JP2004510442A - 腫瘍マーカーおよび使用方法 - Google Patents
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Abstract
様々な組織タイプにおける腫瘍マーカーとしてのプロテインキナーゼ「PBK」(PDZ結合性キナーゼ)の使用が考察される。そのタンパク質の過剰発現を検出する方法、およびそれに有用なキットが説明される。
Description
【0001】
発明の分野
本発明はヒト癌の腫瘍マーカーとして利用することができるタンパク質、およびその使用方法に関する。
【0002】
発明の背景
様々な生化学的および免疫学的存在が哺乳動物における癌の存在、性質または程度を示すマーカーとして有用である。癌が産生するマーカー分子には、モノクローナル免疫グロブリン、ホルモン、分泌血清タンパク質、抗原、酵素およびアイソザイム、細胞表面マーカー、糖タンパク質および炭水化物、並びに細胞外マトリックスタンパク質およびムチンが含まれる。癌マーカーは、体液、例えば、血液、血漿、血清、浸出液、および尿中に現れる可溶性マーカーとして分類され得る。他の癌マーカーは、その特質上血清または他の体液中にいかなる有意の量でも放出されない細胞関連タンパク質および核酸である。細胞または組織関連腫瘍マーカーは、癌性細胞を含む組織サンプル中、またはそのような細胞を含む生物学的サンプル(例えば、脱落気管支上皮細胞を含有する痰サンプル)中で検出可能である。
【0003】
癌マーカーは(非癌性または正常細胞と比較して)癌細胞のほとんど分化していない状態を反映する癌発達マーカーであることがあり、または細胞分裂経路の活性化もしくは細胞死経路の阻害による細胞における分子変化を反映するものであり得る。細胞におけるこれらのマーカーの発現は、細胞を異常または(悪性の可能性のある)癌性と同定するのに利用することができる。
【0004】
癌においては、予測および治療の選択は、癌の成長の程度の他にその組織学的タイプに応じて変化する。癌の臨床診断が単一の試験に依存することはほとんどない;複数のマーカーを評価して治療計画の立案を補佐することができる。新規腫瘍マーカーを同定してヒト癌の検出、予測および監視の補佐をする必要性が存在し続けている。
【0005】
発明の要約
本発明の一側面は、非癌性細胞と比較してPDZ結合性キナーゼ(PBK)の過剰発現を特徴とする癌に関連するマーカータンパク質をコードするmRNAの検出方法である。組織の試験サンプルを得、その試験サンプルからのmRNAを、PBKをコードするmRNAに特異的にハイブリダイズするヌクレオチドプローブと接触させてハイブリダイゼーション産生物を形成する。ハイブリダイゼーション産生物の量を測定し、非悪性組織のサンプル中で予測されるものと比較する。
【0006】
本発明のさらなる側面は、非癌性細胞と比較してPDZ結合性キナーゼ(PBK)の過剰発現を特徴とする癌に関連するマーカータンパク質をコードするmRNAの検出方法であって、mRNAを組織の試験サンプルから得、PBKをコードするmRNAに特異的に結合する核酸配列プライマーを用いて増幅して増幅産生物を形成する方法である。増幅産生物の量を測定し、非悪性細胞におけるものと比較する。試験サンプルによって産生される増幅産生物の量が非悪性対照によって産生されるものよりも多いという知見は、試験サンプル中の癌性細胞の存在を示す。
【0007】
本発明のさらなる側面は、前立腺組織のサンプルを悪性腫瘍についてスクリーニングする方法であって、サンプル組織中のPBK mRNAの量を測定することによる方法である。非悪性前立腺組織と比較して上昇したPBK mRNAのレベルは、そのサンプル組織が悪性であることを示す。
【0008】
本発明のさらなる側面は、前立腺組織のサンプルを悪性腫瘍についてスクリーニングする方法であって、サンプル組織中のPBKタンパク質の量を測定することによる方法である。非悪性前立腺組織と比較して上昇したサンプル中のPBKのレベルは、そのサンプル組織が悪性であることを示す。
【0009】
本発明のさらなる側面は、乳房組織のサンプルを悪性腫瘍についてスクリーニングする方法であって、サンプル組織中のPBK mRNAの量を測定することによる方法である。非悪性乳房組織と比較して上昇したサンプル中のPBK mRNAのレベルは、そのサンプル組織が悪性であることを示す。
【0010】
本発明のさらなる側面は、乳房組織のサンプルを悪性腫瘍についてスクリーニングする方法であって、サンプル組織中のPBKタンパク質の量を測定することによる方法である。非悪性乳房組織と比較して上昇したサンプル中のPBKのレベルは、そのサンプル組織が悪性であることを示す。
【0011】
本発明のさらなる側面は、PBKを発現する細胞におけるPBK活性を阻害する能力について試験化合物をスクリーニングする方法である。この方法は、細胞を試験化合物に対して曝露し、細胞中に存在するPBK活性の量を検出し;および曝露した試験細胞におけるPBK活性の量を試験化合物に対して曝露しなかった対照細胞のものと比較することを含む。対照細胞と比較して減少した曝露した試験細胞におけるPBK活性の量は、その試験化合物が悪性細胞においてPBK活性を阻害することを示す。
【0012】
本発明のさらなる側面は、非癌性細胞と比較してPDZ結合性キナーゼ(PBK)の過剰発現を特徴とするヒト癌に関連するマーカータンパク質をコードするmRNAを検出するためのキットである。このキットは、長さが少なくとも20ヌクレオチドであり、ヒトPBK mRNA配列に相補的であり、かつヒトPBK mRNA配列に特異的にハイブリダイズして標識ハイブリダイゼーション産生物を形成することができる標識核酸配列を含む。このキットは、さらに、少なくとも1種類のヒト組織タイプの癌性細胞において予想されるPBK mRNAのレベルを記載する印刷説明書を含む。
【0013】
本発明のさらなる側面は、非癌性細胞と比較してPDZ結合性キナーゼ(PBK)の過剰発現を特徴とするヒト癌に関連するマーカータンパク質を検出するためのキットである。このキットは、ヒトPBKに特異的に結合する標識抗体、および少なくとも1種類のヒト組織タイプの癌性細胞において予想されるPBKのレベルを記載する印刷説明書を含む。
【0014】
本発明のさらなる側面は、そのゲノムがその内在性PDZ結合性キナーゼ(PBK)遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子内に破損を含むトランスジェニックまたは突然変異誘発マウスである。この破損は機能的PBKタンパク質の発現を妨げ、(野生型マウスと比較して)PBK活性のレベルが低下したトランスジェニックまたは突然変異誘発マウスを生じる。
【0015】
本発明のさらなる側面は、野生型マウスに対してPBK活性のレベルが減少したトランスジェニックマウスを産生するための方法である。この方法は、PBKターゲッティングベクターをマウス胚性幹細胞に導入し;該マウス胚性幹細胞をマウス胚盤胞に導入し;および該マウス胚盤胞を偽妊娠マウスに移植することを含む。
【0016】
本発明のさらなる側面は、そのゲノムが、ヒトPBKのすべてまたはその一部をコードするDNA配列を含み、該DNA配列が組織特異的プロモーターに作動可能に連結するトランスジーンを含むトランスジェニックマウスである。
【0017】
詳細な説明
近年同定されたプロテインキナーゼが、本発明者らにより、腫瘍マーカーとして有用であることが確認されている。このキナーゼは Gaudet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(10):5167 (2000) によって「PBK(PDZ−binding kinase:PDZ結合キナーゼ)」と命名され、また別途、Abe et al., J. Biological Chem. 275(28):21525 (2000) によって「TOPK」(T−LAK cell−originated protein kinase:T−LAK細胞起源プロテインキナーゼ)と名付けられた。本明細書では、このキナーゼをPBK(PDZ−binding kinase:PDZ結合キナーゼ)と呼ぶ。PDZドメインは特定細胞下部位、例えば、上皮細胞タイトジャンクションおよびニューロンシナプス後高密度部でのタンパク−タンパク相互作用を介在する。大部分のPDZドメインは、それらのタンパク質パートナーの最外カルボキシ末端配列に結合する。Fuh et al., J Biol Chem 275(28):21486 (2000)。
【0018】
PBKは以下のアミノ酸配列を有する322アミノ酸セリン/トレオニンキナーゼである。
【0019】
Gaudet et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(10):5167 によって報告されたこのアミノ酸配列は107位にセリン(S)を含む(GenBank登録番号AF189722;107位は上記配列において下線を付されたボールド体で示される)。Abe et al., J. Biological Chem. 275(28):21525 および本発明者らは、この位置にアスパラギン(N)を同定した(配列番号3)。PBKは特徴的なキナーゼサブドメインおよびC末端PDZ結合性T/SXVモチーフを有する。このセリン/トレオニンキナーゼ、すなわち二重特異性キナーゼのコンセンサスD−X−K−X−X−N配列が配列番号2の残基167−172に見出される(上記下線部)。PBKはヒトhDlg(Drosophila Discs−Large(Dlg)腫瘍抑制タンパク質のヒト類似体)のPDZ2に特異的に結合する。Gaudet et al.。このPDZキナーゼをコードする完全長cDNAは本明細書では配列番号1として示される。
【0020】
PBKキナーゼmRNA発現の組織分布は、Abeらにより、精巣、T−LAK(リンホカイン活性化キラーT)細胞、活性化リンパ系細胞およびRPMI 1788 B細胞リンパ腫細胞に特異的なものとして報告された。Gaudetらは、PBKのmRNAが胎盤において最も豊富であり、成人脳組織には存在していなかったと述べている。
【0021】
「癌」、「悪性腫瘍(malignancy)」および「悪性腫瘍(malignant tumor)」という用語は、当業者によって理解されるように、様々なタイプの悪性新生物のいずれかを指すのに用いられる。新生物は細胞増殖によって生成される異常な組織増殖を指す。新生物は、通常は、構造的組織化の欠如および/または正常組織との機能的協調の欠如を示し、識別可能な組織塊を形成し得る。新生物は良性または悪性のいずれかであり得る。「悪性」は周囲の組織に侵入する新生物の能力を指す。悪性増殖は、通常、原発部位から解剖的に隔たっている部位へと転移しやすい。
【0022】
本明細書中で用いられる場合、悪性腫瘍細胞または癌細胞は、悪性転換現象を経験した細胞を指す。悪性転換は、癌性増殖を引き起こす細胞能力を大きく増加させる細胞における変化を指し、悪性転換は、当該技術分野において公知のように、細胞の増殖特性、組織学、および/または細胞の形態における変化によって同定することができる。
【0023】
「固形腫瘍」という用語は、その医学的に認められた意味で用いられ、白血病のような血液の癌は含まない。
【0024】
ここで用いられる場合、「癌マーカー」または「腫瘍マーカー」は癌性増殖もしくは腫瘍の存在、またはその程度の指標である。当該技術分野においては、腫瘍マーカーは、臨床実務において有用である上では、100%特異的であったり100%感受性であったりする必要はないことが公知である。臨床癌診断は単一のマーカーの評価に依存することはほとんどなく、ヒト癌の診断を行う場合、通常は、さらなる診断、実験および臨床手順および観察が考慮される。
【0025】
「癌診断」という用語は、癌または悪性腫瘍の存在の同定の他に、悪性疾患からの良性の区別化を指す。本明細書中で用いられる場合、予後は、当該技術分野において公知であるように、治療に対する応答、再発、生存時間、または他の効果指標の点で患者の経過がどの程度良好であるか、またはどの程度不十分であるかの評価または予測を指す。ここで用いられる場合、モニタリングは、疾患進行の徴候を検出するための患者の反復評価を指す。モニタリングは治療の期間中その治療の効果を評価するために行うことができるし、最小残余疾患、再発疾患、または継続する疾患の進行を検出するために治療後に行うこともできる。
【0026】
前立腺癌は、前立腺から離れてはいるが前立腺癌を起源とする転移性腫瘍を含む、前立腺細胞から生じるあらゆる組織学的タイプの癌を指す。大部分の前立腺癌は腺癌であるが、癌肉腫、移行細胞、小細胞、原発性肉腫、および他の組織学的タイプもより低い頻度で生じる。前立腺癌は十分に認知されている疾患である。
【0027】
乳癌は、乳房から離れてはいるが乳癌を起源とする転移性腫瘍を含む、乳房組織細胞から生じるあらゆる組織学的タイプの癌を指す。大部分の乳癌は上皮細胞から生じるが、他の組織学的タイプの乳癌も報告されている。乳癌は十分に認知されている疾患である。
【0028】
腫瘍マーカーは、罹患していることが(すなわち、悪性もしくは癌性細胞を含むことが)疑われる組織内で、または様々な供給源、例えば、痰、尿、腫瘍液、もしくは乳汁からの剥脱細胞材料の間接的コレクションにより、アッセイすることができる。
【0029】
本発明者らは、PBK mRNAが、対応する正常組織サンプルと比較して腫瘍組織サンプルにおいて過剰発現することを決定している。したがって、PBKまたはPBKをコードする核酸分子の検出および/または定量的測定は悪性腫瘍の検出において有用である。本発明の一態様においては、本発明の方法が前立腺組織サンプルにおける前立腺癌細胞の存在の検出に用いられる。本発明の別の態様においては、これらの方法が乳房組織サンプルにおける乳癌細胞の存在の検出に用いられる。本発明のさらなる態様においては、これらの方法が大腸組織サンプルにおける大腸癌細胞の検出、および肺組織サンプルにおける肺癌細胞の検出に用いられる。
【0030】
本発明はPBKタンパク質およびその対立遺伝子変異体、並びにPBKをコードする核酸分子(およびそれらの変異体)の、癌性組織を検出するためのマーカーとしての使用を含む。これらのマーカーは、同じ組織タイプの正常細胞におけるレベルと比較して、癌細胞においては増大したレベルで、特徴的に存在する。非癌性組織または非増殖性組織においては、PBKマーカーは低レベルまたは検出不能なレベルで存在し得る。PBK「マーカー」にはPBKタンパク質並びにそれらの変異体および断片、並びにPBKまたはそれらの変異体もしくは断片をコードする核酸分子が含まれる。本明細書中で用いられる場合、PBKマーカーの「増大したレベル」は予め決定された標準を上回って増大するレベル、または対照サンプルにおけるレベルを上回って増大するレベルを指す。予め決定される標準は、疑われる悪性腫瘍について試験される組織と同じタイプの健常(非癌性)組織サンプルにおけるPBKマーカーの通常の測定に基づくものであり得る。予め決定される標準はゼロもしくは検出不能であってもよく、または正の量であってもよい。あるいは、被験体を試験する場合には、予め決定される標準はその被験体の以前の試験結果に基づくものであってもよく、またはその被験体からの正常組織におけるPBKの測定に基づくものであってもよい。
【0031】
したがって、本発明の方法は、細胞、組織またはそれらの抽出物をヒトから単離し、さらにPBKマーカーの比較レベルをPBK活性の増大を伴う疾患、例えば、癌、増殖性障害、病的血管形成、および炎症の指標として測定することを含む。本発明の好ましい方法は、細胞、組織またはそれらの抽出物をヒトから単離し、さらに細胞または組織の悪性状態を予測する助けとなるPBKマーカーの比較レベルを測定することを含む。
【0032】
疾患が存在しない場合であっても試験結果が正常標準から幾らか変動することがあることは医学的診断においてはよく知られている。したがって、正常標準はある範囲をもつ値を含み得る。疾患を示すことが認められているマーカーのレベル(「診断レベル」)は正常レベルの数倍であり得る。特定の組織または特定の疾患のPBKマーカーの診断レベル、および疾患の存在をある程度の確実性で示唆する診断レベルを決定するのに、公知の統計法を用いることができる。例えば、PBK mRNAの診断レベルは、標的組織の正常レベルの1.5倍(1.5×)、正常レベルの2倍(2×)、正常レベルの5倍(5×)、正常レベルの10倍(10×)、正常レベルの100倍(100×)、正常レベルの500倍(500×)、正常レベルの1000倍(1,000×)、正常レベルの1500倍(1,500×)、またはそれ以上に設定することができる。通常、診断レベルは、その診断レベルの疾患マーカーが見出されるときには統計学的におそらく被験体が標的疾患を有する点に設定する。
【0033】
疾患の指標と見なされるPBKマーカーのレベルは試験する標的組織の間で異なっていてよい。正常PBKマーカー標準、およびPBKマーカー診断レベルは、特定の組織タイプまたは疾患について、当該技術分野において公知の日常的な診断および臨床試験法を用いて決定することができる。当業者に明らかなように、本発明の方法のための標準または診断レベルを確立するためのデータを得るのにあらゆる数のプロトコルを用いることができる。
【0034】
本発明の方法は、固形腫瘍、前立腺癌、肺癌、大腸癌、および乳癌を含むがこれらに限定されるものではない、PBKマーカーの増加に関連付けられている疾患状態を有することが疑われる被験体に、用いることができる。本発明の方法は、以前に標的状態を有すると診断されている被験体のモニタリング、標的状態の治療を受けている被験体のモニタリング、または以前に標的状態と診断されてはいない被験体のスクリーニングに用いることができる。本明細書に開示される方法は、前立腺組織サンプルおよび乳房組織サンプルをスクリーニングしてそれらに含まれる細胞が癌性であるかどうかを決定するのに特に適する。
【0035】
本明細書中で用いられる場合、スクリーニングおよび診断方法は、そのような方法が標的疾患の検出において100%特異的または100%感受性であることを示すものではない。しかしながら、複数のサンプルの試験においては、診断レベルまたはそれを上回るレベルであると判定されるサンプルの大部分は悪性組織を含む。本発明の方法の特異性および/または感受性は、当業者には明らかなように、試験される病的状態、用いられる生物学的サンプル、被験体の全身的健康状態、および他の要因に依存して様々であり得る。組織サンプル中の悪性と非悪性細胞との相対数が試験結果に影響を及ぼすことも容易に理解される。すなわち、非悪性細胞のより大きなサンプル内に悪性細胞の小病巣を含むサンプルは、基本的に全て悪性細胞を含むサンプルよりも偽陰性と判定される可能性が高い。
【0036】
本発明の一態様においては、癌性細胞を含むことが疑われる組織サンプル中に存在するPBK mRNAの量を測定し、予め決定された標準と比較するか、または同じタイプの正常(非癌性)組織のサンプル中に存在するPBK mRNAの量と比較する。mRNAレベルの様々な測定方法または比較方法が当該技術分野において公知である。mRNAの定量的測定のための好ましい1つの方法は、当該技術分野において公知のように、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)技術を用いる。特に好ましい方法はTAQMAN(R)(PE Applied Biosystems、Foster City、CA)、リアルタイム蛍光プローブポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のシステムを利用する。この方法は標的配列に相補的である蛍光発生プローブを用い、このプローブはPCR反応混合物に添加される。このプローブは、レポーターおよびクエンチャー色素が結合するオリゴヌクレオチドを含む。PCRの間に標的核酸が存在する場合、このプローブがフォワードおよびリバースプライマー部位の間で特異的にアニールする。ポリメラーゼがこのプローブを開裂し、レポーター色素の蛍光強度の増加を生じる。その後、蛍光発光を記録し、および/または測定する。例えば、Orlando, C., P., Pinzani, and M., Pazzagli. ”Developments in quantitative PCR” Clin Chem Lab Med 36 (1998): 255−269;Brink et al., ”Comparative quantification of IL−1beta, IL−10, IL−10r, TNFalpha and IL−7 mRNA levels in UV−irradiated human skin in vivo”, Inflamm Res 49(6):290 (2000) を参照のこと。当業者には公知のように、各々のプライマーおよびプローブのセットについてPCR反応の最適化が必要である。プライマーおよびプローブの選択の補助に市販ソフトウェアを利用することができる(例えば、Perkin Elmer PE/ABD Primer Express software)。例えば、Heid et al., Real−time quantitative PCR. Genome Res 6:986 (1996);Livak et al., PCR Methods Appl 4:357 (1995);Holland et al., Proc Natl Acad Sci USA 88:7276 (1991);Gelmini et al., Clin. Chem 43:752 (1997);Marcucci et al., Leukemia 12 (1998) を参照のこと。
【0037】
当該技術分野において公知のように、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、固定化組織サンプル、脱落細胞、および骨髄吸引物を含む組織サンプル中のDNAまたはmRNAの測定が可能となる。PCR技術の多くのバリエーションが公知であり、当業者は、分析するDNAまたはmRNAの性質、組織、およびアッセイの望ましい感受性に基づいて適切なPCR条件を決定することができる。
【0038】
本発明のさらなる態様においては、癌性細胞を含むことが疑われる組織サンプル中に存在するPBKタンパク質の量を測定し、予め決定された標準と比較するか、または同じタイプの正常(非癌性)組織のサンプル中に存在するPBKタンパク質の量と比較する。標的タンパク質に特異的に結合する標識モノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用を含むがこれらに限定されるものではないタンパク質の定量的検出方法が公知である。PBKタンパク質の量はサンプルの容量当たりのPBKタンパク質の量として、または総タンパク質に対するパーセンテージとして決定することができる。
【0039】
本発明において有用である抗体には、配列番号1、配列番号2または配列番号3のペプチドに特異的に結合するもの、およびそのような抗体のフラグメントが含まれ、それらのフラグメントは配列番号1、配列番号2または配列番号3のペプチドに特異的に結合する。そのような抗体及び抗体フラグメントは、当該技術分野において公知の様々な技術によって産生することができる。「抗体」という用語は、本明細書中で用いられる場合、IgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEを含む免疫グロブリンのすべてのタイプを指す。これらのうち、IgMおよびIgGが好ましい。抗体はモノクローナルであってもポリクローナルであってもよく、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびウマを含むがこれらに限定されるものではないあらゆる種を起源とするものであってよく、またキメラ抗体であってもよい。
【0040】
本発明の方法において用いられるモノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature, 265:495 (1975) の技術および当該技術分野において公知の他の技術に従って、ハイブリドーマ細胞系において産生することができる。腫瘍マーカーに特異的なモノクローナル抗体により、免疫放射線技術、免疫酵素技術、または免疫組織化学技術(これらは当該技術分野において公知である)を使用して、その腫瘍マーカーを検出することが可能となる。
【0041】
癌マーカーに対する抗体は組織学的切片中の該マーカーの存在の検出、正常細胞からの腫瘍細胞の分別に有用である。免疫組織学的染色も、例えば外科的に切除したサンプルが切除縁に罹患組織を有するかどうかを評価するための、病変のより正確な定義付けを可能とする。したがって、PBK抗体は、それらがパラフィン包埋組織またはホルマリン固定組織における使用に適するとき、特に有用である。
【0042】
本発明の方法において有用である抗体は、当該技術分野において公知のように、検出可能なシグナルを生じるように標識することができる。そのような標識には放射性標識、蛍光標識および酵素標識が含まれる。適切なイムノアッセイの例には、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素結合イムノアッセイ等が含まれる。本明細書中で説明される抗体は、さらに、診断アッセイにおいて用いるのに適する固体支持体(例えば、ラテックスまたはポリスチレンのような材料から形成される、ビーズ、プレート、スライドまたはウェル)に結合させることができる。
【0043】
本明細書中で開示される方法において用いるために被験体から採取されるサンプルは、一般には、組織のサンプル、または試験しようとする組織に由来する細胞を含む体液のサンプルである。サンプルは当該技術分野において公知であるあらゆる方法によって得ることができ、これには外科的切除、針吸引生検、およびパンチ生検が含まれるがこれらに限定されるものではない。当該技術分野において公知のように、PBKタンパク質または核酸分子の検出に先立ち、サンプルに追加の通常調製工程を施すことができる。そのような工程には、例えば、保存剤の添加またはマトリックス中への組織サンプルの固定化が含まれる。
【0044】
本明細書中で開示される方法は、PBKタンパク質、そのタンパク質の断片もしくは変異体、またはPBKタンパク質をコードする核酸(またはそれらの断片もしくは変異体)の測定による、生物学的サンプル中に存在するPBKの量の評価を提供する。好ましい態様においては、PBK mRNAの量を測定する。しかしながら、当業者に明らかなように、悪性細胞および正常(非悪性)細胞中のPBKマーカーの比較量を検出するあらゆる適切な方法を本発明において用いることができる。
【0045】
本発明は、本明細書中で開示されるようなPBKタンパク質またはペプチドの変異体の使用ももたらす。本明細書で提供されるPBKタンパク質配列の天然変異体は、保存的なアミノ酸配列差異またはマイナーな非保存的配列差異の分だけ異なり得る。変異体PBKタンパク質またはペプチドは、好ましくは、本明細書で提供されるPBK配列(配列番号2および3)に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、またはそれ以上の配列同一性を有する。保存的アミノ酸置換には以下のグループ内での置換が含まれる:
グリシン、アラニン;
バリン、イソロイシン、ロイシン;
アスパラギン酸、グルタミン酸;
アスパラギン、グルタミン;
セリン、トレオニン;
リジン、アルギニン;
フェニルアラニン、チロシン。
【0046】
「同一性パーセント」または「相同性パーセント」という用語は、2つ以上のアミノ酸配列または核酸配列の比較において見出される配列類似性のパーセンテージを指す。同一性パーセントはコンピューターを用いて、例えば、MegAlignTMプログラム(DNASTAR,Inc.、Madison Wis.)を用いることによって決定することができる。MegAlignTMプログラムは、別の方法、例えば、クラスタル(clustal)法(例えば、Higgins, D. G. and P. M. Sharp (1988) Gene 73: 237−244 を参照)に従って2つ以上の配列間のアラインメントを行うことができる。このクラスタルアルゴリズムは、すべてのペアの間の距離を調べることにより、配列をクラスターにグループ化する。これらのクラスターを二つ一組で、次いでグループとしてアラインメントする。2つのアミノ酸配列、例えば、配列Aおよび配列Bの間での類似性パーセンテージは、配列Aおよび配列Bの間で一致する残基の合計を、「配列Aの長さ − 配列A内のギャップ残基数 − 配列B内のギャップ残基数」で除算し、それに100を乗算することによって算出する。2つのアミノ酸配列の間で低い類似性を示すかまたは類似性なしのギャップは類似性パーセンテージの決定には含まれない。核酸配列間の同一性パーセントは当該技術分野において公知の他の方法、例えば、Jotun Hein法によってもカウントまたは算出することができる(例えば、Hein. J. (1990) Methods Enzymol. 183:626−645 を参照)。
【0047】
「実質的な配列類似性」という用語は、本明細書中で用いられる場合、本明細書に開示されるものに対して僅かな、かつ重大ではない配列変化を有するDNA、RNAまたはアミノ酸配列が等価であるとみなすことを意味する。実質的な配列類似性を有する分子は機能的に等価であり、すなわち、本明細書に具体的に開示される配列と実質的に同じ様式で機能して実質的に同じ組成物および結果を生じる。実質的な配列類似性を有する分子は、典型的には少なくとも約70%の配列同一性を有し、好ましくは配列が少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、または97%以上もの類似性を示す。
【0048】
核酸、ペプチド、またはタンパク質分子への言及における「単離された」という用語の使用は、それらの分子がヒトの活動によってそれらの天然 in vivo 細胞成分から分離されていることを意味する。
【0049】
ここで用いられる場合、「ストリンジェントな条件」という用語は、ポリヌクレオチドと、本明細書に開示されるPBKタンパク質をコードする核酸分子との、ハイブリダイズする条件を指す。ストリンジェントな条件は、塩濃度、有機溶媒(例えば、ホルムアミド)の濃度、温度、および当該技術分野において周知の他の条件によって規定することができる。特には、塩濃度の低下、ホルムアミド濃度の増加、またはハイブリダイゼーション温度の上昇によってストリンジェンシーを高めることができる。
【0050】
例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約750mM NaClおよび75mMクエン酸三ナトリウム未満であり、好ましくは約500mM NaClおよび50mMクエン酸三ナトリウム未満であり、最も好ましくは約250mM NaClおよび25mMクエン酸三ナトリウム未満である。有機溶媒、例えば、ホルムアミドの不在下では低ストリンジェントなハイブリダイゼーションを実施することができ、これに対して少なくとも約35%ホルムアミド、最も好ましくは少なくとも約50%ホルムアミドの存在下で高ストリンジェントなハイブリダイゼーションを実施することができる。ストリンジェントな温度条件には、通常、少なくとも約30℃、より好ましくは少なくとも約37℃、最も好ましくは少なくとも約42℃の温度が含まれる。変動するさらなるパラメータ、例えば、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤(例えば、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS))の濃度、および担体DNAの含有または排除は、当業者に周知である。これらの様々な条件を必要に応じて組み合わせることによって様々なレベルのストリンジェンシーが達成される。好ましい態様においては、ハイブリダイゼーションを30℃で、750mM NaCl、75mMクエン酸三ナトリウム、および1%SDS中において行う。より好ましい態様においては、ハイブリダイゼーションを37℃で、500mM NaCl、50mMクエン酸三ナトリウム、1%SDS、35%ホルムアミド、および100μg/ml変性サケ精子DNA(ssDNA)において行う。最も好ましい態様においては、ハイブリダイゼーションを42℃で、250mM NaCl、25mMクエン酸三ナトリウム、1%SDS、50%ホルムアミド、および200μg/ml ssDNAにおいて行う。これらの条件に関する有用な変更は当業者には容易に明らかとなろう。
【0051】
ハイブリダイゼーションに続く洗浄工程もストリンジェンシーの点で変更され得る。洗浄ストリンジェンシー条件は塩濃度および温度によって規定することができる。上述と同様に、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を低下させることにより、または温度を増加させることにより高めることができる。例えば、洗浄工程のストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約30mM NaClおよび3mMクエン酸三ナトリウム未満であり、最も好ましくは約15mM NaClおよび1.5mMクエン酸三ナトリウム未満である。洗浄工程のストリンジェントな温度条件には、通常、少なくとも約25℃、より好ましくは少なくとも約42℃、最も好ましくは少なくとも約68℃の温度が含まれる。好ましい態様においては、洗浄工程は25℃で、30mM NaCl、3mMクエン酸三ナトリウム、および0.1%SDSにおいて行う。より好ましい態様においては、洗浄工程は42℃で、15mM NaCl、1.5mMクエン酸三ナトリウム、および0.1%SDSにおいて行う。最も好ましい態様においては、洗浄工程は68℃で、15mM NaCl、1.5mMクエン酸三ナトリウム、および0.1%SDSにおいて行う。これらの条件に関するさらなる変更は当業者には容易に明らかであろう。
【0052】
本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件(本明細書で定義される)下で、配列番号1によって表されるヌクレオチド配列の全体もしくは一部またはその相補体にハイブリダイズする核酸分子の検出(ここで、検出される核酸分子は機能的PBKタンパク質をコードする)も包含する。ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズする部分は、典型的には、長さが少なくとも15(例えば、20、25、30、または50)ヌクレオチドである。ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズする部分は、PBKタンパク質をコードする核酸の一部もしくは全体の配列、またはその相補体に対して少なくとも80%、少なくとも95%、または少なくとも98%以上同一である。本明細書に記載されるタイプのハイブリダイズする核酸は、例えば、クローニングプローブ、プライマー(例えば、PCRプライマー)、または診断用プローブとして用いることができる。さらなる手引きは、例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press, NY;および Ausubel et al. (eds.) 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, NY) により、当該技術分野において容易に入手可能である。
【0053】
本発明は、本明細書中で提供される診断法において用いるための、PBKマーカーの検出において有用なオリゴヌクレオチドプローブ、および またはPBKマーカーの検出において有用な抗体を含むキットを提供する。オリゴヌクレオチドプローブはPBKヌクレオチド配列に基づくものであって、好ましくは、長さが約10、20、30、40、50もしくはそれ以上のヌクレオチドである。そのようなオリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチド対の組合せは、PBK腫瘍マーカーのPCRに基づく検出および腫瘍組織サンプルの in−situ ハイブリダイゼーションにおけるプライマーとして有用である。これらのオリゴヌクレオチドは、分解に対するオリゴヌクレオチドの抵抗性を高めるため、1つ以上の修飾された連結基、糖残基および/または塩基を含んでいてもよい。このキットは、特定のタイプの組織におけるPBKヌクレオチドマーカーの標準および診断レベルを記載した印刷された取扱説明書をさらに含んでもよい。この試験キットの構成要素は任意の適切な様式で一緒に包装され、典型的には、単一の容器内にすべての構成要素を含み、かつ試験を実施するための印刷された取扱説明書を含む。この試験キットは、標準または対照として用いられる、PBKをコードする既知量の核酸分子をさらに含んでいてもよい。
【0054】
本発明のさらなる態様は、PBKタンパク質に特異的な抗体を含み、かつ特定のタイプの組織におけるPBKタンパク質の標準および診断レベルを記載した文書化された取扱説明書をさらに含む試験キットである。これらの抗体は固体支持体に結合されていてもよく、または検出可能な構成要素に結合されていてもよい。この試験キットの構成要素は任意の適切な様式で一緒に包装され、典型的には、単一の容器内にすべての構成要素を含み、かつ試験を実施するための印刷された取扱説明書を含む。
【0055】
本発明は、潜在的な医薬作用、例えば、抗癌作用について薬剤をスクリーニングする方法であって、該薬剤がPBKマーカーの減少を引き起こすものである前記方法をさらに提供する。そのような薬剤は、PBK遺伝子の発現を転写もしくは翻訳レベルのいずれかで直接阻害するか、またはPBK活性を阻害するか、またはPBKがはたらく生物学的経路内の工程を阻害し、その結果PBKマーカーの減少を引き起こす。このような方法は、PBKマーカーを過剰発現する細胞を薬剤に対して曝露し、次いで薬剤に曝露した後の細胞中のPBKマーカーのレベルを測定することを含む。細胞はin vitroであってもin vivoであってもよく、腫瘍細胞であっても新生物細胞であってもよい。特に好ましいのはヒト癌の組織培養法および非ヒト哺乳動物モデルである。薬剤は動物に全身的に投与することができ、または新生物増殖体に直接投与することもできる。PBKマーカーのレベルを予め決定された標準に対してまたは対照において見出されるレベルに対して比較する。PBKマーカーのレベルの減少は、その薬剤がPBK遺伝子発現または活性を阻害し、抗癌作用を有し得ることを示す。このようなスクリーニング法は、前立腺癌、乳癌、肺癌および大腸癌の動物モデルまたは細胞培養モデルにおける使用に特に適する。あるいは、このようなスクリーニング法は、同じタイプの非転換細胞と比較してPBKマーカーのレベルが増大している悪性転換細胞系のin vitroスクリーニングによって行うこともできる。PBKマーカーのレベルが有意に減少する場合、たとえそのPBKマーカーのレベルが標準または正常レベルを上回り続けているとしても、その薬剤は阻害性であるとみなすことができる。理想的には、PBKマーカーのレベルは、阻害性薬剤に対して曝露しなかった同じ細胞系に対して少なくとも20%、25%もしくは50%、好ましくは少なくとも70%以上減少する。PBK mRNAまたはPBKタンパク質産生の潜在的阻害剤の例には、アンチセンスRNA、PBKタンパク質の競合阻害剤、例えば、PBKタンパク質の断片、またはPBKタンパク質に対する抗体が含まれる。PBK阻害剤は、PBKタンパク質をコードする核酸分子、すなわち、PBK遺伝子もしくはそれらのRNA転写体、またはPBKタンパク質それ自体、またはそれらのサブユニットに対するものであり得る。PBK阻害剤として機能し得る物質には、これらに限定されるものではないが、PBKとその基質との相互作用を特異的に阻害する化合物、PBKタンパク質を特異的に分解または不活性化する化合物、およびPBKタンパク質の発現を特異的に妨害する化合物が含まれる。そのような薬剤には、PBKの化合物阻害剤、タンパク質もしくはペプチドPBKのアンタゴニストもしくは競合阻害剤、PBKタンパク質に対する抗体、およびPBKの発現を阻害する分子、例えば、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー等が含まれ得る。
【0056】
また本発明は、PBK活性レベルの上昇が生じる癌性、新生物性、または過剰増殖性(hyperproliferative)増殖の治療方法を包含する。この方法は、癌細胞を、PBKの活性(または発現)を阻害する作用物質に対して曝露することを含み、作用物質の量はそうでなければそれらの細胞中に存在するであろうPBK活性(または発現)(すなわち、阻害性作用物質の不在下で生じると予想される活性または発現)を低下または阻害するのに十分なものである。好ましくは、PBK阻害性作用物質は、PBKの活性または発現を同じ組織タイプの非罹患細胞に見出されるレベルまで低下させる量で提供される。PBK阻害剤は、PBKマーカーが上昇している癌、新生物、または過剰増殖障害を患う被検体に全身投与することができ、または、例えば局所注射により、増殖物(growth)に直接投与することができる。この増殖物は、例えば、前立腺癌または乳癌であり得る。PBK阻害剤の最適投与量は、癌の進行のタイプおよび程度、患者の全体的な健康状態、阻害剤の効力、並びに投与経路のような要因に応じて変化するだろう。PBK阻害剤投与量の最適化は当技術分野における通常の技術の範囲内である。
【0057】
PBK阻害剤は、PBKタンパク質をコードする核酸分子、すなわち、PBK遺伝子またはそれらのRNA転写産物、またはPBKタンパク質それ自体、またはそれらのサブユニットを指向するものであり得る。PBK阻害剤として機能し得る物質には、これらに限定されるものではないが、PBKとその基質との間の相互作用を特異的に阻害する化合物、PBKタンパク質を特異的に分解または不活性化する化合物、およびPBKタンパク質の発現を特異的に妨害する化合物が含まれる。そのような作用物質には、PBKの化学物阻害剤、タンパク質もしくはペプチドPBKアンタゴニスト、およびPBKの発現を阻害する分子、例えば、三重らせん(triplex)形成オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム等が含まれ得る。
【0058】
マウスPBKキナーゼcDNA配列が単離され(配列番号7)、コードされたアミノ酸配列が本発明者らによって以下のように決定された:
【0059】
セリン/トレオニンまたは二重特異性キナーゼのコンセンサスD−X−K−X−X−N配列には上記で下線が付されている。GenBank登録番号AB041882は本質的に類似する配列を提供し、これはマウスTOPK(T細胞起源プロテインキナーゼ(T−cell−originated protein kinase))と同定される。Abeら, J. Biological Chem. 275(28):21525 (2000) も参照のこと。GenBank登録番号AB041882で提供されるアミノ酸配列は、(上記配列において下線を付されたボールド体で示される)313位でイソロイシン(I)を挙げる。
【0060】
また内在性PBK遺伝子の対立遺伝子のうちの少なくとも1つが機能的に破壊されている生殖細胞および/または体細胞を有するトランスジェニック非ヒト動物、好ましくはマウスも本発明によって提供される。この動物は、PBK遺伝子破壊についてヘテロ接合であってもよく、またはより好ましくはホモ接合でありうる。内在性PBK遺伝子が機能的に破壊されているホモ接合動物においては、PBK活性は野生型動物において見出されるものに対して実質的に低下している。本発明のトランスジェニック動物は、PBK阻害剤の効力の評価およびPBK阻害剤で治療することができる疾患状態の同定に陽性対照として用いることができる。内在性PBK遺伝子が機能的に破壊されてはいるが異種PBK遺伝子(好ましくは、ヒト)で再構成されているトランスジェニック非ヒト動物、好ましくはマウスも提供される。このような動物は、in vivoでヒトPBK活性を阻害する作用物質を同定するのに用いることができる。宿主細胞中の内在性PBK遺伝子を機能的に破壊するための核酸構築物、その核酸構築物を含む組換えベクター、およびその核酸構築物が導入されている宿主細胞も本発明に包含される。内在性PBKの発現が野生型動物において見られるものに対して増加している非ヒト動物も提供される;そのような過剰発現はその動物の特定の組織タイプまたは解剖学的領域に限定され得る。異種PBKの発現が動物の特定の組織タイプまたは解剖学的領域において達成されている非ヒト動物も提供される。
【0061】
本発明は、内在性PBK遺伝子の対立遺伝子のうちの少なくとも一方、より好ましくは両者が機能的に破壊されている体細胞および/または生殖細胞を有する非ヒト動物(好ましくは非ヒト哺乳動物、より好ましくはマウス)に関する。したがって、本発明は、改変されたPBK遺伝子を有し、したがって少なくとも1つの組織タイプにおけるPBK活性を欠く(または、野生型動物において観察されるものと比較してPBK活性が実質的に低下している)生存可能な動物を提供する。本発明の非ヒト動物は、例えば、PBK阻害剤を評価するための標準対照として、それによりin vivoでヒトPBK阻害剤をスクリーニングするためのモデル系を創出し、および/またはPBK阻害剤での治療に対する疾患状態を確認するための正常ヒトPBK遺伝子のレシピエントとして有用である。
【0062】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物において、PBK遺伝子は、好ましくは、内在性対立遺伝子とその動物の胚性幹細胞前駆体に導入されている改変もしくは異種PBK遺伝子、またはそれらの一部との間の相同組換えによって破壊されている。内在性PBK遺伝子への無発現変異(null mutation)の導入の考慮に加えて、PBK遺伝子の対立遺伝子に点突然変異または欠失を導入してPBK遺伝子活性を改変するのに類似の技術を用いることができる。その後、胚性幹細胞前駆体を発達させ、機能的に破壊されたPBK遺伝子を含む改変されたPBK遺伝子を有する動物が生じる。この動物は機能的に破壊された1つのPBK遺伝子の対立遺伝子を有することができ(すなわち、この動物はこの改変についてヘテロ接合であり得る)、より好ましくは、この動物は機能的に破壊された両方のPBK遺伝子の対立遺伝子を有する(すなわち、この動物はこの改変についてホモ接合であり得る)。
【0063】
本発明の一実施形態においては、両方のPBK遺伝子の対立遺伝子の機能的破壊は、動物の細胞におけるPBK遺伝子産物の発現が非改変動物に対して実質的に不在である動物を生じる。別の実施形態においては、PBK遺伝子の対立遺伝子を、動物の細胞において改変された(すなわち、突然変異体または非野生型)PBK遺伝子産物が産生されるように破壊することができる。
【0064】
加えて、本発明の動物は、特定の疾患状態がPBKの作用に関与し、したがって、PBK阻害剤によって潜在的に治療し得るか否かを決定するのに有用である。例えば、機能的に破壊されたPBK遺伝子を有する本発明の動物において疾患状態を誘導する試みをなすことができる。続いて、疾患状態に対するその動物の羅病性または耐性を決定することができる。疾患状態に対する本発明の動物の耐性に基づき、PBK阻害剤で治療可能である疾患状態を同定することができる。
【0065】
本発明の別の態様は、機能的に破壊された内在性PBK遺伝子を有するが異種PBKをコードする導入遺伝子(すなわち、別の種に由来するPBK遺伝子)もそのゲノム内に担持し、かつそれを発現するトランスジェニック非ヒト動物に関する。好ましくは、この動物はマウスであり、かつ異種PBKはヒトPBK、例えば、本明細書で提供される配列番号2または配列番号3のPBKである。ヒトPBKで再構成されている本発明の動物は、in vivoでヒトPBKを阻害する作用物質の同定に用いることができる。例えば、この動物を、試験しようとする作用物質の存在下および不在下でPBKの産生を誘導する刺激に曝露し、およびその動物におけるPBK応答を測定することができる。作用物質の不在下でのPBK応答と比較して作用物質の存在下でのPBK応答の減少に基づき、in vivoでヒトPBKを阻害する作用物質を同定することができる。
【0066】
本発明のさらに別の態様は、宿主細胞中のPBK遺伝子を機能的に破壊するための核酸構築物に関する。この核酸構築物は:a)非相同置換部分;b)第1PBK遺伝子配列と実質的な同一性を有するヌクレオチド配列を有する、非相同置換部分の上流に位置する第1相同領域;およびc)第2PBK遺伝子配列と実質的な同一性を有するヌクレオチド配列を有する、非相同置換部分の下流に位置する第2相同領域を含み、第2PBK遺伝子配列は天然内在性PBK遺伝子において第1遺伝子配列の下流に位置する。加えて、第1および第2相同領域は、核酸分子が宿主細胞に導入される場合、宿主細胞における核酸構築物と内在性PBK遺伝子との間の相同組換えに十分な長さのものである。PBK遺伝子配列と「実質的な同一性」を有するヌクレオチド配列は、宿主細胞におけるそのヌクレオチド配列と内在性PBK遺伝子配列との間の相同組換えを可能にするのに十分なPBK遺伝子配列との配列同一性を有するヌクレオチド配列を説明しようとするものである。典型的には、フランキングする相同領域のヌクレオチド配列は、相同組換えの標的とされる内在性PBK遺伝子のヌクレオチド配列と少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは98%、99%または100%同一である。最も好ましくは、フランキング相同領域は標的とされる内在性対立遺伝子と同質遺伝子的である(例えば、フランキング領域のDNAは、ターゲッティング構築物を導入しようとする細胞と同じ遺伝的背景を有する細胞から単離される)。
【0067】
好ましい実施形態においては、非相同置換部分は、当技術分野において公知のように、好ましくは調節エレメント(1つもしくは複数)に機能的に連結されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む、陽性選択発現カセットを含有する。「陽性選択発現カセット」という用語は、陽性選択マーカーの発現を制御する調節エレメント(例えば、プロモーターおよびポリアデニル化配列)に機能的に連結された陽性選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を指す。「陽性選択マーカー」は、そのマーカーを含む細胞の選択を許容する。別の好ましい実施形態においては、また核酸構築物は、相同領域の上流または下流のいずれかの遠位に陰性選択発現カセットも含む。好ましい陰性選択発現カセットは、調節エレメント(1つもしくは複数)に機能的に連結された単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を含む。
【0068】
本発明の別の態様は、本発明の核酸構築物が組み込まれている組換えベクターに関する。本発明のさらに別の態様は、本発明の核酸構築物が導入されており、それにより核酸構築物と宿主細胞の内在性PBK遺伝子との間の相同組換えが可能となり、その結果内在性PBK遺伝子の機能的破壊が生じる宿主細胞に関する。この宿主細胞はPBKを正常に発現する哺乳動物細胞であっても、多能性細胞、例えば、マウス胚性幹細胞であってもよい。核酸構築物が導入されており、かつ内在性PBK遺伝子と相同的に組換えられている胚性幹細胞のさらなる発生は、胚性幹細胞の子孫であり、したがってそれらのゲノム内にPBK遺伝子破壊を担持する細胞を有するトランスジェニック非ヒト動物を生じる。次に、PBK遺伝子破壊をそれらの生殖細胞系に担持する動物を選択して飼育し、すべての体細胞および生殖細胞においてPBK遺伝子破壊を有する動物を産生することができる。次いで、そのようなマウスを、PBK遺伝子破壊についてホモ接合性にまで飼育することができる。
【0069】
本明細書で用いられる場合、「機能的に破壊されている」遺伝子は、その遺伝子の正常機能を妨げる、例えば、正常PBK遺伝子産物の発現を妨げ、または正常量のPBK遺伝子産物の発現を妨げる配列改変を有する。機能的破壊を生じる突然変異は、挿入、欠失または点突然変異(1つもしくは複数)であり得る。一実施形態においては、PBK遺伝子の対立遺伝子の両方が、PBK遺伝子産物の発現が動物の細胞中で実質的に低下するか、または不在であるように機能的に破壊される。「不在」という用語は、動物の細胞中で産生される正常PBK遺伝子産物の量が本質的に検出不能であることを意味することが意図されている。このタイプの突然変異は当技術分野において「無発現変異」とも呼ばれ、そのような無発現変異を担持する動物は「ノックアウト動物」とも呼ばれる。別の実施形態においては、PBK遺伝子の対立遺伝子の両方が、改変した形態のPBK遺伝子産物が動物の細胞中で発現するように機能的に破壊される。例えば、1つ以上の点突然変異または欠失突然変異をPBK遺伝子に導入し、それによりそこでコードされるPBK遺伝子産物のアミノ酸配列を改変させることができる。さらに、PBKコードDNA配列を選択された組織特異的プロモーターおよび/またはエンハンサーに連結させ、かつ生じるハイブリッドDNA分子を動物の胚に初期発生段階(例えば、受精卵母細胞段階)で標準法によって導入することにより、選択された組織(例えば、乳房、前立腺)において増加したレベルのPBKを発現するトランスジェニック動物を産生することができる。
【0070】
非相同置換部分はPBK遺伝子内の様々な位置に挿入可能であり、異なる相同領域がフランキングすることでその遺伝子が機能的に破壊されることは当業者には明らかであろう。mPBK遺伝子配列の機能的破壊は、(例えば、neo遺伝子の挿入により)全長mPBK mRNA転写産物の発現を妨げることができ、または改変した形態のmPBKをコードするmPBK mRNA転写産物の発現につながり得る。
【0071】
PBK発現のレベルが低下した非ヒト動物は、さらに、当技術分野において公知のように、リコンビナーゼ技術を用いて得ることができ、そこでは内在性PBK配列を標的とするリコンビナーゼがそのDNA配列を切除または再配置する。例えば、標的とされた遺伝子の発現を調節するためのリコンビナーゼを発現するアデノウイルスベクター系に関する米国特許第6,120,764号を参照のこと。
【0072】
加えて、当技術分野において公知のウイルス遺伝子ベクターを用いて、内在性PBKを過剰発現するか、または異種PBKを発現する非ヒト動物(好ましくは、マウス)を提供することができる。好ましくは、異種PBKはヒトPBKである。異種PBKの発現、または内在性PBKの過剰発現は、動物内の特定の組織タイプまたは組織の領域に限定することができる。組織特異的遺伝子の発現を駆動し、かつトランスジェニック非ヒト動物の提供において有用である様々なプロモーター/エンハンサーが同定されている。発現カセットは、プロモーターおよびポリアデニル化部位、並びに必要であるならば、エンハンサーエレメントを含む、挿入遺伝子の発現に必要な調節エレメントを含む。
【0073】
ラットC(3)1の5’DNA領域内のプロモーターエレメントを、遺伝子産物の前立腺特異的発現を指令し、およびトランスジェニックマウスを産生するために用いることができる。例えば、Zhangら, Prostate 2000 Jun 1;43(4):278−85 を参照のこと。プロモーターおよびラットC(3)1遺伝子の5’領域を、組換えDNA技術を用いてPBK遺伝子のコーディング領域に融合させる。雄性由来の前立腺を、in situ ハイブリダイゼーションにより、組換えPBK mRNAの発現について検査することができる。
【0074】
ヒト前立腺特異的抗原(PSA)および腺性カリクレイン−1(hGK−1、hK2としても知られる)遺伝子は染色体19上に、12kb遺伝子間領域によって分離されて縦列に位置する。PSA遺伝子調節エレメント単独、または遺伝子間領域と一緒の制御の下に配置される導入遺伝子は、前立腺特異的発現を示す。この遺伝子間領域は、高レベルの発現に対する高PSA遺伝子コピー数の必要性を低下させる。例えば、Cleutjensら, Mol. Endocrinol. 11(9):1256−65 (1997);Weiら, Int. J. Mol. Med. 2(4):487−496 (1998) を参照のこと。
【0075】
またトランスジェニックマウスにおける標的とされた遺伝子の前立腺特異的発現は、プロバシン(probasin;PB)プロモーターの断片を用いても達成することができる。小PB断片は前立腺特異的発現を指令するのに十分であるが、より大きな断片の使用は導入遺伝子発現のレベルを増加させる。例えば、Yanら, Prostate 32:129−139 (1997) を参照のこと。
【0076】
したがって、本発明は、当技術分野において公知の組織特異的プロモーターを用いて、PBKの組織特異的過剰発現のマウスモデルをさらに提供する。好ましい組織特異的プロモーターは前立腺特異的プロモーターである。そのようなマウスは、例えば、前立腺のような特定の組織においてヒトPBKを発現することができ、または特定の組織においてマウスPBKを過剰発現することができる。これらの動物は、PBK活性に関するそれらの効果についての化合物のスクリーニングにおいて有用である。
【0077】
導入遺伝子が誘導的に調節されるトランスジェニック非ヒト哺乳動物を産生する様々な系が当技術分野において公知である。本発明のトランスジェニック動物におけるPBK発現の調節は、当技術分野において公知のように、原核生物のTet(テトラサイクリン)リプレッサー/オペレーター/インデューサー系の成分を用いて達成することができる。例えば、米国特許第5,965,440号;米国特許第5,922,927号;米国特許第5,917,122号;米国特許第5,851,796号;米国特許第5,650,298号を参照のこと。
【0078】
あるいは、「遺伝子スイッチ」をBondら, Science 289:1942−46 (2000)に記載されるように挿入することにより、非ヒト動物におけるPBK遺伝子の発現を低下または除去することができる。Bondらは、相同組換えを用いて、ドキシサイクリンに基づく遺伝子スイッチを挿入して標的遺伝子の発現を調節した。動物にドキシサイクリンが与えられるとき、標的遺伝子の発現が消滅する。この調節カセットは標的遺伝子の5’非翻訳領域に挿入される。
【0079】
加えて、ヒトPBK遺伝子の機能をヒト細胞においてin vitroで、またはヒト組織移植片を含む非ヒト動物において改変することができる。そのような改変されたヒト細胞は、化合物をPBK活性に対する薬学的効果についてスクリーニングする上で有用である。ヒト宿主細胞において相同組換えによってヒトPBK(hPBK)遺伝子を標的とするため、ターゲッティングベクターはヒトPBK遺伝子配列と実質的な同一性を有するフランキング相同領域を含む。ヒトPBKゲノムDNA配列は、標準技術を用いてヒトPBK cDNAのすべてまたは一部を含むcDNAプローブでヒトゲノムDNAライブラリをスクリーニングすることによって単離することができる。ヒトPBK cDNAのヌクレオチド配列及びヒトPBKタンパク質の推定アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号1および2によって示される。マウスPBK遺伝子について説明されるように、ヒト細胞内のヒトPBK遺伝子配列の機能的破壊は、全長hPBK mRNA転写産物の発現を妨げることができ、または改変された形態のhPBKをコードするhPBK mRNA転写産物の発現につながり得る。
【0080】
宿主細胞内の内在性PBK遺伝子の対立遺伝子を機能的に破壊するため、本発明のターゲッティングベクターを宿主細胞、例えば、PBKを正常に発現する分化細胞または胚性幹細胞に導入し、相同組換え体を選択する。ターゲッティングベクターは、外来性DNAの導入に好適であることが当技術分野において公知である幾つかの技術(例えば、リン酸カルシウム沈殿、DEAE−デキストラントランスフェクション、マイクロインジェクション、リポフェクション等)のうちのいずれによっても宿主細胞に導入することができるが、最も好ましくは、電気穿孔法によって宿主細胞に導入する。ベクターを宿主細胞に導入した後、導入されたターゲッティングベクターと内在性PBK遺伝子との間の相同組換えを許容するのに十分な期間および条件下で細胞を培養する。宿主細胞を選択し、標準技術(例えば、正常内在性対立遺伝子を相同組換え対立遺伝子と区別するプローブを用いるサザンハイブリダイゼーション)により内在性PBK遺伝子座での相同組換えについてスクリーニングする。
【0081】
実施例
mRNA の定量化
PBK mRNAを検出し、かつ腫瘍組織および正常(非腫瘍性)組織におけるPBK mRNAの相対量を比較するための定量アッセイを設計した。このアッセイはリアルタイム蛍光プローブポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(TaqMan)を用いた。
【0082】
TaqMan配列検出器(ABI PRISM 7700 Sequence Detector)には、核酸配列のハイスループット定量をもたらすためのPCRに基づくアッセイおよびハードウェア/ソフトウェア機器が組み込まれている。熱サイクリング、蛍光検出、および用途特異的ソフトウェアの組合せは、PCR産物の増加をサイクルごとに検出することを可能にする。定量的結果が得られる。
【0083】
この方法は、PCR反応混合物に添加された、標的配列に相補的な蛍光発生プローブを用いた。このプローブは、レポーターおよびクエンチャー(quencher)色素が結合するオリゴヌクレオチドを含有していた。PCRの過程で標的核酸が存在していた場合、プローブがフォワードとリバースプライマー部位との間に特異的にアニーリングした。ポリメラーゼがプローブを開裂し、それがレポーター色素をクエンチャー色素の影響から解放し、したがってレポーター色素の蛍光強度の増加が生じた。その後、蛍光放出を記録し、および/または測定した。例えば、Orlando, C., P., Pinzani,およびM., Pazzagli.「Developments in quantitative PCR.」Clin Chem Lab Med 36 (1998):255−269;Brinkら,「Comparative quantification of IL−1β, IL−10, IL−10r, TNFα and IL−7 mRNA levels in UV−irradiated human skin in vivo」, Inflamm Res 49(6):290 (2000) を参照のこと。
【0084】
プライマーおよびプローブの配列:
フォワードプライマー:5’ AGT TAA CAG TTC CCA TAC AAG TTA ATG C 3’ (配列番号4)
リバースプライマー:5’ CAC ACA TCG TTG AAG CTT TGG A 3’ (配列番号5)
プローブ:5’−(FAM)−TTG AGC TTA GAC CAC AAC ATT GGC CAT CTA G−(TAMRA)−3’ (配列番号6)
FAMは用いられた色素を指す;TAMRAはクエンチャーを指す。
【0085】
PCR サイクリング条件:
48℃30分
95℃10分
以下を40サイクル:
94℃15秒
60℃1分
【0086】
Taqman分析に用いられた具体的な試薬および条件を表1に示す。
【0087】
【表1】
【0088】
簡潔に述べると、組織サンプルから誘導されるRNAのみを欠く、試薬の「マスターミックス」を生成した。45μLのマスターミックスのアリコートを96ウェルTaqmanプレートの各ウェルに添加した。次に、特定のサンプルRNAを、各々のサンプルを三重で、適切なウェル(総容量5μLの水中に50ngのRNA)に添加した。製造業者の指示によってTaqmanプレートを覆い、ABI PRISM 7700 Sequence Detector内に入れた。上述のプライマーおよびプローブを用い、上述のPCR条件下で分析を行った。
【0089】
サンプル
アデノイド、脂肪、副腎、脳、乳房、子宮頸、大腸、子宮内膜、心臓、視床下部、回腸、空腸、腎臓、肝臓、肺、子宮筋層、卵巣、膵臓、膵頭、胎盤、前立腺、直腸、骨格筋、皮膚、小腸、脾臓、胃、精巣、甲状腺、扁桃腺、膀胱、子宮、胎児脳、および胎児腎臓について正常ヒト組織のサンプルを得た(剖検サンプルであった脳および胎児脳を除いて、地元の病院からの外科的サンプル)。
【0090】
組織学的に診断された腫瘍組織および正常組織の対を形成するサンプルを得た。本明細書で用いられる場合、「対を形成する」サンプルは、同じ被検体から得られた腫瘍組織および正常組織のサンプルである。肺腫瘍の23サンプル、前立腺腫瘍の9サンプル;大腸腫瘍の20サンプル;および乳房腫瘍の9サンプルを研究した。
【0091】
結果:正常組織
様々な正常(非癌性)組織タイプにおけるPBK mRNAの相対的な存在度を、上述の蛍光プローブポリメラーゼ連鎖反応を用いて決定した。結果を図1に示す。PBK mRNAは精巣において最も豊富であった。
【0092】
結果:肺腫瘍組織
肺腫瘍サンプルにおけるPBK mRNAを、対を形成する正常肺組織サンプルにおけるものと比較した。図2に示されるように、23の肺腫瘍サンプルのうちの13サンプル(57%)においてPBK mRNAが、その対を形成する正常肺組織と比較したときに少なくとも10倍高く発現した。
【0093】
結果:前立腺腫瘍組織
前立腺腫瘍サンプルにおけるPBK mRNAを、対を形成する正常前立腺組織サンプルにおけるものと比較した。図3に示されるように、9の前立腺腫瘍サンプルのうちの7サンプル(78%)においてPBK mRNAが、その対を形成する正常前立腺組織と比較したときに少なくとも10倍高く発現した。他の2つの腫瘍サンプルにおいては、腫瘍サンプル中のPBK mRNAのレベルは正常組織において検出されるものと同じ(「0」)であった。
【0094】
結果:大腸腫瘍組織
大腸腫瘍サンプルにおけるPBK mRNAを、対を形成する正常大腸組織サンプルにおけるものと比較した。図4に示されるように、20の肺腫瘍サンプルのうちの5サンプル(25%)においてPBK mRNAが、その対を形成する正常大腸組織と比較したときに少なくとも10倍高く発現した。
【0095】
結果:乳房腫瘍組織
乳房腫瘍サンプルにおけるPBK mRNAを、対を形成する正常乳房組織サンプルにおけるものと比較した。図5に示されるように、9の乳房腫瘍サンプルのうちの6サンプル(67%)において、PBK mRNAが、その対を形成する正常乳房組織と比較したときに少なくとも10倍高く発現した。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、正常ヒト組織におけるPBK mRNAの発現をグラフで表す。PBK mRNAの相対的な豊富さが様々な組織にわたって評価され、それはサンプル中のPBK mRNAのレベルの単位なしの測定値である。
【図2】図2は、ヒト肺腫瘍サンプルにおけるPBK mRNAの発現をグラフで表す。(対を形成する非癌性肺組織サンプルにおけるPBK mRNAの発現レベルと比較して)10倍以上の過剰発現が検査した23の肺腫瘍サンプルのうちの13(57%)で見出された。
【図3】図3は、ヒト前立腺腫瘍サンプルにおけるPBK mRNAの発現を、対を形成する正常前立腺サンプルと比較してグラフで表す。10×以上の過剰発現が検査した9つの前立腺腫瘍サンプルのうちの7つ(78%)で見出された。
【図4】図4は、ヒト大腸腫瘍サンプルにおけるPBK mRNAの発現を、対を形成する正常大腸組織サンプルと比較してグラフで表す。10×以上の過剰発現が検査した20の大腸腫瘍サンプルのうちの5つ(25%)で見出された。
【図5】図5は、ヒト乳房腫瘍サンプルにおけるPBK mRNAの発現を、対を形成する正常乳房組織サンプルと比較してグラフで表す。10×以上の過剰発現が検査した9つの乳房腫瘍サンプルのうちの6つ(67%)で見出された。
発明の分野
本発明はヒト癌の腫瘍マーカーとして利用することができるタンパク質、およびその使用方法に関する。
【0002】
発明の背景
様々な生化学的および免疫学的存在が哺乳動物における癌の存在、性質または程度を示すマーカーとして有用である。癌が産生するマーカー分子には、モノクローナル免疫グロブリン、ホルモン、分泌血清タンパク質、抗原、酵素およびアイソザイム、細胞表面マーカー、糖タンパク質および炭水化物、並びに細胞外マトリックスタンパク質およびムチンが含まれる。癌マーカーは、体液、例えば、血液、血漿、血清、浸出液、および尿中に現れる可溶性マーカーとして分類され得る。他の癌マーカーは、その特質上血清または他の体液中にいかなる有意の量でも放出されない細胞関連タンパク質および核酸である。細胞または組織関連腫瘍マーカーは、癌性細胞を含む組織サンプル中、またはそのような細胞を含む生物学的サンプル(例えば、脱落気管支上皮細胞を含有する痰サンプル)中で検出可能である。
【0003】
癌マーカーは(非癌性または正常細胞と比較して)癌細胞のほとんど分化していない状態を反映する癌発達マーカーであることがあり、または細胞分裂経路の活性化もしくは細胞死経路の阻害による細胞における分子変化を反映するものであり得る。細胞におけるこれらのマーカーの発現は、細胞を異常または(悪性の可能性のある)癌性と同定するのに利用することができる。
【0004】
癌においては、予測および治療の選択は、癌の成長の程度の他にその組織学的タイプに応じて変化する。癌の臨床診断が単一の試験に依存することはほとんどない;複数のマーカーを評価して治療計画の立案を補佐することができる。新規腫瘍マーカーを同定してヒト癌の検出、予測および監視の補佐をする必要性が存在し続けている。
【0005】
発明の要約
本発明の一側面は、非癌性細胞と比較してPDZ結合性キナーゼ(PBK)の過剰発現を特徴とする癌に関連するマーカータンパク質をコードするmRNAの検出方法である。組織の試験サンプルを得、その試験サンプルからのmRNAを、PBKをコードするmRNAに特異的にハイブリダイズするヌクレオチドプローブと接触させてハイブリダイゼーション産生物を形成する。ハイブリダイゼーション産生物の量を測定し、非悪性組織のサンプル中で予測されるものと比較する。
【0006】
本発明のさらなる側面は、非癌性細胞と比較してPDZ結合性キナーゼ(PBK)の過剰発現を特徴とする癌に関連するマーカータンパク質をコードするmRNAの検出方法であって、mRNAを組織の試験サンプルから得、PBKをコードするmRNAに特異的に結合する核酸配列プライマーを用いて増幅して増幅産生物を形成する方法である。増幅産生物の量を測定し、非悪性細胞におけるものと比較する。試験サンプルによって産生される増幅産生物の量が非悪性対照によって産生されるものよりも多いという知見は、試験サンプル中の癌性細胞の存在を示す。
【0007】
本発明のさらなる側面は、前立腺組織のサンプルを悪性腫瘍についてスクリーニングする方法であって、サンプル組織中のPBK mRNAの量を測定することによる方法である。非悪性前立腺組織と比較して上昇したPBK mRNAのレベルは、そのサンプル組織が悪性であることを示す。
【0008】
本発明のさらなる側面は、前立腺組織のサンプルを悪性腫瘍についてスクリーニングする方法であって、サンプル組織中のPBKタンパク質の量を測定することによる方法である。非悪性前立腺組織と比較して上昇したサンプル中のPBKのレベルは、そのサンプル組織が悪性であることを示す。
【0009】
本発明のさらなる側面は、乳房組織のサンプルを悪性腫瘍についてスクリーニングする方法であって、サンプル組織中のPBK mRNAの量を測定することによる方法である。非悪性乳房組織と比較して上昇したサンプル中のPBK mRNAのレベルは、そのサンプル組織が悪性であることを示す。
【0010】
本発明のさらなる側面は、乳房組織のサンプルを悪性腫瘍についてスクリーニングする方法であって、サンプル組織中のPBKタンパク質の量を測定することによる方法である。非悪性乳房組織と比較して上昇したサンプル中のPBKのレベルは、そのサンプル組織が悪性であることを示す。
【0011】
本発明のさらなる側面は、PBKを発現する細胞におけるPBK活性を阻害する能力について試験化合物をスクリーニングする方法である。この方法は、細胞を試験化合物に対して曝露し、細胞中に存在するPBK活性の量を検出し;および曝露した試験細胞におけるPBK活性の量を試験化合物に対して曝露しなかった対照細胞のものと比較することを含む。対照細胞と比較して減少した曝露した試験細胞におけるPBK活性の量は、その試験化合物が悪性細胞においてPBK活性を阻害することを示す。
【0012】
本発明のさらなる側面は、非癌性細胞と比較してPDZ結合性キナーゼ(PBK)の過剰発現を特徴とするヒト癌に関連するマーカータンパク質をコードするmRNAを検出するためのキットである。このキットは、長さが少なくとも20ヌクレオチドであり、ヒトPBK mRNA配列に相補的であり、かつヒトPBK mRNA配列に特異的にハイブリダイズして標識ハイブリダイゼーション産生物を形成することができる標識核酸配列を含む。このキットは、さらに、少なくとも1種類のヒト組織タイプの癌性細胞において予想されるPBK mRNAのレベルを記載する印刷説明書を含む。
【0013】
本発明のさらなる側面は、非癌性細胞と比較してPDZ結合性キナーゼ(PBK)の過剰発現を特徴とするヒト癌に関連するマーカータンパク質を検出するためのキットである。このキットは、ヒトPBKに特異的に結合する標識抗体、および少なくとも1種類のヒト組織タイプの癌性細胞において予想されるPBKのレベルを記載する印刷説明書を含む。
【0014】
本発明のさらなる側面は、そのゲノムがその内在性PDZ結合性キナーゼ(PBK)遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子内に破損を含むトランスジェニックまたは突然変異誘発マウスである。この破損は機能的PBKタンパク質の発現を妨げ、(野生型マウスと比較して)PBK活性のレベルが低下したトランスジェニックまたは突然変異誘発マウスを生じる。
【0015】
本発明のさらなる側面は、野生型マウスに対してPBK活性のレベルが減少したトランスジェニックマウスを産生するための方法である。この方法は、PBKターゲッティングベクターをマウス胚性幹細胞に導入し;該マウス胚性幹細胞をマウス胚盤胞に導入し;および該マウス胚盤胞を偽妊娠マウスに移植することを含む。
【0016】
本発明のさらなる側面は、そのゲノムが、ヒトPBKのすべてまたはその一部をコードするDNA配列を含み、該DNA配列が組織特異的プロモーターに作動可能に連結するトランスジーンを含むトランスジェニックマウスである。
【0017】
詳細な説明
近年同定されたプロテインキナーゼが、本発明者らにより、腫瘍マーカーとして有用であることが確認されている。このキナーゼは Gaudet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(10):5167 (2000) によって「PBK(PDZ−binding kinase:PDZ結合キナーゼ)」と命名され、また別途、Abe et al., J. Biological Chem. 275(28):21525 (2000) によって「TOPK」(T−LAK cell−originated protein kinase:T−LAK細胞起源プロテインキナーゼ)と名付けられた。本明細書では、このキナーゼをPBK(PDZ−binding kinase:PDZ結合キナーゼ)と呼ぶ。PDZドメインは特定細胞下部位、例えば、上皮細胞タイトジャンクションおよびニューロンシナプス後高密度部でのタンパク−タンパク相互作用を介在する。大部分のPDZドメインは、それらのタンパク質パートナーの最外カルボキシ末端配列に結合する。Fuh et al., J Biol Chem 275(28):21486 (2000)。
【0018】
PBKは以下のアミノ酸配列を有する322アミノ酸セリン/トレオニンキナーゼである。
【0019】
Gaudet et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(10):5167 によって報告されたこのアミノ酸配列は107位にセリン(S)を含む(GenBank登録番号AF189722;107位は上記配列において下線を付されたボールド体で示される)。Abe et al., J. Biological Chem. 275(28):21525 および本発明者らは、この位置にアスパラギン(N)を同定した(配列番号3)。PBKは特徴的なキナーゼサブドメインおよびC末端PDZ結合性T/SXVモチーフを有する。このセリン/トレオニンキナーゼ、すなわち二重特異性キナーゼのコンセンサスD−X−K−X−X−N配列が配列番号2の残基167−172に見出される(上記下線部)。PBKはヒトhDlg(Drosophila Discs−Large(Dlg)腫瘍抑制タンパク質のヒト類似体)のPDZ2に特異的に結合する。Gaudet et al.。このPDZキナーゼをコードする完全長cDNAは本明細書では配列番号1として示される。
【0020】
PBKキナーゼmRNA発現の組織分布は、Abeらにより、精巣、T−LAK(リンホカイン活性化キラーT)細胞、活性化リンパ系細胞およびRPMI 1788 B細胞リンパ腫細胞に特異的なものとして報告された。Gaudetらは、PBKのmRNAが胎盤において最も豊富であり、成人脳組織には存在していなかったと述べている。
【0021】
「癌」、「悪性腫瘍(malignancy)」および「悪性腫瘍(malignant tumor)」という用語は、当業者によって理解されるように、様々なタイプの悪性新生物のいずれかを指すのに用いられる。新生物は細胞増殖によって生成される異常な組織増殖を指す。新生物は、通常は、構造的組織化の欠如および/または正常組織との機能的協調の欠如を示し、識別可能な組織塊を形成し得る。新生物は良性または悪性のいずれかであり得る。「悪性」は周囲の組織に侵入する新生物の能力を指す。悪性増殖は、通常、原発部位から解剖的に隔たっている部位へと転移しやすい。
【0022】
本明細書中で用いられる場合、悪性腫瘍細胞または癌細胞は、悪性転換現象を経験した細胞を指す。悪性転換は、癌性増殖を引き起こす細胞能力を大きく増加させる細胞における変化を指し、悪性転換は、当該技術分野において公知のように、細胞の増殖特性、組織学、および/または細胞の形態における変化によって同定することができる。
【0023】
「固形腫瘍」という用語は、その医学的に認められた意味で用いられ、白血病のような血液の癌は含まない。
【0024】
ここで用いられる場合、「癌マーカー」または「腫瘍マーカー」は癌性増殖もしくは腫瘍の存在、またはその程度の指標である。当該技術分野においては、腫瘍マーカーは、臨床実務において有用である上では、100%特異的であったり100%感受性であったりする必要はないことが公知である。臨床癌診断は単一のマーカーの評価に依存することはほとんどなく、ヒト癌の診断を行う場合、通常は、さらなる診断、実験および臨床手順および観察が考慮される。
【0025】
「癌診断」という用語は、癌または悪性腫瘍の存在の同定の他に、悪性疾患からの良性の区別化を指す。本明細書中で用いられる場合、予後は、当該技術分野において公知であるように、治療に対する応答、再発、生存時間、または他の効果指標の点で患者の経過がどの程度良好であるか、またはどの程度不十分であるかの評価または予測を指す。ここで用いられる場合、モニタリングは、疾患進行の徴候を検出するための患者の反復評価を指す。モニタリングは治療の期間中その治療の効果を評価するために行うことができるし、最小残余疾患、再発疾患、または継続する疾患の進行を検出するために治療後に行うこともできる。
【0026】
前立腺癌は、前立腺から離れてはいるが前立腺癌を起源とする転移性腫瘍を含む、前立腺細胞から生じるあらゆる組織学的タイプの癌を指す。大部分の前立腺癌は腺癌であるが、癌肉腫、移行細胞、小細胞、原発性肉腫、および他の組織学的タイプもより低い頻度で生じる。前立腺癌は十分に認知されている疾患である。
【0027】
乳癌は、乳房から離れてはいるが乳癌を起源とする転移性腫瘍を含む、乳房組織細胞から生じるあらゆる組織学的タイプの癌を指す。大部分の乳癌は上皮細胞から生じるが、他の組織学的タイプの乳癌も報告されている。乳癌は十分に認知されている疾患である。
【0028】
腫瘍マーカーは、罹患していることが(すなわち、悪性もしくは癌性細胞を含むことが)疑われる組織内で、または様々な供給源、例えば、痰、尿、腫瘍液、もしくは乳汁からの剥脱細胞材料の間接的コレクションにより、アッセイすることができる。
【0029】
本発明者らは、PBK mRNAが、対応する正常組織サンプルと比較して腫瘍組織サンプルにおいて過剰発現することを決定している。したがって、PBKまたはPBKをコードする核酸分子の検出および/または定量的測定は悪性腫瘍の検出において有用である。本発明の一態様においては、本発明の方法が前立腺組織サンプルにおける前立腺癌細胞の存在の検出に用いられる。本発明の別の態様においては、これらの方法が乳房組織サンプルにおける乳癌細胞の存在の検出に用いられる。本発明のさらなる態様においては、これらの方法が大腸組織サンプルにおける大腸癌細胞の検出、および肺組織サンプルにおける肺癌細胞の検出に用いられる。
【0030】
本発明はPBKタンパク質およびその対立遺伝子変異体、並びにPBKをコードする核酸分子(およびそれらの変異体)の、癌性組織を検出するためのマーカーとしての使用を含む。これらのマーカーは、同じ組織タイプの正常細胞におけるレベルと比較して、癌細胞においては増大したレベルで、特徴的に存在する。非癌性組織または非増殖性組織においては、PBKマーカーは低レベルまたは検出不能なレベルで存在し得る。PBK「マーカー」にはPBKタンパク質並びにそれらの変異体および断片、並びにPBKまたはそれらの変異体もしくは断片をコードする核酸分子が含まれる。本明細書中で用いられる場合、PBKマーカーの「増大したレベル」は予め決定された標準を上回って増大するレベル、または対照サンプルにおけるレベルを上回って増大するレベルを指す。予め決定される標準は、疑われる悪性腫瘍について試験される組織と同じタイプの健常(非癌性)組織サンプルにおけるPBKマーカーの通常の測定に基づくものであり得る。予め決定される標準はゼロもしくは検出不能であってもよく、または正の量であってもよい。あるいは、被験体を試験する場合には、予め決定される標準はその被験体の以前の試験結果に基づくものであってもよく、またはその被験体からの正常組織におけるPBKの測定に基づくものであってもよい。
【0031】
したがって、本発明の方法は、細胞、組織またはそれらの抽出物をヒトから単離し、さらにPBKマーカーの比較レベルをPBK活性の増大を伴う疾患、例えば、癌、増殖性障害、病的血管形成、および炎症の指標として測定することを含む。本発明の好ましい方法は、細胞、組織またはそれらの抽出物をヒトから単離し、さらに細胞または組織の悪性状態を予測する助けとなるPBKマーカーの比較レベルを測定することを含む。
【0032】
疾患が存在しない場合であっても試験結果が正常標準から幾らか変動することがあることは医学的診断においてはよく知られている。したがって、正常標準はある範囲をもつ値を含み得る。疾患を示すことが認められているマーカーのレベル(「診断レベル」)は正常レベルの数倍であり得る。特定の組織または特定の疾患のPBKマーカーの診断レベル、および疾患の存在をある程度の確実性で示唆する診断レベルを決定するのに、公知の統計法を用いることができる。例えば、PBK mRNAの診断レベルは、標的組織の正常レベルの1.5倍(1.5×)、正常レベルの2倍(2×)、正常レベルの5倍(5×)、正常レベルの10倍(10×)、正常レベルの100倍(100×)、正常レベルの500倍(500×)、正常レベルの1000倍(1,000×)、正常レベルの1500倍(1,500×)、またはそれ以上に設定することができる。通常、診断レベルは、その診断レベルの疾患マーカーが見出されるときには統計学的におそらく被験体が標的疾患を有する点に設定する。
【0033】
疾患の指標と見なされるPBKマーカーのレベルは試験する標的組織の間で異なっていてよい。正常PBKマーカー標準、およびPBKマーカー診断レベルは、特定の組織タイプまたは疾患について、当該技術分野において公知の日常的な診断および臨床試験法を用いて決定することができる。当業者に明らかなように、本発明の方法のための標準または診断レベルを確立するためのデータを得るのにあらゆる数のプロトコルを用いることができる。
【0034】
本発明の方法は、固形腫瘍、前立腺癌、肺癌、大腸癌、および乳癌を含むがこれらに限定されるものではない、PBKマーカーの増加に関連付けられている疾患状態を有することが疑われる被験体に、用いることができる。本発明の方法は、以前に標的状態を有すると診断されている被験体のモニタリング、標的状態の治療を受けている被験体のモニタリング、または以前に標的状態と診断されてはいない被験体のスクリーニングに用いることができる。本明細書に開示される方法は、前立腺組織サンプルおよび乳房組織サンプルをスクリーニングしてそれらに含まれる細胞が癌性であるかどうかを決定するのに特に適する。
【0035】
本明細書中で用いられる場合、スクリーニングおよび診断方法は、そのような方法が標的疾患の検出において100%特異的または100%感受性であることを示すものではない。しかしながら、複数のサンプルの試験においては、診断レベルまたはそれを上回るレベルであると判定されるサンプルの大部分は悪性組織を含む。本発明の方法の特異性および/または感受性は、当業者には明らかなように、試験される病的状態、用いられる生物学的サンプル、被験体の全身的健康状態、および他の要因に依存して様々であり得る。組織サンプル中の悪性と非悪性細胞との相対数が試験結果に影響を及ぼすことも容易に理解される。すなわち、非悪性細胞のより大きなサンプル内に悪性細胞の小病巣を含むサンプルは、基本的に全て悪性細胞を含むサンプルよりも偽陰性と判定される可能性が高い。
【0036】
本発明の一態様においては、癌性細胞を含むことが疑われる組織サンプル中に存在するPBK mRNAの量を測定し、予め決定された標準と比較するか、または同じタイプの正常(非癌性)組織のサンプル中に存在するPBK mRNAの量と比較する。mRNAレベルの様々な測定方法または比較方法が当該技術分野において公知である。mRNAの定量的測定のための好ましい1つの方法は、当該技術分野において公知のように、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)技術を用いる。特に好ましい方法はTAQMAN(R)(PE Applied Biosystems、Foster City、CA)、リアルタイム蛍光プローブポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のシステムを利用する。この方法は標的配列に相補的である蛍光発生プローブを用い、このプローブはPCR反応混合物に添加される。このプローブは、レポーターおよびクエンチャー色素が結合するオリゴヌクレオチドを含む。PCRの間に標的核酸が存在する場合、このプローブがフォワードおよびリバースプライマー部位の間で特異的にアニールする。ポリメラーゼがこのプローブを開裂し、レポーター色素の蛍光強度の増加を生じる。その後、蛍光発光を記録し、および/または測定する。例えば、Orlando, C., P., Pinzani, and M., Pazzagli. ”Developments in quantitative PCR” Clin Chem Lab Med 36 (1998): 255−269;Brink et al., ”Comparative quantification of IL−1beta, IL−10, IL−10r, TNFalpha and IL−7 mRNA levels in UV−irradiated human skin in vivo”, Inflamm Res 49(6):290 (2000) を参照のこと。当業者には公知のように、各々のプライマーおよびプローブのセットについてPCR反応の最適化が必要である。プライマーおよびプローブの選択の補助に市販ソフトウェアを利用することができる(例えば、Perkin Elmer PE/ABD Primer Express software)。例えば、Heid et al., Real−time quantitative PCR. Genome Res 6:986 (1996);Livak et al., PCR Methods Appl 4:357 (1995);Holland et al., Proc Natl Acad Sci USA 88:7276 (1991);Gelmini et al., Clin. Chem 43:752 (1997);Marcucci et al., Leukemia 12 (1998) を参照のこと。
【0037】
当該技術分野において公知のように、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、固定化組織サンプル、脱落細胞、および骨髄吸引物を含む組織サンプル中のDNAまたはmRNAの測定が可能となる。PCR技術の多くのバリエーションが公知であり、当業者は、分析するDNAまたはmRNAの性質、組織、およびアッセイの望ましい感受性に基づいて適切なPCR条件を決定することができる。
【0038】
本発明のさらなる態様においては、癌性細胞を含むことが疑われる組織サンプル中に存在するPBKタンパク質の量を測定し、予め決定された標準と比較するか、または同じタイプの正常(非癌性)組織のサンプル中に存在するPBKタンパク質の量と比較する。標的タンパク質に特異的に結合する標識モノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用を含むがこれらに限定されるものではないタンパク質の定量的検出方法が公知である。PBKタンパク質の量はサンプルの容量当たりのPBKタンパク質の量として、または総タンパク質に対するパーセンテージとして決定することができる。
【0039】
本発明において有用である抗体には、配列番号1、配列番号2または配列番号3のペプチドに特異的に結合するもの、およびそのような抗体のフラグメントが含まれ、それらのフラグメントは配列番号1、配列番号2または配列番号3のペプチドに特異的に結合する。そのような抗体及び抗体フラグメントは、当該技術分野において公知の様々な技術によって産生することができる。「抗体」という用語は、本明細書中で用いられる場合、IgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEを含む免疫グロブリンのすべてのタイプを指す。これらのうち、IgMおよびIgGが好ましい。抗体はモノクローナルであってもポリクローナルであってもよく、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびウマを含むがこれらに限定されるものではないあらゆる種を起源とするものであってよく、またキメラ抗体であってもよい。
【0040】
本発明の方法において用いられるモノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature, 265:495 (1975) の技術および当該技術分野において公知の他の技術に従って、ハイブリドーマ細胞系において産生することができる。腫瘍マーカーに特異的なモノクローナル抗体により、免疫放射線技術、免疫酵素技術、または免疫組織化学技術(これらは当該技術分野において公知である)を使用して、その腫瘍マーカーを検出することが可能となる。
【0041】
癌マーカーに対する抗体は組織学的切片中の該マーカーの存在の検出、正常細胞からの腫瘍細胞の分別に有用である。免疫組織学的染色も、例えば外科的に切除したサンプルが切除縁に罹患組織を有するかどうかを評価するための、病変のより正確な定義付けを可能とする。したがって、PBK抗体は、それらがパラフィン包埋組織またはホルマリン固定組織における使用に適するとき、特に有用である。
【0042】
本発明の方法において有用である抗体は、当該技術分野において公知のように、検出可能なシグナルを生じるように標識することができる。そのような標識には放射性標識、蛍光標識および酵素標識が含まれる。適切なイムノアッセイの例には、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素結合イムノアッセイ等が含まれる。本明細書中で説明される抗体は、さらに、診断アッセイにおいて用いるのに適する固体支持体(例えば、ラテックスまたはポリスチレンのような材料から形成される、ビーズ、プレート、スライドまたはウェル)に結合させることができる。
【0043】
本明細書中で開示される方法において用いるために被験体から採取されるサンプルは、一般には、組織のサンプル、または試験しようとする組織に由来する細胞を含む体液のサンプルである。サンプルは当該技術分野において公知であるあらゆる方法によって得ることができ、これには外科的切除、針吸引生検、およびパンチ生検が含まれるがこれらに限定されるものではない。当該技術分野において公知のように、PBKタンパク質または核酸分子の検出に先立ち、サンプルに追加の通常調製工程を施すことができる。そのような工程には、例えば、保存剤の添加またはマトリックス中への組織サンプルの固定化が含まれる。
【0044】
本明細書中で開示される方法は、PBKタンパク質、そのタンパク質の断片もしくは変異体、またはPBKタンパク質をコードする核酸(またはそれらの断片もしくは変異体)の測定による、生物学的サンプル中に存在するPBKの量の評価を提供する。好ましい態様においては、PBK mRNAの量を測定する。しかしながら、当業者に明らかなように、悪性細胞および正常(非悪性)細胞中のPBKマーカーの比較量を検出するあらゆる適切な方法を本発明において用いることができる。
【0045】
本発明は、本明細書中で開示されるようなPBKタンパク質またはペプチドの変異体の使用ももたらす。本明細書で提供されるPBKタンパク質配列の天然変異体は、保存的なアミノ酸配列差異またはマイナーな非保存的配列差異の分だけ異なり得る。変異体PBKタンパク質またはペプチドは、好ましくは、本明細書で提供されるPBK配列(配列番号2および3)に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、またはそれ以上の配列同一性を有する。保存的アミノ酸置換には以下のグループ内での置換が含まれる:
グリシン、アラニン;
バリン、イソロイシン、ロイシン;
アスパラギン酸、グルタミン酸;
アスパラギン、グルタミン;
セリン、トレオニン;
リジン、アルギニン;
フェニルアラニン、チロシン。
【0046】
「同一性パーセント」または「相同性パーセント」という用語は、2つ以上のアミノ酸配列または核酸配列の比較において見出される配列類似性のパーセンテージを指す。同一性パーセントはコンピューターを用いて、例えば、MegAlignTMプログラム(DNASTAR,Inc.、Madison Wis.)を用いることによって決定することができる。MegAlignTMプログラムは、別の方法、例えば、クラスタル(clustal)法(例えば、Higgins, D. G. and P. M. Sharp (1988) Gene 73: 237−244 を参照)に従って2つ以上の配列間のアラインメントを行うことができる。このクラスタルアルゴリズムは、すべてのペアの間の距離を調べることにより、配列をクラスターにグループ化する。これらのクラスターを二つ一組で、次いでグループとしてアラインメントする。2つのアミノ酸配列、例えば、配列Aおよび配列Bの間での類似性パーセンテージは、配列Aおよび配列Bの間で一致する残基の合計を、「配列Aの長さ − 配列A内のギャップ残基数 − 配列B内のギャップ残基数」で除算し、それに100を乗算することによって算出する。2つのアミノ酸配列の間で低い類似性を示すかまたは類似性なしのギャップは類似性パーセンテージの決定には含まれない。核酸配列間の同一性パーセントは当該技術分野において公知の他の方法、例えば、Jotun Hein法によってもカウントまたは算出することができる(例えば、Hein. J. (1990) Methods Enzymol. 183:626−645 を参照)。
【0047】
「実質的な配列類似性」という用語は、本明細書中で用いられる場合、本明細書に開示されるものに対して僅かな、かつ重大ではない配列変化を有するDNA、RNAまたはアミノ酸配列が等価であるとみなすことを意味する。実質的な配列類似性を有する分子は機能的に等価であり、すなわち、本明細書に具体的に開示される配列と実質的に同じ様式で機能して実質的に同じ組成物および結果を生じる。実質的な配列類似性を有する分子は、典型的には少なくとも約70%の配列同一性を有し、好ましくは配列が少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、または97%以上もの類似性を示す。
【0048】
核酸、ペプチド、またはタンパク質分子への言及における「単離された」という用語の使用は、それらの分子がヒトの活動によってそれらの天然 in vivo 細胞成分から分離されていることを意味する。
【0049】
ここで用いられる場合、「ストリンジェントな条件」という用語は、ポリヌクレオチドと、本明細書に開示されるPBKタンパク質をコードする核酸分子との、ハイブリダイズする条件を指す。ストリンジェントな条件は、塩濃度、有機溶媒(例えば、ホルムアミド)の濃度、温度、および当該技術分野において周知の他の条件によって規定することができる。特には、塩濃度の低下、ホルムアミド濃度の増加、またはハイブリダイゼーション温度の上昇によってストリンジェンシーを高めることができる。
【0050】
例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約750mM NaClおよび75mMクエン酸三ナトリウム未満であり、好ましくは約500mM NaClおよび50mMクエン酸三ナトリウム未満であり、最も好ましくは約250mM NaClおよび25mMクエン酸三ナトリウム未満である。有機溶媒、例えば、ホルムアミドの不在下では低ストリンジェントなハイブリダイゼーションを実施することができ、これに対して少なくとも約35%ホルムアミド、最も好ましくは少なくとも約50%ホルムアミドの存在下で高ストリンジェントなハイブリダイゼーションを実施することができる。ストリンジェントな温度条件には、通常、少なくとも約30℃、より好ましくは少なくとも約37℃、最も好ましくは少なくとも約42℃の温度が含まれる。変動するさらなるパラメータ、例えば、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤(例えば、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS))の濃度、および担体DNAの含有または排除は、当業者に周知である。これらの様々な条件を必要に応じて組み合わせることによって様々なレベルのストリンジェンシーが達成される。好ましい態様においては、ハイブリダイゼーションを30℃で、750mM NaCl、75mMクエン酸三ナトリウム、および1%SDS中において行う。より好ましい態様においては、ハイブリダイゼーションを37℃で、500mM NaCl、50mMクエン酸三ナトリウム、1%SDS、35%ホルムアミド、および100μg/ml変性サケ精子DNA(ssDNA)において行う。最も好ましい態様においては、ハイブリダイゼーションを42℃で、250mM NaCl、25mMクエン酸三ナトリウム、1%SDS、50%ホルムアミド、および200μg/ml ssDNAにおいて行う。これらの条件に関する有用な変更は当業者には容易に明らかとなろう。
【0051】
ハイブリダイゼーションに続く洗浄工程もストリンジェンシーの点で変更され得る。洗浄ストリンジェンシー条件は塩濃度および温度によって規定することができる。上述と同様に、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を低下させることにより、または温度を増加させることにより高めることができる。例えば、洗浄工程のストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約30mM NaClおよび3mMクエン酸三ナトリウム未満であり、最も好ましくは約15mM NaClおよび1.5mMクエン酸三ナトリウム未満である。洗浄工程のストリンジェントな温度条件には、通常、少なくとも約25℃、より好ましくは少なくとも約42℃、最も好ましくは少なくとも約68℃の温度が含まれる。好ましい態様においては、洗浄工程は25℃で、30mM NaCl、3mMクエン酸三ナトリウム、および0.1%SDSにおいて行う。より好ましい態様においては、洗浄工程は42℃で、15mM NaCl、1.5mMクエン酸三ナトリウム、および0.1%SDSにおいて行う。最も好ましい態様においては、洗浄工程は68℃で、15mM NaCl、1.5mMクエン酸三ナトリウム、および0.1%SDSにおいて行う。これらの条件に関するさらなる変更は当業者には容易に明らかであろう。
【0052】
本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件(本明細書で定義される)下で、配列番号1によって表されるヌクレオチド配列の全体もしくは一部またはその相補体にハイブリダイズする核酸分子の検出(ここで、検出される核酸分子は機能的PBKタンパク質をコードする)も包含する。ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズする部分は、典型的には、長さが少なくとも15(例えば、20、25、30、または50)ヌクレオチドである。ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズする部分は、PBKタンパク質をコードする核酸の一部もしくは全体の配列、またはその相補体に対して少なくとも80%、少なくとも95%、または少なくとも98%以上同一である。本明細書に記載されるタイプのハイブリダイズする核酸は、例えば、クローニングプローブ、プライマー(例えば、PCRプライマー)、または診断用プローブとして用いることができる。さらなる手引きは、例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press, NY;および Ausubel et al. (eds.) 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, NY) により、当該技術分野において容易に入手可能である。
【0053】
本発明は、本明細書中で提供される診断法において用いるための、PBKマーカーの検出において有用なオリゴヌクレオチドプローブ、および またはPBKマーカーの検出において有用な抗体を含むキットを提供する。オリゴヌクレオチドプローブはPBKヌクレオチド配列に基づくものであって、好ましくは、長さが約10、20、30、40、50もしくはそれ以上のヌクレオチドである。そのようなオリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチド対の組合せは、PBK腫瘍マーカーのPCRに基づく検出および腫瘍組織サンプルの in−situ ハイブリダイゼーションにおけるプライマーとして有用である。これらのオリゴヌクレオチドは、分解に対するオリゴヌクレオチドの抵抗性を高めるため、1つ以上の修飾された連結基、糖残基および/または塩基を含んでいてもよい。このキットは、特定のタイプの組織におけるPBKヌクレオチドマーカーの標準および診断レベルを記載した印刷された取扱説明書をさらに含んでもよい。この試験キットの構成要素は任意の適切な様式で一緒に包装され、典型的には、単一の容器内にすべての構成要素を含み、かつ試験を実施するための印刷された取扱説明書を含む。この試験キットは、標準または対照として用いられる、PBKをコードする既知量の核酸分子をさらに含んでいてもよい。
【0054】
本発明のさらなる態様は、PBKタンパク質に特異的な抗体を含み、かつ特定のタイプの組織におけるPBKタンパク質の標準および診断レベルを記載した文書化された取扱説明書をさらに含む試験キットである。これらの抗体は固体支持体に結合されていてもよく、または検出可能な構成要素に結合されていてもよい。この試験キットの構成要素は任意の適切な様式で一緒に包装され、典型的には、単一の容器内にすべての構成要素を含み、かつ試験を実施するための印刷された取扱説明書を含む。
【0055】
本発明は、潜在的な医薬作用、例えば、抗癌作用について薬剤をスクリーニングする方法であって、該薬剤がPBKマーカーの減少を引き起こすものである前記方法をさらに提供する。そのような薬剤は、PBK遺伝子の発現を転写もしくは翻訳レベルのいずれかで直接阻害するか、またはPBK活性を阻害するか、またはPBKがはたらく生物学的経路内の工程を阻害し、その結果PBKマーカーの減少を引き起こす。このような方法は、PBKマーカーを過剰発現する細胞を薬剤に対して曝露し、次いで薬剤に曝露した後の細胞中のPBKマーカーのレベルを測定することを含む。細胞はin vitroであってもin vivoであってもよく、腫瘍細胞であっても新生物細胞であってもよい。特に好ましいのはヒト癌の組織培養法および非ヒト哺乳動物モデルである。薬剤は動物に全身的に投与することができ、または新生物増殖体に直接投与することもできる。PBKマーカーのレベルを予め決定された標準に対してまたは対照において見出されるレベルに対して比較する。PBKマーカーのレベルの減少は、その薬剤がPBK遺伝子発現または活性を阻害し、抗癌作用を有し得ることを示す。このようなスクリーニング法は、前立腺癌、乳癌、肺癌および大腸癌の動物モデルまたは細胞培養モデルにおける使用に特に適する。あるいは、このようなスクリーニング法は、同じタイプの非転換細胞と比較してPBKマーカーのレベルが増大している悪性転換細胞系のin vitroスクリーニングによって行うこともできる。PBKマーカーのレベルが有意に減少する場合、たとえそのPBKマーカーのレベルが標準または正常レベルを上回り続けているとしても、その薬剤は阻害性であるとみなすことができる。理想的には、PBKマーカーのレベルは、阻害性薬剤に対して曝露しなかった同じ細胞系に対して少なくとも20%、25%もしくは50%、好ましくは少なくとも70%以上減少する。PBK mRNAまたはPBKタンパク質産生の潜在的阻害剤の例には、アンチセンスRNA、PBKタンパク質の競合阻害剤、例えば、PBKタンパク質の断片、またはPBKタンパク質に対する抗体が含まれる。PBK阻害剤は、PBKタンパク質をコードする核酸分子、すなわち、PBK遺伝子もしくはそれらのRNA転写体、またはPBKタンパク質それ自体、またはそれらのサブユニットに対するものであり得る。PBK阻害剤として機能し得る物質には、これらに限定されるものではないが、PBKとその基質との相互作用を特異的に阻害する化合物、PBKタンパク質を特異的に分解または不活性化する化合物、およびPBKタンパク質の発現を特異的に妨害する化合物が含まれる。そのような薬剤には、PBKの化合物阻害剤、タンパク質もしくはペプチドPBKのアンタゴニストもしくは競合阻害剤、PBKタンパク質に対する抗体、およびPBKの発現を阻害する分子、例えば、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー等が含まれ得る。
【0056】
また本発明は、PBK活性レベルの上昇が生じる癌性、新生物性、または過剰増殖性(hyperproliferative)増殖の治療方法を包含する。この方法は、癌細胞を、PBKの活性(または発現)を阻害する作用物質に対して曝露することを含み、作用物質の量はそうでなければそれらの細胞中に存在するであろうPBK活性(または発現)(すなわち、阻害性作用物質の不在下で生じると予想される活性または発現)を低下または阻害するのに十分なものである。好ましくは、PBK阻害性作用物質は、PBKの活性または発現を同じ組織タイプの非罹患細胞に見出されるレベルまで低下させる量で提供される。PBK阻害剤は、PBKマーカーが上昇している癌、新生物、または過剰増殖障害を患う被検体に全身投与することができ、または、例えば局所注射により、増殖物(growth)に直接投与することができる。この増殖物は、例えば、前立腺癌または乳癌であり得る。PBK阻害剤の最適投与量は、癌の進行のタイプおよび程度、患者の全体的な健康状態、阻害剤の効力、並びに投与経路のような要因に応じて変化するだろう。PBK阻害剤投与量の最適化は当技術分野における通常の技術の範囲内である。
【0057】
PBK阻害剤は、PBKタンパク質をコードする核酸分子、すなわち、PBK遺伝子またはそれらのRNA転写産物、またはPBKタンパク質それ自体、またはそれらのサブユニットを指向するものであり得る。PBK阻害剤として機能し得る物質には、これらに限定されるものではないが、PBKとその基質との間の相互作用を特異的に阻害する化合物、PBKタンパク質を特異的に分解または不活性化する化合物、およびPBKタンパク質の発現を特異的に妨害する化合物が含まれる。そのような作用物質には、PBKの化学物阻害剤、タンパク質もしくはペプチドPBKアンタゴニスト、およびPBKの発現を阻害する分子、例えば、三重らせん(triplex)形成オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム等が含まれ得る。
【0058】
マウスPBKキナーゼcDNA配列が単離され(配列番号7)、コードされたアミノ酸配列が本発明者らによって以下のように決定された:
【0059】
セリン/トレオニンまたは二重特異性キナーゼのコンセンサスD−X−K−X−X−N配列には上記で下線が付されている。GenBank登録番号AB041882は本質的に類似する配列を提供し、これはマウスTOPK(T細胞起源プロテインキナーゼ(T−cell−originated protein kinase))と同定される。Abeら, J. Biological Chem. 275(28):21525 (2000) も参照のこと。GenBank登録番号AB041882で提供されるアミノ酸配列は、(上記配列において下線を付されたボールド体で示される)313位でイソロイシン(I)を挙げる。
【0060】
また内在性PBK遺伝子の対立遺伝子のうちの少なくとも1つが機能的に破壊されている生殖細胞および/または体細胞を有するトランスジェニック非ヒト動物、好ましくはマウスも本発明によって提供される。この動物は、PBK遺伝子破壊についてヘテロ接合であってもよく、またはより好ましくはホモ接合でありうる。内在性PBK遺伝子が機能的に破壊されているホモ接合動物においては、PBK活性は野生型動物において見出されるものに対して実質的に低下している。本発明のトランスジェニック動物は、PBK阻害剤の効力の評価およびPBK阻害剤で治療することができる疾患状態の同定に陽性対照として用いることができる。内在性PBK遺伝子が機能的に破壊されてはいるが異種PBK遺伝子(好ましくは、ヒト)で再構成されているトランスジェニック非ヒト動物、好ましくはマウスも提供される。このような動物は、in vivoでヒトPBK活性を阻害する作用物質を同定するのに用いることができる。宿主細胞中の内在性PBK遺伝子を機能的に破壊するための核酸構築物、その核酸構築物を含む組換えベクター、およびその核酸構築物が導入されている宿主細胞も本発明に包含される。内在性PBKの発現が野生型動物において見られるものに対して増加している非ヒト動物も提供される;そのような過剰発現はその動物の特定の組織タイプまたは解剖学的領域に限定され得る。異種PBKの発現が動物の特定の組織タイプまたは解剖学的領域において達成されている非ヒト動物も提供される。
【0061】
本発明は、内在性PBK遺伝子の対立遺伝子のうちの少なくとも一方、より好ましくは両者が機能的に破壊されている体細胞および/または生殖細胞を有する非ヒト動物(好ましくは非ヒト哺乳動物、より好ましくはマウス)に関する。したがって、本発明は、改変されたPBK遺伝子を有し、したがって少なくとも1つの組織タイプにおけるPBK活性を欠く(または、野生型動物において観察されるものと比較してPBK活性が実質的に低下している)生存可能な動物を提供する。本発明の非ヒト動物は、例えば、PBK阻害剤を評価するための標準対照として、それによりin vivoでヒトPBK阻害剤をスクリーニングするためのモデル系を創出し、および/またはPBK阻害剤での治療に対する疾患状態を確認するための正常ヒトPBK遺伝子のレシピエントとして有用である。
【0062】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物において、PBK遺伝子は、好ましくは、内在性対立遺伝子とその動物の胚性幹細胞前駆体に導入されている改変もしくは異種PBK遺伝子、またはそれらの一部との間の相同組換えによって破壊されている。内在性PBK遺伝子への無発現変異(null mutation)の導入の考慮に加えて、PBK遺伝子の対立遺伝子に点突然変異または欠失を導入してPBK遺伝子活性を改変するのに類似の技術を用いることができる。その後、胚性幹細胞前駆体を発達させ、機能的に破壊されたPBK遺伝子を含む改変されたPBK遺伝子を有する動物が生じる。この動物は機能的に破壊された1つのPBK遺伝子の対立遺伝子を有することができ(すなわち、この動物はこの改変についてヘテロ接合であり得る)、より好ましくは、この動物は機能的に破壊された両方のPBK遺伝子の対立遺伝子を有する(すなわち、この動物はこの改変についてホモ接合であり得る)。
【0063】
本発明の一実施形態においては、両方のPBK遺伝子の対立遺伝子の機能的破壊は、動物の細胞におけるPBK遺伝子産物の発現が非改変動物に対して実質的に不在である動物を生じる。別の実施形態においては、PBK遺伝子の対立遺伝子を、動物の細胞において改変された(すなわち、突然変異体または非野生型)PBK遺伝子産物が産生されるように破壊することができる。
【0064】
加えて、本発明の動物は、特定の疾患状態がPBKの作用に関与し、したがって、PBK阻害剤によって潜在的に治療し得るか否かを決定するのに有用である。例えば、機能的に破壊されたPBK遺伝子を有する本発明の動物において疾患状態を誘導する試みをなすことができる。続いて、疾患状態に対するその動物の羅病性または耐性を決定することができる。疾患状態に対する本発明の動物の耐性に基づき、PBK阻害剤で治療可能である疾患状態を同定することができる。
【0065】
本発明の別の態様は、機能的に破壊された内在性PBK遺伝子を有するが異種PBKをコードする導入遺伝子(すなわち、別の種に由来するPBK遺伝子)もそのゲノム内に担持し、かつそれを発現するトランスジェニック非ヒト動物に関する。好ましくは、この動物はマウスであり、かつ異種PBKはヒトPBK、例えば、本明細書で提供される配列番号2または配列番号3のPBKである。ヒトPBKで再構成されている本発明の動物は、in vivoでヒトPBKを阻害する作用物質の同定に用いることができる。例えば、この動物を、試験しようとする作用物質の存在下および不在下でPBKの産生を誘導する刺激に曝露し、およびその動物におけるPBK応答を測定することができる。作用物質の不在下でのPBK応答と比較して作用物質の存在下でのPBK応答の減少に基づき、in vivoでヒトPBKを阻害する作用物質を同定することができる。
【0066】
本発明のさらに別の態様は、宿主細胞中のPBK遺伝子を機能的に破壊するための核酸構築物に関する。この核酸構築物は:a)非相同置換部分;b)第1PBK遺伝子配列と実質的な同一性を有するヌクレオチド配列を有する、非相同置換部分の上流に位置する第1相同領域;およびc)第2PBK遺伝子配列と実質的な同一性を有するヌクレオチド配列を有する、非相同置換部分の下流に位置する第2相同領域を含み、第2PBK遺伝子配列は天然内在性PBK遺伝子において第1遺伝子配列の下流に位置する。加えて、第1および第2相同領域は、核酸分子が宿主細胞に導入される場合、宿主細胞における核酸構築物と内在性PBK遺伝子との間の相同組換えに十分な長さのものである。PBK遺伝子配列と「実質的な同一性」を有するヌクレオチド配列は、宿主細胞におけるそのヌクレオチド配列と内在性PBK遺伝子配列との間の相同組換えを可能にするのに十分なPBK遺伝子配列との配列同一性を有するヌクレオチド配列を説明しようとするものである。典型的には、フランキングする相同領域のヌクレオチド配列は、相同組換えの標的とされる内在性PBK遺伝子のヌクレオチド配列と少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは98%、99%または100%同一である。最も好ましくは、フランキング相同領域は標的とされる内在性対立遺伝子と同質遺伝子的である(例えば、フランキング領域のDNAは、ターゲッティング構築物を導入しようとする細胞と同じ遺伝的背景を有する細胞から単離される)。
【0067】
好ましい実施形態においては、非相同置換部分は、当技術分野において公知のように、好ましくは調節エレメント(1つもしくは複数)に機能的に連結されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む、陽性選択発現カセットを含有する。「陽性選択発現カセット」という用語は、陽性選択マーカーの発現を制御する調節エレメント(例えば、プロモーターおよびポリアデニル化配列)に機能的に連結された陽性選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を指す。「陽性選択マーカー」は、そのマーカーを含む細胞の選択を許容する。別の好ましい実施形態においては、また核酸構築物は、相同領域の上流または下流のいずれかの遠位に陰性選択発現カセットも含む。好ましい陰性選択発現カセットは、調節エレメント(1つもしくは複数)に機能的に連結された単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を含む。
【0068】
本発明の別の態様は、本発明の核酸構築物が組み込まれている組換えベクターに関する。本発明のさらに別の態様は、本発明の核酸構築物が導入されており、それにより核酸構築物と宿主細胞の内在性PBK遺伝子との間の相同組換えが可能となり、その結果内在性PBK遺伝子の機能的破壊が生じる宿主細胞に関する。この宿主細胞はPBKを正常に発現する哺乳動物細胞であっても、多能性細胞、例えば、マウス胚性幹細胞であってもよい。核酸構築物が導入されており、かつ内在性PBK遺伝子と相同的に組換えられている胚性幹細胞のさらなる発生は、胚性幹細胞の子孫であり、したがってそれらのゲノム内にPBK遺伝子破壊を担持する細胞を有するトランスジェニック非ヒト動物を生じる。次に、PBK遺伝子破壊をそれらの生殖細胞系に担持する動物を選択して飼育し、すべての体細胞および生殖細胞においてPBK遺伝子破壊を有する動物を産生することができる。次いで、そのようなマウスを、PBK遺伝子破壊についてホモ接合性にまで飼育することができる。
【0069】
本明細書で用いられる場合、「機能的に破壊されている」遺伝子は、その遺伝子の正常機能を妨げる、例えば、正常PBK遺伝子産物の発現を妨げ、または正常量のPBK遺伝子産物の発現を妨げる配列改変を有する。機能的破壊を生じる突然変異は、挿入、欠失または点突然変異(1つもしくは複数)であり得る。一実施形態においては、PBK遺伝子の対立遺伝子の両方が、PBK遺伝子産物の発現が動物の細胞中で実質的に低下するか、または不在であるように機能的に破壊される。「不在」という用語は、動物の細胞中で産生される正常PBK遺伝子産物の量が本質的に検出不能であることを意味することが意図されている。このタイプの突然変異は当技術分野において「無発現変異」とも呼ばれ、そのような無発現変異を担持する動物は「ノックアウト動物」とも呼ばれる。別の実施形態においては、PBK遺伝子の対立遺伝子の両方が、改変した形態のPBK遺伝子産物が動物の細胞中で発現するように機能的に破壊される。例えば、1つ以上の点突然変異または欠失突然変異をPBK遺伝子に導入し、それによりそこでコードされるPBK遺伝子産物のアミノ酸配列を改変させることができる。さらに、PBKコードDNA配列を選択された組織特異的プロモーターおよび/またはエンハンサーに連結させ、かつ生じるハイブリッドDNA分子を動物の胚に初期発生段階(例えば、受精卵母細胞段階)で標準法によって導入することにより、選択された組織(例えば、乳房、前立腺)において増加したレベルのPBKを発現するトランスジェニック動物を産生することができる。
【0070】
非相同置換部分はPBK遺伝子内の様々な位置に挿入可能であり、異なる相同領域がフランキングすることでその遺伝子が機能的に破壊されることは当業者には明らかであろう。mPBK遺伝子配列の機能的破壊は、(例えば、neo遺伝子の挿入により)全長mPBK mRNA転写産物の発現を妨げることができ、または改変した形態のmPBKをコードするmPBK mRNA転写産物の発現につながり得る。
【0071】
PBK発現のレベルが低下した非ヒト動物は、さらに、当技術分野において公知のように、リコンビナーゼ技術を用いて得ることができ、そこでは内在性PBK配列を標的とするリコンビナーゼがそのDNA配列を切除または再配置する。例えば、標的とされた遺伝子の発現を調節するためのリコンビナーゼを発現するアデノウイルスベクター系に関する米国特許第6,120,764号を参照のこと。
【0072】
加えて、当技術分野において公知のウイルス遺伝子ベクターを用いて、内在性PBKを過剰発現するか、または異種PBKを発現する非ヒト動物(好ましくは、マウス)を提供することができる。好ましくは、異種PBKはヒトPBKである。異種PBKの発現、または内在性PBKの過剰発現は、動物内の特定の組織タイプまたは組織の領域に限定することができる。組織特異的遺伝子の発現を駆動し、かつトランスジェニック非ヒト動物の提供において有用である様々なプロモーター/エンハンサーが同定されている。発現カセットは、プロモーターおよびポリアデニル化部位、並びに必要であるならば、エンハンサーエレメントを含む、挿入遺伝子の発現に必要な調節エレメントを含む。
【0073】
ラットC(3)1の5’DNA領域内のプロモーターエレメントを、遺伝子産物の前立腺特異的発現を指令し、およびトランスジェニックマウスを産生するために用いることができる。例えば、Zhangら, Prostate 2000 Jun 1;43(4):278−85 を参照のこと。プロモーターおよびラットC(3)1遺伝子の5’領域を、組換えDNA技術を用いてPBK遺伝子のコーディング領域に融合させる。雄性由来の前立腺を、in situ ハイブリダイゼーションにより、組換えPBK mRNAの発現について検査することができる。
【0074】
ヒト前立腺特異的抗原(PSA)および腺性カリクレイン−1(hGK−1、hK2としても知られる)遺伝子は染色体19上に、12kb遺伝子間領域によって分離されて縦列に位置する。PSA遺伝子調節エレメント単独、または遺伝子間領域と一緒の制御の下に配置される導入遺伝子は、前立腺特異的発現を示す。この遺伝子間領域は、高レベルの発現に対する高PSA遺伝子コピー数の必要性を低下させる。例えば、Cleutjensら, Mol. Endocrinol. 11(9):1256−65 (1997);Weiら, Int. J. Mol. Med. 2(4):487−496 (1998) を参照のこと。
【0075】
またトランスジェニックマウスにおける標的とされた遺伝子の前立腺特異的発現は、プロバシン(probasin;PB)プロモーターの断片を用いても達成することができる。小PB断片は前立腺特異的発現を指令するのに十分であるが、より大きな断片の使用は導入遺伝子発現のレベルを増加させる。例えば、Yanら, Prostate 32:129−139 (1997) を参照のこと。
【0076】
したがって、本発明は、当技術分野において公知の組織特異的プロモーターを用いて、PBKの組織特異的過剰発現のマウスモデルをさらに提供する。好ましい組織特異的プロモーターは前立腺特異的プロモーターである。そのようなマウスは、例えば、前立腺のような特定の組織においてヒトPBKを発現することができ、または特定の組織においてマウスPBKを過剰発現することができる。これらの動物は、PBK活性に関するそれらの効果についての化合物のスクリーニングにおいて有用である。
【0077】
導入遺伝子が誘導的に調節されるトランスジェニック非ヒト哺乳動物を産生する様々な系が当技術分野において公知である。本発明のトランスジェニック動物におけるPBK発現の調節は、当技術分野において公知のように、原核生物のTet(テトラサイクリン)リプレッサー/オペレーター/インデューサー系の成分を用いて達成することができる。例えば、米国特許第5,965,440号;米国特許第5,922,927号;米国特許第5,917,122号;米国特許第5,851,796号;米国特許第5,650,298号を参照のこと。
【0078】
あるいは、「遺伝子スイッチ」をBondら, Science 289:1942−46 (2000)に記載されるように挿入することにより、非ヒト動物におけるPBK遺伝子の発現を低下または除去することができる。Bondらは、相同組換えを用いて、ドキシサイクリンに基づく遺伝子スイッチを挿入して標的遺伝子の発現を調節した。動物にドキシサイクリンが与えられるとき、標的遺伝子の発現が消滅する。この調節カセットは標的遺伝子の5’非翻訳領域に挿入される。
【0079】
加えて、ヒトPBK遺伝子の機能をヒト細胞においてin vitroで、またはヒト組織移植片を含む非ヒト動物において改変することができる。そのような改変されたヒト細胞は、化合物をPBK活性に対する薬学的効果についてスクリーニングする上で有用である。ヒト宿主細胞において相同組換えによってヒトPBK(hPBK)遺伝子を標的とするため、ターゲッティングベクターはヒトPBK遺伝子配列と実質的な同一性を有するフランキング相同領域を含む。ヒトPBKゲノムDNA配列は、標準技術を用いてヒトPBK cDNAのすべてまたは一部を含むcDNAプローブでヒトゲノムDNAライブラリをスクリーニングすることによって単離することができる。ヒトPBK cDNAのヌクレオチド配列及びヒトPBKタンパク質の推定アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号1および2によって示される。マウスPBK遺伝子について説明されるように、ヒト細胞内のヒトPBK遺伝子配列の機能的破壊は、全長hPBK mRNA転写産物の発現を妨げることができ、または改変された形態のhPBKをコードするhPBK mRNA転写産物の発現につながり得る。
【0080】
宿主細胞内の内在性PBK遺伝子の対立遺伝子を機能的に破壊するため、本発明のターゲッティングベクターを宿主細胞、例えば、PBKを正常に発現する分化細胞または胚性幹細胞に導入し、相同組換え体を選択する。ターゲッティングベクターは、外来性DNAの導入に好適であることが当技術分野において公知である幾つかの技術(例えば、リン酸カルシウム沈殿、DEAE−デキストラントランスフェクション、マイクロインジェクション、リポフェクション等)のうちのいずれによっても宿主細胞に導入することができるが、最も好ましくは、電気穿孔法によって宿主細胞に導入する。ベクターを宿主細胞に導入した後、導入されたターゲッティングベクターと内在性PBK遺伝子との間の相同組換えを許容するのに十分な期間および条件下で細胞を培養する。宿主細胞を選択し、標準技術(例えば、正常内在性対立遺伝子を相同組換え対立遺伝子と区別するプローブを用いるサザンハイブリダイゼーション)により内在性PBK遺伝子座での相同組換えについてスクリーニングする。
【0081】
実施例
mRNA の定量化
PBK mRNAを検出し、かつ腫瘍組織および正常(非腫瘍性)組織におけるPBK mRNAの相対量を比較するための定量アッセイを設計した。このアッセイはリアルタイム蛍光プローブポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(TaqMan)を用いた。
【0082】
TaqMan配列検出器(ABI PRISM 7700 Sequence Detector)には、核酸配列のハイスループット定量をもたらすためのPCRに基づくアッセイおよびハードウェア/ソフトウェア機器が組み込まれている。熱サイクリング、蛍光検出、および用途特異的ソフトウェアの組合せは、PCR産物の増加をサイクルごとに検出することを可能にする。定量的結果が得られる。
【0083】
この方法は、PCR反応混合物に添加された、標的配列に相補的な蛍光発生プローブを用いた。このプローブは、レポーターおよびクエンチャー(quencher)色素が結合するオリゴヌクレオチドを含有していた。PCRの過程で標的核酸が存在していた場合、プローブがフォワードとリバースプライマー部位との間に特異的にアニーリングした。ポリメラーゼがプローブを開裂し、それがレポーター色素をクエンチャー色素の影響から解放し、したがってレポーター色素の蛍光強度の増加が生じた。その後、蛍光放出を記録し、および/または測定した。例えば、Orlando, C., P., Pinzani,およびM., Pazzagli.「Developments in quantitative PCR.」Clin Chem Lab Med 36 (1998):255−269;Brinkら,「Comparative quantification of IL−1β, IL−10, IL−10r, TNFα and IL−7 mRNA levels in UV−irradiated human skin in vivo」, Inflamm Res 49(6):290 (2000) を参照のこと。
【0084】
プライマーおよびプローブの配列:
フォワードプライマー:5’ AGT TAA CAG TTC CCA TAC AAG TTA ATG C 3’ (配列番号4)
リバースプライマー:5’ CAC ACA TCG TTG AAG CTT TGG A 3’ (配列番号5)
プローブ:5’−(FAM)−TTG AGC TTA GAC CAC AAC ATT GGC CAT CTA G−(TAMRA)−3’ (配列番号6)
FAMは用いられた色素を指す;TAMRAはクエンチャーを指す。
【0085】
PCR サイクリング条件:
48℃30分
95℃10分
以下を40サイクル:
94℃15秒
60℃1分
【0086】
Taqman分析に用いられた具体的な試薬および条件を表1に示す。
【0087】
【表1】
【0088】
簡潔に述べると、組織サンプルから誘導されるRNAのみを欠く、試薬の「マスターミックス」を生成した。45μLのマスターミックスのアリコートを96ウェルTaqmanプレートの各ウェルに添加した。次に、特定のサンプルRNAを、各々のサンプルを三重で、適切なウェル(総容量5μLの水中に50ngのRNA)に添加した。製造業者の指示によってTaqmanプレートを覆い、ABI PRISM 7700 Sequence Detector内に入れた。上述のプライマーおよびプローブを用い、上述のPCR条件下で分析を行った。
【0089】
サンプル
アデノイド、脂肪、副腎、脳、乳房、子宮頸、大腸、子宮内膜、心臓、視床下部、回腸、空腸、腎臓、肝臓、肺、子宮筋層、卵巣、膵臓、膵頭、胎盤、前立腺、直腸、骨格筋、皮膚、小腸、脾臓、胃、精巣、甲状腺、扁桃腺、膀胱、子宮、胎児脳、および胎児腎臓について正常ヒト組織のサンプルを得た(剖検サンプルであった脳および胎児脳を除いて、地元の病院からの外科的サンプル)。
【0090】
組織学的に診断された腫瘍組織および正常組織の対を形成するサンプルを得た。本明細書で用いられる場合、「対を形成する」サンプルは、同じ被検体から得られた腫瘍組織および正常組織のサンプルである。肺腫瘍の23サンプル、前立腺腫瘍の9サンプル;大腸腫瘍の20サンプル;および乳房腫瘍の9サンプルを研究した。
【0091】
結果:正常組織
様々な正常(非癌性)組織タイプにおけるPBK mRNAの相対的な存在度を、上述の蛍光プローブポリメラーゼ連鎖反応を用いて決定した。結果を図1に示す。PBK mRNAは精巣において最も豊富であった。
【0092】
結果:肺腫瘍組織
肺腫瘍サンプルにおけるPBK mRNAを、対を形成する正常肺組織サンプルにおけるものと比較した。図2に示されるように、23の肺腫瘍サンプルのうちの13サンプル(57%)においてPBK mRNAが、その対を形成する正常肺組織と比較したときに少なくとも10倍高く発現した。
【0093】
結果:前立腺腫瘍組織
前立腺腫瘍サンプルにおけるPBK mRNAを、対を形成する正常前立腺組織サンプルにおけるものと比較した。図3に示されるように、9の前立腺腫瘍サンプルのうちの7サンプル(78%)においてPBK mRNAが、その対を形成する正常前立腺組織と比較したときに少なくとも10倍高く発現した。他の2つの腫瘍サンプルにおいては、腫瘍サンプル中のPBK mRNAのレベルは正常組織において検出されるものと同じ(「0」)であった。
【0094】
結果:大腸腫瘍組織
大腸腫瘍サンプルにおけるPBK mRNAを、対を形成する正常大腸組織サンプルにおけるものと比較した。図4に示されるように、20の肺腫瘍サンプルのうちの5サンプル(25%)においてPBK mRNAが、その対を形成する正常大腸組織と比較したときに少なくとも10倍高く発現した。
【0095】
結果:乳房腫瘍組織
乳房腫瘍サンプルにおけるPBK mRNAを、対を形成する正常乳房組織サンプルにおけるものと比較した。図5に示されるように、9の乳房腫瘍サンプルのうちの6サンプル(67%)において、PBK mRNAが、その対を形成する正常乳房組織と比較したときに少なくとも10倍高く発現した。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、正常ヒト組織におけるPBK mRNAの発現をグラフで表す。PBK mRNAの相対的な豊富さが様々な組織にわたって評価され、それはサンプル中のPBK mRNAのレベルの単位なしの測定値である。
【図2】図2は、ヒト肺腫瘍サンプルにおけるPBK mRNAの発現をグラフで表す。(対を形成する非癌性肺組織サンプルにおけるPBK mRNAの発現レベルと比較して)10倍以上の過剰発現が検査した23の肺腫瘍サンプルのうちの13(57%)で見出された。
【図3】図3は、ヒト前立腺腫瘍サンプルにおけるPBK mRNAの発現を、対を形成する正常前立腺サンプルと比較してグラフで表す。10×以上の過剰発現が検査した9つの前立腺腫瘍サンプルのうちの7つ(78%)で見出された。
【図4】図4は、ヒト大腸腫瘍サンプルにおけるPBK mRNAの発現を、対を形成する正常大腸組織サンプルと比較してグラフで表す。10×以上の過剰発現が検査した20の大腸腫瘍サンプルのうちの5つ(25%)で見出された。
【図5】図5は、ヒト乳房腫瘍サンプルにおけるPBK mRNAの発現を、対を形成する正常乳房組織サンプルと比較してグラフで表す。10×以上の過剰発現が検査した9つの乳房腫瘍サンプルのうちの6つ(67%)で見出された。
Claims (43)
- 非癌性細胞と比較してPDZ結合性キナーゼ(PBK)の過剰発現を特徴とする癌に関連するマーカータンパク質をコードするmRNAの検出方法であって:
(a)癌性であることが疑われる組織の試験サンプルを得;
(b)該試験サンプル組織中の細胞に由来するmRNAを、PBKをコードするmRNAに相補的であり、かつそれに特異的にハイブリダイズする少なくとも1つのヌクレオチドプローブと接触させてハイブリダイゼーション産生物を形成し;
(c)産生されるハイブリダイゼーション産生物の量を検出し;並びに
(d)(c)において検出されるハイブリダイゼーション産生物の量を非悪性細胞において予想される量と比較する、
ことを含み、
ここで、(c)において産生されるハイブリダイゼーション産生物の量が非悪性対照細胞によって産生されるものよりも多いという発見が該試験サンプルにおける癌性細胞の存在を示す方法。 - 組織が前立腺、乳房、肺および大腸から選択される請求項1記載の方法。
- 組織が前立腺および乳房組織から選択される請求項1記載の方法。
- ヌクレオチドプローブが配列番号1の少なくとも20の連続するヌクレオチドを含む請求項1記載の方法。
- PBKをコードする前記mRNAが配列番号2または配列番号3のタンパク質をコードする請求項1記載の方法。
- 試験サンプルをヒト被験者から得る請求項1記載の方法。
- 検出されるハイブリダイゼーション産生物の量を同じ被検体から得られる非悪性組織のサンプルにおいて検出される量と比較する請求項1記載の方法。
- 検出されるハイブリダイゼーション産生物の量を予め決定される標準量と比較する請求項1記載の方法。
- 非癌性細胞と比較してPDZ結合性キナーゼ(PBK)の過剰発現を特徴とする癌に関連するマーカータンパク質をコードするmRNAの検出方法であって:
(a)癌性であることが疑われる組織の試験サンプルを得;
(b)該試験サンプル中の細胞に由来するmRNA配列を、PBKをコードするmRNAに相補的であり、かつ特異的にハイブリダイズする核酸配列プライマーを用いて増幅して増幅産生物を形成し;
(c)産生される増幅産生物の量を検出し;並びに
(d)(c)において検出される増幅産生物の量を非悪性細胞において予想される量と比較する、
ことを含み、
ここで、(c)において産生される増幅産生物の量が非悪性対照細胞によって産生されるものよりも多いという発見が該試験サンプルにおける癌性細胞の存在を示す方法。 - 組織が前立腺、乳房、肺および大腸から選択される請求項9記載の方法。
- 組織が前立腺および乳房組織から選択される請求項9記載の方法。
- ヌクレオチドプローブが配列番号1の少なくとも20の連続するヌクレオチドを含む請求項9記載の方法。
- PBKをコードするmRNAが配列番号2または配列番号3のタンパク質をコードする請求項9記載の方法。
- 試験サンプルをヒト被験者から得る請求項9記載の方法。
- 検出されるハイブリダイゼーション産生物の量を同じ被検体から得られる非悪性組織のサンプルにおいて検出される量と比較する請求項9記載の方法。
- 検出されるハイブリダイゼーション産生物の量を予め決定される標準量と比較する請求項9記載の方法。
- 増幅がRT−PCRによるものである請求項9記載の方法。
- 前立腺組織のサンプルを悪性腫瘍についてスクリーニングする方法であって、該サンプル組織中のPBK mRNAの量を測定することを含み、ここで、非悪性前立腺組織と比較しての該サンプル中のPBK mRNAのレベルの上昇は該サンプル組織が悪性であることを示す方法。
- 前立腺組織のサンプルを悪性腫瘍についてスクリーニングする方法であって、該サンプル組織中のPBKタンパク質の量を測定することを含み、ここで、非悪性前立腺組織と比較しての該サンプル中のPBKのレベルの上昇は該サンプル組織が悪性であることを示す方法。
- 乳房組織のサンプルを悪性腫瘍についてスクリーニングする方法であって、該サンプル組織中のPBK mRNAの量を測定することを含み、ここで、非悪性乳房組織と比較しての該サンプル中のPBK mRNAのレベルの上昇は該サンプル組織が悪性であることを示す方法。
- 乳房組織のサンプルを悪性腫瘍についてスクリーニングする方法であって、該サンプル組織中のPBKタンパク質の量を測定することを含み、ここで、非悪性乳房組織と比較しての該サンプル中のPBKのレベルの上昇は該サンプル組織が悪性であることを示す方法。
- 細胞中のPBKの活性を阻害する能力について試験化合物をスクリーニングする方法であって:
(a)PBKを発現する細胞を試験化合物に対して曝露し;
(b)該細胞におけるPBK活性の量を測定し;および
(c)該曝露した試験細胞におけるPBK活性の量を該試験化合物に曝露してはいない対照細胞におけるものと比較する、
ことを含み、
ここで、対照細胞と比較しての該曝露した試験細胞におけるPBK活性の量の減少は該試験化合物が細胞におけるPBK活性を阻害することを示す方法。 - 曝露する工程をin vitroで行う請求項22記載の方法。
- 曝露する工程をin vivoで行う請求項22記載の方法。
- 非癌性細胞と比較してPDZ結合性キナーゼ(PBK)の過剰発現を特徴とするヒト癌に関連するマーカータンパク質をコードするmRNAを検出するためのキットであって:
(a)長さが少なくとも20ヌクレオチドであり、かつヒトPBK mRNA配列に相補的である標識核酸分子であって、該ヒトPBK mRNA配列に特異的にハイブリダイズして標識ハイブリダイゼーション産生物を形成することができる標識核酸分子;および
(b)少なくとも1つのヒト組織タイプの癌性細胞において予想されるPBK mRNAのレベルを記載する印刷された取扱説明書、
を含むキット。 - 対照または標準として用いるための、ヒトPBKをコードする既知量のmRNAをさらに含む請求項25記載のキット。
- 印刷された取扱説明書が、非癌性および癌性前立腺組織細胞において見出されるPBK mRNAの比較レベルを記載する、請求項25記載のキット。
- 印刷された取扱説明書が、非癌性および癌性乳房組織細胞において見出されるPBK mRNAの比較レベルを記載する、請求項25記載のキット。
- プローブが配列番号1の一部に相補的である請求項25記載のキット。
- 非癌性細胞における発現レベルと比較してPDZ結合性キナーゼ(PBK)の過剰発現を特徴とするヒト癌に関連するマーカータンパク質を検出するためのキットであって:
(a)ヒトPBKに特異的に結合する標識抗体;および
(b)少なくとも1つのヒト組織タイプの癌性細胞において予想されるPBKのレベルを記載する印刷された取扱説明書、
を含むキット。 - 標識モノクローナル抗体を含む請求項30記載のキット。
- 標識ポリクローナル抗体を含む請求項30記載のキット。
- ヒト組織タイプが前立腺組織である請求項30記載のキット。
- ヒト組織タイプが乳房組織である請求項30記載のキット。
- 標識抗体が酵素標識、放射標識および蛍光標識からなる群より選択される標識を含む、請求項30記載のキット。
- ゲノムがその内在性PDZ結合性キナーゼ(PBK)遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子に破壊を含むトランスジェニックマウスであって、該破壊が完全に機能的なPBKタンパク質の発現を妨げ、かつ該破壊が野生型マウスと比較してPBKのレベルの低下を示す該トランスジェニックマウスを生じるトランスジェニックマウス。
- 破壊が内在性PBK遺伝子への陽性選択発現カセットの挿入から生じる、請求項36のトランスジェニックマウス。
- 野生型マウスに対してPBK活性のレベルの低下を示すトランスジェニックマウスの産生方法であって:
(a)PBKターゲッティングベクターをマウス胚性幹細胞に導入し;
(b)該マウス胚性幹細胞をマウス胚盤胞に導入し;
(c)該マウス胚盤胞を偽妊娠マウスに移植し;
(d)期限まで該移植されたマウス胚盤胞を発達させ;
(e)ゲノムが少なくとも1つの対立遺伝子における内在性PBK遺伝子の破壊を含むトランスジェニックマウスを同定する、
ことを含む方法。 - 工程(e)のトランスジェニックマウスを繁殖させてゲノムが内在性PBK遺伝子の対立遺伝子の両者に破壊を含むトランスジェニックマウスを得ることをさらに含む請求項38記載の方法であって、ここで、該破壊が野生型マウスに対してPBK活性のレベルの低下を示す該トランスジェニックマウスを生じる方法。
- PBKターゲッティングベクターが陽性選択発現カセットを含む請求項39の方法。
- ゲノムがトランスジーンを含み、該トランスジーンが組織特異的プロモーターに作動可能に連結するヒトPBKをコードするDNA配列を含むトランスジェニックマウスであって、該DNA配列が該組織の少なくとも幾つかの細胞において発現するトランスジェニックマウス。
- 発達が前記組織における新組織形成または肥厚である請求項41記載のトランスジェニックマウス。
- 組織特異的プロモーターが前立腺組織特異的プロモーターである請求項41のトランスジェニックマウス。
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