량 및 캡슐 효율은 하기 계산식 1 및 계산식 2를 이용하여 계산하였다.

[계산식 1]

[계산식 2]

또한, 방출 과정 동안 FK506의 침전을 방지하기 위해 계면활성제로서 1% 트윈20(Sigma-Aldrich)을 함유하는 인산완충식염수(PBS)를 이용하여 PLGA 마이크로스피어로부터 FK506의 시험관 내 방출을 분석하였다. 간략하게, 적절한 양의 폴리도파민이 코팅된 FK506 봉입 PLGA 마이크로스피어를 방출 배지 5 ml에 현탁하고, 300,000 Da MWCO 멤브레인(Sartorius Stedim Lab Ltd, Stonehouse, Gloucestershire, UK)이 장착된 초원심분리 튜브에 봉입하였다. 상기 튜브는 멤브레인 양쪽으로부터 액체가 통과하도록 방출 배지 5 ml을 함유하는 다른 50 ml 튜브로 대체하고, 진탕 배양기(SI-64, 150; Hanyang Scientific Equipment Co., Ltd, Republic of Korea)를 이용하여 37℃에서 배양하였다. 일정 시간 후, 초원심분리 튜브 내 방출 용액을 원심분리하여 입자로부터 분리하고, 농축시켜 FK506 농도를 분석하였다. 약물 방출을 위한 싱크 조건(sink condition)을 유지하기 위해 새로운 배지를 튜브에 채워 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 4e를 참조하여 보면, 네 가지 제제(F1 내지 F4)의 초기 시간에서는 FK506 방출이 명백하게 관찰되지 않았지만, 방출 역학은 사용된 PLGA 유형에 의해 영향을 받는 것을 확인하였다. 특히, pD-M(F1)과 pD-M(F2)은 40일 이내에 봉입된 약물 전체를 방출하는 반면, pD-M(F3)과 pD-M(F4)은 40일 후에도 지속적으로 약물을 방출하는 것을 확인하였다.

실시예 5 : 췌장 소도 세포 분리

8주령, 250-300 g의 정상 수컷 Sprague-Dawley(SD) 랫(rat)의 췌장 소도 세포는 P형 콜라게나제(collagenase type P)를 이용하여 분리하였다. 췌장 소도 세포는 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS, Gibco), 2 mM 중탄산 나트륨(sodium bicarbonate), 11 mM 글루코즈(Sigma), 6 mM HEPES 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin, Invitrogen Co., Carlsbad, CA)이 포함된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 동물실험은 영남대학교 기관윤리위원회에 승인을 받고 수행하였다.

실시예 6 : 췌장 소도 세포 표면에 폴리도파민으로 코팅된 마이크로스피어 의 접합

분리 후 3일째, 췌장 소도 세포는 HBSS(pH 8.0)로 2회 세척하고 1,000 rpm으로 1분 동안 원심분리하여 획득하였다. 췌장 소도 세포 표면에 마이크로스피어를 접합시키기 위해, HBSS(pH=8.0, 10 mM)에 2 mg/ml 농도로 첨가된 pD-Ms의 현탁액을 췌장 소도 세포에 첨가하고 37℃에서 2분 동안 섞어주었다. 이후 세포를 수집하고 배양 배지에 재현탁하였다.

췌장 소도 세포의 표면에서 마이크로스피어의 최대 접합을 위해, 두 가지 배양 방법으로 코팅 효율을 평가하였다. 첫 번째 방법은 세포를 마이크로스피어와 연속적으로 1시간 또는 10분 동안 3회 반복하여 배양하는 것이며, 두 번째 방법은 다음 배양 전, HBSS로 세척하여 접합되지 않은 마이크로스피어를 제거하는 것이다.

췌장 소도 세포 표면에서 폴리도파민의 코팅 효과를 분석하기 위해, 비기능화된 마이크로스피어를 대조군으로 사용하였다. 접합의 안정성을 입증하기 위해, 마이크로스피어가 접합된 췌장 소도세포를 24일 동안 배양하면서 스캐닝 전자 현미경 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 관찰하였다.

도 5a를 참조하여 보면, 비기능화된 마이크로스피어는 췌장 소도 세포와 반응하지 않은 반면, 폴리도파민으로 기능화된 마이크로스피어는 췌장 소도 세포 표면에 균일하게 코팅되는 것을 확인하였다.

그러나, 도 5b 및 도 5d를 참조하여 보면, 마이크로스피어 코팅을 위한 도파민 산화 시간의 증가는 폴리도파민 나노입자에 의해 마이크로스피어와 췌장 소도 세포 사이의 상호작용을 억제하여 접합에 부정적인 영향을 미치는 것을 확인하였다. 따라서, 폴리도파민으로 코팅된 균일한 마이크로스피어를 제조하기 위해서는 도파민 산화 시간을 1시간으로 유지시키는 것이 중요하다. 또한, 마이크로스피어와 췌장 소도 세포를 10분씩 3회 반응시켰을 때, 췌장 소도 세포 표면에 마이크로스피어의 밀도가 1시간 동안 반응시켰을 때 보다 더 증가하는 것을 확인하였다.

따라서, 췌장 소도 세포 표면에 마이크로스피어를 접합하는 최적의 조건은 다음과 같다: (1) 마이크로스피어 코팅 단계: 도파민 1 mg/ml, 산화 시간 1시간; (2) 췌장 소도 세포의 접합: 마이크로스피어 농도 2 ㎎/ml, 배양 시간 10분, 3회 반복.

또한, 도 6을 참조하여 보면, 마이크로스피어는 7일째까지 췌장 소도 세포 표면에서 관찰되었다. SEM 이미지에서 관찰된 바와 같이, 마이크로스피어는 14일 후 췌장 소도 세포 표면에서 사라졌으나, 공초점 현미경 레이저 스캐닝 이미지에서 고밀도로 검출되는 것을 확인하였다.

실시예 7 : 개질된 췌장 소도 세포에서 캡슐화된 FK506의 정량

간략하게, 폴리도파민으로 코팅된 마이크로스피어(pD-M (F1))로 개질된 췌장 소도 세포(150 IEQ)를 1 ml의 아세토니트릴에서 배양한 후, 초음파 처리하고, 17,000 rpm에서 원심분리하여 상등액을 취하고, 이를 LC/MS/MS 분석에 사용하였다. 장비는 Agilent 1260 Infinity HPLC 시스템(Agilent Technologies, Santa Clara, CA) 및 API-400 질량 분석기(AB SCIEX, Framingham, MA)를 사용하였다. 크로마토그래피 분리는 Atlatis® dC18 컬럼(2.1 x 150 mm, 3 μm; Water Corporations, Milford, MA) 및 아세토니트릴(A) 및 2 mM 아세트산 암모늄 및 0.1% 포름산(B)을 함유하는 수성 완충액으로 구성된 이동상을 이용하여 수행하였다. 구배는 90% A에서 시작하여 2.5분에서 10.5분까지 5% A로, 10.5분에서 16.0분까지 90%로 변경하였다. 유속은 250 μl/분, 컬럼 온도는 60℃로 설정하였다. 전자분무 이온화(electrospray ionization)는 양이온 모드에서 수행하였다. 질소는 전자 분사원(elecrospray source)에서 시스(sheath) 가스 및 보조 가스로 사용하였다. 탠덤 질량 분광 분석은 다중 반응 모니터링(mutiple reaction monitoring; MRM) 모드에서 수행하였다. DP(declustering potential), CE(collision energy) 및 CXP(collision cell exit potential)의 값은 각각 81, 29 및 22였다.

실시예 8 : 췌장 소도 세포의 생존율 분석

비개질된 췌장 소도 세포 및 캡슐화된 췌장 소도 세포의 생존율은 CCK-8분석을 이용하여 분석하였다. 간략하게, RPMI 배지에 현탁한 췌장 소도 세포 100 μl를 96 웰 플레이트(96 well plate) (20 세포/웰)에 넣고, WST-8[2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-etrazoium, monosodium salt] 10 μl를 처리하였다. 4시간 반응 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하고, 최종 데이터는 각 시료의 dsDNA 함량으로 정규화하여 분석하였다.

췌장 소도 세포 생존율은 생존/사멸 분석 키트(live/dead assay kit)를 이용하여 분석하였다. 간략하게, 췌장 소도 세포를 배양 배지로부터 수집한 후 세척하고, 차광 상태에서 아크리딘 오렌지(acridine orange, AO, Sigma) 0.67 μM 및 프로피디움 이오다이드 75 μM(propidium Iodide PI, Sigma)이 포함된 HBSS와 10분 동안 반응시켰다. 이후 염색된 췌장 소도 세포를 형광 현미경으로 관찰하였다. 아크리딘 오렌지는 세포 투과성을 가지므로 모든 유핵 세포를 염색하여 초록색 형광을 나타낸다. PI는 오직 기능 결핍된 세포막을 가지는 세포에 들어가므로 사멸 세포 및 괴사 세포를 염색하여 빨간색 형광을 나타낸다.

FK506은 췌장을 비롯한 많은 장기 및 세포 유형에 심각한 독성을 일으키는 것으로 알려져 있다. 또한, 화학적 및 물리적 변형을 야기하는 접합 공정은 췌장 소도 세포 기능 장애의 원인이 될 수 있다. 따라서, FK506 전달 시스템이 췌장 소도 세포의 생존율 및 기능에 영향을 미치는지 여부를 확인하였다. 비개질된 췌장 소도 세포(대조군), pD-M으로 개질된 췌장 소도 세포, pD-M(F1)으로 개질된 췌장 소도 세포 및 pD-M(F2)으로 개질된 췌장 소도 세포를 이용하여 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 7a를 참조하여 보면, 생존/사멸 분석에서 확인할 수 있듯이, 모든 군에서 췌장 소도 세포가 살아 있는 것을 확인하였으며, 도 7b를 참조하여 보면, CCK-8 분석에서 대조군(100 ± 11.55%)과 비교하였을 때, pD-M으로 개질된 췌장 소도 세포, pD-M(F1)으로 개질된 췌장 소도 세포 및 pD-M(F2)으로 개질된 췌장 소도 세포의 생존율이 각각 103.22 ± 7.32%, 96.78 ± 8.09% 및 113.15 ± 7.75%인 것을 확인하였다. 또한, 도 7c를 참조하여 보면, 췌장 소도 세포의 Bcl-2 및 Bax 발현 수준은 군 간에 유의한 차이를 보이지 않았다. 따라서, FK506이 봉입되며, 폴리도파민으로 코팅된 마이크로스피어를 이용한 췌장 소도 세포의 개질은 세포 생존율에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.

실시예 9 : 글루코스 자극 인슐린 분비

마이크로스피어로 개질된 췌장 소도 세포의 기능은 저 글루코스 및 고 글루코스 Krebs-Ringer 중탄산염 완충액(KRBB, pH 7.4) 용액(Sigma, St. Louis, MO)을 이용하여 췌장 소도 세포로부터 분비되는 인슐린의 양을 측정하여 평가하였다. 간략하게, 췌장 소도 세포를 2회 세척한 다음 2.8 mM 농도의 저 글루코오스 KRBB 용액 1 ml과 1시간 동안 전처리한 후, 새로운 2.8 mM 농도의 저 글루코오스 KRBB 용액 1 ml과 2시간 동안 배양하고, 28 mM 농도의 고 글루코오스 KRBB 용액 1 ml과 37℃에서 2시간 더 배양하였다. 각 조건에서 상등액을 취하고, Rat/Mouse Insulin ELISA 키트(Millipore, MA)를 사용하여 췌장 소도 세포로부터 분비된 인슐린의 양을 측정하였다. 최종 데이터는 각 시료의 dsDNA 함량으로 정규화하여 분석하였다. 자극 지수(stimulation index, SI) 값은 고 글루코스 조건의 인슐린 분비량을 저 글루코스 조건의 인슐린 분비량으로 나누어 계산하였다.

그 결과, 도 7d 및 도 7e를 참조하여 보면, 저 글루코스(2.8 MM) 및 고 글루코스(28 MM) 조건에서 개질된 췌장 소도 세포의 인슐린 분비량이 약간 감소하는 것을 확인하였다. 그러나 자극 지수는 4개의 군 간 통계적으로 유의한 차이는 없었다. 상기 결과로부터 세포 표면 개질 공정은 췌장 소도 세포의 기능에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.

실시예 10 : 당뇨 마우스의 신장 캡슐을 이용한 랫 췌장 소도 세포의 이종 이식

C57BL/6 마우스에 스트렙토조토신(streptozotocin, STZ) 200 mg/kg을 단일 복강 내 주사하여 제 1형 당뇨병을 유도하였다. 3일 후, 2일 연속 350 mg/dl 이상의 혈당 수치를 가지는 마우스를 당뇨 마우스로 선별하였다. 마우스는 케타민(ketamine) 80 mg/kg 및 자일라진(xylazine) 16 mg/kg을 복강 내 주사하여 마취시키고, 요추 절개로 마우스 왼쪽 신장을 노출시킨 다음 31 게이지(gauge) 바늘을 이용하여 신장 바닥에 작은 상처를 만들었다. 이후, 곡선형 모세관을 캡슐에 삽입하고 모든 방향으로 부드럽게 움직여 이식체를 보관한 캡슐 아래 주머니(pouch)를 만들었다. 컷다운 튜빙(cutdown tubing, JMS Co., Ltd, South Korea)에 포함된 마이크로스피어로 개질된 췌장 소도 세포 또는 비개질된 췌장 소도 세포(400 IEQ)는 해밀턴 주사기(Hamilton company, Nevada, USA)로 주머니에 주입하였다. 이후, 상처를 조심스럽게 낮은 열로 소작한 다음 신장을 복막으로 다시 넣고 절개를 봉합하였다. 실험하는 동안 마우스는 물과 사료를 자율적으로 섭취하도록 하였다.

췌장 소도 세포 이식 후, 비-공복 혈당 농도는 휴대용 혈당계(Contour TS, Bayer Healthcare LLC, IN, USA)를 이용하여 마우스 꼬리 정맥에서 측정하였다. 혈당치가 2일 연속 200 mg/dl 이하로 떨어지면 실험이 성공적인 것으로 간주하였고, 2일 연속 200 mg/dl 이상이면 이식된 췌장 소도 세포가 거부 반응을 일으킨 것으로 간주하였다.

그 결과, 도 8a 및 도 8b를 참조하여 보면, 췌장 소도 세포 수혜자(n=5) 및 pD-M으로 개질된 췌장 소도 세포 수혜자(n=7)는 12일의 동일 이식 중간 생존 시간(median survival time; MST)에서 단시간 동안 정상 혈당을 유지하였으나, 이후 급성 이식 실패를 나타내었다.

반면, 도 8d 및 도 8e를 참조하여 보면, FK506이 봉입되고, 폴리도파민으로 코팅된 마이크로스피어를 췌장 소도 세포에 접합시켰을 때, 이식 생존율이 크게 향상되는 것을 확인하였다. pD-M(F1)로 개질된 췌장 소도 세포 수혜자(n=12) 및 pD-M(F2)로 개질된 췌장 소도 세포 수혜자(n=6)의 MST는 대조군보다 2.8배 및 2.2배 더 높은 값을 나타내었다(MST=34일 및 26.5일).

또한, 도 8h를 참조하여 보면, pD-M(F1)은 이식 생존율을 향상시켰을 뿐만 아니라 pD-M(F2)보다 혈당치를 훨씬 잘 조절하였으며, pD-M(F1)에서 FK506의 함유량은 pD-M(F2)에서 FK506 함유량에 절반에 불과하였다(각각 3.33 ± 0.07% 및 6.71 ± 0.11%). pD-M(F2)에서 방출된 FK506의 수준은 pD-M(F1)에서 방출된 FK506 수준보다 약 3배 더 높았다. 상기 결과는 pD-M(F2)에서 방출된 FK506의 높은 수준이 이식된 췌장 소도 세포의 생존 및 기능을 방해할 수 있음을 의미한다. 또한, pD-M(F1)으로부터 방출된 FK506은 췌장 소도 세포에 악영향을 미치지 않으면서 면역 거부로부터 췌장 소도 세포를 보호하기에 충분함을 확인하였다.

실시예 11 : 복강 내 당 부하 검사

혈당 수준을 낮추는데 있어서, 이식된 췌장 소도 세포의 기능을 평가하기 위해, 이식 후 20일째에 복강 내 당 부하 검사(intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT)를 수행하였다. 간략하게, 마우스는 물을 자유롭게 섭취하게 하였으나, 식염수에 용해한 포도당 용액(2.0 g/kg)을 복강 주사하기 전 12시간 동안 금식시켰다. 혈당 수치는 주사 후, 0, 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90 및 120분에 측정하고 기록하였다. 정상 마우스 및 당뇨병 마우스를 대조군으로 사용하였다.

그 결과, 도 8i를 참조하여 보면, 당뇨병 마우스의 혈당 수치는 고농도의 글루코스 투여 10분 후에 600 mg/dL 이상으로 급속히 증가하였으며, 120분에 400 mg/dL 이상으로 유지되었다. 대조적으로, 정상 마우스와 pD-M(F1)으로 개질된 췌장 소도 세포 수혜자의 혈당 수준의 변화 패턴은 유사하였고, 15분에 증가하여 120분 이내에 정상 수준까지 점진적으로 감소하였다. 상기 결과는 pD-M(F1)으로 개질된 췌장 소도 세포와 비개질된 췌장 소도 세포가 생체 내 기능에 있어서 유의한 차이를 나타내지 않는 것을 의미한다.

또한, 도 9를 참조하여 보면, 이식된 마우스의 체중 변화에 있어서, pD-M(F1)으로 개질된 췌장 소도 세포만이 체중을 증가시켜 정상적인 발달을 나타내었고, 약물 전달 시스템의 효과를 입증하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

폴리도파민(polydopamine)으로 코팅되며 폴리(락틱-코-글리콜산) (poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA) 고분자로 이루어진 마이크로스피어 및 상기 마이크로스피어 내 약물 또는 생리활성물질을 봉입시킨 것을 특징으로 하는 마이크로스피어.
제 1항에 있어서, 상기 마이크로스피어의 평균 직경은 1 내지 1000 μm인 것을 특징으로 하는 마이크로스피어.
제 1항에 있어서, 상기 약물 또는 생리활성물질은 면역억제제, 항혈액응고제, 항염증제, 항산화제 및 호르몬제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 마이크로스피어.
제 3항에 있어서, 상기 약물 또는 생리활성물질은 화학 약품, 단백질, 펩타이드, 항체, 유전자, siRNA 및 microRNA로 이루어진 군에서 선택된 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는 마이크로스피어.
PLGA 마이크로스피어와 약물 또는 생리활성물질을 교반시켜 상기 마이크로스피어 내 약물 또는 생리활성물질을 봉입시키는 제 1단계;
상기 약물 또는 생리활성물질이 봉입된 PLGA 마이크로스피어의 고분자 현탁액과 도파민 용액을 반응시키는 제 2단계; 및
상기 반응시킨 반응물을 원심분리하여 폴리도파민으로 코팅된 PLGA 마이크로스피어를 획득하는 제 3단계;
를 포함하는 마이크로스피어의 제조방법.
제 5항에 있어서, 상기 제 2단계는 PLGA 마이크로스피어의 고분자 현탁액과 도파민 용액을 1:1.5 내지 3의 부피비로 첨가하는 것을 특징으로 하는 마이크로스피어의 제조방법.
제 5항에 있어서, 상기 제 2단계는 15 내지 40℃, pH 8 내지 9의 조건에서 30분 내지 2시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 마이크로스피어의 제조방법.
PLGA 마이크로스피어와 약물 또는 생리활성물질을 교반시켜 상기 마이크로스피어 내 약물 또는 생리활성물질을 봉입시키는 제 1단계;
상기 약물 또는 생리활성물질이 봉입된 PLGA 마이크로스피어의 고분자 현탁액과 도파민 용액을 반응시키는 제 2단계;
상기 반응시킨 반응물을 원심분리하여 폴리도파민으로 코팅된 PLGA 마이크로스피어를 획득하는 제 3단계; 및
상기 폴리도파민으로 코팅된 PLGA 마이크로스피어와 세포를 반응시켜 세포 표면을 개질하는 제 4단계;
를 포함하는 세포 표면 개질 방법.
제 8항에 있어서, 제 4단계의 세포는 췌장 소도 세포, 줄기세포, 간세포, 섬유아세포, 림프구, 혈관내피세포, 신경세포, 법랑아세포, 각질세포, 지방세포, 차골세포, 섬모세포, 대식세포, 수상세포, 뇌의 뉴런, 난세포 및 신방근세포로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 세포 표면 개질 방법.
제 8항에 있어서, 상기 제 4단계는 15 내지 40℃에서 5 내지 15분씩 2 내지 5회 반복 수행하는 것을 특징으로 하는 세포 표면 개질 방법.
제 1항에 따른 마이크로스피어로 표면이 개질된 세포를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 약학 조성물.