CN114540267A - 一种关于仔猪肠黏膜的不同浓度胶原蛋白网络体外制备方法 - Google Patents

一种关于仔猪肠黏膜的不同浓度胶原蛋白网络体外制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种关于仔猪肠黏膜的不同浓度胶原蛋白网络体外制备方法，包括如下步骤：仔猪回肠粘膜下层的分离；猪回肠粘膜下层脱细胞；不同胶原蛋白浓度的猪脱细胞基质‑凝胶的配制；不同胶原蛋白浓度的仔猪脱细胞基质‑凝胶的表征。该方法利用脱细胞技术，结合水凝胶模型，能够在模拟仔猪回肠黏膜下层生理屏障功能的基础上实现对胶原蛋白的精准调控，为体外研究其功能提供理想模型。

Description

一种关于仔猪肠黏膜的不同浓度胶原蛋白网络体外制备方法
技术领域
本发明属于材料制备领域，具体涉及一种模拟仔猪肠黏膜胶原蛋白网络体外制备方法。
背景技术
断奶仔猪生长受阻是困扰生猪养殖业的关键问题，仔猪生长发育主要依赖肠-肝轴的吸收与转运。肠黏膜不仅是肠道抵御病原菌等有害物质的重要屏障，也是营养物质消化吸收转运的主要场所。肠腔中营养物质经肠上皮细胞载体转运吸收进入肠黏膜，在肠黏膜中逐级转运至微血管并通过门静脉循环到达肝脏，再分配到机体各组织。研究发现，大量营养物质被肠黏膜截留，且肠道发生炎症时胶原蛋白浓度上升，肠黏膜截留比例更高。
关于仔猪肠黏膜下层营养物质转运的研究较少。肠黏膜下层分布大量细胞外基质，他们是营养物质转运至微血管须跨越的生理屏障，细胞外基质异常会导致肠黏膜营养物质截留增加，从而限制了肠黏膜运效率。研究表明，胶原蛋白(细胞外基质的主要成分)可能通过动态变化调控肠黏膜营养物质截留。准确掌握细胞外基质中胶原蛋白的动态变化对肠黏膜营养物质截留，对于研究仔猪肠道健康具有重要意义。目前没有仔猪肠黏膜胶原蛋白的研究报道，且胶原蛋白动态变化对仔猪肠黏膜截留的作用及机制尚不清楚。这主要是因为体内精准调控仔猪肠黏膜胶原蛋白难以实现。
本发明从体外模型着手，在脱细胞基质的基础上添加不同浓度的胶原溶液，模拟仔猪肠道环境并可以实现胶原蛋白浓度/类型的精准调控，从而为研究胶原蛋白动态变化对猪肠黏膜营养物质截留的作用及机制提供理想的体外模型。
发明内容
本发明一种关于仔猪肠黏膜的不同浓度胶原蛋白网络体外制备方法，其制备流程如图1所示。
该方法包括以下步骤：
第一步：仔猪回肠粘膜下层的分离，用0.9％NaCl溶液反复清洗仔猪回肠段，小心地去除肠周围的脂肪组织，再用0.9％NaCl溶液清洗，将其切成肠段，然后用无菌剪刀将肠段剪开，展平；用无菌镊子将浆膜层从回肠膜上剥离，再将肌肉层剥离，用0.9％NaCl溶液连续洗涤去除粘膜。最后，机械去除剩余的肌肉层，分离出猪回肠粘膜下层。
第二步：猪回肠粘膜下层脱细胞，包括①用0.9％NaCl溶液清洗分离的猪回肠粘膜下层，直到组织碎片被完全清除。然后将猪回肠粘膜下层进行冻融，放入液氮保存15-20分钟，然后立即在恒温箱中孵育，直至完全解冻。解冻后，用0.9％NaCl溶液在室温下清洗猪回肠粘膜下层10-15分钟；②用NaOH溶液在室温下处理猪回肠粘膜下层，随后用0.9％NaCl溶液清洗样品；③在37℃恒温箱中，用配制好的抗坏血酸和PAA溶液培养36小时，随后用NaCl溶液清洗样品；④将猪回肠粘膜下层浸泡在70％乙醇配制的0.15％PAA溶液中，在室温下震荡20-24小时，随后用0.9％的NaCl溶液清洗样品；⑤在室温下，用10-15％过氧化氢配制的0.15％PAA溶液孵育猪回肠粘膜下层12-16小时，用0.9％的NaCl反复清洗猪回肠粘膜下层；⑥将脱细胞的猪回肠粘膜下层放在指定的模具中，在-86℃下冷冻至少12小时，然后，在-80℃下冻干一夜，将冻干的猪脱细胞组织用研钵和杵在液氮中粉碎制备成猪脱细胞基质(PECM)粉末。
第三步：不同胶原蛋白浓度的猪脱细胞基质-凝胶的配制，称取500mgPECM，并在室温下用含有50mg胃蛋白酶的0.5M醋酸消化溶解72小时。等待PECM完全溶解后,用40μM大小网格过滤，去除未溶解颗粒，并将得到的溶液4℃保存，得到2.5％的PECM溶液。在此基础上，分别加入不同浓度(0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％)的胶原蛋白溶液COLTRIX(Type-1atelo-collagen)，然后放置4℃保存。使用前，通过逐滴添加冷NaOH来调节PECM-凝胶溶液的pH值，使其保持一致。
第四步：不同胶原蛋白浓度的仔猪脱细胞基质-凝胶的表征检测，包括：
(1)PECM-凝胶均表现出热响应行为，不同浓度的PECM-凝胶均表现出热响应行为，低浓度组相比，高浓度组具有快速凝胶化的特点，其复模量急剧增加。
(2)PECM-凝胶的粘度变化，在10s-1的剪切速率下，PECM-凝胶的粘度分别为0.26Pa(0.5COL)、1.15Pa(1COL)、1.58Pa(1.5COL)、3.67Pa(2COL)和4.52Pa(2.5COL)，如图2所示。
(3)PECM-凝胶的弹性模量变化，高浓度组的弹性模量远高于低浓度组。其中高浓度的弹性模量范围约为1000～10000Pa，而低浓度组约为50～100Pa。其变化趋势如图3所示。
本发明以猪脱细胞基质--凝胶是以猪肠道脱细胞基质为基础，进而达到模拟猪回肠黏膜下层的生理屏障功能的目的。在此基础上加入不同浓度/类型的胶原蛋白配制而成。因此，本发明可精确地调整胶原蛋白的类型以及浓度，从而为研究胶原蛋白动态变化对猪肠黏膜营养物质截留的作用及机制提供理想的体外模型。
附图说明
图1为制备PECM-凝胶制备流程图。
图2为不同浓度的PECM-凝胶的粘度变化。
图3为不同浓度的PECM-凝胶的弹性模量变化。
具体实施方式
以下列举具体实施例对本发明进行说明，实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表本发明的保护范围，其他人根据本发明做出的非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
第一步：仔猪回肠粘膜下层的分离，用0.9％NaCl溶液反复清洗仔猪回肠段，小心地去除肠周围的脂肪组织，再用0.9％NaCl溶液清洗。将其切成10厘米的肠段，然后用无菌剪刀将肠段剪开，展平；用无菌镊子将浆膜层从回肠膜上剥离，再将肌肉层剥离，用0.9％NaCl溶液连续洗涤去除粘膜。最后，机械去除剩余的肌肉层，分离出猪回肠粘膜下层。
第二步：猪回肠粘膜下层脱细胞，包括①用NaCl溶液清洗分离的猪回肠粘膜下层，直到组织碎片被完全清除。然后将猪回肠粘膜下层进行冻融，放入液氮保存15-20分钟，然后立即在恒温箱中孵育，直至完全解冻。解冻后，用0.9％NaCl溶液在室温下清洗猪回肠粘膜下层10-15分钟；②0.1M NaOH溶液在室温下处理猪回肠粘膜下层1小时，随后用0.9％的NaCl溶液清洗样品；③在37℃恒温箱中，用配制好的0.1M抗坏血酸和0.15％PAA溶液培养36小时，随后用0.9％的NaCl溶液清洗样品；④将猪回肠粘膜下层浸泡在70％乙醇配制的0.15％PAA溶液中，在室温下震荡20-24小时，随后用0.9％的NaCl溶液清洗样品；⑤在室温下，用10-15％过氧化氢配制的0.15％PAA溶液孵育猪回肠粘膜下层12-16小时，用0.9％的NaCl反复清洗猪回肠粘膜下层；⑥将脱细胞的猪回肠粘膜下层放在指定的模具中，在-86℃下冷冻至少12小时，然后，在-80℃下冻干一夜，将冻干的猪脱细胞组织用研钵和杵在液氮中粉碎制备成PECM粉末。
第三步：不同胶原蛋白浓度的猪脱细胞基质-凝胶的配制，称取500mgPECM，并在室温下用含有50mg胃蛋白酶的0.5M醋酸消化溶解72小时。等待PECM完全溶解后,用40μM大小网格过滤，去除未溶解颗粒，并将得到的溶液4℃保存，得到2.5％的PECM溶液。在此基础上，分别加入不同浓度(0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％)的胶原蛋白溶液COLTRIX(Type-1atelo-collagen)，然后放置4℃保存。使用前，通过逐滴添加冷NaOH来调节PECM-凝胶溶液的pH，使其保持一致。
第四步：不同胶原蛋白浓度的仔猪脱细胞基质-凝胶的表征检测，包括：
(1)PECM-凝胶均表现出热响应行为，不同浓度的PECM-凝胶均表现出热响应行为，低浓度组相比，高浓度组具有快速凝胶化的特点，其复模量急剧增加。
(2)PECM-凝胶的粘度变化，在10s-1的剪切速率下，PECM-凝胶的粘度分别为0.26Pa(0.5COL)、1.15Pa(1COL)、1.58Pa(1.5COL)、3.67Pa(2COL)和4.52Pa(2.5COL)。
(3)PECM-凝胶的弹性模量变化，高浓度组的弹性模量远高于低浓度组。其中高浓度的弹性模量范围约为1000～10000Pa，而低浓度组约为50～100Pa。

Claims (2)

1.本发明一种关于仔猪肠黏膜的不同浓度胶原蛋白网络体外制备方法，该方法包括以下步骤：
第一步：仔猪回肠粘膜下层的分离，用0.9％NaCl溶液反复清洗仔猪回肠段，小心地去除肠周围的脂肪组织，再用0.9％NaCl溶液清洗，将其切成肠段，然后用无菌剪刀将肠段剪开，展平；用无菌镊子将浆膜层从回肠膜上剥离，再将肌肉层剥离，用0.9％NaCl溶液连续洗涤去除粘膜。最后，机械去除剩余的肌肉层，分离出猪回肠粘膜下层。
第二步：猪回肠粘膜下层脱细胞，包括①用0.9％的NaCl溶液清洗分离的猪回肠粘膜下层，直到组织碎片被完全清除。然后将猪回肠粘膜下层进行冻融，放入液氮保存15-20分钟，然后立即在恒温箱中孵育，直至完全解冻。解冻后，用0.9％的NaCl溶液在室温下清洗猪回肠粘膜下层10-15分钟；②用NaOH溶液在室温下处理猪回肠粘膜下层，随后用NaCl溶液清洗样品；③在37℃恒温箱中，用配制好的抗坏血酸和PAA溶液培养36小时，随后用NaCl溶液清洗样品；④将猪回肠粘膜下层浸泡在70％乙醇配制的0.15％PAA溶液中，在室温下震荡20-24小时，随后用0.9％的NaCl溶液清洗样品；⑤在室温下，用10-15％过氧化氢配制的0.15％PAA溶液孵育猪回肠粘膜下层12-16小时，用0.9％的NaCl反复清洗猪回肠粘膜下层；⑥将脱细胞的猪回肠粘膜下层放在指定的模具中，在-86℃下冷冻至少12小时，然后，在-80℃下冻干一夜，将冻干的猪脱细胞组织用研钵和杵在液氮中粉碎制备成猪脱细胞基质(PECM)粉末。
第三步：不同胶原蛋白浓度的猪脱细胞基质-凝胶的配制，称取500mgPECM，并在室温下用含有50mg胃蛋白酶的0.5M醋酸消化溶解72小时。等待PECM完全溶解后,用40μM大小网格过滤，去除未溶解颗粒，并将得到的溶液4℃保存，得到2.5％的PECM溶液。在此基础上，分别加入不同浓度(0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％)的胶原蛋白溶液COLTRIX(Type-1atelo-collagen)，然后放置4℃保存。使用前，通过逐滴添加冷NaOH来调节PECM-凝胶溶液的pH，使其保持一致。
第四步：不同胶原蛋白浓度的仔猪脱细胞基质-凝胶的表征检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于表征检测结果如下：
(1)PECM-凝胶均表现出热响应行为，不同浓度的PECM-凝胶均表现出热响应行为，低浓度组相比，高浓度组具有快速凝胶化的特点，其复模量急剧增加。
(2)PECM-凝胶的粘度变化，在10s-1的剪切速率下，PECM-凝胶的粘度分别为0.26Pa(0.5COL)、1.15Pa(1COL)、1.58Pa(1.5COL)、3.67Pa(2COL)和4.52Pa(2.5COL)。
(3)PECM-凝胶的弹性模量变化，高浓度组的弹性模量远高于低浓度组。其中高浓度的弹性模量范围约为1000～10000Pa，而低浓度组约为50～100Pa。
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