JP7064010B2 - Ｄｎａ断片混合物が高濃度で含まれた流動性を有する液剤組成物及びその製造方法 - Google Patents

Ｄｎａ断片混合物が高濃度で含まれた流動性を有する液剤組成物及びその製造方法 Download PDF

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本発明はＤＮＡ断片混合物が高濃度で含まれた液剤組成物及びその製造方法に関し、より詳しくは、高濃度のＤＮＡ断片混合物が室温条件で流動性が維持され、安定化した状態で含まれている液剤組成物に関する。
核酸（nucleic acid）は細胞内の核に存在するＤＮＡとＲＮＡであって、プリン（purine）塩基（アデニン、Ａ；グアニン、Ｇ）やピリミジン（pyrimidine）塩基（シトシン、Ｃ；チミン、Ｔ；ウラシル、Ｕ）、五炭糖及び燐酸から構成されたヌクレオチド（nucleotide）の重合体である。このような核酸は遺伝情報の貯蔵と伝達のための物質と認識されてきたが、最近には核酸が細胞の外部で小片に分解されて細胞の表面の受容体と選択的結合して細胞の内部に信号を活性化する役割と核酸の小片が細胞内に移動して少ないエネルギーで速かにＤＮＡ合成を誘導する役割をすることと知られるにつれて、新たな機能及びこれを活用した技術開発がなされている。
ポリデオキシリボヌクレオチド（polydeoxyribonucleotide）は動物または植物から抽出された特定の規格を有するＤＮＡ断片混合物であって、アデノシンＡ２受容体（adenosine A2 receptors）を刺激して抗炎症（anti-inflammation）、細胞増殖（cell proliferation）、組織再生（tissue regeneration）効果を有すると知られている（非特許文献１）。ヨーロッパと韓国ではサケや鱒のようなサケ科魚類の精液から抽出して得るＤＮＡ断片混合物をＰＤＲＮ（登録商標）と命名し、細胞増殖と組織再生のための医薬品原料に使用している（非特許文献２）。
ポリヌクレオチド（polynucleotide、以下、ＰＮ）もＰＤＲＮ（登録商標）と同様にサケや鱒のようなサケ科魚類の精液から抽出して得るＤＮＡ断片混合物であるが、ＰＤＲＮ（登録商標）より核酸の鎖長さが長く、高分子量が大きい。このようなＰＮは物理的な支持体の役割により細胞固着と潤滑及び緩衝効果を示すことによって、医療機器の原料に使われている。
医薬品及び医療機器の開発において、原料物質の濃度、溶解度、物理学的性質及び形態は、医薬品または医療機器の適用方法及び原料物質の人体内吸収に影響を与える。また、原料物質に賦形剤または担体などの多様な追加成分を追加する場合には、原料物質及び追加成分が均一に混合されることが重要であり、この際、原料物質及び追加成分の溶解度が重要に作用する。
ＰＤＲＮ（登録商標）及びＰＮのようなＤＮＡ断片混合物の伝達効果を高めるための目的に、同一の量の溶媒に多量のＤＮＡ断片混合物を溶解させて濃度を高める方法が検討されたが、一般的な低分子の核酸抽出物とは異なり、ＤＮＡ断片混合物は分子量が大きいので、溶解に困難性がある。特に、高濃度のＤＮＡ断片混合物が含まれた液剤を製造する場合に、溶解過程でゲル化（gelation）が進行されるにつれて、流動性が低くなるか、または溶解できなかったＤＮＡ断片混合物の沈殿が起こりながら産業的に使用が困難な問題点が表れる。
ここに、本発明者はＤＮＡ断片混合物を含む液剤組成物を研究する過程で、流動性を有する高濃度のＤＮＡ断片混合物が含まれている液剤組成物を製造し、このような液剤組成物が薬剤学的活性を維持し、人体内に効果的に注射できることを確認した。また、長期保管時にも製造された組成物の状態変化無しで流動性が持続的に維持されて高い安定性を有することを確認することによって、本発明を完成するに至った。
また、多量のＤＮＡ断片混合物の注入が必要な場合、数回反復注入しなければならなかった既存とは異なり、本発明の高濃度のＤＮＡ断片混合物が含まれている液剤組成物を通じて注入回数を減らすことができるようになり、他の有効成分との混合も高濃度状態で可能になることで、産業的な活用度を増加させることができた。
従来の先行技術として特許文献１にはスペルミン共重合体に核酸が結合された核酸伝達複合体が記載されているが、本発明の陽イオン性添加剤を用いて高濃度のＤＮＡ断片混合物を溶解させる効果は全く記載及び暗示されていない。また、特許文献２にはポリアミン誘導体及び核酸を含む剤形物が記載されているが、本発明の高濃度の断片混合物を溶解させる効果は全く記載及び暗示されていない。
非特許文献３はスペルミンを用いたＤＮＡ凝縮に対して記載されているが、本発明の高濃度のＤＮＡ断片混合物のゲル化及びこれを防止して高濃度のＤＮＡ断片混合物を溶解する効果は記載されていない。
韓国登録特許第１４５９１８５号 韓国公開特許第２０１１－０１２９９６９号
Kim, Y. H., et al., 2010 Yun, J. K., et al., 2015 Sung, B. K.(2012)
本発明の目的は、ＤＮＡ断片混合物が高濃度で含まれた液剤組成物及びその製造方法を提供するのであって、室温でも流動性及び安定性を有する高濃度のＤＮＡ断片混合物が含まれている液剤組成物を製造することができる。
本発明はＤＮＡ断片混合物が高濃度で含まれた２０℃で粘度が１～１，０００ｍＰａ・ｓである流動性を有する液剤組成物に関するものである。
前記液剤組成物は、陽イオン性添加剤を含むことができる。
前記液剤組成物は、ＤＮＡ断片混合物及び陽イオン性添加剤が１：１～５重量割合で混合できる。
前記液剤組成物は、ＤＮＡ断片混合物が液剤組成物の総重量を基準に２～２０重量％が含まれることができる。
前記ＤＮＡ断片混合物は、分子量が５０～１０，０００ｋＤａでありうる。
前記ＤＮＡ断片混合物はポリデオキシリボヌクレオチド（polydeoxyribonucleotide）及びポリヌクレオチド（polynucleotide）からなる群より選択される一種以上でありうる。
前記ＤＮＡ断片混合物は、魚類の精巣または精液から分離できる。
前記魚類は、サケ科でありうる。
前記陽イオン性添加剤は、陽イオン性ペプチド、陽イオン性脂質及び陽イオン性高分子からなる群より選択される一種以上でありうる。
前記陽イオン性ペプチドは、ポリリシン（polylysine）、プロタミン（protamine）、及びＫＡＬＡペプチド（cationic fusogenic peptide）からなる群より選択される一種以上でありうる。
前記陽イオン性脂質は、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロライド（N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride）、１，２－ジオレオイルオキシ－３－（トリメチルアンモニオ）プロパン（1,2-dioleoyloxy-3-(trimethylammonio)propane）、１，２－ジオレオイル－３－（４′－トリメチルアンモニオ）ブタンオイル－ｓｎ－グリセロール（1,2-dioleoyl-3-(4'-trimethylammonio)butanoyl-sn-glycerol）、１，２－ジアシル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（1,2-diacyl-3-dimethylammonium-propane）、１，２－ジアシル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（1,2-diacyl-3-trimethylammonium-propane）、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロール－３－エチルホスホコリン（1,2-diacyl-sn-glycerol-3-ethylphosphocholine）、３β－［Ｎ－（Ｎ′，Ｎ′－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（3β-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（dimethyldioctadecylammonium bromide）、及びその共重合体からなる群より選択される一種以上でありうる。
前記陽イオン性高分子は、キトサン（chitosan）、スペルミン（spermine）、プトレシン（putrescine）、カダベリン（cadaverine）、及びスペルミジン（spermidine）からなる群より選択される一種以上でありうる。
前記液剤組成物は、ヒアルロン酸（hyaluronic acid）、カルボキシメチルセルロース（carboxymethyl cellulose）、コラーゲン（collagen）、アルギネート（alginate）、ポロキサマー（poloxamer）、抗体（antibody）、蛋白質（protein）、ペプチド（peptide）、ｍｉＲＮＡ（micro RNA）、ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）、アプタマー（aptamer）、合成薬物（chemical drug）、及び骨移植材（bone graft materials）からなる群より選択される１種以上を追加で混合することができる。
前記液剤組成物は、注射溶剤、液状剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、ローション剤、内用液剤、外用液剤、経皮吸収剤に使われることができる。
前記液剤組成物は、ＤＮＡ断片混合物を緩衝溶液に入れて、熱撹拌器を用いて８０℃以上の高温で溶解させてＤＮＡ断片混合物貯蔵溶液を製造する第１ステップ；陽イオン性添加剤を緩衝溶液に入れて溶解させて陽イオン性添加剤貯蔵溶液を製造する第２ステップ；及び８０℃以上の熱撹拌器で前記第１ステップのＤＮＡ断片混合物貯蔵溶液と第２ステップの陽イオン性添加剤貯蔵溶液を混合し撹拌しながら温度を室温に低める第３ステップ；からなる過程を通じて製造できる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明はＤＮＡ断片混合物が高濃度で含まれた２０℃で粘度が１～１，０００ｍＰａ・ｓの流動性を有する液剤組成物に関するものである。
前記流動性（fluidity）は液体のように流れて動く性質をいうものであって、粘度と関連があり、製剤開発時、製剤均一性及び含有量に影響を及ぼすことがある。また、注射剤型の場合には注入可能か否かを決定する主要な性質として説明される。一般に、水の粘度は２０℃で約１ｍＰａ・ｓであり、蜂蜜の粘度は約１０，０００ｍＰａ・ｓと知られており、水と類似の粘度が注射剤型だけでなく、他の剤型への適用にも効用性が高い。
本発明の流動性を有する液剤組成物は２０℃で１～１，０００ｍＰａ・ｓの粘度を示すものでありうる。好ましくは１～１００ｍＰａ・ｓの粘度を示すものであり、前記粘度は混合される剤型の選択によって調節できるが、流動性が維持されることが好ましい。
また、前記流動性を有する液剤組成物は室温で長期間保管しても物性の変化無しで持続的に流動性が維持されて高い安定性を有する。
前記ＤＮＡ断片混合物とは、燐酸、４種類の塩基、デオキシリボース（deoxyribose）からなる生体高分子に該当するＤＮＡが抽出された形態であって、多様な分子量を有するＤＮＡ断片形態に混合されて存在することを称するものである。
前記ＤＮＡ断片混合物は高濃度で溶解させる過程でゲル化（gelation）されて流動性が低くなるか、または溶解できなかったＤＮＡ断片混合物の沈殿が起こって産業的に利用が困難であることがある。したがって、ＤＮＡ断片混合物を高濃度で含有する流動性を有する液剤組成物を製造するために陽イオン性添加剤を添加することができる。
前記ＤＮＡ断片混合物のゲル化はＤＮＡ断片混合物が単独に含まれている液剤組成物の総重量を基準にＤＮＡ断片混合物が２重量％以上の場合に表れることができる。
前記陽イオン性添加剤を添加した流動性を有する液剤組成物はＤＮＡ断片混合物及び陽イオン性添加剤が１：１～１０重量割合で混合されたものでありうる。好ましくは１：１～５重量割合であり、より好ましくは１：３～５重量割合である。
前記ＤＮＡ断片混合物が高濃度で含まれた液剤組成物はＤＮＡ断片混合物が流動性を有する液剤組成物の総重量を基準に２重量％以上含まれたものでありうる。好ましくは２～２０重量％であり、より好ましくは２～１０重量％である。
前記ＤＮＡ断片混合物が高濃度で含まれた液剤組成物は多量のＤＮＡ断片混合物の注入が必要な場合、注入回数を減らすことができ、他の有効成分との混合においても高濃度状態で可能になることによって、産業的な活用度を増加させることができる。
前記ＤＮＡ断片混合物は分子量が５０～１０，０００ｋＤａでありうる。ＤＮＡ断片混合物の分子量が５０ｋＤａ未満の場合には陽イオン性添加剤使用無しで十分に高濃度で溶かすことができ、流動性が維持されることができ、１０，０００ｋＤａ超過の場合には水に対する溶解度が低く、流動性が減少して産業的に利用し難い。
前記ＤＮＡ断片混合物は、ポリデオキシリボヌクレオチド（polydeoxyribonucleotide）及びポリヌクレオチド（polynucleotide）からなる群より選択される一種以上でありうる。
前記ＤＮＡ断片混合物は、魚類の精巣または精液から分離したものでありうる。
前記魚類はサケ科でありえ、好ましくはサケまたは鱒であり、最も好ましくはサケである。
前記陽イオン性添加剤は、陽イオン性ペプチド、陽イオン性脂質、及び陽イオン性高分子からなる群より選択される一種以上でありうる。
前記陽イオン性ペプチドは、ポリリシン（polylysine）、プロタミン（protamine）及びＫＡＬＡペプチド（cationic fusogenic peptide）からなる群より選択される一種以上でありうる。しかしながら、これに限定されない。
前記陽イオン性脂質は、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロライド（N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride）、１，２－ジオレオイルオキシ－３－（トリメチルアンモニオ）プロパン（1,2-dioleoyloxy-3-(trimethylammonio)propane）、１，２－ジオレオイル－３－（４′－トリメチルアンモニオ）ブタンオイル－ｓｎ－グリセロール（1,2-dioleoyl-3-(4'-trimethylammonio)butanoyl-sn-glycerol）、１，２－ジアシル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（1,2-diacyl-3-dimethylammonium-propane）、１，２－ジアシル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（1,2-diacyl-3-trimethylammonium-propane）、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロール－３－エチルホスホコリン（1,2-diacyl-sn-glycerol-3-ethylphosphocholine）、３β－［Ｎ－（Ｎ′，Ｎ′－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（3β-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（dimethyldioctadecylammonium bromide）、及びその共重合体からなる群より選択される一種以上でありうる。しかしながら、これに限定されない。
前記陽イオン性高分子は、キトサン（chitosan）、スペルミン（spermine）、プトレシン（putrescine）、カダベリン（cadaverine）及びスペルミジン（spermidine）からなる群より選択される一種以上でありうる。好ましくは、スペルミン、スペルミジン、及びプトレシンからなる群より選択される一種以上でありうる。最も好ましくは、スペルミンである。しかしながら、これに限定されない。
前記液剤組成物は、生理学的活性物質または医療機器原料物質を追加で添加することができる。
前記生理学的活性物質は、抗体（antibody）、蛋白質（protein）、ペプチド（peptide）、ｍｉＲＮＡ（micro RNA）、ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）、アプタマー（aptamer）、合成薬物（chemical drug）などでありうるが、これに限定されない。
前記医療機器原料物質は、ヒアルロン酸（hyaluronic acid）、カルボキシメチルセルロース（carboxymethyl cellulose）、コラーゲン（collagen）、アルギネート（alginate）、ポロキサマー（poloxamer）、骨移植材（bone graft materials）などでありうるが、これに限定されない。
前記液剤組成物は、注射溶剤、液状剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、ローション剤、内用液剤、外用液剤、経皮吸収剤などに使われることができ、液剤組成物が使われることができる剤型であれば制限しない。
前記液剤組成物は、ＤＮＡ断片混合物を緩衝溶液に入れて熱撹拌器を用いて８０℃以上の高温で溶解させてＤＮＡ断片混合物貯蔵溶液を製造する第１ステップ；陽イオン性添加剤を緩衝溶液に入れて溶解させて陽イオン性添加剤貯蔵溶液を製造する第２ステップ；及び８０℃以上の熱撹拌器で前記第１ステップのＤＮＡ断片混合物貯蔵溶液と第２ステップの陽イオン性添加剤貯蔵溶液を混合し撹拌しながら温度を室温に低める第３ステップ；からなる過程を通じて製造できる。
前記第１ステップのＤＮＡ断片混合物貯蔵溶液の製造のための緩衝溶液は、ソジウムホスフェートジベーシックドデカハイドレート（sodium phosphate dibasic dodecahydrate）、塩化ナトリウム（sodium chloride）、塩化マグネシウム（magnesium chloride）、塩化カリウム（potassium chloride）、燐酸緩衝食塩水（phosphate buffer saline）、またはＨＥＰＥＳ（N-(2-hydroxyethyl)-piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid）緩衝溶液などを使用することができるが、これに限定するのではない。
前記第２ステップの陽イオン性添加剤貯蔵溶液製造のための緩衝溶液は、ソジウムホスフェートジベーシックドデカハイドレート、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、燐酸緩衝食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝溶液、酢酸（acetic acid）、塩酸（hydrochloric acid）、アスコルビン酸（ascorbic acid）、乳酸（lactic acid）、硝酸（nitric acid）などでありうるが、これに限定するのではない。
また、本発明はＤＮＡ断片混合物が高濃度で含まれた流動性を有する液剤及び薬学的賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。
前記薬学的組成物は、通常の方法により、注射剤、液状剤、クリーム剤、及び軟膏剤、ゲル剤、ローション剤、内用液剤、外用液剤、及び経皮吸収剤などに使用することができる。前記薬学的組成物に含まれることができる担体、賦形剤、及び希釈剤には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート、及び鉱物油などを挙げることができる。製剤化する場合には普通使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調剤される。
本発明の薬学的組成物の投与量は治療を受ける対象の年齢、性別、体重、疾患の病理状態、病理状態の深刻度、投与経路、及び処方者の判断によって変わる。
本発明の薬学的組成物は、ネズミ、家畜、及びヒトのような哺乳動物に多様な経路で投与できる。投与の全ての方式は予想できるが、例えば、経口、直腸、または静脈、筋肉、皮下、皮膚、子宮内硬膜または脳血管内注射、局所適用により投与できる。
本発明は、ＤＮＡ断片混合物が高濃度で含まれた液剤組成物及びその製造方法に関し、より詳しくは、室温（１～３０℃）で流動性及び安定性を有する高濃度のＤＮＡ断片混合物が含まれている液剤組成物を製造し、製造された高濃度のＤＮＡ断片混合物が含まれた液剤組成物が薬剤学的活性を維持し、人体内に効果的に注射できることを確認しており、室温で長期保管する場合にも組成物の物性変化無しで持続的に流動性が維持される高い安定性を有することを確認した。
これを通じて、本発明のＤＮＡ断片混合物が高濃度で含まれた流動性を有する液剤組成物が注射剤、液状剤、クリーム剤など、多様な剤型の開発に適用可能であると期待され、液剤状態の高濃度ＤＮＡ断片混合物に多様な高分子及び活性因子を追加混合することを容易にすることで、多様な物質との組合せを通じての活性が増加した組成物の開発にも助けになることと期待される。
本発明のＤＮＡ断片混合物が高濃度で含まれた液剤組成物の振動変形サイズ（Ａ）及び温度変化（Ｂ）に従う貯蔵弾性率（Ｇ’）と損失弾性率（Ｇ”）及び複素粘度（η*）の変化を分析した結果を示している。 本発明のＤＮＡ断片混合物が高濃度で含まれた液剤組成物の物性変化を肉眼で観察した結果を示している。
以下、本発明の好ましい実施例を詳細に説明する。しかしながら、本発明はここで説明される実施例に限定されず、他の形態に具体化されることもできる。むしろ、ここで紹介される内容が徹底し完全になり、当業者に本発明の思想を十分に伝達するために提供するものである。
＜実施例１．高濃度のＤＮＡ断片混合物が含まれた液剤組成物の製造＞
本発明のＤＮＡ断片混合物は、ポリデオキシリボヌクレオチド（製品名：ＰＤＲＮ（登録商標）、株式会社パーマリサーチプロダクト製造、大韓民国）を、陽イオン性添加剤はスペルミン（spermine）を用いた。
ＤＮＡ断片混合物としてＰＤＲＮ（登録商標）を０．４％塩化ナトリウム（sodium chloride、ＮａＣｌ）緩衝溶液に入れて熱撹拌器を用いて８０℃で２０分間溶解させてＰＤＲＮ（登録商標）貯蔵溶液（stock solution）を製造した。
陽イオン性添加剤としてスペルミンを０．４％塩化ナトリウム（sodium chloride、ＮａＣｌ）緩衝溶液に入れて常温で１時間以上溶解させてスペルミン貯蔵溶液を製造した。
前記で製造されたＰＤＲＮ（登録商標）貯蔵溶液及びスペルミン貯蔵溶液を以下の表１に記載された濃度条件になるように混合して実施例１－１乃至実施例１－１２の組成物を製造した。この際、ＰＤＲＮ（登録商標）貯蔵溶液を８０℃で撹拌しながら上記のスペルミン貯蔵溶液をゆっくり添加しながら１時間以上撹拌して混合した後、撹拌器で持続的に撹拌しながら温度を室温に低めて本発明の液剤組成物を製造した。
Figure 0007064010000001
＜比較例１．比較対象の高濃度のＤＮＡ断片混合物が含まれた液剤組成物の製造＞
本発明の高濃度ＤＮＡ断片混合物との比較のために、下記の表２に記載された比較例１－１乃至比較例１－１０の液剤組成物を前記実施例１の製造方法と同一の方法により製造した。
Figure 0007064010000002
＜実施例２．高濃度のＤＮＡ断片混合物が含まれた液剤組成物の物性確認＞
液剤組成物の安定性及び物性はこれを用いた剤型開発及び施術部位に従う施術方法に大きい影響を与える。ここに、本発明の高濃度のＤＮＡ断片混合物が含まれている流動性がある液剤組成物が外部から加えられる力または温度によって物性変化があるかを分析することによって、安定的に流動性を維持するかを確認した。
実施例２－１．レオメータ（rheometer）を用いた物性確認
粘性（viscosity）は運動に対抗する流体の内部抵抗または流動性（fluidity）と関連しているものであって、温度に影響を受ける。弾性（elasticity）は外部の力により変形を起こした物質の力が除去された時に元の形態に戻ろうとする性質で、水のような液体は弾性変形をしない。したがって、物質の粘性と弾性の絶対値と相対的な割合はその物質が外力に対して反応する特性を決定付ける重要な材料関数である。
これによって、本発明の高濃度のＤＮＡ断片混合物が含まれている流動性がある液剤組成物の流動性及び安定性を粘性と弾性の変化分析を通じて確認した。
前記実施例１及び比較例１で製造した液剤組成物と対照群に水を用いて、振動変形（oscillation strain）サイズ及び温度変化に従う貯蔵弾性率（storage modulus、Ｇ’）と損失弾性率（loss modulus、Ｇ”）及び複素粘度（complex viscosity、η*）をレオメータを用いて測定し、その結果を図１に示した。この際、使用した測定条件はＰＵ２０、間隔（Gap）０．５ｍｍ、０．１Ｈｚ、１％応力－変形率（stress strain）で２４℃から４０℃まで１℃ずつ上げながら１分間維持させて貯蔵弾性率（Ｇ’）及び損失弾性率（Ｇ”）の変化を測定した。
前記貯蔵弾性率は弾性を、損失弾性率は粘性を測定したものであり、複素粘度は粘度を実数部と虚数部の和で示した数学的な表現である。
図１（Ａ）の振動変形サイズに従う影響を確認した結果から示すように、比較例１－５は振動変形サイズが１０％以上与えられる場合に、貯蔵弾性率（Ｇ’）、損失弾性率（Ｇ”）、及び複素粘度（η*）が全て急激に減少する一方、実施例１－６は振動変形のサイズに従う貯蔵弾性率（Ｇ’）、損失弾性率（Ｇ”）、及び複素粘度（η*）の変化がほとんどなくて、これは対照群に用いた水と類似するということを確認した。
また、図１（Ｂ）の温度に従う影響を確認した結果から示すように、比較例１－５は温度に従う貯蔵弾性率（Ｇ’）、損失弾性率（Ｇ”）、及び複素粘度（η*）の変化が大きく表れる一方、水と実施例１－６は大きな変化がないことを確認した。
本明細書に示してはいないが、前記実施例１－１乃至実施例１－５、実施例１－７乃至実施例１－１２の場合にも振動変形サイズ及び温度に従う弾性及び粘性の変化がほとんどないことを確認した。
実施例２－２．肉眼観察を通じての物性確認
前記実施例１及び比較例１で製造した高濃度のＤＮＡ断片混合物が含まれた液剤組成物を室温で２４時間保管した後、各液剤組成物の相（phase）変化を肉眼を通じて観察し、その結果を図２及び下記の表３に示した。この際、相変化の有無は組成物製造直後と比較した時、室温で放置後、製造した組成物の流動性の減少またはゲル化を基準に判断した。
Figure 0007064010000003
前記表３及び図２に示すように、ＰＤＲＮ（登録商標） １重量％のみ含まれている比較例１－１の場合には室温保管しても相変化がない一方、２重量％以上のＰＤＲＮ（登録商標）のみ含まれている比較例１－３、比較例１－５、比較例１－７、及び比較例１－９の場合には室温保管時、相変化が表れることを確認した。
また、２重量％以上のＰＤＲＮ（登録商標）にスペルミンがＰＤＲＮ（登録商標）の重量％対比１倍未満に混合されている比較例１－４、比較例１－６、比較例１－８、及び比較例１－１０の場合には相変化が表れてゲル化されながら流動性が減少することを確認した一方、スペルミンがＰＤＲＮ（登録商標）の重量％対比１倍以上混合されている実施例１－１乃至実施例１－１２の場合にはＰＤＲＮ（登録商標）が２重量％以上含まれていることにもかかわらず相変化が表れず、流動性を維持していることを確認した。
したがって、前記実施例２－１及び実施例２－２の結果を通じて、本発明の高濃度のＤＮＡ断片混合物が含まれている流動性がある液剤組成物は水のような流動性を維持しており、外部から加えられる力及び温度変化に従う粘性及び弾性数値変化がほとんど無しで安定性が維持されていることが分かった。
＜実施例３．高濃度のＤＮＡ断片混合物が含まれた液剤組成物の長期安定性確認＞
本発明の高濃度のＤＮＡ断片混合物が含まれた液剤組成物の長期保管時、安定性を確認するために、前記実施例１－１乃至実施例１－１２の液剤組成物の製造後、室温で８週間保管した。保管する間、１週、２週、４週、８週次に各々の液剤組成物の複素粘度をレオメータを用いて測定し、その結果を下記の表４に示した。
Figure 0007064010000004
前記の表４に示すように、実施例１－１乃至実施例１－１２の場合、室温保管期間に従う複素粘度の差が大きく表れないことを確認した。さらに、複素粘度の数値が対照群に用いた水の複素粘度数値と類似することを確認した。
これを通じて、本発明の高濃度のＤＮＡ断片混合物が含まれた液剤組成物が水と類似する流動性を有し、長期間保管しても流動性が維持されることを確認することによって、安定性が高いことが分かった。
＜製造例１．高濃度のＤＮＡ断片混合物及び陽イオン性ペプチドが含まれた液剤組成物の製造＞
前記実施例１で使用した陽イオン性添加剤であるスペルミンの代りに陽イオン性ペプチドの一種類であるポリリシンを用いて前記実施例１の製造方法と同一の方法により高濃度のＤＮＡ断片混合物が含まれた液剤組成物を製造した。
製造された液剤組成物の粘度を確認した結果、粘度が２ｍＰａ・ｓ以下に維持され、複素粘度も０．１５η*（Ｐａ．ｓ）として流動性が維持されることを確認した。
＜製造例２．高濃度のＤＮＡ断片混合物及び陽イオン性脂質が含まれた液剤組成物の製造＞
前記実施例１で使用した陽イオン性添加剤であるスペルミンの代りに陽イオン性脂質の一種類であるジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドを用いて実施例１の製造方法と同一の方法により高濃度のＤＮＡ断片混合物が含まれた液剤組成物を製造した。
製造された液剤組成物の粘度を確認した結果、粘度が２．２ｍＰａ・ｓ以下に維持され、複素粘度も０．１４η*（Ｐａ．ｓ）として流動性が維持されることを確認した。
＜製造例３．追加成分が含まれた高濃度のＤＮＡ断片混合物が含まれた液剤組成物の製造＞
本発明の高濃度のＤＮＡ断片混合物が含まれた液剤組成物に生理学的活性物質または医療機器原料物質を追加した時、流動性に影響を与えるかを確認した。
前記実施例１－６の液剤組成物に２重量％ヒアルロン酸溶液を１：１重量割合で混合し、点も及び複素粘度を測定した。その結果、ヒアルロン酸が追加で含まれた液剤組成物の粘度は１．５ｍＰａ・ｓ以下に維持され、複素粘度も０．１２η*（Ｐａ．ｓ）として流動性が維持されることを確認した。
これを通じて、本発明のＤＮＡ断片混合物が高濃度で含まれた液剤組成物を産業的に使用可能であることが分かった。

Claims (6)

  1. ＤＮＡ断片混合物と、スペルミンとスペルミジンとジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドからなる群より選択される１種以上の陽イオン性添加剤とが、１：１～５重量割合で混合され、
    前記ＤＮＡ断片混合物が、魚類の精巣または精液から分離されたものであると共に、分子量が５０～１０，０００ｋＤａであり、液剤組成物の総重量を基準に濃度２～１０重量％含まれ、
    ２０℃で粘度が１～１００ｍＰａ・ｓである
    ことを特徴とする流動性を有する液剤組成物。
  2. 前記ＤＮＡ断片混合物は、ポリデオキシリボヌクレオチド（polydeoxyribonucleotide）及びポリヌクレオチド（polynucleotide）からなる群より選択される１種以上である
    請求項１に記載の流動性を有する液剤組成物。
  3. 前記魚類は、サケ科である
    請求項１または２に記載の流動性を有する液剤組成物。
  4. 前記液剤組成物は、ヒアルロン酸（hyaluronic acid）、カルボキシメチルセルロース（carboxymethyl cellulose）、コラーゲン（collagen）、アルギネート（alginate）、ポロキサマー（poloxamer）、抗体（antibody）、蛋白質（protein）、ペプチド（peptide）、ｍｉＲＮＡ（micro RNA）、ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）、アプタマー（aptamer）、合成薬物（chemical drug）、及び骨移植材（bone graft materials）からなる群より選択される１種以上が追加で混合された
    請求項１ないし３のいずれかに記載の流動性を有する液剤組成物。
  5. 前記液剤組成物は、注射溶剤、液状剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、ローション剤、内用液剤、外用液剤、及び経皮吸収剤に使われる
    請求項１ないし４のいずれかに記載の流動性を有する液剤組成物。
  6. 請求項１ないし５のいずれかに記載の流動性を有する液剤組成物の製造方法であって、
    ＤＮＡ断片混合物を緩衝溶液に入れて、熱撹拌器を用いて８０℃以上の高温で溶解させてＤＮＡ断片混合物貯蔵溶液を製造する第１ステップ；
    陽イオン性添加剤を緩衝溶液に入れて溶解させて陽イオン性添加剤貯蔵溶液を製造する第２ステップ；及び
    ８０℃以上の熱撹拌器で前記第１ステップのＤＮＡ断片混合物貯蔵溶液と第２ステップの陽イオン性添加剤貯蔵溶液を混合し撹拌しながら温度を室温に低める第３ステップ；を含む
    ことを特徴とする流動性を有する液剤組成物の製造方法。
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