CN111790007A - 一种温敏型鹿茸软骨基质水凝胶材料的制备方法及应用 - Google Patents

一种温敏型鹿茸软骨基质水凝胶材料的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

一种温敏型鹿茸软骨基质水凝胶材料的制备方法及应用。本发明属于组织工程技术领域。本发明为解决目前针对鹿茸软骨的脱细胞基质材料存在细胞脱除不完全的技术问题。方法：将鹿茸去血、去皮后浸泡于含抑肽酶的PBS缓冲液中，然后置于密闭加压装置中加压处理，切片、研磨后和冻融缓冲液混合于金属密闭容器中孵育，液氮急冻、解冻后，再依次经胰蛋白酶消化液、EDTA去污剂、核酸清除剂、除菌剂处理，真空冷冻干燥后经胃蛋白酶消化液消化，得到温敏型鹿茸软骨基质水凝胶。本发明的处理方法相比现有鹿茸软骨脱细胞处理方法具有更好的细胞脱除效果，脱细胞处理未对胞外基质成分造成严重损失，脱细胞后的基质材料空隙均匀，血管管腔结构依然保留。

Description

一种温敏型鹿茸软骨基质水凝胶材料的制备方法及应用
技术领域
本发明属于组织工程技术领域；具体涉及一种温敏型鹿茸软骨基质水凝胶材料的制备方法及应用。
背景技术
目前，由创伤和各种疾病引起的关节软骨缺损在临床上十分常见，但关节软骨的自身修复能力极其有限。目前，用于临床治疗关节软骨损伤的方法(软骨、骨膜移植、软骨下骨钻孔以及关节削磨成形术等)都有其局限性，均不能实现长期的软骨修复。组织工程方法的出现，为解决人体软骨组织修复提供了一种全新的材料来进行组织修复和重建，即脱细胞基质材料，特别是软骨组织的脱细胞基质材料。但是，目前的软骨脱细胞基质支架只适合小范围的软骨缺损修复，大段软骨缺损修复由于缺乏充足的营养供应或血管化不及时，不能让软骨再生及替代。因为，软骨组织中无淋巴及血管组织，且软骨基质致密不利于种子细胞的迁移生长。例如，专利CN 102085390A公开了一种软骨脱细胞基质，这种软骨脱细胞基质只能做到1～30μm厚度，不适用于大段软骨缺损或者对软骨厚度要求较大的组织修复中应用。
鹿茸软骨与普通软骨不同的是，鹿茸的软骨组织中富含血管，在纵向上形成了多条相互平行的管腔结构，脱细胞处理后这些结构可以作为种子细胞迁移的通道。其次，鹿茸的生长速度极快，在某些鹿种中鹿茸的生长速度可以达到2.7cm/天。研究发现，鹿茸中富含多种生成因子如：成纤维细胞生长因子(FGF)2、血管内皮生长因子(VEGF)2、pleotrophin、胸腺素β10、神经生长因子(NGF)、胰岛素样生长因子，转移生长因子等。这些生长因子对鹿茸软骨血管形成具有至关重要的作用。例如，FGF、VEGF等都能够促进组织的血管新生，这些生长因子能够直接地促进血管内皮细胞的迁移，使新生血管快速生成。NGF能够在组织损伤后通过刺激VEGF的表达来促进血管生成。因此，鹿茸软骨富含大量促血管生成因子，以此为原材料开发的脱细胞基质材料有别于其它软骨组织来源的材料，可用于人体软骨/骨修复。进一步将其开发为温敏型水凝胶，还可以用于皮肤及神经等组织的修复，具有极大应用价值。但目前针对鹿茸软骨的脱细胞基质材料存在细胞脱除不完全的问题，因此，研发一种细胞脱除效果好的鹿茸软骨的脱细胞基质材料尤为重要。
发明内容
本发明为解决目前针对鹿茸软骨的脱细胞基质材料存在细胞脱除不完全的技术问题，而提供了一种温敏型鹿茸软骨基质水凝胶材料的制备方法及应用。
本发明的一种温敏型鹿茸软骨基质水凝胶材料的制备方法按以下步骤进行：
一、将鹿茸中血液去除干净，然后去除外皮；
二、将步骤一处理后的鹿茸浸泡于含抑肽酶的PBS缓冲液中，然后置于密闭加压装置中，于压力为80MPa～120MPa，温度为25～35℃下保压10min～15min；
三、将步骤二处理后的鹿茸切成薄片，然后研磨至粒径为0.07mm～0.16mm，得到鹿茸骨泥；
四、①按料液比1：(1～2)将鹿茸骨泥和冻融缓冲液置于金属密闭容器中，于3～5℃下孵育2h～4h，然后用液氮急冻30min～75min，再在35～40℃水浴中解冻15min～45min，去除上清液后重复操作2～3次；②去除上清液，按料液比1：(5～8)加入含抑肽酶的PBS缓冲液，于3～5℃下振荡8h～12h；
五、①去除上清液，按料液比1：(3～5)加入胰蛋白酶消化液，于35～40℃下振荡孵育，每隔2h～4h更换一次胰蛋白酶消化液，共孵育24h～36h，去除上清液后重复操作2～3次；②去除上清液，按料液比1：(5～8)加入含抑肽酶的PBS缓冲液，于3～5℃下振荡8h～12h；
六、①去除上清液，按料液比1：(3～5)加入EDTA去污剂，于3～5℃下振荡12h～36h，去除上清液后重复操作2～3次；②去除上清液，按料液比1：(5～8)加入含抑肽酶的PBS缓冲液，于3～5℃下振荡8h～12h，重复2～3次；
七、①去除上清液，按料液比1：(3～5)加入核酸清除剂，于35～40℃下振荡12h～36h，去除上清液后重复操作3～5次；②去除上清液，按料液比1：(5～8)加入含抑肽酶的PBS缓冲液，于3～5℃下振荡8h～12h，重复2～3次；
八、①去除上清液，按料液比1：(3～5)加入除菌剂，于3～5℃下振荡12h～36h，去除上清液后重复操作2～3次；②去除上清液，按料液比1：(5～8)加入无菌去离子水，于3～5℃下振荡12h～24h，重复3～5次；
九、去除上清液后真空冷冻干燥，得到基质冻干粉；
十、按基质冻干粉的质量与胃蛋白酶消化液的体积的比为1：(5～10)将二者混合，于35～40℃下振荡消化36h～72h，离心后取上清液于3～5℃下预冷处理2h～4h，然后用冰NaoH溶液调整pH至7.2～7.4，得到温敏型鹿茸软骨基质水凝胶。
进一步限定，步骤二中所述含抑肽酶的PBS缓冲液中抑肽酶的浓度为1.5U/mL～2.5U/mL。
进一步限定，步骤二中所述含抑肽酶的PBS缓冲液中抑肽酶的浓度为2U/mL。
进一步限定，步骤三中所述薄片厚度为4mm～6mm。
进一步限定，步骤四①中所述冻融缓冲液由Tris-HCl和Triton X混合而成，pH为8，其中Tris-HCl的浓度为10mM，Triton X的质量浓度为1.5％～2％。
进一步限定，步骤五①中所述胰蛋白酶消化液的pH为8.6，胰蛋白酶的质量浓度0.25％～0.5％。
进一步限定，步骤六①中所述EDTA去污剂的pH为7.0～7.2，EDTA浓度为0.1mol/L～0.5mol/L。
进一步限定，步骤七①中所述核酸清除剂为含DNAse和RNAse的Tris-HCl缓冲液，其中DNAse的含量为50U/mL～80U/mL，RNAse的含量为2.5U/mL～5U/mL，Tris-HCl的浓度为50mM。
进一步限定，步骤四、五、六、七中所述含抑肽酶的PBS缓冲液中抑肽酶的浓度为1.5U/mL～2.5U/mL。
进一步限定，步骤四、五、六、七中含抑肽酶的PBS缓冲液中抑肽酶的浓度为2U/mL。
进一步限定，步骤八①中所述除菌剂为含过氧乙酸的PBS缓冲液，pH为7.2，其中过氧乙酸的质量浓度为0.1％～0.3％。
进一步限定，步骤九中所述真空冷冻干燥参数为，温度为-60～-80℃，真空度为15Pa～25Pa，时间为8h～16h。
进一步限定，步骤十中所述胃蛋白酶消化液的pH为2.8～3，其中胃蛋白酶的浓度为1mg/mL，盐酸的浓度为0.5M。
进一步限定，将步骤十得到的水凝胶在4℃下冷藏保存，得到流体形态的鹿茸软骨基质水凝胶。
进一步限定，将步骤十得到的水凝胶在37℃水浴中加热10min～15min(模拟人体或动物体内环境)，得到胶冻状鹿茸软骨基质水凝胶。
本发明的一种温敏型鹿茸软骨基质水凝胶材料作为软骨组织修复应用于医药领域。
本发明与现有技术相比具有的显著效果如下：
1)本发明的处理方法相比现有鹿茸软骨脱细胞处理方法具有更好的细胞脱除效果，脱细胞处理未对胞外基质成分造成严重损失，脱细胞后的基质材料空隙均匀，血管管腔结构依然保留。
2)本发明制备的温敏型鹿茸软骨基质水凝胶对关节软骨修复和重建效果优异，4周时肉眼可见白色新生软骨，8周创面表面光滑与正常关节软骨几乎无差异。
3)本发明制备的温敏型鹿茸软骨基质水凝胶全皮层缺损治疗效果良好，伤口愈合速度快，基本无疤痕。
附图说明
图1为具体实施方式一步骤九得到的脱细胞后基质组织照片；
图2为对照组一未经脱细胞处理的鹿茸软骨组织；
图3为对照组二的组织照片；
图4为经具体实施方式一步骤九得到的脱细胞后基质组织和未经脱细胞处理的DNA含量对比图；
图5为具体实施方式一步骤九得到的脱细胞后基质材料的横切面SEM图片；
图6为具体实施方式一步骤九得到的脱细胞后基质材料的纵切面SEM图片；
图7为具体实施方式一4℃下流体形态水凝胶；
图8为具体实施方式一37℃下胶冻形态水凝胶；
图9为治疗组兔关节软骨损伤的治疗效果图；
图10为对照组兔关节软骨损伤的治疗效果图；
图11为大鼠全皮层缺损治疗效果对比图；
图12为兔桡骨大段骨缺损治疗效果对比图；
图13为细胞毒性检测柱形图；
图14为对照组的细胞毒性检测柱形图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的一种温敏型鹿茸软骨基质水凝胶材料的制备方法按以下步骤进行：
一、用真空泵将鹿茸中血液去除干净，然后沿纵向将鹿茸外皮进行切割，撕去外皮；
二、将步骤一处理后的鹿茸浸泡于含2U/mL抑肽酶的PBS缓冲液中，然后置于密闭加压装置(深海海底水压实验装置，济南思名特)中，于压力为100MPa，温度为30℃下保压15min；
三、用切片机将步骤二处理后的鹿茸切成5mm的薄片，然后用破骨机研磨至粒径为0.1mm，得到鹿茸骨泥；
四、①按料液比1：2将鹿茸骨泥和冻融缓冲液(10mM Tris-HCl，1.5wt％Triton X，pH为8)置于金属密闭容器中，于4℃下孵育3h，然后用液氮急冻45min，再在37℃水浴中解冻15min，去除上清液后重复操作3次；②去除上清液，按料液比1：5加入含2U/mL抑肽酶的PBS缓冲液，于4℃下振荡12h；
五、①去除上清液，按料液比1：5加入胰蛋白酶消化液(pH为8.6，胰蛋白酶浓度0.25wt％)，于37℃下振荡孵育，每隔3h更换一次胰蛋白酶消化液，共孵育24h，去除上清液后重复操作3次；②去除上清液，按料液比1：5加入含2U/mL抑肽酶的PBS缓冲液，于4℃下振荡12h；
六、①去除上清液，按料液比1：5加入EDTA去污剂(pH为7.0，EDTA浓度为0.1mol/L)，于4℃下振荡24h，去除上清液后重复操作3次；②去除上清液，按料液比1：5加入含2U/mL抑肽酶的PBS缓冲液，于4℃下振荡12h，重复3次；
七、①去除上清液，按料液比1：5加入核酸清除剂(60U/mL DNAse，2.5U/mL RNAse，50mM Tris-HCl)，于37℃下振荡24h，去除上清液后重复操作5次；②去除上清液，按料液比1：5加入含2U/mL抑肽酶的PBS缓冲液，于4℃下振荡12h，重复3次；
八、①去除上清液，按料液比1：5加入除菌剂(pH为7.2，过氧乙酸0.2.wt％)，于4℃下振荡24h，去除上清液后重复操作3次；②去除上清液，按料液比1：5加入无菌去离子水，于4℃下振荡24h，重复5次；
九、去除上清液后真空冷冻干燥，所述真空冷冻干燥参数为，温度为-80℃，真空度为15Pa，时间为16h，得到基质冻干粉；
十、按基质冻干粉的质量与胃蛋白酶消化液(pH为2.8，胃蛋白酶的浓度为1mg/mL，盐酸的浓度为0.5M)的体积的比为1：5将二者混合，于37℃下振荡消化72h，离心后取上清液于4℃下预冷处理3h，然后用冰NaoH溶液调整pH至7.2，得到温敏型鹿茸软骨基质水凝胶。
对照组一：不经具体实施方式一脱细胞处理的鹿茸软骨组织。
对照组二：本试验除了不进行具体实施方式一步骤二的处理，其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
对照组三：本试验与具体实施方式一不同的是：步骤六①中EDTA去污剂更换为SDS。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
检测试验
(一)脱细胞效果评价
1.组织学观察：分别取数片具体实施方式一步骤九得到的脱细胞后基质组织(处理组)与对照组一和对照组二的组织，用4％多聚甲醛固定，制作石蜡切片后进行常规HE染色，观察拍照，得到如图1所示的具体实施方式一步骤九得到的脱细胞后基质组织照片、如图2所示的对照组一(未经本实施方式脱细胞处理的鹿茸软骨组织)组织照片和如图3所示的对照组二的组织照片。
从图1～2的HE染色结果显示，鹿茸软骨组织在脱细胞前，发育成熟的软骨(存在典型的软骨陷窝)和软骨前体、间充质组织(细胞排列紧密，细胞核多数细长)混杂在一起，软骨间存在血管管腔结构。经过脱细胞处理，细胞已经完全从软骨、软骨前体、间充质组织中脱去，留下空隙均匀的基质材料，但血管管腔结构依然保留，说明脱细胞处理非常成功。从图1和图3对边可知，未经具体实施方式一步骤二加压处理的部分软骨陷窝中细胞内容物未完全除去，效果较差。
2.DNA含量及基质有效成分测定：
分别称取10mg具体实施方式一步骤九得到的脱细胞后基质组织(处理组)与未经本实施方式脱细胞处理的鹿茸软骨组织(对照组)，使用相应试剂盒进行羟脯氨酸、粘多糖及DNA浓度进行测定，得到如图4所示的DNA含量对比图。
从图4可知，处理组、对照组的DNA定量检测发现，脱细胞处理后处理组组织中DNA含量仅为对照组含量1.1％(28.16ng/mg干物质)，两者差异极其显著，说明脱细胞处理成功。但与此同时，羟脯氨酸(胶原蛋白含量标志物)和粘多糖在脱细胞处理前后差异不大，处理组分别为对照含量的86.6％和95.2％，差异不显著，说明脱细胞处理未对胞外基质成分造成严重损失。
3.脱细胞处理后基质超微结构观察：
对具体实施方式一步骤九得到的脱细胞后基质材料的横纵切面用扫描电镜观察，得到如图5所示的具体实施方式一步骤九得到的脱细胞后基质材料的横切面SEM图片和如图6所示的具体实施方式一步骤九得到的脱细胞后基质材料的纵切面SEM图片，从图5可以看出，软骨基质中含量丰富的网状结构适于软骨细胞生长，鹿茸软骨组织脱细胞基质材料中含有适于软骨细胞生长的横向陷窝系统。除此之外，从图6可以看出，鹿茸软骨基质中还有丰富的纵向管状系统(箭头所示)，非常适于血管侵入，这是鹿茸软骨组织中血管系统在脱细胞处理后遗留下来的结构。而软骨修复的最大难题是，软骨组织不含血管只能依靠渗透作用进行物质能量交换。鹿茸软骨基质这种天然的横向网状及纵向管状结构适于种子细胞的长入，正是良好的软骨组织修复材料来源。
4.将具体实施方式一得到的水凝胶在4℃下冷藏保存，得到流体形态的鹿茸软骨基质水凝胶(形态照片如图7所示)。将具体实施方式一得到的水凝胶在37℃水浴中加热10min～15min(模拟人体或动物体内环境)，得到胶冻状鹿茸软骨基质水凝胶(形态照片如图8所示)。
(二)关节软骨损伤修复效果评价
1.脱细胞基质材料治疗兔关节软骨损伤试验
通过手术制备兔关节软骨缺损模型(直径5mm，深3mm)，分别给予具体实施方式一得到的温敏型鹿茸软骨基质水凝胶填充治疗(治疗组)和不做治疗(对照组)。于4周，8周处死动物取材观察。得到如图9所示的治疗组的治疗效果图和如图10所示的对照组的治疗效果图，从图9～10可以看出，治疗组4周时肉眼可见白色新生软骨，8周创面表面光滑与正常关节软骨几乎无差异。组织切片也进一步证实，4周治疗组创面上层充满了新生的软骨组织，下层正在进行软骨内成骨。8周上层关节软骨修复完成，同时下层关节软骨下骨重建也已完成。
2.脱细胞基质水凝胶治疗大鼠全皮层缺损
制备大鼠全皮层缺损模型，分别给予具体实施方式一得到的温敏型鹿茸软骨基质水凝胶填充治疗(治疗组)，重组人表皮生长因子凝胶(阳性对照，易孚)以及不做治疗(对照组)。间隔三天观察一次，得到如图11所示的治疗效果对比图，从图11可以看出，治疗组伤口可以很快的皱缩结痂，伤口愈合速度明显优于对照组，与易孚治疗组几乎无差异，15天时伤口已基本愈合，但对照组依然保留疤痕。
3.脱细胞基质冻干粉治疗兔大段骨缺损
制备兔桡骨大段骨缺损模型，骨缺损长度为1cm，分别给予具体实施方式一步骤九得到的鹿茸软骨基质冻干粉(治疗组)，猪软骨脱细胞基质(阳性对照)以及不做治疗(对照组)。分别于2月、4月后处死动物，得到如图12所示的治疗效果对比图，从图12可以看出2月时，对照组桡骨缺损处有少量骨痂出现，但大段区域为空白无新骨生成。阳性对照组可见部分新骨生成但桡骨髓腔为开放，缺损区域可见明显的较大空白区，治疗组缺损区域已完全封闭由新生骨填充，但是缺损中央处骨痂较薄。4月时，对照组骨痂已完全停止生长变得光滑圆润，两侧骨痂间保留大段骨缺损。阳性对照组两侧新生骨痂基本相连，但缺损区域未完全由新骨填充。治疗组已完全由新骨填充，完成兔桡骨大段骨缺损修复。
4.细胞毒性检测
根据ISO 10993-5和ISO 10993-12，将具体实施方式一步骤九得到的脱细胞基质冻干粉和对照组三步骤九后的基质冻干粉按照一定比例添加至正常DMEM(含10％胎牛血清)培养基中，37℃下培养24h，制备基质(ECM)浸出液。按照不同浓度梯度进行稀释后，利用MTT试剂盒检测ECM浸出液对大鼠骨髓间充值干细胞增殖的影响，得到如图13所示的细胞毒性检测柱形图和如图14所示的对照组的细胞毒性检测柱形图，从图13可以看出，浸出液对大鼠间充质干细胞的增殖无影响，其中25％，50％浸出液培养组细胞增殖速度率高于正常培养组(不添加具体实施方式一步骤九得到的脱细胞基质冻干粉的DMEM培养基)，100％浸出液培养组与正常培养组无显著差异。即本方案制备的ECM无细胞毒性。从图14可以看出，100％浸出液培养组细胞增殖速度显著低于正常培养基组，25％及50％浸出液培养组与正常培养组相比无显著差异。由此可见本方案将去污剂由SDS替换为EDTA，避免了SDS残留于基质中，降低基质的细胞毒性。

Claims (10)

1.一种温敏型鹿茸软骨基质水凝胶材料的制备方法，其特征在于，该制备方法按以下步骤进行：
一、将鹿茸中血液去除干净，然后去除外皮；
二、将步骤一处理后的鹿茸浸泡于含抑肽酶的PBS缓冲液中，然后置于密闭加压装置中，于压力为80MPa～120MPa，温度为25～35℃下保压10min～15min；
三、将步骤二处理后的鹿茸切成薄片，然后研磨至粒径为0.07mm～0.16mm，得到鹿茸骨泥；
四、①按料液比1：(1～2)将鹿茸骨泥和冻融缓冲液置于金属密闭容器中，于3～5℃下孵育2h～4h，然后用液氮急冻30min～75min，再在35～40℃水浴中解冻15min～45min，去除上清液后重复操作2～3次；②去除上清液，按料液比1：(5～8)加入含抑肽酶的PBS缓冲液，于3～5℃下振荡8h～12h；
五、①去除上清液，按料液比1：(3～5)加入胰蛋白酶消化液，于35～40℃下振荡孵育，每隔2h～4h更换一次胰蛋白酶消化液，共孵育24h～36h，去除上清液后重复操作2～3次；②去除上清液，按料液比1：(5～8)加入含抑肽酶的PBS缓冲液，于3～5℃下振荡8h～12h；
六、①去除上清液，按料液比1：(3～5)加入EDTA去污剂，于3～5℃下振荡12h～36h，去除上清液后重复操作2～3次；②去除上清液，按料液比1：(5～8)加入含抑肽酶的PBS缓冲液，于3～5℃下振荡8h～12h，重复2～3次；
七、①去除上清液，按料液比1：(3～5)加入核酸清除剂，于35～40℃下振荡12h～36h，去除上清液后重复操作3～5次；②去除上清液，按料液比1：(5～8)加入含抑肽酶的PBS缓冲液，于3～5℃下振荡8h～12h，重复2～3次；
八、①去除上清液，按料液比1：(3～5)加入除菌剂，于3～5℃下振荡12h～36h，去除上清液后重复操作2～3次；②去除上清液，按料液比1：(5～8)加入无菌去离子水，于3～5℃下振荡12h～24h，重复3～5次；
九、去除上清液后真空冷冻干燥，得到基质冻干粉；
十、按基质冻干粉的质量与胃蛋白酶消化液的体积的比为1：(5～10)将二者混合，于35～40℃下振荡消化36h～72h，离心后取上清液于3～5℃下预冷处理2h～4h，然后用冰NaoH溶液调整pH至7.2～7.4，得到温敏型鹿茸软骨基质水凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种温敏型鹿茸软骨基质水凝胶材料的制备方法，其特征在于，步骤三中所述薄片厚度为4mm～6mm。
3.根据权利要求1所述的一种温敏型鹿茸软骨基质水凝胶材料的制备方法，其特征在于，步骤四①中所述冻融缓冲液由Tris-HCl和Triton X混合而成，pH为8，其中Tris-HCl的浓度为10mM，Triton X的质量浓度为1.5％～2％。
4.根据权利要求1所述的一种温敏型鹿茸软骨基质水凝胶材料的制备方法，其特征在于，步骤五①中所述胰蛋白酶消化液的pH为8.6，胰蛋白酶的质量浓度0.25％～0.5％。
5.根据权利要求1所述的一种温敏型鹿茸软骨基质水凝胶材料的制备方法，其特征在于，步骤六①中所述EDTA去污剂的pH为7.0～7.2，EDTA浓度为0.1mol/L～0.5mol/L。
6.根据权利要求1所述的一种温敏型鹿茸软骨基质水凝胶材料的制备方法，其特征在于，步骤七①中所述核酸清除剂为含DNAse和RNAse的Tris-HCl缓冲液，其中DNAse的含量为50U/mL～80U/mL，RNAse的含量为2.5U/mL～5U/mL，Tris-HCl的浓度为50mM。
7.根据权利要求1所述的一种温敏型鹿茸软骨基质水凝胶材料的制备方法，其特征在于，步骤八①中所述除菌剂为含过氧乙酸的PBS缓冲液，pH为7.2，其中过氧乙酸的质量浓度为0.1％～0.3％。
8.根据权利要求1所述的一种温敏型鹿茸软骨基质水凝胶材料的制备方法，其特征在于，步骤九中所述真空冷冻干燥参数为，温度为-60～-80℃，真空度15Pa～25Pa，时间为8h～16h。
9.根据权利要求1所述的一种温敏型鹿茸软骨基质水凝胶材料的制备方法，其特征在于，步骤十中所述胃蛋白酶消化液的pH为2.8～3，其中胃蛋白酶的浓度为1mg/mL，盐酸的浓度为0.5M。
10.如权利要求1～9任意一项权利要求所述的一种温敏型鹿茸软骨基质水凝胶材料的应用，其特征在于，将温敏型鹿茸软骨基质水凝胶材料作为软骨组织修复材料应用于医药领域。
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