CN116212118B - 一种降解速率可控的复合骨修复材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种降解速率可控的复合骨修复材料及其制备方法，属于生物医用材料领域。本发明首先制备表面具有介孔结构的中空生物活性玻璃微球，然后对中空生物活性玻璃微球进行表面氨基化修饰，制备得到氨基化修饰的生物活性玻璃微球，再加入磷酸化壳聚糖并以京尼平作为交联剂进行交联反应，最终制备得到复合骨修复材料。本发明通过控制氨基化修饰的生物活性玻璃微球与磷酸化壳聚糖之间质量比，来控制复合材料的体内外降解性，制备得到降解速率可控的复合骨修复材料。研究结果表明，本发明所制备的复合骨修复材料具有良好的生物相容性，能够诱导新生骨质的生成和沉积；同时，复合骨修复材料在大鼠体内的生物相容性较好，并且具有缓慢的降解速率。
Description
技术领域
本发明涉及一种骨修复材料，特别涉及一种降解速率可控的复合骨修复材料及其制备方法，属于生物医用材料领域。
背景技术
因外伤、骨肿瘤而造成的骨缺损，无法仅凭机体自身的新陈代谢来修复。需要通过外科手术的方式，使用一些可操作的、具有生物活性的材料来填补或者辅助骨缺损处的修复。因此，开发新型可替代人工骨修复材料广泛吸引科研工作者的关注。人工骨修复材料是生物材料领域研究的一大分支，主要包括无机材料、天然高分子材料和有机高分子材料。天然高分子材料以壳聚糖、海藻酸钠、胶原等生物大分子具有广泛应用前景。无机材料包括生物活性玻璃、生物陶瓷、羟基磷灰石等。目前多采用无机材料与天然高分子材料相结合的方式构建复合支架，模拟骨缺损原位的三维微环境，在发挥填充、支撑作用的同时，满足骨诱导和骨传导的要求。
壳聚糖（Chitosan, CS）是一类具有多羟基、多氨基的天然多糖分子，具有优异的生物相容性和可降解性，是骨组织工程材料中的重要材料之一。壳聚糖分子中含有的氨基和羟基，可以进行化学改性，诸如羧基化、磺酸化和羟乙基化改性等，赋予其额外的功能，如调控细胞因子的分泌，有助于其在骨组织工程中的应用。磷酸化壳聚糖（Phosphorylatedchitosan, PCS）是壳聚糖的衍生物，能够诱导羟基磷灰石晶体的生成和沉积，增强成骨细胞的黏附、增殖和活性，在骨修复领域具有很大的研究前景。自1970年，Hench教授首次发现生物活性玻璃（Bioactive glass, BG）以来，生物活性玻璃就因其组成、形态可调控性以及可降解性，在新陈代谢、骨质矿化沉积、骨传导和骨诱导方面发挥重大作用而备受研究者青睐，成为无机生物活性材料领域的一个重要分支。生物活性玻璃是一类以SiO2为晶格架构形成的硅酸盐材料，有助于成骨细胞分化和骨组织的钙化过程，能够诱导胶原的沉积从而形成新的骨质。
单一组分的天然高分子材料，如壳聚糖及其衍生物制备的多孔材料，具备理想的孔结构，但是机械性能太低，不足以满足骨修复材料对材料机械强度的要求。而无机材料，如生物活性玻璃等是促进骨组织生成的重要组分，但是成型性较差。近年来，许多研究者将天然高分子材料与无机材料联合应用，提高天然高分子材料的机械强度，弥补无机材料的脆性并提高复合材料的生物相容性。Chen J课题组利用干压成形技术制备了具有无定形结构和微米级尺寸的生物活性玻璃片剂，生物矿化实验和细胞毒性试验均证明该方法制备的产品具有良好的机械强度和矿化能力以及较高的生物相容性，在骨缺损修复领域具有很高的应用前景（Chen J, Zeng L, Chen X, Liao T, Zheng J. Preparation andcharacterization of bioactive glass tablets and evaluation of bioactivity andcytotoxicity in vitro. Bioact Mater. 2017 Dec 1;3(3):315-321.）。但是，该方法制备的材料的可塑形性差、降解速率慢。S Dhivya等制备了含有壳聚糖和纳米羟基磷灰石的凝胶（Zn-CS:β-GP: nHAp）并研究了该凝胶的降解性，发现其在体外溶菌酶溶液中浸泡48hr 后，Zn-CS:β-GP: nHAp的降解率接近70%，该凝胶的体外降解率较快（Dhivya S,Saravanan S, Sastry TP, Selvamurugan N. Nanohydroxyapatite-reinforcedchitosan composite hydrogel for bone tissue repair in vitro and in vivo. JNanobiotechnology. 2015 Jun 12;13:40.）。李智慧等将中空生物玻璃微球加入到丝素蛋白和PEO溶液中，制得复合纤维膜，该复合纤维膜具有诱导生成羟基磷灰石的能力，但是没有研究材料的降解性能。
骨修复材料应该具有可控的体内降解性以便满足附近组织的矿物质在此沉积形成新骨，即材料自身的降解速率与新骨的形成速率应该具有一定的匹配性。如何控制材料的降解性是研发具有潜在应用前景的人工骨修复材料的难题之一。
发明内容
针对上述问题，本发明的第一个目的是提供一种降解速率可控的复合骨修复材料，通过控制复合骨修复材料的体内外降解速率，更好地满足骨缺损修复的要求。
本发明的另一个目的是提供一种上述降解速率可控的复合骨修复材料的制备方法。
本发明首先制备表面具有介孔结构的中空生物玻璃微球（BG），然后对BG进行表面氨基化修饰，制备得到氨基化生物活性玻璃微球（NBG），再加入磷酸化壳聚糖（PCS）并以京尼平作为交联剂进行交联反应，最终制备得到复合骨修复材料。本发明通过控制NBG与PCS之间质量比，来控制复合材料的体内外降解性，制备得到降解速率可控的复合骨修复材料。
本发明具体的技术方案如下：
一种降解速率可控的复合骨修复材料，其特征在于，包括表面氨基化修饰的中空生物活性玻璃微球（NBG），以及NBG与磷酸化壳聚糖（PCS）通过京尼平交联反应得到的交联结构，所述NBG与PCS的质量比为1:1~1:4。
进一步的，所述氨基化修饰的中空生物活性玻璃微球（NBG）具有“核-壳”式结构，粒径介于280-360 nm之间，表面富有介孔。
一种降解速率可控的复合骨修复材料制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）以十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）为模板剂，采用溶胶-凝胶结合模板法，在碱催化条件下制备表面介孔的中空生物玻璃微球（BG）；
（2）以3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）为氨基化试剂，对BG进行表面氨基化修饰，制备表面氨基化修饰的中空生物活性玻璃微球（NBG）；
（3）以壳聚糖为原料，加入甲醛和亚磷酸，制备得到磷酸化壳聚糖，经透析纯化和冷冻干燥，得到提纯后的磷酸化壳聚糖；
（4）将NBG加入到磷酸化壳聚糖（PCS）溶液中，搅拌均匀，再加入京尼平作为交联剂进行交联反应；对交联产物进行冷冻干燥，得到复合骨修复材料。
进一步的，步骤（3）中透析纯化采用的是截留分子量3 kDa的透析袋。
步骤（4）所述NBG与PCS的质量比为1:1~1:4。当NBG与PCS的质量比低于1:1时，由于PCS质量比太低，无法包裹NBG，因而无法制备成规则形状的复合骨修复材料；随着PCS质量比的增加，PCS之间的交联程度增加，材料失重率逐渐降低。复合骨修复材料中NBG的添加能够增加材料的压缩强度和弹性模量。当NBG与PCS的质量比高于1:4时，由于材料中NBG含量的降低，材料的压缩强度和弹性模量将逐渐降低。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
1、本发明制备的生物活性玻璃微球具有“核-壳”型中空结构，生物相容性良好，具备体外诱导羟基磷灰石沉积的能力。
2、本发明所制备的复合骨修复材料具有粗糙的表面、内部富有大孔结构且连通性较好，孔隙率达到59-76%。材料具有良好的力学性能，通过提高PCS的质量比，复合骨修复材料的压缩强度和弹性模量与纯PCS相比均显著增加。氨基化生物活性玻璃能够增强NBG和PCS之间的交联，使得复合材料在体内的降解速率缓慢；通过控制氨基化修饰及NBG和PCS之间的质量比，能够控制复合材料的降解速率，更好地满足骨缺损修复的要求。
3、本发明所制备的复合骨修复材料具有良好的生物相容性，能够诱导新生骨质的生成和沉积；材料具有良好的细胞相容性，有利于细胞的贴附和增殖以及营养物质的运输。将复合骨修复材料植入股骨缺损部位中，通过H&E组织切片观察，表明复合骨修复材料在大鼠体内的生物相容性较好，并且具有缓慢的降解速率。利用Masson染色观察表明，复合骨修复材料能够诱导新生骨质的生成和沉积。
附图说明
图1是本发明制备的生物活性玻璃微球的扫描电镜和透射电镜图。
图2 是本发明制备的复合骨修复材料的样品图。
图3 是本发明制备的复合骨修复材料内部结构扫描电镜图。
图4是本发明制备的复合骨修复材料的体外降解率图。
图5 是本发明制备的复合骨修复材料植入大鼠股骨部位后组织H&E染色图。
图6是本发明制备的复合骨修复材料植入大鼠股骨部位后组织Masson染色图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施例来进一步详细说明本发明。
实施例1：
（1）生物活性玻璃（BG）的制备：
将0.8 g 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）溶解到无水乙醇-水溶液中，再加入氨水6ml，搅拌均匀1 hr；然后每间隔1 hr加入6 ml正硅酸四乙酯（TEOS）、0.57 ml 磷酸三乙酯（TEP）、1.19 g 四水硝酸钙（CN），之后继续搅拌12 hr；离心收集生物活性玻璃，去离子水洗涤2遍，乙醇洗涤2遍，高温烘干12小时。马弗炉烧制：200℃焙烧1 hr，400℃煅烧2 hr，600℃焙烧3 hr。最后得到表面介孔生物活性玻璃，其组成为n(SiO2): n(P2O5): n(CaO)= 60:4:36。
如图1所示，制备的生物活性玻璃微球具有规则的球形结构，粒径均一、球形完整，表面粗糙。生物活性玻璃微球的粒径分布呈现正态分布，粒径介于280-360 nm之间，微球具有明显的“核-壳”式结构。
通过BET法对微球表面的孔结构进行分析，表明生物活性玻璃微球呈现典型的Ⅳ型等温线和H2型滞后环，符合介孔材料的特征曲线，其孔径分布主要集中在介孔范围。生物活性玻璃微球的平均孔径为7.60±1.23 nm，比表面积为358.78±12.22 m2/g，孔体积为0.68±0.17 ml/g。
（2）氨基化生物活性玻璃（NBG）的制备：
以APTES为氨基化试剂，根据n(APTES): n(SiO2)=0.05:1的摩尔比制备氨基化修饰生物玻璃：甲苯（100 ml）与APTES混合均匀，加入生物玻璃粉末，超声分散30 min，水浴锅升温至80 ℃，冷凝回流12 hr，反应结束获得氨基化生物活性玻璃（NBG），烘干并研制成粉末待用。
Zeta电位测定结果如表1所示。从表中数据可知，BG的表面Zeta电位为负值，而氨基化修饰制备的NBG，其表面Zeta电位为正值。
表1 BG及NBG的Zeta电位测定结果
| 样品 | 表面电荷（mV） |
| BG (10 mg/ml) | -11.6±0.35 |
| NBG (10 mg/ml) | 6.01±0.69 |
（3）磷酸化壳聚糖的制备：
配制300 ml 1%的壳聚糖-冰醋酸溶液，待完全溶解后滴加甲醛水溶液，搅拌分散1hr，再将6 g亚磷酸固体溶解到适量去离子水中，逐滴滴加到反应体系中，升高反应体系温度至70 ℃，水浴条件下连续反应6 hr。反应结束后，加入无水乙醇进行沉淀，离心15 min后得到白色絮状物，即为磷酸化壳聚糖。磷酸化壳聚糖加入去离子水溶解后，使用截留分子量3000 Da的透析袋进行透析3 d，冷冻干燥2 d后得到提纯后的磷酸化壳聚糖。
当n(CS:H3PO3)=1:2时，本方法所制备的磷酸化壳聚糖的取代度为25%。
（4）复合骨修复材料的制备：
将0.4 g磷酸化壳聚糖溶解于10 ml去离子水中，将0. 4 g NBG粉末，加入磷酸化壳聚糖溶液中，搅拌均匀，再加入京尼平（1 wt%），搅拌均匀。将混合物溶液分装至48孔板中，交联反应12 hr以上。将48孔板在-20 ℃冰箱中预冻，再冷冻干燥48 hr，得到复合骨修复材料NBP1。
实施例2：
本实施例的步骤（1），（2）和（3）同实施例1。
（4）将0.4 g磷酸化壳聚糖溶解于10 ml去离子水中。将0.2 g NBG粉末，加入磷酸化壳聚糖溶液中，搅拌均匀。加入京尼平（1 wt%），搅拌均匀。将混合物溶液分装至48孔板中，交联反应12 hr以上。将48孔板在-20 ℃冰箱中预冻，再冷冻干燥48 hr，得到复合骨修复材料NBP2。
实施例3：
本实施例的步骤（1），（2）和（3）同实施例1。
（4）将0.3 g磷酸化壳聚糖溶解于10 ml去离子水中。将0.1 g NBG粉末，加入磷酸化壳聚糖溶液中，搅拌均匀。加入京尼平（1 wt%），搅拌均匀。将混合物溶液分装至48孔板中，交联反应12 hr以上。将48孔板在-20 ℃冰箱中预冻，再冷冻干燥48 hr，得到复合骨修复材料NBP3。
实施例4：
本实施例的步骤（1），（2）和（3）同实施例1。
（4）将0.4 g磷酸化壳聚糖溶解于10 ml去离子水中。将0.1 g NBG粉末，加入磷酸化壳聚糖溶液中，搅拌均匀。加入京尼平（1 wt%），搅拌均匀。将混合物溶液分装至48孔板中，交联反应12 hr以上。将48孔板在-20 ℃冰箱中预冻，再冷冻干燥48 hr，得到复合骨修复材料NBP4。
本发明制备的人工骨修复材料的样品实物图如图2所示。复合骨修复材料NBP1~NBP4均为规则的圆柱状材料。复合骨修复材料NBP1~NBP4的内部结构如图3所示，SEM观察显示支架横截面的表面粗糙、富有大孔结构且连通性较好，测定其孔隙率达到59-76%。NBP1材料显示出较“厚”的孔壁，并且含有大量的300微米以上的大孔结构。随着PCS相对质量比的较高，PCS分子之间以及PCS与NBG之间能够发生更多的交联作用，因而NBP3与NBP4材料的内部呈现更致密的孔隙结构，孔径大小平均为100微米左右。
以磷酸化壳聚糖材料作为空白对照，对上述实施例制备的复合骨修复材料的力学性能进行了测试。结果如表2所示，从数据可以看出，利用氨基化修饰的生物活性玻璃制备的复合骨修复材料，其压缩强度和弹性模量随着PCS质量比的增加而显著增加；NBG的加入显著增加了复合骨修复材料的力学性能。而NBG的质量比再高，将影响材料的可塑性。
表2 复合骨修复材料的力学性能及孔隙率
| 材料 | 压缩强度(MPa) | 弹性模量(MPa) | 孔隙率% |
| PCS | 0.24±0.05 | 0.51±0.28 | 52.3±5.6 |
| NBP1 | 0.64±0.07 | 0.47±0.05 | 59.5±3.6 |
| NBP2 | 0.83±0.10 | 0.57±0.32 | 76.5±7.6 |
| NBP3 | 1.03±0.15 | 2.20±0.27 | 61.1±4.2 |
| NBP4 | 0.93±0.21 | 1.13±0.58 | 74.0±3.4 |
将上述骨修复材料浸泡在溶菌酶溶液（20000 U/ml）中，以评价材料的体外降解性。结果显示，随着时间的延长，材料的失重率不断增加。NBP1材料的降解率明显高于其它材料。在降解5 周时，各组材料的降解率如图4所示。NBP1的材料失重率达65%左右。而NBP2，NBP3，NBP4这三组材料随着PCS质量比的增加，材料失重率逐渐降低，且整体的失重率较低。
效果实施例：
选择体重在240-260 g的SD雄性大鼠。在大鼠右侧股骨中上区域，用牙科钻打出大约3× 4×4 mm3的骨缺损区域，将辐照灭菌的复合骨修复材料植入缺损区域中，分层缝合肌肉。采用H&E染色观察植入材料处部位的炎症浸润情况，结果如图5所示。研究发现复合骨修复材料植入缺损部位1个月（1M）时，在材料与原位骨质接触位置，存在一定的炎症浸润情况，存在组织液与骨髓液浸入材料的现象。术后2 M时，没有观察到明显的炎症浸润情况，而且复合骨修复材料出现降解和溶出的情况。术后3 M时，材料内部充斥大量纤维组织与肉芽组织，且有新生骨质的积累，证明材料具有良好的体内生物相容性。
进一步采用Masson染色观察NBP2和NBP4材料植入骨缺损部位的变化，结果如图6所示。NBP2植入1个月（1 M）后能明显观察到未愈合的股骨缺损，支架内部有骨髓细胞的渗入。术后2 M时，新生骨质进一步发生矿化，新生骨质向材料内部延伸。术后3 M时，NBP2材料降解明显，骨缺损部位的新生骨质和原生骨质融合性较好。NBP4植入1M、2M后，也观察到新生骨质的生成。但是，NBP4的体外降解速率较慢，植入体内3 M后，NBP4材料内部骨架仍处于比较完整的状态。Masson染色观察表明复合支架能够诱导新生骨质的生成和沉积，复合骨修复材料在体内骨缺损修复中发挥重要作用。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (4)
1.一种降解速率可控的复合骨修复材料，其特征在于，包括表面氨基化修饰的中空生物活性玻璃微球，以及所述表面氨基化修饰的中空生物活性玻璃微球与磷酸化壳聚糖通过京尼平交联反应得到的交联结构，所述表面氨基化修饰的中空生物活性玻璃微球与磷酸化壳聚糖的质量比为1:1~1:4；所述氨基化修饰的中空生物活性玻璃微球具有核-壳式结构，粒径介于280-360 nm之间，表面富有介孔。
2.一种权利要求1所述降解速率可控的复合骨修复材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）以十六烷基三甲基溴化铵为模板剂，采用溶胶-凝胶结合模板法，在碱催化条件下制备表面介孔的中空生物玻璃微球；
（2）以3-氨丙基三乙氧基硅烷为氨基化试剂，对中空生物活性玻璃微球进行表面氨基化修饰，制备氨基化修饰的中空生物活性玻璃微球；
（3）以壳聚糖为原料，加入甲醛和亚磷酸，制备得到磷酸化壳聚糖，经透析纯化和冷冻干燥，得到提纯后的磷酸化壳聚糖；
（4）将氨基化修饰的中空生物活性玻璃微球加入到磷酸化壳聚糖溶液中，搅拌均匀，再加入京尼平作为交联剂进行交联反应；对交联产物进行冷冻干燥，得到复合骨修复材料。
3.如权利要求2所述的复合骨修复材料制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中透析纯化采用的是截留分子量3 kDa的透析袋。
4.如权利要求2所述的复合骨修复材料制备方法，其特征在于，步骤（4）所述氨基化修饰的中空生物活性玻璃微球与磷酸化壳聚糖的质量比为1:1~1:4。
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