CN116440329A - 用于修复软骨的脱细胞软骨基质支架和凋亡小体组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种用于修复软骨的脱细胞软骨基质支架和凋亡小体组合物及其制备方法，组合物包括：微孔支架，支撑件包括脱细胞软骨外基质和交联的有机聚合物；凋亡小体，凋亡小体存在于微孔支架；其中，基于体积3.14mm³的微孔支架，包含0.01‑0.02ug的凋亡小体。本申请的合支架可以提高凋亡小体活性，延长凋亡小体的作用时间，达到缓释的效果，还可以调控关节腔微环境，有效促进关节软骨修复，提高了损失软骨的修复效果，避免了传统外源性细胞移植所带来的安全隐患。

Description

用于修复软骨的脱细胞软骨基质支架和凋亡小体组合物及其 制备方法

技术领域

本申请属于医用材料技术领域，具体涉及一种用于修复软骨的脱细胞软骨基质支架和凋亡小体组合物及其制备方法。

背景技术

关节软骨，缺乏血管、神经及淋巴管组织，一旦受到损伤很难实现自我修复，严重的会导致骨关节炎。随着社会全民健身锻炼的普及，关节软骨损伤的病人越来越多，年龄趋向于年轻化。

相关技术中，关节软骨损伤主要采用手术治疗，包括关节清创术、微骨折术、自体骨膜移植、自体骨软骨移植和自体软骨细胞移植等。手术治疗为患者带来了诸多不便，亟需一种新的手段或用品对损失的软骨进行修复。

发明内容

鉴于此，本申请提供一种用于修复软骨的脱细胞软骨基质支架和凋亡小体组合物及其制备方法，旨在提供一种组合物，可以有效调控关节腔微环境并促进关节软骨修复。

第一方面，本申请实施例提供了一种用于修复软骨的脱细胞软骨基质支架和凋亡小体组合物，包括：

微孔支架，包括脱细胞软骨外基质和交联的有机聚合物；

凋亡小体，所述凋亡小体存在于所述微孔支架；

其中，基于体积3.14mm³的所述微孔支架，包含0.01-0.02ug的凋亡小体。

根据本申请的一方面的实施例，基于所述微孔支架的总重，包含95-99％的脱细胞软骨外基质和1-5％的交联的有机聚合物。

根据本申请的一方面的实施例，交联的有机聚合物的原料包括碳二亚胺和N-羟基磺酰亚胺。

根据本申请的一方面的实施例，脱细胞软骨外基质构成多孔的支撑件，所述交联的有机聚合物分布于支撑件表面和至少部分孔隙中。

根据本申请的一方面的实施例，基于体积3.14mm³的所述微孔支架，包含10⁴-10⁷个的凋亡小体。

根据本申请的一方面的实施例，组合物满足下列条件中至少一项：

所述凋亡小体来源于人脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或其组合；

所述凋亡小体的粒径为200-4800nm；

所述脱细胞软骨外基质来源于猪、牛、马或其组合。

第二方面，本申请实施例提供了一种用于修复软骨的脱细胞软骨基质支架和凋亡小体组合物的制备方法，包括：

分别提供脱细胞软骨外基质溶液和凋亡小体溶液；

将所述脱细胞软骨外基质溶液进行冷冻干燥，得到微孔固相基体；

将所述微孔固相基体与有机聚合物溶液混合，在加热的条件下进行交联，得到包含经交联的有机聚合物的微孔支架；

将所述凋亡小体溶液分散于所述微孔支架的至少部分微孔，得到第一方面的组合物。

根据本申请的一方面的实施例，

凋亡小体溶液的浓度为0.8-1.2μg/ml，可选为1μg/ml。

根据本申请的一方面的实施例，

得到包含经交联的有机聚合物的微孔支架之后，还包括：用缓冲液冲洗经交联的所述微孔支架并进行灭菌。

根据本申请的一方面的实施例，

凋亡小体溶液包括缓冲液，所述缓冲液选自包含第二溶质，所述第二溶质选自磷酸盐、氯化钠或其组合。

与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：

本申请提供的用于修复软骨损伤的组合物，利用脱细胞软骨外基质和缓冲液制备出具有微孔的支架结构，交联后的微孔支架强度更适宜使用，凋亡小体与微孔支架相互配合，一方面可以提高凋亡小体活性，延长凋亡小体的作用时间，达到缓释的效果，另一方面，两者相互搭配可以调控关节腔微环境，有效促进关节软骨修复，提高了损失软骨的修复效果，避免了传统外源性细胞移植所带来的安全隐患。本申请的制备方法工艺简单，可操作性强，适宜批量生产。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据附图获得其他的附图。

图1示出了本申请实施例1制得的凋亡小体的透射电镜图；

图2示出了本申请实施例1制得的凋亡小体表达的蛋白电泳图；

图3示出了本申请实施例1制得的凋亡小体粒径分布图；

图4示出了本申请实施例1凋亡小体特异性蛋白染色图；

图5示出了本申请实施例大鼠骨软骨修复效果对比图；

图6示出了本申请实施例大鼠骨软骨修复评分图；

图7示出了本申请实施例大鼠骨软骨6周时修复切片染色图；

图8示出了本申请实施例大鼠骨软骨修复12周时切片染色图；

图9示出了本申请实施例软骨修复评分图。

具体实施方式

为了使本申请的申请目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本申请，并非为了限定本申请。

为了简便，本申请仅明确地公开了一些数值范围。然而，任意下限可以与任何上限组合形成未明确记载的范围；以及任意下限可以与其它下限组合形成未明确记载的范围，同样任意上限可以与任意其它上限组合形成未明确记载的范围。此外，尽管未明确记载，但是范围端点间的每个点或单个数值都包含在该范围内。因而，每个点或单个数值可以作为自身的下限或上限与任意其它点或单个数值组合或与其它下限或上限组合形成未明确记载的范围。

在本申请的描述中，需要说明的是，除非另有说明，“以上”、“以下”为包含本数，“一种或多种”中的“多种”的含义是两种及其两种以上。

本申请的上述申请内容并不意欲描述本申请中的每个公开的实施方式或每种实现方式。如下描述更具体地举例说明示例性实施方式。在整篇申请中的多处，通过一系列实施例提供了指导，这些实施例可以以各种组合形式使用。在各个实例中，列举仅作为代表性组，不应解释为穷举。

关节软骨，缺乏血管、神经及淋巴管组织，一旦受到损伤很难实现自我修复，最终会导致骨关节炎的发生。随着社会全民健身锻炼的普及，关节软骨损伤的病人越来越多，年龄趋向于年轻化。

关节软骨损伤的手术治疗主要包括关节清创术、微骨折术、自体骨膜移植、自体骨软骨移植和自体软骨细胞移植等。关节清创术的长期治疗效果不理想且复发率高。微骨折术后的新生组织并不是透明软骨，而是纤维软骨样修复，其结构和功能均欠佳。自体游离骨膜移植常取用胫骨前方的骨膜，但骨膜形成软骨面的能力受多种因素影响，比如年龄、供体的位置、移植的方向等，预期治疗效果很难确定。自体软骨移植对于小面积的软骨损伤具有良好的修复效果，但供区限制多，异体软骨移植来源虽然广泛，但由于移植排斥反应及疾病传播的风险，难以实现规模性临床应用。

基于此，发明人进行了大量的研究，旨在提供一种修复软骨损伤的组合物，在解决上述问题的同时，可以高效修复软骨损伤。

用于修复软骨的脱细胞软骨基质支架和凋亡小体组合物第一方面，本申请提供了一种用于修复软骨的脱细胞软骨基质支架和凋亡小体组合物，包括：

微孔支架，包括脱细胞软骨外基质和交联的有机聚合物；

凋亡小体，凋亡小体存在于微孔支架；

其中，基于体积3.14mm³的微孔支架，包含0.01-0.02ug的凋亡小体。

囊泡包括外泌体、凋亡小体，凋亡囊泡。经研究发现，与微骨折等传统修复技术相比，干细胞有潜力形成更典型的透明软骨，并且可以更好地控制软骨损失的症状。与自体软骨细胞相比，干细胞具有更广泛的来源和更强的体外扩增能力，但是，使用干细胞的可能带来体外运输和储存过程中的干性丢失、干细胞的致瘤性、干细胞的免疫性、干细胞治疗难以标准化等问题。经研究发现，不能将活细胞视为临床应用的现成产品。而干细胞旁分泌因子代替干细胞治疗，可克服活细胞治疗的不足，提供了一种无细胞的临床上可行的疗法。与传统的干细胞治疗相比，干细胞旁分泌因子等特点。目前研究较多的干细胞外泌体具有类似干细胞的软骨修复作用。

进一步研究发现，细胞凋亡小体在组织再生和胚胎发生过程中具有易渗透入组织，低免疫源性，易储存的特点。细胞凋亡后产生的凋亡小体，包含多种活性小分子物质，促进邻近细胞的修复再生。研究发现外源性干细胞移植后绝大多数移植细胞在短期内发生凋亡，表明干细胞移植仍发挥了一定的效应。

本申请的技术方案，采用脱细胞软骨外基质支架(DCM)与凋亡小体相互作用，具有较好地促进软骨再生修复的作用。此外，临床使用中，可以采用患者自身的软骨细胞进行制备。

在一些实施例中，基于微孔支架的总重，包含95％-99％的脱细胞软骨外基质。上述质量分数的脱细胞软骨外基质存在于软骨基质中，一方面可以实现支架的支撑的作用，另一方面，合适的质量分数脱细胞软骨外基质可以具有促进细胞黏附、增殖以及成软骨分化的作用。

在一些实施例中，交联的有机聚合物的原料包括碳二亚胺和N-羟基磺酰亚胺。

在一些实施例中，脱细胞软骨外基质构成多孔的支撑件，所述交联的有机聚合物分布于支撑件表面和至少部分孔隙中。本申请的脱细胞软骨外基质一方面可以构成固相的支架结构，且其具有微孔；另一方面，交联的有机聚合物分布于支撑件表面和至少部分孔隙可以有效提高支撑件的机械强度，有利于后续使用。

在一些实施例中，基于体积3.14mm³的微孔支架，包含(10⁴)-(10⁷)个的凋亡小体。在体积合适的微孔支架中负载合适浓度的凋亡小体，一方面可以提高凋亡小体与微孔支架的联合作用效果，另一方面可以保持凋亡小体的活力，可以达到长效持续地修复和调控微环境。

在一些实施例中，凋亡小体的制备方法包括：对人脐带间充质干细胞进行细胞凋亡诱导，并在完全培养基中继续培养；

取完全培养基中的上清液，从所述上清液中得到凋亡小体。

在一些实施例中，对人脐带间充质干细胞进行细胞凋亡诱导的时机为人脐带间充质干细胞在增殖后，在贴壁培养中的密度为80-90％。一般来说，培养初期采用密度为50％作用进行培养。

在一些实施例中，采用星形孢菌素staurosporine(STS)、紫外线照射或其组合；可以对人脐带间充质干细胞进行细胞凋亡诱导。

在一些实施例中，凋亡小体表达有蛋白Histone H3.3、蛋白Histone H2B、蛋白C3b、蛋白C1QC。上述蛋白为鉴定凋亡小体独特的蛋白，通过这些蛋白可以判定这些囊泡为凋亡小体。

在一些实施例中，凋亡小体的形貌为球形。

在一些实施例中，凋亡小体为干细胞来源。

根据本申请实施例，凋亡小体可以通过激活细胞的能量代谢促进细胞增殖、迁移、巨噬细胞的表型改变；组合物中的凋亡小体和微孔支架由于不含有活细胞，能避免使用外源性细胞移植带来的安全隐患，生物安全性高；凋亡小体与脱细胞软骨外基质结合方式有效调节了软骨再生微环境促进了受损软骨的修复。

在一些实施例中，组合物满足下列条件中至少一项：

凋亡小体来源于人脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或其组合；上述来源的凋亡小体，具有更佳的修复软骨能和且活性较强。

凋亡小体的粒径为200-4800nm；上述粒径的凋亡小体更易于附着于微孔支架，且易被内源性干细胞及巨噬细胞吞噬，进而发挥促软骨再生修复的作用。

脱细胞软骨外基质来源于猪、牛、马或其组合。

在一些实施例中，交联的聚合物可以通过碳二亚胺和N-羟基磺酰亚胺交联制得，交联的方式可以为真空干热物理方法交联，紫外线交联。交联的条件可以为在醛类化合物交联1h～48h，还可以为在碳化二亚胺类化合物交联1h～48h。

第二方面，本申请提供了一种用于修复软骨的脱细胞软骨基质支架和凋亡小体组合物的制备方法，包括：

分别提供脱细胞软骨外基质溶液和凋亡小体溶液；

将所述脱细胞软骨外基质溶液进行冷冻干燥，得到微孔固相基体；

将所述微孔固相基体与有机聚合物溶液混合，在加热的条件下进行交联，得到包含经交联的有机聚合物的微孔支架；

将所述凋亡小体溶液分散于所述微孔支架的至少部分微孔，得到所述组合物。

在一些实施例中，脱细胞软骨外基质溶液中包括悬浮液，悬浮液包含第一溶质，第一溶质选自磷酸盐、氯化钠或其组合。

在一些实施例中，悬浮液的浓度为0.5％-2％。本申请中的固相悬浮液可以在冷冻干燥后使脱细胞软骨外基质构成的结构具有微孔，可以使其在后期使用过程中，提高其修复和调控能力，还可以提高凋亡小体的活性。

根据本申请实施例，通过将脱细胞软骨外基质溶液进行冷冻干燥，一方面可以有效保留脱细胞软骨外基质的活性，便于其后期作用于受损软骨，另一方面，可以使脱细胞软骨外基质溶液中部分溶剂被去除，得到的固态物具有很多微孔，便于后续凋亡小体的缓释和作用。

在一些实施例中，凋亡小体溶液的浓度为0.8-1.2μg/ml，可选为1μg/ml。通过选用浓度为0.8-1.2μg/ml的凋亡小体，可以使其保持活性，还可以提高其修复软骨和调控软骨微环境的效果。

在一些实施例中，得到包含经交联的有机聚合物的微孔支架之后，还包括：用缓冲液冲洗经交联的微孔支架并进行灭菌。

实施例

下述实施例更具体地描述了本申请公开的内容，这些实施例仅仅用于阐述性说明，因为在本申请公开内容的范围内进行各种修改和变化对本领域技术人员来说是明显的。除非另有声明，以下实施例中所报道的所有份、百分比、和比值都是基于重量计，而且实施例中使用的所有试剂都可商购获得或是按照常规方法进行合成获得，并且可直接使用而无需进一步处理，以及实施例中使用的仪器均可商购获得。

实施例1

凋亡小体的制备：从新生儿脐带提取的生长状态良好的人脐带间充质干细胞，经过解放军总医院伦理委员会的认可，在人脐带间充质干细胞汇合度达到80-90％时，采用staurosporine(STS)诱导细胞凋亡，继续在完全培养基中培养24小时，取细胞培养上清使用300g离心10分钟，继续取上清使用12000g 4℃离心30分钟，所得沉淀物为干细胞凋亡小体。

采用JEOL公司JEM-1200EX型透射电子显微镜对沉淀物进行检测，观察凋亡小体，得到如图1所示的透射电镜图，其形貌为圆球形；对制得的凋亡小体采用WB(免疫印迹法)进行验证，得到如图2所示的凋亡小体蛋白电泳图，图中第一列代表了人脐带间充质干细胞，第二列代表了凋亡小体；发现其表达Histone H3.3、Histone H2B、C3b、C1QC蛋白。采用动态光散射的方法对凋亡小体溶液检测，得到如图3凋亡小体粒径分布，颗粒大小200-4800nm。

实施例2

制备猪来源脱细胞软骨外基质：从市场获取的新鲜猪股骨，用手术刀削取其股骨内外髁及股骨头的关节软骨。无菌蒸馏水洗涤3次后将软骨碎片用1％乙酸浸泡3次/30分钟，无菌蒸馏水漂洗3次，每次30分钟，-80℃冻存。然后用双氧水500ml浸泡2次，每次1小时，蒸馏水泡洗5次，每次20分钟，-80℃冻存。解冻后软骨块加去离子水洗2次，每次10分钟，然后加预冷去离子水至粉碎杯中彻底粉碎，充分粉碎后以1000转/分钟离心10分钟取上清，沉淀加水混匀后反复多次离心取上清。将收集的上清以6000转/分钟离心30分钟，收集上层无细胞分层，以10000转离心40分钟得到沉淀，即细胞软骨细胞外基质。

将收集的沉淀用50u/ml DNA酶+1U/ml RNA酶溶液混匀放置4℃，4小时后再次10000rpm的速度离心40分钟，得到4％脱细胞软骨外基质(decellularized cartilagematrix,DCM)。

实施例3

微孔支架的制备方法：用无菌蒸馏水充分洗涤实施例2制备的DCM，然后加蒸馏水制成0.5％-2％w/v的悬浮液。

将上述悬浮液置于圆柱形模具中，在-20℃下冷冻12小时，在-80℃下冷冻1小时，然后在冷冻干燥机中冻干48小时。

将冷冻干燥的支架浸入碳化二亚胺类化合物与N-羟基琥珀酰亚胺的混合水溶液中交联1h～48h，用蒸馏水浸泡从支架上洗掉多余的交联液。并通过干燥，裁剪产生直径为2mm且厚度为约1mm的微孔支架，并最终通过在5mRad的⁶⁰Coγ射线照射进行灭菌。

实施例4

用于修复软骨的脱细胞软骨基质支架和凋亡小体组合物的制备：将溶于磷酸盐缓冲液的实施例1凋亡小体通过蛋白定量(BCA法)后，使用微量注射器在每个支架(直径为2mm且厚度为约1mm)滴注20μl(1μg/ml)凋亡小体悬浮液，随即植入大鼠膝关节腔软骨缺损，之后分别在第3、7、14天向大鼠手术关节腔内注射凋亡小体(1μg/ml)20μl。

测试部分

1)凋亡小体特异性蛋白-膜联蛋白荧光染色：采用浓度1μg/ml的Annexin V-FITC染料对实施例1制得的凋亡小体进行染色，得到如图4所示的图片，说明了凋亡小体可以被Annexin V染色，还说明了凋亡小体为球形囊泡。

2)大鼠骨软骨修复实验：采用随机对照分组方法，对圣水金蟾有限公司来源的雄性SD大鼠，每组鼠的体重和个数分别为250g±50g(n＝5)，对其使用一个直径为2mm的角膜环钻在股骨滑车沟中进行钻孔，以形成深度为1.5mm的全层圆柱形骨软骨缺损，分别对不同组的大鼠进行处理，分为不进行处理的对照组(control)、用实施例1的凋亡小体处理的Abs组、用实施例2脱细胞软外基质处理的DCM组，用实施例4的组合物处理的DCM+Abs组，除对照组合DCM组外，其他两组分别在手术过程中和术后3、7、14天关节腔内注射1μg/ml ABs 20μl。，手术处理后6周和12周经过取材拍照，得到的效果如图5所示，从图中可知，实施例4的用于修复软骨的脱细胞软骨基质支架和凋亡小体组合物处理的DCM+Abs组效果最好。

采用国际软骨修复协会(ICRS)制定的评分规则，对大鼠骨软骨修复实验的效果进行大体观软骨修复评分，得到图6所示的结果，评分越高，效果越好，从处理6周后和12周后的效果可知，实施例的组合物对软修复的效果最佳。

4)染色切片实验：分别用染色剂HE、番红O固绿、Ⅱ型胶原对大鼠的膝关节滑车石蜡切片进行染色得到的效果如图7和图8所示，从图中可知，实施例4的组合物处理的DCM+Abs组效果最好。

采用改良O'Driscoll组织学评分，对切片中的软骨修复组织学评分，得到图9所示的结果，评分越高，效果越好，从处理6周后和12周后的效果可知，实施例的用于修复软骨的脱细胞软骨基质支架和凋亡小体组合物对软修复的效果最佳。

以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种用于修复软骨的脱细胞软骨基质支架和凋亡小体组合物，包括：

微孔支架，包括脱细胞软骨外基质和交联的有机聚合物；

凋亡小体，所述凋亡小体存在于所述微孔支架；

其中，基于体积3.14mm³的所述微孔支架，包含0.01-0.02ug的凋亡小体。

2.根据权利要求1所述组合物，其特征在于，基于所述微孔支架的总重，包含95-99％的脱细胞软骨外基质和1-5％的交联的有机聚合物。

3.根据权利要求1所述组合物，其特征在于，所述交联的有机聚合物的原料包括碳二亚胺和N-羟基磺酰亚胺。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的组合物，其特征在于，所述脱细胞软骨外基质构成多孔的支撑件，所述交联的有机聚合物分布于支撑件表面和至少部分孔隙中。

5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，

基于体积3.14mm³的所述组合物，包含10⁴-10⁷个的凋亡小体。

6.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物满足下列条件中至少一项：

所述凋亡小体来源于人脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或其组合；

所述凋亡小体的粒径为200-4800nm；

所述脱细胞软骨外基质来源于猪、牛、马或其组合。

7.一种用于修复软骨的脱细胞软骨基质支架和凋亡小体组合物的制备方法，包括：

分别提供脱细胞软骨外基质溶液和凋亡小体溶液；

将所述脱细胞软骨外基质溶液进行冷冻干燥，得到微孔固相基体；

将所述微孔固相基体与有机聚合物溶液混合，在加热的条件下进行交联，得到包含经交联的有机聚合物的微孔支架；

将所述凋亡小体溶液分散于所述微孔支架的至少部分微孔，得到所述组合物。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述凋亡小体溶液的浓度为0.8-1.2μg/ml，可选为1μg/ml。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述得到包含经交联的有机聚合物的微孔支架之后，还包括：用缓冲液冲洗经交联的所述微孔支架并进行灭菌。

10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述凋亡小体溶液包括缓冲液，所述缓冲液选自包含第二溶质，所述第二溶质选自磷酸盐、氯化钠或其组合。