JP2015511491A - バイオエンジニアリングによって作製された同種異系血管 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、その内容全体が本明細書に組み込まれる2012年3月16日出願の米国仮出願第61/611,810号の優先権および利益を主張するものである。
本発明は、血管を脱細胞化するための方法および材料を提供する。本明細書で使用される場合、「脱細胞化」とは、細胞外マトリックス(ECM)足場の3次元構造が残存するように血管から細胞を除去するプロセスを指す。物理的方法ならびに化学的作用剤および生物学的作用剤を組み合わせて使用して細胞を溶解し、多くの場合、その後にすすぐ工程を続けて細胞残余物および壊死組織片を除去する。有効な脱細胞化は、組織の密度および組織化、最終産物に望ましい幾何的性質および生物学的性質、ならびに標的化臨床的適用などの因子によって規定される。ECMの完全性を保存しながら血管を脱細胞化し、当業者が、例えば、プロセスの間に特定の作用剤および技法を選択することによって生物活性を最適化することができる。
本発明は、再生された血管を生成するための材料および方法を提供する。再生された血管は、本明細書に記載のドナー由来の脱細胞化した血管を細胞の集団と接触させ、前記細胞の集団を脱細胞化した血管上で、およびその中で培養することによって作製することができる。本明細書で使用される場合、「再細胞化」とは、細胞を脱細胞化した血管またはECM足場に導入または送達し、細胞を、細胞が増殖し、かつ/または分化して、最終的に正常な血管のものと同様の構築様式、細胞組織化、および生物活性を有する血管が再生されるように培養するプロセスを指す。
骨髄を使用してバイオエンジニアリングによって作製された血管
この実施例では、EHPVOの10歳の女児における、自己由来の幹細胞を用いて再細胞化した脱細胞化ドナー静脈を使用したmeso Rex手順が記載されている。
1歳の女児が血小板減少症および脾腫を有することが発見された。彼女は特発性血小板減少性紫斑病(ITP)と有すると考えられ、地方の病院で数年にわたって経過観察された。彼女が9.5歳の時にさらに調査し、食道静脈瘤および脾腫が確認された。INRはわずかに上昇した。プロテインSおよびプロテインCについては正常なレベルが示され、APC抵抗性については除外された。彼女には、門脈圧亢進症を軽減するためにベータ遮断薬が投薬された。
進行中の感染症または他の疾患を有さない健康な30歳の臓器移植ドナーから9cmの静脈セグメントを取り出した。静脈の一端を開いたままにし、残りの開口部を縫合して漏出を予防した。静脈を0.5%ペニシリン、0.5%ストレプトマイシン、および0.5%アンホテリシンBを含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS)ですすいだ。最初に、組織を蒸留水(D/W)で72時間にわたってすすいだ。各脱細胞化サイクルは、1%トリトンXと一緒にインキュベートし(3時間)、その後1%トリnブチルホスフェートと一緒にインキュベートし(3時間)、1Mの塩化ナトリウム中0.004mg/mlのデオキシリボヌクレアーゼIと一緒にインキュベートする(全てSigma、Gothenburg、Sweden)(3時間)ことからなった。グラフトの一端を開いたままにし、他方をクランプし、内腔に1%トリトンX(Sigma、Gothenburg、Sweden)を満たした。次いで、他方の端をクランプし、撹拌器に入れ、37℃で3時間穏やかに振とうした。インキュベーション時間の最後に、検体の一端を開き、内腔の内容物を空にし、検体をPBSで洗浄した。トリnブチルホスフェート(Sigma)、およびDNase(Sigma)を用いた処理について同じ手順を続けた。最後に、検体を蒸留水で一晩洗浄して細胞壊死組織片を除去した。7サイクルを実行した。脱細胞化プロセスの最後に、グラフトをPBSで48時間連続して洗浄した(6時間ごとに交換した)。脱細胞化のために使用した溶液は全て上記の抗生物質を含有した。各サイクル後に、組織の小片を核、HLAクラスI抗原およびHLAクラスII抗原の存在についてスクリーニングし、標準の手順を使用して組織学的に検証した。
自己由来のレシピエント細胞を、レシピエントから得た骨髄20mlから調製した。骨髄をまずLymphoprepで分離し、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で3回洗浄した。内皮細胞を、CD133でコーティングしたMini MACSビーズを製造者の説明書に従って用いて単離した。トリパンブルーを使用して、得られたCD133+細胞の数を計数し、生存能力を試験した。CD133+細胞を、0.2%ゼラチンでコーティングした培養ウェル中、37℃、95%空気および5%CO2の加湿雰囲気中で培養した。完全培地の調製について:基本培地MCDB 131+10%熱失活ヒトAB血清、1%L-グルタミンおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシンにアスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、トランスフェリン、インスリン、組換えヒト血管内皮増殖因子、ヒト線維芽細胞増殖因子、ヒト上皮増殖因子、ヘパリンおよび硫酸ゲンタマイシンを含有するEGM-2 Single Quote Kit(Lonza、Walkersville、MD USA)を補充した。培地を2〜3日ごとに交換した。全てのウェルから集密した細胞をトリプシン処理によって剥離し、プールし、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回洗浄した。第1継代時に培養した自己由来のレシピエント内皮細胞を、2色免疫蛍光法を用いてVEカドヘリン、アセチル化LDLおよびフォン・ヴィルブランド因子について染色し、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を用いて対比染色して、内皮表現型を確認した後に、バイオリアクター内のマトリックスに付着させた。
内皮細胞を培養フラスコから剥離し、それらの成長に特異的な培地中に希釈し、マイクロシリンジを用いてマトリックスの内面に縦方向に適用した。グラフト表面1平方センチメートル当たりに播種したECの平均数は7.5×104個であった。開放端をクランプし、マトリックスを37℃で、5%CO2のロッキングローラーにおいた。3日後に、内面に平滑筋細胞分化培地に浮遊させた平滑筋細胞を同じ密度で播種し、さらに3日間インキュベートした。次いでマトリックスをバイオリアクター内に入れた。血清を伴わない内皮細胞培地(無血清培地)を内部に加え(25ml)、無血清SMC分化培地を外部に加え(25ml)、回転を毎分1〜5回転で開始した(37℃、5%CO2)。外部培地および内部培地を72時間ごとに取り換えた。抽出した培地を、微生物コロニー形成について市販のキット(Invitrogen、Sweden、Cat番号C-7028)を使用して試験した。バイオリアクター培養の総期間は2週間であった。
静脈グラフトの用意ができた日に手術を計画した。静脈グラフトは外科手術時にバイオリアクターから低温貯蔵溶液に移した。患者をMercedes様切開術で切り開き、肝靭帯および門を露出させた。臍から肝臓まで円形の靭帯を慎重に周囲から分離した。臍帯静脈が見いだされ、これは非常に小さく、部分的にのみ開通性であった。腹部の左側部分に静脈瘤が見いだされ、また拡大した脾臓が左側の季肋部を占めていた。静脈瘤は質が悪く、バイパスには適さなかった。手術前の頸静脈の長さは、バイパスのためには短すぎると推定されたので探査しなかった。
再灌流は順調であった。門脈において毎秒25〜30cmおよび動脈において毎秒40cmの良好な血流が手術中に測定され、超音波で確認された(図1D)。手術中の門脈圧は手順の開始時に20mm Hgであったが、門脈の再灌流後には測定しなかった。患者を、第1週には1日2回、次いで第2週には毎日、超音波を用いて経過観察した。血流は、一部の左門脈枝では毎秒80cmにまで達したが、右門脈では毎秒15cmの低流が見られた。外科手術の1週間後にCT血管造影を使用してグラフトを可視化し、開通性であることが見いだされた(図1E)。手術後の超音波により、手術後7日目に、門脈吻合の部位において血管壁の輪郭の変化が認められ、放射線科医はこの部位における血栓症を除外することができなかった。したがって、手術後、患者は毎日6回Heparin(登録商標)1000IEを静脈内に受け、1日2回超音波で経過観察され、この所見がモニタリングされた。数日後に、患者は創傷被覆材から出血し、ヘモグロビンが減少したが、輸血は必要なかった。同じ日にAPTTが>210であることが見いだされ、これはヘパリン処置によって引き起こされたと思われ、したがって、一時的に停止した。患者を最初の1ヶ月連続して、ドナー抗原、肝酵素についての逐次的な血液検査および超音波を使用した血流スピードの画像化の実施を伴ってモニタリングした。同様の試験を移植の3ヶ月後、6ヶ月後、9ヶ月後、および12ヶ月後に実施した。
抗内皮細胞抗体についてのスクリーニングを移植前および移植後の両方で実施した。血清試料を移植の1ヶ月前、1週間後、3週間後、1ヶ月後、3ヶ月後、6ヶ月後、9ヶ月後および12ヶ月後に収集した。それぞれの場合に、アンジオポエチン受容体Tie-2を発現している末梢血単核細胞(PBMC)を患者の血液試料から市販のXM-ONE(登録商標)キットを製造者(AbSorber AB、Stockholm、Sweden)の説明書に従って使用して新鮮に単離した。細胞をすぐにGuavaフローサイトメーター(Millipore、Gothenburg、Sweden)でGuava解析ソフトウェアを使用して解析した。いかなる抗体も有さないことが分かっている健康な輸血されていない血液型ABの男性由来の血清が陰性対照としての機能を果たした。多数回の輸血または臓器移植の結果として同種異系抗体が形成された患者由来の血清のプールを陽性対照として使用した。死体ドナー由来の凍結リンパ球も、上記の抗ドナーHLA抗体および抗内皮細胞抗体をスクリーニングするための標的として使用した。
トリトン、TnBPおよびDNaseを使用して、ドナー静脈は7サイクル後に首尾よく脱細胞化された。脱細胞化の前後の腸骨静脈の肉眼的形態が図2A〜Hに示されている。しかし、脱細胞化した静脈の構築様式はネイティブな対照とは異なった(図2B)。サイクル7の最後に、脱細胞化した静脈グラフトにおいて核またはHLAクラスI抗原またはHLAクラスII抗原の発現は見いだされなかった(図2F〜H)。脱細胞化手順全体には12日かかり、その最後に、静脈が首尾よく脱細胞化されたことが見いだされた(組織学的所見に基づいて)。患者の骨髄から単離されたCD133+幹細胞は、VE-カドヘリン、AcLDLおよびvWFを発現する成熟内皮細胞に非常に容易に分化した(図3)。同様に、平滑筋細胞を骨髄細胞から首尾よく成長させることができ、これは後に、アルファ-平滑アクチンおよびビメンチンを発現する細胞に分化した(図3)。ECおよびSMCの単離および増殖のための総時間はおよそ15日であった。
これらの結果により、脱細胞化したヒト腸骨静脈が自己由来の幹細胞を使用して上首尾に再細胞化されたことが実証され、これをその後、門脈血栓症の患者における上腸間膜静脈と肝内左門脈の間のバイパス手順のために使用した。
全血を使用した同種異系血管
生後の脈管形成は、循環している内皮前駆細胞(EPC)が寄与する成体における新しい血管の形成であり、血管新生は、既存の内皮細胞からの新しい血管の形成である。これらの2つのプロセスは、血管枝の形成、および創傷治癒、虚血、骨折治癒、腫瘍の成長などのような病原性の状態に寄与する。循環中では内皮細胞および内皮前駆細胞が共存しており、内皮前駆細胞は血管化に寄与する。さらに、血管における別の重要な細胞型である平滑筋細胞の前駆細胞も循環血液中に存在する。
静脈の脱細胞化
約7〜9cmのヒト腸骨静脈を死体の臓器ドナーから取り出し、抗生物質を伴う滅菌PBS中に保管し、実験室に輸送した。静脈をすぐに蒸留水で洗浄して、全血を除去した。静脈の末端の両方を蓋付きの接続器具に接続し、他の剥離、枝を縫合し、漏出を予防した。脱細胞化サイクルは、静脈を、1%トリトン-x 100(×100、Sigma、Sweden)、1%トリn-ブチルホスフェート(TNBP)(28726.291、VWR、Sweden)および4mg/LのデオキシリボヌクレアーゼI(DNase I)(D7291、Sigma、Sweden)を用い、各溶液と一緒に4時間ずつ、37℃、160RPMのスピードで、撹拌器内で撹拌することを含んだ。トリトン溶液およびTNBP溶液を、抗生物質ペニシリン200U/ml、ストレプトマイシン0.2mg/mlおよびアンホテリシン2ug/ml)(Sweden)、5mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)二ナトリウム塩二水和物(ED2SS、Sigma、Sweden)および0.4mMのフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)(93482、Sigma、Sweden)を含有する蒸留水中に調製した。塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを伴うDulbecos PBS(A12858、Life Tecnologies)中DNase I溶液を調製した。脱細胞化を9サイクル継続し、各サイクルの間に蒸留水を灌流することによって洗浄した。脱細胞化後、組織を、滅菌PBS中0.1%過酢酸を用いて1時間にわたって滅菌し、その後、滅菌蒸留水およびPBSを用い、各溶液につき24時間にわたって洗浄した。
9サイクル後に、脱細胞化した静脈から生検材料を取得し、免疫組織化学的検査、免疫蛍光法、DNA定量、ルミネックス、走査型電子顕微鏡および透過型電子顕微鏡レベルの分析、引っ張り強さおよび細胞外マトリックス定量のために処理した。
正常な、脱細胞化し、再細胞化した静脈生検材料を同じプロトコールに従って処理した。生検材料を4%緩衝ホルマリン中に48時間にわたって固定して、パラフィンブロックおよびcryoblock用のtissue tech OCTを調製し、液体窒素で凍結させた。厚さ5umのパラフィンおよび凍結切片を染色のために切り取った。パラフィン切片を下降性の一連のアルコール中で水分を元の状態に戻した後、ヘマトキシリン-エオシン(HE)染色、マッソントリクローム(MT)染色、vernhoeff von gieson(VVG)染色および免疫組織化学的検査を用いて染色した。HE染色では、スライドをMeyersヘマトキシリンおよびエオシンアルコール液中でそれぞれ7分および1分インキュベートし、その後、間に蒸留水を用いて10分洗浄し、後で脱水し封入した。MT(25088-1、Polysciences、Germany)染色およびVVG(25089-1、Polysciences、Germany)染色を製造者の説明書に従って実施した。
約20mgの正常な生検材料5つおよび脱細胞化した生検材料5つを5つの異なる静脈から収集し、DNeasy血液および組織キットプロトコール(69506、Qiagen、Sweden)に従ってDNAを単離した。nanodropを用いて存在するDNAの量を測定した。
血管新生増殖因子17種のパネルを、正常な静脈組織3つ、およびそれと比較して脱細胞化した静脈組織3つにおいて定量した。組織試料約30mgを取得し、総タンパク質を単離した(2140、Millipore、Germany)。タンパク質の量を、BSA標準物質のセットを用いてBradford法によって測定し、ELISAリーダー(Synergy2、Biotek、USA)を使用して595nmにおいて測定した。全ての組織のタンパク質量を、TM緩衝液(millipore)を用いて同じ濃度に正規化し、ルミネックスプレートにローディングした。ヒト血管新生/増殖因子磁気ビーズパネル1供給者のプロトコール(Millipore、Sweden)に従ってルミネックスを実施した。簡単に述べると、ルミネックスプレートを、アッセイ緩衝液200ulを用いて活性化した。正規化されたタンパク質25ul、標準物質および対照をそれぞれのウェルに加え、アッセイ緩衝液をブランクとして使用した。ウェル中の試料をアッセイ緩衝液25ulで希釈し、標準物質および対照をTM緩衝液25ulで希釈した。抗体をコーティングした磁気ビーズをボルテックスし、ビーズ25ulを全てのウェルに加え、穏やかなプレート振とう機において4℃で20時間インキュベートした。プレートを磁石上で1分静置し、洗浄緩衝液を用いて洗浄した。検出抗体25ulを加え、1時間インキュベートし、その後、ストレプトアビジン-フィコエリトリン25ulを加え、30分インキュベートした。後でプレートを洗浄説明書に従って洗浄緩衝液で洗浄し、シース液100ulを全てのウェルに加え、磁気ビーズを5分振とうすることによって懸濁させ、ルミネックスで読み取った。
コラーゲンおよびGAG定量を、Biocolor CompanyからのSircol Collagen Assay KitおよびBislycan GAGs Assay Kitを使用して行った。簡単に述べると、コラーゲンを、酢酸に溶解させたペプシンを24時間にわたって用いて、組織約20mgから抽出し、濃縮試薬を用いて濃縮し、精製した。抽出されたコラーゲンをsircol色素試薬1mlに浸し、その後、酸-塩洗浄試薬を用いて洗浄した。コラーゲン-色素ペレットをアルカリ試薬中に放出させ、555nmにおいて読み取った(Synergy2、Biotek、USA)。GAGを、組織20mgから、パパイン抽出試薬中、65℃で3時間にわたって抽出した。抽出されたGAGを振とう機においてbislycan色素試薬1mlに30分浸し、次いで、遠心分離してペレットGAG-色素複合体にした。結合した色素を色素解離試薬0.5ml中に放出させ、656nmにおいて読み取った(Synergy2、Biotek、USA)。コラーゲンおよびGAGを、キット内に供給された既知濃度のコラーゲンおよびGAGを用いた標準グラフに基づいて定量した。
静脈セグメントについて、Instron 5566(Instron、Norwood USA)を用いて張力試験した。前負荷は0.1Nであり、使用した試験スピードは毎分50mmであった。張力テスターの正確度は力が0.5%であり、伸長が0.5%である。静脈を幅がおよそ4mmの環状試料に切り取った。切片の最小幅をカリパスで測定し、記録した。2つの円柱状の5mmのグリップ(それぞれ高さ2.5mm、幅5mm)を環試料の内側に置いた後に、半径方向の変形を実施した。測定された力を、負荷を受ける部分である環の最小の幅で割ることによって力を正規化した(血管壁は不均一すぎると考えられたので、応力を算出しなかった)。前負荷後の試料の伸長も測定した。試料を完全に破壊するために使用した力の総計および力の総計の50%における伸長を算出した。
バイオリアクターを、静脈の寸法に応じて実験室において固有に調製した。バイオリアクターは、ポリエチレンチューブおよびシリコンチューブと接続したポリプロピレンチューブの囲まれた設定からなった。バイオリアクターおよびチューブを使用する前にオートクレーブ内で滅菌した。血液および培地を、蠕動ポンプを使用して毎分2mlのスピードで灌流した。
再細胞化当日に、血液30mlを健康なドナー(年齢群25〜35)それぞれから収集し、滅菌ヘパリンコーティングバキュテナーチューブ中に入れ、できるだけ早く実験室に輸送した。必要な血液量は血管の長さおよびパイプの長さに左右される。長さ9cm、直径1cmの静脈は、血液30mlを用いて再細胞化することができる。動脈または静脈から収集した血液のいずれも再細胞化のために使用することができる。
再細胞化プロセス全体を極めて滅菌条件下で実施し、灌流は全て、5%CO2を供給した37℃のインキュベーター内で行った。再細胞化の前に、静脈にヘパリン(Leo)をPBS 1ml当たり50IUの濃度で2時間灌流した。ヘパリンを流し出し、すぐに全血を毎分2mlのスピードで48時間灌流した。次いで、血液を流し出し、静脈を、1%ペニシリン-ストレプトマイシン-アンホテリシンを含有するPBSを用いて3〜5分、または血液が完全に除去されるまで洗浄した。その後、静脈に内皮培地および平滑筋培地を交互に12日間灌流した(各培地を3日間)。完全な内皮培地を、10%熱失活ヒトAB血清(34005100、Life technologies、Sweden)、1%グルタミン(25030、Lonza、Denmark)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン-アンホテリシンを補充したMCDB 131(10372、Life technologies、Sweden)基本培地、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、トランスフェリン、インスリン、組換えヒトVEGF、ヒト線維芽細胞増殖因子、ヒト上皮増殖因子、ヘパリンおよび硫酸ゲンタマイシンを含有するEGM2 single quote kit(CC-4176、Lonza、Denmark)を使用して調製した。完全な平滑筋培地を、10%熱失活ヒトAB血清、1%ペニシリン-ストレプトマイシンアンホテリシンを補充した培地231(M231、Life technologies、Sweden)500mlおよび平滑筋成長補充剤(SMGS)(S-007-25、Life Technologies、Sweden)20mlおよび平滑筋分化補充剤(SMDS)(S-008-5、Life technologies)5mlを使用して調製した。最初のサイクルのためには、SMGSのみを含有する平滑筋培地を使用し、第2のサイクルではSMGSおよびSMDSを両方使用した。
再細胞化の14日後に、静脈から生検材料を取得して、前に説明されている通りcryoblockおよびパラフィンブロックを調製した。内皮細胞の存在を可視化するために、CD31(1:1000)マーカーおよびVWF(1:100)マーカーを選択し、免疫蛍光法によって染色し、一方、平滑筋細胞を可視化するために、平滑筋アクチン(1:50)を免疫組織化学的検査によって染色した。再細胞化した静脈についても、前に説明されている通り機械的強度について張力を試験した。
静脈の脱細胞化
1%トリトンおよび1%TNBPを用いた撹拌と灌流の組合せによる脱細胞化により、腸骨静脈が9サイクルで首尾よく脱細胞化された。DVの肉眼的形態は、白色および半透明に見えたが、サイズの変化および漏出は見いだされなかった(図7)。HE染色、MT染色およびVVG染色によって組織学的分析を行った。9サイクル後に、全てのDVにおいて核の染色(HE-青色およびMT-黒色染色)は観察されなかった(図8、図9および図10)。
MT染色により、脱細胞化後に豊富な量のコラーゲンが存在することが示された(青色、図3)。VVE染色では、エラスチンおよび核は黒色になり、コラーゲンは赤色になる(図10)。VVE染色により、脱細胞化後にさえエラスチン環が存在することが観察された。DVにおける、主要なECMタンパク質であるラミニン、フィブロネクチン、IV型コラーゲンおよびI型コラーゲンについての免疫組織化学的検査染色によっても、重要なECMタンパク質が保存されていることが示された(図11および図12)。それぞれsircolアッセイおよびbislycanアッセイを用いたコラーゲンおよびGAGの定量によっても、脱細胞化後にコラーゲンおよびGAGの有意な減少は示されなかった(図13)。脱細胞化プロトコールにより、DNA量も、正常な静脈における組織1mg当たり193±ngから脱細胞化した静脈における15±8ng/mgまで減少した(図13)。ルミネックス、増殖因子レプチン、およびEGFによって試験した17種の血管新生増殖因子のうち、13種の増殖因子がDVになお存在した(図14)。DVに保持された増殖因子は少ないが減少倍率は7〜9分の1であった。脱細胞化した静脈において検出されなかった増殖因子は、正常な静脈では少量存在していた。これらの結果の全てにより、この脱細胞化したECMが再細胞化のための適切な足場になり得ることが示された。
バイオリアクターシステムを用いて、長さが7〜9cmの静脈5つを、血液を2日間、および内皮培地および平滑筋培地を交互に、各培地を3日間ずつ12日間用いて再細胞化した。再細胞化後の静脈の肉眼的形態はピンク色がかって見え、外膜を有した。静脈はバイオリアクターを用いて納得のいくように作動した。HEを用いた組織学的染色により、静脈の内層、中層および外層に多数の核が存在することが示された。MT染色によっても、黒色に染色された核および赤色の細胞質および青色のI型コラーゲンへの細胞の付着が存在することが確認された(図15、図16および図17)。
内皮細胞マーカーVWFを用いた免疫蛍光法染色により連続した緑色が示され、CD31抗体を用いた緑色の点在する出現により静脈の内膜に向かって内皮細胞が存在することが確認された(図18)。平滑筋アクチンを用いた免疫組織化学的検査染色によって、静脈の中層および外層全体にわたって紡錘状の平滑筋細胞が存在することも確認された(図19)。平滑筋細胞は静脈全体に分布し、内皮内膜のすぐ下に平滑筋細胞の薄い環が存在する。脱細胞化を、デオキシコール酸ナトリウムを用いて行った場合には同様の結果は得られなかった(図20、図21および図22)。
正常な静脈と比較した脱細胞化した静脈の引っ張り強さは、破壊するために必要な力および破壊される前に伸長する長さの減少を示し、これは、脱細胞化した静脈が抵抗し得る圧力の量が正常な静脈と比較して少ないことを示す。しかし、これらの性質はどちらも、再細胞化には回復し、正常な静脈に近づいた(図23)。
これらの実験により、ex vivoにおける全血を使用した静脈の3次元培養が実証された。このグラフト調製および手順のための技術は、血管疾患を有する患者において臨床使用するために安全であると考えられる。固有に調製したバイオリアクターシステムは組織の成長に役立ち、灌流の圧力が軽度であることに起因して、リアクターの内側の静脈が膨張したままに保たれ、したがって表面領域全体を栄養分に曝露させることができる。TNBPおよびトリトンを用いた腸骨静脈の脱細胞化により、ECMの構成成分および強度が保護された足場ももたらされた。しかし、静脈を脱細胞化するために必要なサイクルの数はドナー間、および組織内の位置間で変動する。これらの実験では、総腸骨静脈、外腸骨静脈および内腸骨静脈を使用した。総腸骨静脈では9サイクルかかり、外腸骨静脈および内腸骨静脈は7サイクル後に脱細胞化された。6〜7サイクルの灌流後に継続的にモニタリングすることが必要であり、脱細胞化手順は核が存在しなくなったらすぐに停止することができる。
Claims (33)
- 血管を再細胞化する方法であって、脱細胞化した血管に細胞の集団を導入する工程と、前記細胞の集団を脱細胞化した血管上で培養し、それにより、血管を再細胞化する工程とを含む方法。
- 前記細胞の集団が全血、骨髄、または幹細胞由来のものである、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞の集団が、内皮細胞および平滑筋細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記幹細胞がCD133+発現細胞である、請求項2に記載の方法。
- 前記細胞の集団をin vitroにおいて増殖させ、内皮細胞および平滑筋細胞に分化させた後に、脱細胞化した血管に内皮細胞および平滑筋細胞を導入する、請求項1に記載の方法。
- 脱細胞化した血管に細胞の集団を導入する工程が注射または灌流によるものである、請求項1に記載の方法。
- 培養する工程が、内皮細胞培地および平滑筋細胞培地の灌流を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記内皮細胞培地および平滑筋細胞培地の灌流を交互に実施する、請求項7に記載の方法。
- 交互に実施することを少なくとも2回繰り返す、請求項8に記載の方法。
- 細胞の集団を脱細胞化した血管上で培養する工程により、細胞の集団が内皮細胞および平滑筋細胞に分化する、請求項1に記載の方法。
- 前記内皮細胞が脱細胞化した血管の外側壁を覆い、平滑筋細胞が脱細胞化した血管の内腔壁を覆う、請求項10に記載の方法。
- 前記内皮細胞がVE-カドヘリン、AcLDL、vWFまたはCD31を発現する、請求項3または11に記載の方法。
- 前記平滑筋細胞が平滑筋アクチンまたはビメンチンを発現する、請求項3または11に記載の方法。
- 細胞の集団を培養する工程がin vitroにおけるものである、請求項1に記載の方法。
- 前記血管が静脈または動脈である、請求項1に記載の方法。
- 請求項1から15のいずれか一項によって作製される血管。
- 埋め込むための、請求項16に規定する血管の使用。
- 血管グラフトを患者に提供するための方法であって、
a.対象由来の細胞の集団を脱細胞化した血管に送達する工程と、
b.前記対象由来の細胞の集団を脱細胞化した血管上で培養する工程と
を含む方法。 - 前記脱細胞化した血管が同種異系ドナー由来のものである、請求項18に記載の方法。
- 前記対象由来の細胞の集団が全血、骨髄、または幹細胞由来のものである、請求項18に記載の方法。
- 前記対象由来の細胞の集団が、内皮細胞および平滑筋細胞を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記幹細胞がCD133+発現細胞である、請求項20に記載の方法。
- 前記対象由来の細胞の集団をin vitroにおいて増殖させ、内皮細胞および平滑筋細胞に分化させた後に、脱細胞化した血管に内皮細胞および平滑筋細胞を導入する、請求項18に記載の方法。
- 対象由来の細胞の集団を脱細胞化した血管に導入する工程が、注射または灌流によるものである、請求項18に記載の方法。
- 培養する工程が、内皮細胞培地および平滑筋細胞培地の灌流を含む、請求項18に記載の方法。
- 内皮細胞培地および平滑筋細胞培地の灌流を交互に実施する、請求項25に記載の方法。
- 交互に実施することを少なくとも2回繰り返す、請求項26に記載の方法。
- 対象由来の細胞の集団を脱細胞化した血管上で培養する工程により、対象由来の細胞の集団が内皮細胞および平滑筋細胞に分化する、請求項18に記載の方法。
- 前記内皮細胞が脱細胞化した血管の外側壁を覆い、前記平滑筋細胞が脱細胞化した血管の内腔壁を覆う、請求項28に記載の方法。
- 前記内皮細胞がVE-カドヘリン、AcLDL、vWFまたはCD31を発現する、請求項21または29に記載の方法。
- 前記平滑筋細胞が平滑筋アクチンまたはビメンチンを発現する、請求項21または29に記載の方法。
- 細胞の集団を培養する工程がin vitroにおけるものである、請求項18に記載の方法。
- 前記血管が静脈または動脈である、請求項18に記載の方法。
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