KR101534276B1

KR101534276B1 - 지방 이식 수술 후 지방세포 성장 및 생착 증진을 위한 조성물

Info

Publication number: KR101534276B1
Application number: KR1020140091076A
Authority: KR
Inventors: 신동진
Original assignee: 주식회사 에스씨301테라피
Priority date: 2014-07-18
Filing date: 2014-07-18
Publication date: 2015-07-07

Abstract

본 발명은 마이크로캡슐의 핵제에 지방 세포 이식시 혈관 형성 및 확장에 효과적이며 지방세포 성장 및 생착률을 증가시킬 수 있는 세포성장 촉진제가 함유되어, 자가 지방 이식 시 지방세포 생착률을 극대화시킬 수 있는 지방 이식 수술 후 지방세포 성장 및 생착 증진을 위한 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 지방 이식 수술 후 지방세포 성장 및 생착 증진을 위한 조성물은, 폴리디옥시리보뉴클리오티드(Polydeoxyribonucleotide)을 성분으로 하는 액상의 세포성장 촉진제 내에 소포로리피드(sophorolipid)가 유효 성분으로서 포함되며, 지방세포의 성장을 촉진하기 위한 해조류 줄기세포 추출물을 포함하는 마이크로캡슐이 혼입된 것을 특징으로 한다.

Description

지방 이식 수술 후 지방세포 성장 및 생착 증진을 위한 조성물{TISSUE REGENERATION COMPOSITION FOR FAT TRANSPLANT}

본 발명은 지방 이식 수술시 조직 재생을 활성화시키기 위한 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 마이크로캡슐의 핵제에 지방 세포 이식시 혈관 형성 및 확장에 효과적이며 지방세포 성장 및 생착률을 증가시킬 수 있는 세포성장 촉진제가 함유되어, 자가 지방 이식 시 지방세포 생착률을 극대화시킬 수 있는 지방 이식 수술 후 지방세포 성장 및 생착 증진을 위한 조성물에 관한 것이다.

현재 지방세포의 자가 이식은 널리 행해지고 있다. 자가 지방세포 이식은 1890년대부터 시작되었고, 1980년대 지방 흡입술이 시작된 이래 널리 사용됨으로써 그 사례도 상당히 많아져서 자가 지방 이식의 안전성은 이미 입증되어 있다. 특히 지방 이식은 나이로 인하여 노화된 피부의 주름 개선을 비롯하여, 입술선, 턱선, 이마선의 교정, 코 성형, 유방 성형 등에 사용되고 있다. 또한, 화상이나 상처로 인하여 함몰된 피부, 암 절제 수술로 상실된 부분 등에도 지방을 이식함으로써 결함 부위를 교정하는 수술로서 좋은 성과를 보이고 있다.

자가 지방세포 이식 방법은 주사기를 이용하여 본인의 몸에서 지방을 채취하여 다시 주사기를 이용하여 원하는 부위에 주입하는 방법을 말하며, 일반적으로, 자신의 복부나 둔부에서 미세도관을 이용해 지방을 흡입한 후 이를 원심분리를 하여 지방세포만 정제한 다음 원하는 부위에 주입하는 방법으로 수행되게 된다.

이러한 자가 지방세포 이식 방법은 많이 사용되는 데, 자가 지방세포는 기존의 상품화된 충전 물질(콜라젠, 알로덤, 레스틸렌, 아테콜, 쥬비덤, 아쿠아미드, 인터폴 등의 필러) 보다 활용이 용이하며, 적용 범위가 다양한 점, 바로 일상생활이 가능하다는 점과 붓기와 멍이 별로 없다는 점 및 자가조직을 이용하기 때문에 부작용과 거부감이 적다는 여러가지 장점이 있다.

그러나 자가 지방세포 이식 방법은 지방세포를 이식한 다음, 시간이 지남에 따라 이식된 지방이 조직에 흡수되어 잔여량이 감소(생착율이 감소)하는 단점이 있다. 따라서, 2회 이상의 시술이 필요한 경우가 많아 번거롭게 된다. 따라서, 지방세포를 사용할 경우, 잔여량의 충분한 유지를 위해서, 즉 생착율을 높이기 위한 방법의 개발이 요구되어 왔다.

이러한 생착율을 높이기 위하여 지방조직에 포함되어 있는 지방 줄기세포를 생체이식 재료로 이용하는 기술이 사용되고 있다. 미국특허 제6,153,432호(2000. 11. 28)에서는 지방 흡입술을 통해 얻어진 지방조직으로부터 지방 줄기세포를 분리하고 이식에 필요한 지방세포로 분화하는 방법 및 시약에 대하여 기술하고 있다.

지방 줄기세포는 면역반응을 억제하여 염증반응을 감소시키고, 지방 유래 중간엽 줄기세포는 지방세포, 연골세포, 뼈세포, 근육세포 등으로 분화가 가능할 뿐 아니라, 혈관생성을 유도하는 것으로 알려져 있다.

따라서 유방 확대를 위한 자가 지방 이식술에서 지방 줄기세포를 함께 이식하는 방법을 행함으로써 지방 조직만을 이식하는 기존의 자가 지방 이식술에 비하여 높은 생착률을 보이고 있으나, 아직까지 지방 조직의 생착률이 70% 정도 수준에 머무르고 있다.

등록특허 제0788632호(등록일자 2007년 12월 18일) 공개특허 제2010-0025658호(공개일자 2010년 03월 10일)

본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 혈관 형성 및 확장에 효과적이며 지방세포의 생착률을 증가시킬 수 있는 세포성장 촉진제가 함유된 마이크로캡슐을 함유하고, 지방 이식술 후 마이크로캡슐이 이식 부위에 균일하게 분산되어 지방세포 성장 효과를 극대화시키고, 생착률을 더욱 증가시킬 수 있도록 한 생체 분해성 마이크로캡슐 및 이를 이용한 지방 이식 수술 후 지방세포 성장 및 생착 증진을 위한 조성물을 제공함에 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 지방세포 성장 및 생착 증진을 위한 조성물은, 폴리디옥시리보뉴클리오티드(Polydeoxyribonucleotide)을 성분으로 하는 액상의 세포성장 촉진제 내에 소포로리피드(sophorolipid)가 유효 성분으로서 포함되며, 지방세포의 성장을 촉진하기 위한 해조류 줄기세포 추출물을 포함하는 마이크로캡슐이 혼입된 것을 특징으로 한다.

상기 마이크로캡슐은 해조류 줄기세포 추출물 및 트레할로스(trehalose)를 함유하며 방출량을 제어하는 방출제어제에 흡착된 핵제와, 상기 핵제 상에 코팅되어 핵제가 서서히 방출되도록 방출 속도를 제어하는 코팅층을 갖는다.

상기 마이크로캡슐의 코팅층은 폴리에틸렌글리콜 및 폴리디메틸실록산을 포함한다.

또한, 상기 방출제어제는 이산화규소, 규산 칼슘, 탈크 및 알루미늄마그네슘메타실리케이트로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면, 줄기세포의 성장 촉진 및 조직 재생 작용을 하는 폴리디옥시리보뉴클리오티드(Polydeoxyribonucleotide)을 성분으로 하는 액상의 세포성장 촉진제 내에 지방세포의 성장을 촉진하는 기능성 핵제와 코팅층을 갖는 마이크로캡슐이 함유되고, 소포로리피드(sophorolipid)에 의해 마이크로캡슐이 뭉침이 방지되어 마이크로캡슐이 지방 이식 부위에 균일하게 분포될 수 있게 되어, 조직 세포의 성장이 더욱 촉진될 수 있게 되며, 이에 따라 지방 이식술 후 생착률을 더욱 증가시킬 수 있는 효과가 있다.

또한 마이크로캡슐의 핵제에 해조류 줄기세포 추출물과 함께 트레할로스(trehalose)가 포함되어 있으므로 지방 이식술 후 지방 줄기세포의 생존률을 더욱 높일 수 있게 되므로 생착률을 더욱 향상시킬 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 조직 재생 조성물에 대한 지방유래 줄기세포의 세포독성을 확인한 그래프이다.
도 2는 지방유래 줄기세포에 산화 스트레스를 가한 후 본 발명에 따른 조직 재생 조성물을 처리하여 지방유래 줄기세포의 단백질의 발현양상을 비교한 그래프이다.

이하 본 발명에 따른 지방 이식 수술 후 지방세포 성장 및 생착 증진을 위한 조성물에 대해 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 지방 이식 수술 후 지방세포 성장 및 생착 증진을 위한 조성물은 폴리디옥시리보뉴클리오티드(Polydeoxyribonucleotide)을 성분으로 하는 액상의 세포성장 촉진제 내에 소포로리피드(sophorolipid)가 유효 성분으로서 포함되며, 지방세포의 성장을 촉진하는 기능성 핵제와 코팅층을 갖는 마이크로캡슐을 함유하여 지방세포의 생착률을 증진시키는 작용을 한다.

상기 마이크로캡슐은 지방세포의 성장을 촉진할 수 있는 해조류 줄기세포 추출물을 유효 성분으로 함유하며 방출량을 제어하는 방출제어제에 흡착된 핵제와, 상기 핵제 상에 코팅되어 핵제가 서서히 방출되도록 방출 속도를 제어하는 코팅층으로 구성된다. 상기 마이크로캡슐은 입도가 1~10㎛ 이다.

상기 핵제는 트레할로스(trehalose)를 함유하는 생리적 수용액에 해조류 줄기세포 추출물을 혼합하여 만들어진다. 트레할로스는 미생물부터 식물, 곤충까지 넓게 자연계에 존재하는 당질의 한 종류이며, 이함수의 결정구조를 가진 비환원성 당류로서 지방이식 시 지방 줄기세포의 막을 안정화하고 생존률을 향상시키는 작용을 한다.

해조류 줄기세포 추출물은 에탄올과 같은 용매를 이용하여 추출하는 화학적 방법과 초음파 및 압착을 이용하는 물리적 방법에 의해 추출된다. 해조류에는 바람직하게는 톳(Hizikia fusiformis), 미역(Undaria pinnatifida), 다시마(Laminaria japonica), 대황(Eisenia bicyclis), 모자반(Sargassum confusum), 우뭇가사리(Gelidium amansii), 참김(Porphyra tenera), 돌김(Porphyra yezoensis), 파래김(Undaria pinnatifida), 파래(Enteromorpha) 및 청각(Codium fragile) 등을 사용할 수 있다.

이러한 해조류 줄기세포 추출물은 항산화활성과 세포증식효과, 콜라겐 합성효과 및 콜라겐분해효소 활성억제효과를 갖는다. 전술한 것과 같이 해조류 줄기세포 추출물은 트레할로스가 함유된 생리적 수용액을 담체 성분으로 한다.

상기 마이크로캡슐의 코팅층은 핵제의 방출 속도를 제어할 수 있는 생분해성 고분자로서, 폴리에틸렌글리콜 및 폴리디메틸실록산으로 이루어진다.

이러한 마이크로캡슐은 핵제를 초음파 방법으로 방출제어제에 흡착시키고, 상기 핵제가 흡착된 방출제어제를 유화제가 함유된 수용액에 첨가하여 분산 용액을 제조하고, 상기 분산 용액에 폴리에틸렌글리콜 및 폴리디메틸실록산으로 이루어진 생분해성 고분자가 유기용매에 용해된 용액을 첨가하여 교반하고, 상기 유기용매가 건조되어 제거될 때까지 교반하여 중합반응하는 과정을 통해 제조된다.

상기 마이크로캡슐은 핵제를 방출제어제에 흡착시킨 후 코팅층으로 코팅하여 캡슐화함으로써, 핵제의 방출시 방출제어제의 흡착력으로 인해 핵제의 방출량이 제어되어 핵제가 지속적으로 방출되고, 코팅층에 의해 방속도도가 제어될 수 있는 특징을 갖는다. 상기 방출제어제로는 이산화규소, 규산 칼슘, 탈크 및 알루미늄마그네슘메타실리케이트로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하다.

이 후, 핵제가 흡착된 방출제어제를 유화제가 함유된 수용액에 첨가하여 분산키는 과정에서 상기 유화제는 캡슐의 분산성 향상과 안정된 캡슐을 제조하기 위해 소수성과 친수성 모두를 분산시킬 수 있는 양쪽성 계면활성제로서, 폴리비닐알코올, 젤라틴, 소디움도데실설페이트 등이 있고, 바람직하게는 폴리비닐알코올을 사용한다.

상기 마이크로캡슐의 코팅층인 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol) 및 폴리디메틸실록산(poly (dimethylsiloxane), PDMS) 간의 혼합비율에 따라 핵제의 방출 속도를 제어할 수 있다. 폴리에틸렌글리콜을 단독 사용하여 제조된 마이크로캡슐의 경우 10시간 경과 후 핵제의 70%가 방출되어 30 시간 이상동안 지속적으로 유지된 반면, 폴리에틸렌글리콜 80중량% 및 폴리디메틸실록산 20중량%를 사용하여 제조된 마이크로캡슐의 경우, 10시간 경과 후 핵제의 85%가 방출되고 15시간 경과 후에는 90% 방출량을 보이며 30 시간 이상동안 지속적으로 유지되는 결과를 보이는 것으로 확인되었다.

또한 폴리에틸렌글리콜에 폴리디메틸실록산의 혼합비율이 증가할수록 핵제의 방출량이 증가하는 결과를 보임으로써, 친수성 고분자인 폴리디메틸실록산의 함량이 증가하면 마이크로캡슐의 표면에 친수성 그룹이 증가하여 마이크로캡슐 벽을 통한 핵제의 확산이 빠르게 진행되어, 그 방출량이 증가하게 된다.

따라서, 본 발명의 마이크로캡슐은 핵제를 방출제어제에 흡착시킴으로써 핵제의 서방성 방출에 기여하고, 코팅층로서 폴리에틸렌글리콜 및 폴리디메틸실록산을 사용하고 그 혼합비율을 조절함으로써 핵제의 방출속도 및 방출량을 용이하게 제어할 수 있는 특성을 갖는다.

실시예 1

배양된 미역의 0.2mm 와트만 여과지(Watman paper)에 여과하여 배지를 모두 제거하고 증류수로 세척한 배양세포 300g을 4℃에서 저온 압착하여 추출한 액 50g을 최종 추출하였다. 추출한 액 50g 에 농도가 35.8 mg/mL 인 트레할로스 함유 생리 식염수 15㎖를 혼합하여 교반하여 핵제를 제조하였다.

80℃의 오븐에서 24 시간이상 건조하여 준비된 이산화규소에 초음파기를 이용하여 핵제 1g을 흡착시킨 후, 증류수 500 ㎖에 유화제인 폴리비닐알코올을 첨가하여 충분히 교반하여 분산시킨 후, 상기 용액에 마이크로캡슐의 코팅층인 폴리에틸렌글리콜 및 폴리디메틸실록산 80 중량%: 20 중량%의 혼합비율로 메틸렌클로라이드에 용해시킨 용액을 혼합하면서 30℃의 온도에서 2,500 rpm의 교반속도로 중합하였다. 상기 용매로 사용한 메틸렌클로라이드가 완전히 제거될 때까지 약 5 시간동안 교반한 후, 여과하고 건조하여 0.1∼10 ㎛의 입경 분포를 갖는 마이크로캡슐을 제조하였다.

폴리디옥시리보뉴클리오티드(Polydeoxyribonucleotide)을 성분으로 하는 액상의 세포성장 촉진제(D+CELL 350 TRA I, 파마리서치) 2.2㎖에 소포로리피드 0.3g 과 마이크로캡슐 0.5g을 혼합하였다.

비교예 1

폴리디옥시리보뉴클리오티드(Polydeoxyribonucleotide)을 성분으로 하는 액상의 세포성장 촉진제(D+CELL 350 TRA I, 파마리서치) 2.2㎖에 실시예 1과 동일한 방식으로 제조된 마이크로캡슐 0.5g을 혼합하였다.

비교예2

폴리디옥시리보뉴클리오티드(Polydeoxyribonucleotide)을 성분으로 하는 액상의 세포성장 촉진제(D+CELL 350 TRA I, 파마리서치) 2.2㎖ 만 사용하였다.

시험예1 : 세포독성 실험

지방 이식 수술 후 지방세포 성장 및 생착 증진을 위한 조성물의 세포독성을 파악하기 위하여 인간 지방유래 줄기세포에 대한 세포독성 실험을 수행하였다.

(1) 인간 지방유래 줄기세포에서의 세포독성

인간 지방유래 줄기세포를 75㎠ T-flask에 계대배양(passage)하여, CO₂ 배양기(CO2 Incubator)에서 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양을 하였다. 통상적으로 두 번째 또는 세 번째에서 세포의 계대배양을 진행하였다.

상기 조직 재생 조성물을 0.01, 0.1, 1, 5, 10%의 농도로 상기 지방유래 줄기세포에 처리하고, 지방유래 줄기세포에서의 세포독성 정도를 CCK-8키트(Dojindo)를 이용하여 확인하였다.

상기 실험 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 조직 재생 조성물 0.01, 0.1, 1, 5, 10%의 농도에서 세포독성이 없거나 극히 미미함을 확인할 수 있었다.

시험예 2 : 지방유래 줄기세포의 CD29, CD44 발현량 측정

조직 재생 조성물 함유 조성물의 효과를 파악하기 위하여 인간 지방유래 줄기세포 및 전이-증폭세포 각각의 표지 마커 유전자의 발현 수준을 측정하였다.

지방유래 줄기세포의 줄기세포성 증진효과를 파악하기 위해서 조직 재생 조성물을 0.01%로 배지에 첨가하였다. 지방유래 줄기세포의 산화스트레스는 과산화수소수(H₂O₂)를 200μM 농도로 24시간 처리하였다.

2㎖의 인산염 완충액(Phosphate Buffered Saline, PBS)으로 세포를 세척한 다음, 트리졸 시약(Trizol reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 세포 내의 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 키아젠사의 RNA 키트(QIAGEN RNeasy kt, QIAGEN, Valencia, CA)로 한번 더 정제한 후, 애질런트社의 바이오어낼라이저2100 모델 기기(Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 RNA의 질(quality)을 확인하였다. 인비트로젠社의 역전사키트(Superscript Reverse Transcriptase (RT) kit, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하였고, 이를 실시간 역전사 중합 효소 연쇄반응(real time-reverse transcription polymerase chain reaction, Q-RT-PCR)을 통해 정량적으로 분석하였다.

지방유래 줄기세포에서 CD29, CD44 유전자의 발현 패턴 변화를 어플라이드바이오시스템社의 택맨 유전자 발현시스템(TaqMan gene expression assay kit, Applied Biosystems, Foster City, CA) (CD29 유전자 프라이머:Hs00559595_m1, CD44 유전자 프라이머: Hs01075861_m1)을 이용하여 평가하였으며, 그 결과를 도 2((a)CD29,(b)CD44)에 나타내었다.

도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 지방유래 줄기세포의 각 유전자(CD29, CD44)의 발현양이 음성대조군 대비 약 1.1배, 1.2배 증가함을 확인하였다. 이러한 증가는 통계적으로 유의한 것이었다.

시험예 3 : 지방유래 줄기세포의 유세포 분석

인간 지방유래 줄기세포를 0.25% 트립신(Trypsin-EDTA)으로 75㎠ Ti 플라스크로부터 분리한 뒤 1500rpm에서 5분간 세포를 가라앉힌 다음, 배양액을 제거한 뒤에 3㎖의 차단버퍼(Blocking buffer), 2% 우태아 혈청(Fetal calf serum: FCS), 2% 소의 혈청 알부민(Bovine Serum Albumin(BSA) KGM-2)을 넣어주어 세포를 현탁하였다.

4℃에서 15분 동안 세포 (약 106 개의 세포)를 적용시킨 다음, FITC (Fluorescein isothiocyanate)가 부착된 CD44 항체(Cat No. 560977)(BD Pharmingen, CA, US)와 PE-Cy(phycoerythrin-cyanine)가 부착된 CD29 항체(Cat No. 559882) (BD Pharmingen, CA, US)을 각각 100: l로 넣어주어, 4℃ 하에서 45분 동안 반응시켰다. 한편 음성대조군으로 사용되는 세포에는 FITC Rat IgG2a, k 아이소타이프(isotype)(Cat No. 555742)와 PE-Cy5 mouse IgG1 k 아이소타이프(Cat No. 555750)를 역시 100: l로 넣어주어, 4℃ 하에서 45분 동안 반응시켰다.

반응이 끝난 후 3ml의 워싱 버퍼(2% Bovine Serum Albumin (BSA) KGM-2)로 두 번 세척한 후, 세포를 현탁하였다. 이후 FACSCalibur(BD Bioscience, San Jose, CA, U.S)로 지방유래 줄기세포에서 CD29, CD44을 발현하는 세포들의 활성의 변화를 관찰하고, 표 1에 나타내었다.

	음성대조군	조직 재생 조성물
CD29를 발현하는 지방유래 줄기세포의 수	4008	4465
CD29를 발현하는 지방유래 줄기세포의 수	증가 %	11.4%
CD44를 발현하는 지방유래 줄기세포의 수	5316	5547
CD44를 발현하는 지방유래 줄기세포의 수	증가 %	4.3%

표 1에서 볼 수 있는 것과 같이 음성대조군에 비하여 CD29는 11.4% 증가하고, CD44는 4% 증가함을 확인할 수 있다.

이상에서 본 발명은 기재된 실시예에 대해서만 상세히 기술되었지만, 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

Claims

폴리디옥시리보뉴클리오티드(Polydeoxyribonucleotide)을 성분으로 하는 액상의 세포성장 촉진제 내에 소포로리피드(sophorolipid)가 유효 성분으로서 포함되며, 상기 세포성장 촉진제에 지방세포의 성장을 촉진하기 위한 해조류 줄기세포 추출물을 포함하는 마이크로캡슐이 혼입되어 구성되고, 상기 마이크로캡슐은 해조류 줄기세포 추출물 및 트레할로스(trehalose)를 함유하며 방출량을 제어하는 방출제어제에 흡착된 핵제와, 상기 핵제 상에 코팅되어 핵제가 서서히 방출되도록 방출 속도를 제어하는 코팅층을 갖는 것을 특징으로 하는 지방 이식 수술 후 지방세포 성장 및 생착 증진을 위한 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 마이크로캡슐의 코팅층은 폴리에틸렌글리콜 및 폴리디메틸실록산을 포함하는 것을 특징으로 하는 지방 이식 수술 후 지방세포 성장 및 생착 증진을 위한 조성물.
제1항에 있어서, 상기 방출제어제는 이산화규소, 규산 칼슘, 탈크 및 알루미늄마그네슘메타실리케이트로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인 특징으로 하는 지방 이식 수술 후 지방세포 성장 및 생착 증진을 위한 조성물.