CN110433331A - 一种生物活性支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物活性支架及其制备方法,本发明先通过接枝或吸附的方式在中空介孔羟基磷灰石微球上负载骨形态发生蛋白,得载药微球;然后将载药微球混入支架基质溶液中,再利用3D打印技术打印制备复合支架;最后通过表面吸附趋化生长因子,得到本发明中的生物活性支架;或者是先将载药微球和趋化生长因子共混于支架基质溶液中,再利用3D打印技术打印制备生物活性支架。采用本发明中的方法得到的支架可以实现多种生长因子的时序释放,早期释放趋化生长因子,招募骨修复细胞到缺损区,后期主要释放骨形态发生蛋白,诱导募集到缺损区的骨髓基质干细胞成骨分化,充分调动自体组织的再生修复潜能,促进骨缺损再生修复。
Description
技术领域
本发明属于生物支架制备技术领域,具体涉及一种生物活性支架及其制备方法。
背景技术
支架材料是骨组织工程中最基本的物质和结构基础,它能在植入体内后为种子细胞的黏附、增殖、分化、物质交换等过程起到重要作用,极大的影响着细胞行为和组织重建。近年来,3D打印技术已成为生物医学领域和应用的热点。3D打印技术通过逐层打印制造支架,能够精确的模拟天然组织复杂的三维微观结构、支架形状,准确控制微孔的分布、空间走向,制备出结构可控且孔隙高度贯通的支架,具备发泡等传统技术所不具备的优势。
在骨缺损修复中,骨再生和骨愈合是在骨髓间充质干细胞(BMSCs)到达受伤区域后开始的,而骨形态发生蛋白的主要作用是促进细胞成骨分化,但是大块骨缺损区因细胞数量不足,单独使用骨形态发生蛋白治疗效果欠佳,常需和其他活性因子联合使用。趋化生长因子能够在骨修复早期利用SDF-1/CXCR4信号通路调控循环系统、局部或远端BMSCs向目标位点募集,参与损失组织修复。但是二者的同时释放并不能有效协同促进细胞迁移和分化。
PLGA是聚乳酸(PLA)与聚羟基乙酸(PGA)单体共聚物,可以通过调整两种单体的比例来控制聚合物组成,从而调控其机械强度和降解速度。因其生物相容性好、无毒、可加工性强等优点,在美国已通过FDA认证,被正式作为药用辅料收录进美国药典。将PLGA溶解于二氯甲烷即可用于3D打印技术,但是单一的PLGA支架并不能实现组织工程支架的多功能化要求。
介孔羟基磷灰石在组成上与自然骨的成分类似,生物相容性和骨传导性好,同时介孔材料具有比传统微球更大的比表面积,传统的羟基磷灰石微球作为生长因子载体的药物包封率通常在15%~50%,而介孔羟基磷灰石包封率可以达到60%左右,在药物和生长因子缓释和控释领域已显示出优越性,但是仅仅通过物理吸附在孔道中生长因子的释放周期短、容易失去生物活性,因此通过载体表面氨基化处理把生物活性因子共价连接,可以进一步调控生长因子的负载和释放行为。已经有研究报道,介孔二氧化硅表面氨基化处理后负载内皮生长因子(EFG)用于靶向肿瘤细胞的治疗;介孔羟基磷灰石表面氨基化、羧基化处理后接枝短肽用于提高材料表面的细胞黏附性能。利用中空介孔羟基磷灰石表面氨基化处理以后进行表面氨基化处理后负载生长因子还未见报道。
发明内容
针对上述现有技术,本发明提供一种生物活性支架以及生物活性支架的制备方法;本发明通过3D打印制备具有孔结构精确可控、孔隙高度贯通、多种生长因子时序性可控释放的高性能复合骨组织工程支架。其通过中空介孔羟基磷灰石微球(MHA)吸附生物活性骨形态发生蛋白,采用打印时在PLGA基质中同步添加或支架成型后表面吸附方式负载趋化生长因子实现双因子时序性释放,协同促进骨组织再生重建。
为了达到上述目的,本发明所采用的技术方案是,提供的一种生物活性支架,本发明中的生物活性支架负载有骨形态发生蛋白和趋化生长因子,并且趋化生长因子和骨形态发生蛋白时序性释放(初期释放趋化生长因子,中后期释放骨形态发生蛋白);生物活性支架内部具有高度贯通的孔隙,并且孔隙率达到50~80%,孔隙的平均孔径为100~900μm。本发明中的生物活性支架通过以下步骤制得:
S1:制备中空介孔羟基磷灰石微球(MHA);
S2:在中空介孔羟基磷灰石微球(MHA)上负载骨形态发生蛋白,得载药微球;
S3:将载药微球混入浓度为0.1~0.3g/mL的支架基质溶液中,然后利用3D打印机打印出具有100~900μm孔径的复合支架;复合支架中载药微球所占比重为30%~50%;
S4:在35~40℃条件下将浓度为8~12μg/mL的趋化生长因子溶液滴加涂覆于复合支架上,静置2~4h,得生物活性支架。
或者是包括以下步骤:
S1:制备中空介孔羟基磷灰石微球;
S2:在中空介孔羟基磷灰石微球上负载骨形态发生蛋白,得载药微球;
S3:将载药微球混入浓度为0.1~0.3g/mL的支架基质溶液中,再加入浓度为8~12μg/mL的趋化生长因子溶液,趋化生长因子溶液与支架基质溶液的体积比为1:10~20,混合均匀后用3D打印机打印出具有100~900μm孔径的复合支架,干燥后得生物活性支架;所述复合支架中载药微球所占比重为10%~70%。
在上述技术方案的基础上,本发明还可以做如下改进。
进一步,S1中中空介孔羟基磷灰石微球的制备方法为:在搅拌条件下,将1体积份浓度为18~20mg/mL的磷酸肌酸溶液缓慢滴加到3体积份浓度为4~6mg/mL的氯化钙溶液中,滴加完成后用1mol/L的NaOH溶液将混合溶液的pH值调节为10左右,并继续搅拌反应30min;然后将反应后的混合物转移至微波反应釜中,控制反应温度为110~160℃,微波功率为5W,在此条件下继续反应10~30min;然后离心、洗涤、冷冻干燥得中空介孔羟基磷灰石微球(MHA)。
进一步,S2中载药微球的具体制备方法为:在无菌条件下将中空介孔羟基磷灰石微球(MHA)按1:10mg/mL的料液比浸入浓度为0.1~0.3μg/mL的骨形态发生蛋白溶液中,室温振荡吸附24h,然后离心、洗涤、冷冻干燥,即得。
进一步,S2中载药微球的还可以通过以下步骤制得:
(1)将中空介孔羟基磷灰石微球浸入无水乙醇中并超声分散30min,然后将分散液与浓度为15~25mmol/L的氨基硅烷偶联剂乙醇溶液按1:1~3的体积比混合,调节混合溶液的pH值为8~9,超声反应6h;过滤、洗涤、干燥,并在130℃下焙烧2h,得氨基化改性的中空介孔羟基磷灰石微球;
(2)将NHS、EDC和MES混合并溶解于乙醇中,得混合溶液,所述混合溶液中NHS、EDC和MES的浓度分别0.05mmol/mL、0.1mmol/mL和0.05mmol/mL;
(3)将氨基化改性的中空介孔羟基磷灰石微球分散于浓度为0.1~0.3μg/mL的骨形态发生蛋白溶液中,然后向溶液中滴加混合溶液,所滴加的混合溶液与骨形态发生蛋白溶液的体积比为1:4~6,再于37℃下摇床孵化4h,离心、PBS溶液冲洗、真空干燥得载药微球。
进一步,氨基硅烷偶联剂为γ-氨丙基三乙氧基硅烷。
进一步,骨形态发生蛋白为BMP-2、BMP-4或BMP-7。
进一步,支架基质为PLGA、聚己内酯、聚乳酸、聚氨酯、壳聚糖、胶原、明胶和纤维素中的至少一种。当支架基质为PLGA时,其分子量为
进一步,趋化生长因子为TGF-β或SDF-1。
进一步,S3中3D打印时气压为0.1~0.6MPa,出丝速度为1~30mm/s。
本发明的有益效果是:
1.本发明采用中空介孔羟基磷灰石作为生长因子载体,具有更高的孔体积和比表面积,极大提升了药物包封率。
2.本发明通过3D打印技术制备了一种生物活性支架,平均孔径300~600μm,孔隙率为50%~70%,内部孔隙高度贯通,支架形状可以精确调控,具有良好的生物相容性、生物降解性以及促成骨的能力。
3.本发明将MHA进行表面氨基化处理再负载生长因子后再加入高分子基质中,延长了骨形态发生蛋白的缓释周期,提高了药物活性、利用率和安全性。
4.本发明制备的生物活性支架能够实现时序释放,早期释放趋化生长因子,招募骨修复细胞到缺损区,后期主要释放骨形态发生蛋白,诱导募集到缺损区的骨髓基质干细胞成骨分化,充分调动自体组织的再生修复潜能,促进骨缺损再生修复。
附图说明
图1为MHA的形貌表征;其中,(a)为MHA的SEM图谱;(b)为MHA的TEM图谱;(c)为MHA吸附BMP-2后的SEM图谱;
图2为MHA的氮气吸脱附曲线(a)和MHA的孔径分布(b);
图3为MHA/PLGA 3D支架的形貌表征;其中,(a)为Micro-CT三维重建图像;(b)和(c)为扫描电镜图片;
图4为MHA/PLGA 3D支架的降解1月后的表面形貌扫描电镜图片;
图5为MHA/PLGA 3D支架的降解3月后的表面形貌扫描电镜图片;
图6为MHA/PLGA 3D支架的降解6月后的表面形貌扫描电镜图片;
图7为实施例二的支架的生长因子释放曲线;
图8为不同支架对BMSCs的迁移作用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例一
一种生物活性支架的制备方法,包括以下步骤:
S1:中空介孔羟基磷灰石微球(MHA)的制备
将1.963g磷酸肌酸加入100mL的蒸馏水中配制成A溶液,将1.225g二水氯化钙加入250mL蒸馏水中配制成B溶液;取10mL A溶液缓慢滴加入30mL B溶液中,用1mol/L的NaOH调节pH至10左右,滴加完全后磁力搅拌反应30min;再移至微波反应釜中,控制反应温度为120℃,微波功率为5W,继续反应30min;然后多次离心、洗涤,冷冻干燥后得到MHA。
S2:MHA表面功能化修饰并负载骨形态发生蛋白
SS1:将MHA浸入无水乙醇中并超声分散30min,然后将分散液与浓度为20mmol/L的γ-氨丙基三乙氧基硅烷(APS)乙醇溶液按1:1的体积比混合,调节混合溶液的pH值为8.5,超声反应6h;过滤、洗涤、干燥,并在130℃下焙烧2h,得氨基化改性的中空介孔羟基磷灰石微球;
SS2:将0.25mmol的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和0.25mmol的MES共同溶于乙醇中,得溶液C;之后将0.5mmol的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶于乙醇中,得溶液D;合并溶液C和溶液D,并补充乙醇至总体积为5mL,得混合溶液;混合溶液中NHS、EDC和MES的浓度分别0.05mmol/mL、0.1mmol/mL和0.05mmol/mL;
SS3:将氨基化改性的中空介孔羟基磷灰石微球分散于浓度为0.2μg/mL的BMP-2溶液中,然后向溶液中滴加混合溶液,所滴加的混合溶液与骨形态发生蛋白溶液的体积比为1:5,再于37℃下摇床孵化4h,离心、PBS溶液冲洗、真空干燥得载药微球BMHA。
S3:3D打印支架并负载趋化生长因子
将支架基质PLGA按1:5g/mL的料液比溶解于二氯甲烷中,配成浓度为0.2g/mL的支架基质溶液,所用PLGA的分子量为200000左右,并且PLA:PGA=85:25;再将BMHA混入支架基质溶液中,混合均匀后用生物3D打印机打印复合支架,所混入的BMHA占打印出的复合支架的比重为40%;打印过程中控制打印机气压为0.5MPa,出丝速度为20mm/s左右,所打印出的复合支架具有60%左右的孔隙率,孔径为300~600μm。将干燥后的复合支架放置在37℃恒温振荡摇床上,将0.05mL浓度为10μg/mL的SDF-1溶液均匀滴加涂覆在支架上,放置2小时,完成生物活性支架的制备。
实施例二
一种生物活性支架的制备方法,包括以下步骤:
S1:中空介孔羟基磷灰石微球(MHA)的制备
将1.812g磷酸肌酸加入100mL的蒸馏水中配制成A溶液,将1.025g二水氯化钙加入250mL蒸馏水中配制成B溶液;取10mL A溶液缓慢滴加入30mL B溶液中,用1mol/L的NaOH调节pH至10左右,滴加完全后磁力搅拌反应30min;再移至微波反应釜中,控制反应温度为150℃,微波功率为5W,继续反应10min;然后多次离心、洗涤,冷冻干燥后得到MHA。
S2:MHA负载骨形态发生蛋白
取上述合成的MHA 5mg,在无菌条件下浸入50mL浓度为0.2μg/mL的BMP-2溶液中室温振荡平衡吸附24小时;然后离心、洗涤,冷冻干燥得负载有BMP-2的载药微球BMHA。
S3:3D打印支架并负载趋化生长因子
将支架基质PLGA按1:5g/mL的料液比溶解于二氯甲烷中,配成浓度为0.2g/mL的支架基质溶液,所用PLGA的分子量为300000左右,并且PLA:PGA=85:25;再将BMHA混入支架基质溶液中,混合均匀后用生物3D打印机打印复合支架,所混入的BMHA占打印出的复合支架的比重为50%;打印过程中控制打印机气压为0.2MPa,出丝速度为5mm/s左右,所打印出的复合支架具有70%左右的孔隙率,孔径为300~600μm。将干燥后的复合支架放置在37℃恒温振荡摇床上,将0.05mL浓度为10μg/mL的SDF-1溶液均匀滴加涂覆在支架上,放置2小时,完成生物活性支架的制备。
实施例三
一种生物活性支架的制备方法,包括以下步骤:
S1:中空介孔羟基磷灰石微球(MHA)的制备
将1.963g磷酸肌酸加入100mL的蒸馏水中配制成A溶液,将1.225g二水氯化钙加入250mL蒸馏水中配制成B溶液;取10mL A溶液缓慢滴加入30mL B溶液中,用1mol/L的NaOH调节pH至10左右,滴加完全后磁力搅拌反应30min;再移至微波反应釜中,控制反应温度为110℃,微波功率为5W,继续反应10min;然后多次离心、洗涤,冷冻干燥后得到MHA。
S2:MHA负载骨形态发生蛋白
取上述合成的MHA 5mg,在无菌条件下浸入50mL浓度为0.3μg/mL的BMP-4溶液中室温振荡平衡吸附24小时;然后离心、洗涤,冷冻干燥得负载有BMP-4的载药微球BMHA。
S3:3D打印支架并负载趋化生长因子
将支架基质聚己内酯按1:5g/mL的料液比溶解于二氯甲烷中,配成浓度为0.2g/mL的支架基质溶液,所用聚己内酯的分子量为300000左右;再将S2步骤所得的BMHA与支架基质溶液在25℃下均匀混合,然后将0.05mL浓度为10μg/mL的TGF-β溶液直接滴加到混合溶液中,搅拌形成O/W乳液,再用生物3D打印机打印具有平均孔径为100~900μm、高度贯通的复合支架,放入室温真空干燥箱中干燥,即形成时序释放双因子的生物活性支架。
实施例四
一种生物活性支架的制备方法,包括以下步骤:
S1:中空介孔羟基磷灰石微球(MHA)的制备
将1.963g磷酸肌酸加入100mL的蒸馏水中配制成A溶液,将1.225g二水氯化钙加入250mL蒸馏水中配制成B溶液;取10mL A溶液缓慢滴加入30mL B溶液中,用1mol/L的NaOH调节pH至10左右,滴加完全后磁力搅拌反应30min;再移至微波反应釜中,控制反应温度为120℃,微波功率为5W,继续反应10min;然后多次离心、洗涤,冷冻干燥后得到MHA。
S2:MHA表面功能化修饰并负载骨形态发生蛋白
SS1:将MHA浸入无水乙醇中并超声分散30min,然后将分散液与浓度为25mmol/L的γ-氨丙基三乙氧基硅烷(APS)乙醇溶液按1:3的体积比混合,调节混合溶液的pH值为8.5,超声反应6h;过滤、洗涤、干燥,并在130℃下焙烧2h,得氨基化改性的中空介孔羟基磷灰石微球;
SS2:将0.25mmol的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和0.25mmol的MES共同溶于乙醇中,得溶液C;之后将0.5mmol的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶于乙醇中,得溶液D;合并溶液C和溶液D,并补充乙醇至总体积为5mL,得混合溶液;混合溶液中NHS、EDC和MES的浓度分别0.05mmol/mL、0.1mmol/mL和0.05mmol/mL;
SS3:将氨基化改性的中空介孔羟基磷灰石微球分散于浓度为0.3μg/mL的BMP-7溶液中,然后向溶液中滴加混合溶液,所滴加的混合溶液与骨形态发生蛋白溶液的体积比为1:4,再于37℃下摇床孵化4h,离心、PBS溶液冲洗、真空干燥得载药微球BMHA。
S3:3D打印支架并负载趋化生长因子
将支架基质壳聚糖酯按1:3.3g/mL的料液比溶解于二氯甲烷中,配成浓度为0.3g/mL的支架基质溶液;再将S2步骤所得的BMHA与支架基质溶液在25℃下均匀混合,然后将0.05mL浓度为12μg/mL的TGF-β溶液直接滴加到混合溶液中,搅拌形成O/W乳液,再用生物3D打印机打印具有平均孔径为100~900μm、高度贯通的复合支架,放入室温真空干燥箱中干燥,即形成时序释放双因子的生物活性支架。
结果分析
对本发明实施例一制得的BMHA和实施例二制得的MHA、BMHA分别进行扫描电镜观察,同时对实施例二制得的MHA进行透射电镜观察,结果如图1所示;其中,图1(a)为实施例二制得的MHA的扫描电镜图像,图1(b)为实施例二制得的MHA的透射电镜图像,图1(c)为实施例一制得的BMHA的扫描电镜图像。从上述图像中可以看出制得的MHA粒径约为1~2μm,具有中空结构,吸附蛋白质后表面的孔道明显减少。
对本发明实施例二制得的MHA进行了BET分析,结果如图2所示。从图2(a,b)中可以看出微球比表面积为174.71m2g-1,BJH脱附孔容为0.59cm3g-1,平均孔径为12.6nm,说明本发明制得的MHA具有大比表面积和孔容,有利于生长因子的负载和控释。
对本发明实施例二制得的复合支架分别进行进行Micro-CT三维重建和扫描电镜分析,结果如图3所示。从图3(a,b)可以看出,实施例2所制备的复合支架具有高度贯通的孔隙,支架孔结构排列均匀整齐;从图3(c)可以看出,支架具有粗糙的表面结构,表面存在半包覆的MHA,有利于骨髓间从充质干细胞的粘附生长。
对本发明实施例二制得的复合支架进行抗压强度、弹性模量和孔隙率测定。为了对比MHA在支架中的作用,按照实施例二的支架制备过程制备了不含生长因子及MHA的纯PLGA支架作为对照组。采用液体替代法测定3D多孔复合支架的孔隙率,每组五个平行样。使用天平称量支架干重,记为W,使用游标卡尺测量支架的尺寸,计算支架体积V。然后将支架材料浸入无水乙醇中,反复抽真空使无水乙醇完全浸入支架后取出称重记为W1,无水乙醇密度记为ρ,用式(1)计算孔隙率。
采用日本shimadzu公司的AG-IC50KN型万能材料测试机,参考ASTM标准F451-95测定多孔支架(6×6×10mm3)的抗压强度和弹性模量,压缩加载速度为0.5mm/min,持续施压到样品变形至原长度的40%时,停止测试。实验结果如表1所示。
表1 不同支架的孔隙率、抗压强度和弹性模量
由表1可知两种支架的孔隙率均为60%左右,说明3D打印工艺稳定,能精确的控制多孔支架的孔结构;同时也表明MHA微球的添加量对多孔支架的孔隙率无显著影响。从力学测试结果可以看出纯PLGA支架的弹性模量可达62MPa,压缩强度为6.4MPa,具有较好的力学性能,同时MHA微球的掺入可以显著提高复合支架的弹性模量和压缩强度。正常情况下,人体皮质骨的压缩强度范围为100~230MPa,松质骨的压缩强度范围为2~13MPa,因此,本实验中所制备的3D支架的压缩强度与人体松质骨的力学强度相匹配。
将本发明实施例二制得的复合支架放置在37℃的恒温摇床PBS溶液中进行1月、3月、6月的降解实验,结果如图4、图5和图6所示。从图4~6可以看出随着降解时间增加,支架表面半包覆的羟基磷灰石脱落,水溶液浸润到有机无机界面中,促进了支架中生长因子的释放。
对本发明实施例二制得的复合支架进行释放实验。称取支架约1.5mg放入离心管中,并加入100μL的PBS,置于37℃恒温震荡摇床,在1d,4d,7d,14d,21d,42d时间点取上清液50μL,同时补充PBS 50μL。用SDF-1ELISA kit和BMP-2ELISA kit测定所取样液的药物浓度,计算药物累计释放量及累计释放百分比。每个时间点6个平行样。结果如图7所示。从图7可以看到,两种生长因子在初期都有爆释过程,但SDF-1在4天左右就释放完全,而BMP-2在28天也只释放出60%左右。这种时序性的释放过程有利于骨组织的重建。
对本发明实施例二制得的MHA/PLGA支架进行细胞迁移实验。为了对比载生长因子支架对细胞迁移的作用,按照实施例二的支架制备过程制备了不含生长因子的空白支架作为对照组。本实验采用Transwell迁移小室检测SDF-1对BMSCs的迁移作用。24孔Transwell(孔径为8μm,美仑生物)有上室、下室和聚碳酸酯滤膜组成。将支架分别放在迁移板的下室中,并加入500μL细胞培养基,在上室内加入1×106个/mL细胞悬液500μL,置于5%CO2,37℃孵箱培养24小时后,用棉球擦去上室内细胞,4%多聚甲醛固定聚碳酸酯滤膜上的细胞30min,然后0.1%结晶紫染色10min,光学显微镜下观察细胞并计数。无生长因子的MHA/PLGA支架设为对照组。实验结果如图8所示,图8(A)为无生长因子的MHA/PLGA支架,图8(B)为实施例二所制备的MHA/PLGA支架。从图中可以看出实施例二所制备的支架对BMSCs细胞有明显的迁移作用,有利于BMSCs的募集和后期骨修复。
虽然结合实施例与附图对本发明的具体实施方式进行了详细地描述,但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内,本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。
Claims (10)
1.一种生物活性支架的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1:制备中空介孔羟基磷灰石微球;
S2:在中空介孔羟基磷灰石微球上负载骨形态发生蛋白,得载药微球;
S3:将载药微球混入浓度为0.1~0.3g/mL的支架基质溶液中,然后利用3D打印机打印出具有100~900μm孔径的复合支架;所述复合支架中载药微球所占比重为10%~70%;
S4:在20~40℃条件下将浓度为8~12μg/mL的趋化生长因子溶液滴加涂覆于复合支架上,静置2~4h,得生物活性支架;
或者是包括以下步骤:
S1:制备中空介孔羟基磷灰石微球;
S2:在中空介孔羟基磷灰石微球上负载骨形态发生蛋白,得载药微球;
S3:将载药微球混入浓度为0.1~0.3g/mL的支架基质溶液中,再加入浓度为8~12μg/mL的趋化生长因子溶液,趋化生长因子溶液与支架基质溶液的体积比为1:10~20,混合均匀后用3D打印机打印出具有100~900μm孔径的复合支架,干燥后得生物活性支架;所述复合支架中载药微球所占比重为10%~70%。
2.根据权利要求1所述的生物活性支架的制备方法,其特征在于,S1中中空介孔羟基磷灰石微球的制备方法为:将浓度为18~20mg/mL的磷酸肌酸溶液与浓度为4~6mg/mL的氯化钙溶液按1:3的体积比混合,调节混合溶液的pH值为10并搅拌反应30min;再将混合物升温至110~160℃,并在5W的微波功率下反应10~30min;然后离心、洗涤、冷冻干燥得中空介孔羟基磷灰石微球。
3.根据权利要求1所述的生物活性支架的制备方法,其特征在于,S2中载药微球的具体制备方法为:在无菌条件下将中空介孔羟基磷灰石微球按1:10mg/mL的料液比浸入浓度为0.1~0.3μg/mL的骨形态发生蛋白溶液中,室温振荡吸附24h,然后离心、洗涤、冷冻干燥,即得。
4.根据权利要求1所述的生物活性支架的制备方法,其特征在于,S2中载药微球的制备方法包括以下步骤:
(1)将中空介孔羟基磷灰石微球浸入无水乙醇中并超声分散30min,然后将分散液与浓度为15~25mmol/L的氨基硅烷偶联剂乙醇溶液按1:1~3的体积比混合,调节混合溶液的pH值为8~9,超声反应1~6h;过滤、洗涤、干燥,并在100~150℃下焙烧2h,得氨基化改性的中空介孔羟基磷灰石微球;
(2)将NHS、EDC和MES混合并溶解于乙醇中,得混合溶液,所述混合溶液中NHS、EDC和MES的浓度分别0.05mmol/mL、0.1mmol/mL和0.05mmol/mL;
(3)将氨基化改性的中空介孔羟基磷灰石微球分散于浓度为0.1~0.3μg/mL的骨形态发生蛋白溶液中,然后向溶液中滴加混合溶液,所滴加的混合溶液与骨形态发生蛋白溶液的体积比为1:4~6,再于37℃下摇床孵化4h,离心、PBS溶液冲洗、真空干燥得载药微球。
5.根据权利要求4所述的生物活性支架的制备方法,其特征在于:所述氨基硅烷偶联剂为γ-氨丙基三乙氧基硅烷。
6.根据权利要求1或3或4所述的生物活性支架的制备方法,其特征在于:所述骨形态发生蛋白为BMP-2、BMP-4或BMP-7。
7.根据权利要求1所述的生物活性支架的制备方法,其特征在于:所述支架基质为PLGA、聚己内酯、聚乳酸、聚氨酯、壳聚糖、胶原、明胶和纤维素中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的生物活性支架的制备方法,其特征在于:所述趋化生长因子为TGF-β或SDF-1。
9.根据权利要求1所述的生物活性支架的制备方法,其特征在于:S3中3D打印时气压为0.1~0.6MPa,出丝速度为1~30mm/s。
10.采用权利要求1~9任一项所述的生物活性支架的制备方法所制备的生物活性支架,其特征在于:所述生物活性支架初期释放趋化生长因子,中后期释放骨形态发生蛋白。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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