JP2013542431A - エルロチニブ治療のためのマーカーとしてのｉｐｐ複合体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、癌患者におけるエルロチニブ塩酸塩治療の臨床的利益を予測するバイオマーカーを提供する。
Description
本発明は、癌患者におけるエルロチニブ塩酸塩治療の臨床的利益を予測するバイオマーカーを提供する。
多くのヒト悪性腫瘍は上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）の異常又は過剰な発現に関連している。ＥＧＦ、トランスフォーミング増殖因子-α（ＴＧＦ-α）、及び多くの他のリガンドはＥＧＦＲに結合し、レセプターの細胞内チロシンキナーゼドメインの自己リン酸化を刺激する。様々な細胞内経路が続いて活性化され、これら下流イベントがインビトロで腫瘍細胞増殖を生じる。ＥＧＦＲを介した腫瘍細胞の刺激はインビボでの腫瘍増殖及び腫瘍生存の双方にとって重要でありうると想定されている。
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤のタルセバ（登録商標）を用いた初期の臨床データでは、化合物が安全で、標的有効濃度（前臨床データで決定）をもたらす用量で一般に良好な耐性があることが示されている。進行した疾患を患っている患者での第Ｉ相及びＩＩ相臨床試験では、タルセバ（登録商標）がある範囲の上皮腫瘍において有望な臨床活性を有していることが証明されている。実際、タルセバ（登録商標）は、確立された第二次化学療法と同様の程度であるが、化学療法よりもさらに安全なプロファイルの付加的利益と改善された簡便性を伴って、過去に治療された頭頸部癌及びＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）の患者において長く持続する部分的寛解を誘導することができることを示している。無作為化二重盲検プラセボ対照試験（ＢＲ.２１）は、単剤タルセバ（登録商標）が、進行疾患に対する標準的な治療が失敗したＮＳＣＬＣ患者の生存率を有意に長くし、改善することを示している。
タルセバ（登録商標）（エルロチニブ塩酸塩）は小化学分子であり；経口的に活性で強力なＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＥＧＦＲ-ＴＫＩ）である。
イレッサＴＭ（ゲフィチニブ）は小化学分子であり；経口的に活性なＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＥＧＦＲ-ＴＫＩ）である。
肺癌は、北アメリカ及びヨーロッパにおける癌関連死の主因である。アメリカ合衆国では、肺癌に続く死亡の数は、組合せた癌死の第２（結腸）、第３（乳房）及び第４（前立腺）の主要な原因の合計死よりも多い。全ての肺癌の約７５％から８０％がＮＳＣＬＣであり、およそ４０％の患者に局部的に進行した及び／又は切除不能な疾患が見つかっている。このグループは、癌性胸水を除くバルキーステージＩＩＩＡ及びＩＩＩＢの疾患の患者を含む。
欧州連合における肺癌のおおよその発生率は５２．５で、死亡率は４８．７症例／１０００００／年である。それぞれ、男性は７９．３と７８．３、女性は２１．６と２０．５である。ＮＳＣＬＣは全肺癌の症例の８０％を占める。肺癌死亡率の約９０％の男性及び約８０％の女性で、喫煙が原因である。
米国では、アメリカ癌学会によれば、２００４年中、約１７３８００の新規の肺癌の症例（男性で９３１００、女性で８０７００）があり、全ての新規癌の約１３％を占めていた。ほとんどの患者は、診断から２年以内にそれらの疾患の結果、死亡している。多くのＮＳＣＬＣ患者にとって、治療成功は見つけにくいままになっている。進行した腫瘍は、多くの場合、外科手術に適してはおらず、放射線療法及び化学療法の耐用量に対して耐性がある場合もある。無作為試験において、現在最も活性のある併用化学療法は、約３０％〜４０％の奏功率、３５％〜４０％の１年生存率を達成している。これは、支持療法のみで見られる１年生存率１０％より、実に進んでいる（Shepherd 1999）。
最近まで、再発後の患者の治療選択肢は、最善の支持療法又は緩和に限定されていた。最善の支持療法とドセタキセル（テキソテレ）を比較した最近の治験では、ＮＳＣＬＣの患者は、シスプラチンベースの第１次レジメンが失敗した後、第２次化学療法が有益である可能性が示されている。全ての年齢のＥＣＯＧパフォーマンスステイタス０、１又は２の患者では、先のプラチナベースの治療では難治性であった者と同様に、ドセタキセルを用いることで生存率が改善されることが示された。治療の効果がなかった患者は、体重が１０％低減し、乳酸デヒドロゲナーゼレベルが上昇し、多臓器併発又は肝臓併発がみられた者を含む。さらに、ドセタキセル単独療法の有益性は第２次設定を越えなかった。第３次治療又はそれ以上でドセタキセルを投与された患者では、生存の延長は見られなかった。単剤ドセタキセルはＮＳＣＬＣの標準的な第２次療法となっている。最近、ＮＳＣＬＣの第２次治療における他の第ＩＩＩ相無作為試験では、ドセタキセルとペメトレキセド（アリムタ（登録商標））を比較している。ペメトレキセドを用いた治療は、臨床的に等価な効果を生じたが、ドセタキセルと比較して副作用が有意に少なかった。
癌治療を個別化する方法を開発する必要性が存在することが長い間、認識されてきている。標的癌療法の開発では、腫瘍標的の分子プロファイルを提供できる方法（すなわち、臨床的利益を予測するもの）に特に関心がある。癌における遺伝子発現プロファイリングの原理の証拠は、現在の形態学的及び免疫組織化学的試験に基づいては明白ではない腫瘍タイプの分子的分類と共に既に確立されている。２つの別々の疾病は、遺伝子発現プロファイリングを使用して、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の単一の現在の分類から、異なる予後で区別されている。
腫瘍に活性化ＥＧＦＲ変異を持つＮＳＣＬＣ患者は、エルロチニブ及びゲフィチニブ等のチロシンキナーゼ阻害剤での治療に特に良好に応答することが示されている（Paz-Aresら 2010）。ゲフィチニブは未選択の患者集団に臨床的利益を付与しないと思われるが（Thatcherら Lancet 2005）、エルロチニブは付与する（Shepherdら NEJM 2005；Cappuzzoら 2010）。よって、癌患者におけるエルロチニブ塩酸塩での治療の臨床的利益を予測し、癌患者におけるゲフィニチブ治療の臨床的利益を予測しない発現バイオマーカーを提供することが本発明の目的である。
ＥＣＭ（細胞外マトリックス）は、組織及び器官の形成のための構造的フレームワークを提供する。ＥＣＭは、細胞表面の基質接着分子に結合し、生存、増殖、極性及び分化を調節する様々な細胞内シグナル伝達経路に影響を与える。ＥＣＭに結合する接着分子の重要なファミリーはインテグリンである。インテグリンはアルファ及びベータ-サブユニットからなり、大きな細胞外ドメインと比較的小さな細胞質ドメインからなる。リガンド結合は、ＥＣＭへの細胞接着部位での多タンパク質複合体のアセンブリに至るシグナル伝達カスケードを活性化させる。これらの事象は細胞に対して２つの重要な影響を有している：それらはＥＣＭとアクチン細胞骨格との間に結合を構築し、それらは多くの細胞内シグナル伝達経路の流動を変更する。インテグリン媒介性シグナル伝達の重要なレギュレーターとして作用する３つのタンパク質は、ＩＬＫ（インテグリン結合キナーゼ）及びアダプタータンパク質ＰＩＮＣＨ（Particularly Interesting Cys-His-rich Protein）及びＰａｒｖ（Parvin）であり、そのなかでＩＬＫはインテグリン媒介性シグナル伝達の主要なレギュレーターである。これらの分子は、ＩＰＰ複合体と称されるヘテロ三量体複合体を形成する。ＩＬＫの主要な機能は細胞骨格にインテグリンを結合させることである。ＩＬＫは、そのＮ末端ドメインを介してＰＩＮＣＨに結合し、そのＣ末端ドメインを介してアルファ-パルビンに結合し、ＰＩＮＣＨ-ＩＬＫ-アルファ-パルビン三元複合体（ＩＰＰ複合体）の形成に至る。ＩＰＰ複合体は、インテグリンとアクチン細胞骨格との間のアダプターとして、またいくつかのシグナル伝達経路を調節するハブとして機能する。
野生型ＥＧＦＲを含むヒトＮＳＣＬＣ株は、ＥＭＴ前にエルロチニブ塩酸塩に対して大なる感受性を示す（Thomsonら（2005））。上皮間葉転換（ＥＭＴ）は、細胞接着の損失、Ｅ-カドヘリン発現の後退、及び増加した細胞移動性により特徴付けられる生体細胞の表現型転換である。いくつかの発癌経路（例えば、ペプチド増殖因子、インテグリン等）はＥＭＴを誘導すると考えられている。ＥＭＴは増殖を受けている細胞の独特の特徴であり、腫瘍進行及び転移において重要な役割を担っていることが示唆される。インテグリン結合キナーゼの発現増加は、非小細胞肺癌における短い生存期間に関連している（Takanamiら （2005））。
ＭＥＲＩＴ研究は、第２次非小細胞肺癌患者におけるタルセバについての非無作為化非盲検有効性マーカー同定試験である。
「バイオマーカー」なる用語は、生物学的状態、すなわち治療的相互作用に対する薬理学的応答性又は生物学的プロセスの指標として使用される物質を意味する。バイオマーカーは、疾患のリスク又は進行、もしくは与えられた治療に対する疾患の罹患率と相関するタンパク質の発現又は状態における変化を示す。
「マーカー遺伝子」なる用語は、一片のＤＮＡが宿主生物に成功裏に挿入されたかどうかを決定するために使用される遺伝子を意味する。
遺伝子発現は、遺伝子からの情報が、機能的遺伝子産物、すなわちタンパク質の合成に使用されるプロセスである。「発現レベル」なる用語は、特定の遺伝子が細胞、組織又は生物内で発現されるレベルを意味する。タンパク質との文脈における「発現レベル」なる用語は、ある時に細胞に存在する特定のタンパク質の量を反映する。
「化学プロテオミクス」なる用語は、全プロテオームから相互作用するタンパク質複合体を捕捉し同定するためのベイトとして固定化小分子を使用する質量分析ベースのアフィニティークロマトグラフィーアプローチである。それは、例えばキナーゼ阻害剤に、それらの作用様式を探索するために、又は自然の生成物に標的同定のために、利用することができる。
「活性化レベル」なる用語は、ある時に細胞において特定のタンパク質が活性である可能性を反映する。一例は、その基質を修飾することができるようにある部位でリン酸化されるキナーゼである。
「治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＰＰ複合体の発現レベルを代表する値」なる用語は、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるマーカー遺伝子の平均発現レベルの推定値を意味する。臨床的利益は、≧１２週間の疾患安定化又は客観的反応を有することのいずれかとして定義した。
特定の実施態様では、マーカー遺伝子の発現レベルは、定量的ＲＴ-ＰＣＲ等のＲＮＡ発現レベルを評価するマイクロアレイ技術又は他の技術、あるいは免疫組織化学（ＩＨＣ）等の、それぞれのタンパク質の発現レベルを調べる任意の方法により、決定される。遺伝子チップの構築及び使用は、当該技術分野でよく知られている。例えば、米国特許第５２０２２３１号；同５４４５９３４号；同５５２５４６４号；同５６９５９４０号；同５７４４３０５号；同５７９５７１６号及び同１５８００９９２号を参照。また、Johnston, M. Curr. Biol. 8:R171-174 （1998）；Iyer VRら, Science 283:83-87 （1999）も参照。もちろん、遺伝子の発現レベルは、当業者に知られている他の方法、例えばノーザンブロット、ＲＴ-ＰＣＲ、リアルタイム定量的ＰＣＲ、プライマー伸長法、リボヌクレアーゼ保護、ＲＮＡ発現プロファイリングにより、決定することができる。
本発明のマーカー遺伝子は、他のバイオマーカー、特にＥＧＦＲバイオマーカーと組合せて、バイオマーカーセットとできる。バイオマーカーセットは、癌患者におけるエルロチニブ塩酸塩での治療の効果について予測するための予測バイオマーカーの任意の組合せから構築することができる。ここに記載のバイオマーカー及びバイオマーカーセットは、例えば、癌を患っている患者がエルロチニブ塩酸塩での治療介入に如何に応答するかを予測するために使用することができる。
ここで使用される「遺伝子」なる用語は、遺伝子の変異体を含む。「変異体」なる用語は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号により与えられる核酸配列に実質的に同様な核酸配列に関する。「実質的に同様な」なる用語は当業者によく理解される。特に、遺伝子変異体は、ヒト集団において最もよく見られる対立遺伝子の核酸配列と比較してヌクレオチド交換を示す対立遺伝子でありうる。好ましくは、このような実質的に同様な核酸配列は、最もよく見られる対立遺伝子に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有する。「変異体」なる用語はスプライスバリアントに関することも意味する。
本発明によって記述された遺伝子の遺伝子発現を検出し定量するための技術は、限定されるものではないが、ノーザンブロット、ＲＴ-ＰＣＲ、リアルタイム定量的ＰＣＲ、プライマー伸長法、リボヌクレアーゼ保護、ＲＮＡ発現プロファイリング、及び関連技術を含む。これらの技術は当業者によく知られており、例えば、Sambrook Jら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition （Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 2000）を参照のこと。
この発明によって記述された各遺伝子のタンパク質発現を検出するための技術は、限定されるものではないが、免疫組織化学（ＩＨＣ）を含む。
本発明のバイオマーカーは、癌を患っている患者、特に難治性ＮＳＣＬＣを患っている患者に対する個別化された療法である。この個別化された療法により、治療している医師は、癌療法、特にＮＳＣＬＣのための既存薬剤のなかから最も適切な薬剤を選択することが可能になる。将来の患者それぞれにとっての個別化された療法の利益は、奏功率／利益を受ける患者の数が増加し、効果のない治療による副作用の危険性が低減されることである。
ここで用いられる用語法は、特定の実施態様を記述する目的のためであり、限定することを意図したものではないことが理解されなければならない。さらに、ここに記載のものと類似した又は等価な任意の方法、装置及び材料を本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法、装置及び材料をここに記載する。
驚くべきことに、本発明は、エルロチニブ塩酸塩での治療に対する癌患者の応答性が、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨの併せた、個々の、又はそれぞれ個々に組合せたものの活性化レベルを決定することにより、予測できることを見出した。さらに、臨床成績における差異は、化学プロテオミクスにより決定される、エルロチニブ及びゲフィチニブのタンパク質相互作用プロファイルの差に起因しうる。
所定の目的において、本発明は、エルロチニブ塩酸塩での治療に対する癌患者の応答性を予測するインビトロ方法であって、
患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子からなる群から選択される１、２又は３の遺伝子の発現レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の併せた又は個々の発現レベルを代表する値と、ＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の併せた又は個々の発現レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の併せた又は個々の低い発現レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子からなる群から選択される１、２又は３の遺伝子の発現レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の併せた又は個々の発現レベルを代表する値と、ＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の併せた又は個々の発現レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の併せた又は個々の低い発現レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
所定の目的において、本発明は、エルロチニブ塩酸塩での治療に対する癌患者の応答性を予測するインビトロ方法であって、
患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の発現レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の共同した発現レベルを代表する値と、ＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の共同した発現レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の共同した低い発現レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の発現レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の共同した発現レベルを代表する値と、ＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の共同した発現レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の共同した低い発現レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
所定の目的において、本発明は、エルロチニブ塩酸塩での治療に対する癌患者の応答性を予測するインビトロ方法であって、
患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ及びＰＩＮＣＨ遺伝子の発現レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫ及びＰＩＮＣＨ遺伝子の共同した発現レベルを代表する値と、ＩＬＫ及びＰＩＮＣＨ遺伝子の共同した発現レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ及びＰＩＮＣＨ遺伝子の共同した低い発現レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ及びＰＩＮＣＨ遺伝子の発現レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫ及びＰＩＮＣＨ遺伝子の共同した発現レベルを代表する値と、ＩＬＫ及びＰＩＮＣＨ遺伝子の共同した発現レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ及びＰＩＮＣＨ遺伝子の共同した低い発現レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
所定の目的において、本発明は、エルロチニブ塩酸塩での治療に対する癌患者の応答性を予測するインビトロ方法であって、
患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ及びアルファ-パルビン遺伝子の発現レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫ及びアルファ-パルビン遺伝子の共同した発現レベルを代表する値と、ＩＬＫ及びアルファ-パルビン遺伝子の共同した発現レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ及びアルファ-パルビン遺伝子の共同した低い発現レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ及びアルファ-パルビン遺伝子の発現レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫ及びアルファ-パルビン遺伝子の共同した発現レベルを代表する値と、ＩＬＫ及びアルファ-パルビン遺伝子の共同した発現レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ及びアルファ-パルビン遺伝子の共同した低い発現レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
所定の目的において、本発明は、エルロチニブ塩酸塩での治療に対する癌患者の応答性を予測するインビトロ方法であって、
患者の腫瘍試料におけるアルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の発現レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるアルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の共同した発現レベルを代表する値と、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の共同した発現レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるアルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の共同した低い発現レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
患者の腫瘍試料におけるアルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の発現レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるアルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の共同した発現レベルを代表する値と、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の共同した発現レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるアルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の共同した低い発現レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
所定の目的において、本発明は、エルロチニブ塩酸塩での治療に対する癌患者の応答性を予測するインビトロ方法であって、
患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ遺伝子の発現レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫ遺伝子の共同した発現レベルを代表する値と、ＩＬＫ遺伝子の発現レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ遺伝子の低い発現レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ遺伝子の発現レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫ遺伝子の共同した発現レベルを代表する値と、ＩＬＫ遺伝子の発現レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ遺伝子の低い発現レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
所定の目的において、本発明は、エルロチニブ塩酸塩での治療に対する癌患者の応答性を予測するインビトロ方法であって、
患者の腫瘍試料におけるＰＩＮＣＨ遺伝子の発現レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＰＩＮＣＨ遺伝子の発現レベルを代表する値と、ＰＩＮＣＨ遺伝子の発現レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるＰＩＮＣＨ遺伝子の低い発現レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
患者の腫瘍試料におけるＰＩＮＣＨ遺伝子の発現レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＰＩＮＣＨ遺伝子の発現レベルを代表する値と、ＰＩＮＣＨ遺伝子の発現レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるＰＩＮＣＨ遺伝子の低い発現レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
所定の目的において、本発明は、エルロチニブ塩酸塩での治療に対する癌患者の応答性を予測するインビトロ方法であって、
患者の腫瘍試料におけるアルファ-パルビン遺伝子の発現レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるアルファ-パルビン遺伝子の共同した発現レベルを代表する値と、アルファ-パルビン遺伝子の発現レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるアルファ-パルビン遺伝子の低い発現レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
患者の腫瘍試料におけるアルファ-パルビン遺伝子の発現レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるアルファ-パルビン遺伝子の共同した発現レベルを代表する値と、アルファ-パルビン遺伝子の発現レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるアルファ-パルビン遺伝子の低い発現レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
所定の目的において、本発明はここに記載の方法に関し、ここで、発現レベルはマイクロアレイ技術により決定される。
所定の目的において、本発明は、エルロチニブ塩酸塩での治療に対する癌患者の応答性を予測するインビトロ方法であって、
患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質からなる群から選択される１、２又は３のタンパク質の活性化レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質の併せた又は個々の活性化レベルを代表する値と、ＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質の併せた又は個々の活性化レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質の併せた又は個々の低い活性化レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質からなる群から選択される１、２又は３のタンパク質の活性化レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質の併せた又は個々の活性化レベルを代表する値と、ＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質の併せた又は個々の活性化レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質の併せた又は個々の低い活性化レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
所定の目的において、本発明は、エルロチニブ塩酸塩での治療に対する癌患者の応答性を予測するインビトロ方法であって、
患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質の活性化レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質の共同した活性化レベルを代表する値と、ＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質の共同した活性化レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質の併せた低い活性化レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質の活性化レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質の共同した活性化レベルを代表する値と、ＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質の共同した活性化レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質の併せた低い活性化レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
所定の目的において、本発明は、エルロチニブ塩酸塩での治療に対する癌患者の応答性を予測するインビトロ方法であって、
患者の腫瘍試料におけるＩＬＫタンパク質の活性化レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫタンパク質の活性化レベルを代表する値と、ＩＬＫタンパク質の活性化レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫタンパク質の低い活性化レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
患者の腫瘍試料におけるＩＬＫタンパク質の活性化レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫタンパク質の活性化レベルを代表する値と、ＩＬＫタンパク質の活性化レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫタンパク質の低い活性化レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
所定の目的において、本発明は、エルロチニブ塩酸塩での治療に対する癌患者の応答性を予測するインビトロ方法であって、
患者の腫瘍試料におけるＰＩＮＣＨタンパク質の活性化レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＰＩＮＣＨタンパク質の活性化レベルを代表する値と、ＰＩＮＣＨタンパク質の活性化レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるＰＩＮＣＨタンパク質の低い活性化レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
患者の腫瘍試料におけるＰＩＮＣＨタンパク質の活性化レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＰＩＮＣＨタンパク質の活性化レベルを代表する値と、ＰＩＮＣＨタンパク質の活性化レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるＰＩＮＣＨタンパク質の低い活性化レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
所定の目的において、本発明は、エルロチニブ塩酸塩での治療に対する癌患者の応答性を予測するインビトロ方法であって、
患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ及びＰＩＮＣＨタンパク質の活性化レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫ及びＰＩＮＣＨタンパク質の共同した活性化レベルを代表する値と、ＩＬＫ及びＰＩＮＣＨタンパク質の共同した活性化レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ及びＰＩＮＣＨタンパク質の共同した低い活性化レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ及びＰＩＮＣＨタンパク質の活性化レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫ及びＰＩＮＣＨタンパク質の共同した活性化レベルを代表する値と、ＩＬＫ及びＰＩＮＣＨタンパク質の共同した活性化レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ及びＰＩＮＣＨタンパク質の共同した低い活性化レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
所定の目的において、本発明は、エルロチニブ塩酸塩での治療に対する癌患者の応答性を予測するインビトロ方法であって、
患者の腫瘍試料におけるアルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質の活性化レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるアルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質の共同した活性化レベルを代表する値と、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質の共同した活性化レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるアルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質の共同した低い活性化レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
患者の腫瘍試料におけるアルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質の活性化レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるアルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質の共同した活性化レベルを代表する値と、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質の共同した活性化レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるアルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質の共同した低い活性化レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
所定の目的において、本発明は、エルロチニブ塩酸塩での治療に対する癌患者の応答性を予測するインビトロ方法であって、
患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ及びアルファ-パルビンタンパク質の活性化レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫ及びアルファ-パルビンタンパク質の共同した活性化レベルを代表する値と、ＩＬＫ及びアルファ-パルビンタンパク質の共同した活性化レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ及びアルファ-パルビンタンパク質の共同した低い活性化レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ及びアルファ-パルビンタンパク質の活性化レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫ及びアルファ-パルビンタンパク質の共同した活性化レベルを代表する値と、ＩＬＫ及びアルファ-パルビンタンパク質の共同した活性化レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ及びアルファ-パルビンタンパク質の共同した低い活性化レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
所定の目的において、本発明は、エルロチニブ塩酸塩での治療に対する癌患者の応答性を予測するインビトロ方法であって、
患者の腫瘍試料におけるアルファ-パルビンタンパク質の活性化レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるアルファ-パルビンタンパク質の活性化レベルを代表する値と、アルファ-パルビンタンパク質の活性化レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるアルファ-パルビンタンパク質の低い活性化レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
患者の腫瘍試料におけるアルファ-パルビンタンパク質の活性化レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるアルファ-パルビンタンパク質の活性化レベルを代表する値と、アルファ-パルビンタンパク質の活性化レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるアルファ-パルビンタンパク質の低い活性化レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
所定の目的において、本発明は、エルロチニブ塩酸塩での治療に対する癌患者の応答性を予測するインビトロ方法であって、
患者の腫瘍試料におけるＩＬＫタンパク質のリン酸化レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫのリン酸化レベルを代表する値と、ＩＬＫのリン酸化レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫタンパク質の種々のリン酸化レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
患者の腫瘍試料におけるＩＬＫタンパク質のリン酸化レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫのリン酸化レベルを代表する値と、ＩＬＫのリン酸化レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫタンパク質の種々のリン酸化レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示す方法に関する。
所定の目的において、本発明は、ヒト患者に対して癌治療を選択する方法であって、
ｉ）患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子からなる群から選択される１、２又は３の遺伝子の発現レベルを決定し、
ｉｉ）治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子からなる群から選択される１、２又は３の遺伝子の発現レベルを代表する値と、ＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子からなる群から選択される１、２又は３の遺伝子の発現レベルを比較し、
ｉｉｉ）ここで、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子からなる群から選択される１、２又は３の遺伝子の低い発現レベルが、エルロチニブ塩酸塩での治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示し、
ｉｖ）患者に対する癌治療としてエルロチニブ塩酸塩治療を選択する
ことを含む、方法に関する。
ｉ）患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子からなる群から選択される１、２又は３の遺伝子の発現レベルを決定し、
ｉｉ）治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子からなる群から選択される１、２又は３の遺伝子の発現レベルを代表する値と、ＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子からなる群から選択される１、２又は３の遺伝子の発現レベルを比較し、
ｉｉｉ）ここで、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子からなる群から選択される１、２又は３の遺伝子の低い発現レベルが、エルロチニブ塩酸塩での治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示し、
ｉｖ）患者に対する癌治療としてエルロチニブ塩酸塩治療を選択する
ことを含む、方法に関する。
所定の目的において、本発明は、患者の癌を治療する方法であって、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子からなる群から選択される１、２又は３の遺伝子の発現レベルが、エルロチニブ塩酸塩での治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子からなる群から選択される１、２又は３の遺伝子の発現レベルの発現レベルよりも低い場合に、患者に有効量のエルロチニブ塩酸塩を投与することを含む方法に関する。
所定の目的において、本発明は、ヒト患者に対して癌治療を選択する方法であって、
ｉ）患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質からなる群から選択される１、２又は３のタンパク質の活性化レベルを決定し、
ｉｉ）治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質からなる群から選択される１、２又は３のタンパク質の活性化レベルを代表する値と、ＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質からなる群から選択される１、２又は３のタンパク質の活性化レベルを比較し、
ｉｉｉ）ここで、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質からなる群から選択される１、２又は３のタンパク質の低い活性化レベルが、エルロチニブ塩酸塩での治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示し、
ｉｖ）患者に対する癌治療としてエルロチニブ塩酸塩治療を選択する
ことを含む、方法に関する。
ｉ）患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質からなる群から選択される１、２又は３のタンパク質の活性化レベルを決定し、
ｉｉ）治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質からなる群から選択される１、２又は３のタンパク質の活性化レベルを代表する値と、ＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質からなる群から選択される１、２又は３のタンパク質の活性化レベルを比較し、
ｉｉｉ）ここで、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質からなる群から選択される１、２又は３のタンパク質の低い活性化レベルが、エルロチニブ塩酸塩での治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示し、
ｉｖ）患者に対する癌治療としてエルロチニブ塩酸塩治療を選択する
ことを含む、方法に関する。
所定の目的において、本発明は、患者の癌を治療する方法であって、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質からなる群から選択される１、２又は３のタンパク質の活性化レベルが、エルロチニブ塩酸塩での治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質からなる群から選択される１、２又は３のタンパク質の発現レベルの活性化レベルよりも低い場合に、患者に有効量のエルロチニブ塩酸塩を投与することを含む方法に関する。
所定の目的において、本発明は、ＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨに併せて関するここに記載の方法に関する。
所定の目的において、本発明は、ＩＬＫ及びＰＩＮＣＨに併せて関するここに記載の方法に関する。
所定の目的において、本発明は、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨに併せて関するここに記載の方法に関する。
所定の目的において、本発明は、ＩＬＫ及びアルファ-パルビンに併せて関するここに記載の方法に関する。
所定の目的において、本発明は、ＩＬＫに関するここに記載の方法に関する。
所定の目的において、本発明は、アルファ-パルビンに関するここに記載の方法に関する。
所定の目的において、本発明は、ＰＩＮＣＨに関するここに記載の方法に関する。
所定の目的において、本発明は、癌が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）であるここに記載の方法に関する。
所定の目的において、本発明は、癌患者がゲフィチニブでの治療に応答しないここに記載の方法に関する。
所定の目的において、本発明は、エルロチニブ塩酸塩治療に対する癌患者の応答性を予測するための、ＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子からなる群から選択される１、２又は３の遺伝子の使用に関する。
所定の目的において、本発明は、エルロチニブ塩酸塩治療に対する癌患者の応答性を予測するための、ＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の使用に関する。
所定の目的において、本発明は、エルロチニブ塩酸塩治療に対する癌患者の応答性を予測するための、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の使用に関する。
所定の目的において、本発明は、エルロチニブ塩酸塩治療に対する癌患者の応答性を予測するための、ＩＬＫ及びＰＩＮＣＨ遺伝子の使用に関する。
所定の目的において、本発明は、エルロチニブ塩酸塩治療に対する癌患者の応答性を予測するための、ＩＬＫ及びアルファ-パルビン遺伝子の使用に関する。
所定の目的において、本発明は、癌を治療するためのエルロチニブ塩酸塩の使用に関し、ここで、
ｉ）患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質からなる群から選択される１、２又は３のタンパク質の活性化レベルを決定し、
ｉｉ）ＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の併せた又は個々の発現レベルを、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の併せた又は個々の発現レベルの代表値と比較し、
ｉｉｉ）エルロチニブ塩酸塩を、ＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の併せた又は個々の発現レベルが低い患者に投与する。
ｉ）患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質からなる群から選択される１、２又は３のタンパク質の活性化レベルを決定し、
ｉｉ）ＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の併せた又は個々の発現レベルを、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の併せた又は個々の発現レベルの代表値と比較し、
ｉｉｉ）エルロチニブ塩酸塩を、ＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の併せた又は個々の発現レベルが低い患者に投与する。
所定の目的において、本発明は、癌を治療するためのエルロチニブ塩酸塩の使用に関し、ここで、ＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質の併せた活性化レベルが関与している。
所定の目的において、本発明は、癌を治療するためのエルロチニブ塩酸塩の使用に関し、ここで、ＩＬＫタンパク質の活性化レベルが関与している。
所定の目的において、本発明は、癌を治療するためのエルロチニブ塩酸塩の使用に関し、ここで、アルファ-パルビンタンパク質の活性化レベルが関与している。
所定の目的において、本発明は、癌を治療するためのエルロチニブ塩酸塩の使用に関し、ここで、ＰＩＮＣＨタンパク質の活性化レベルが関与している。
所定の目的において、本発明は、癌を治療するためのエルロチニブ塩酸塩の使用に関し、ここで、ＩＬＫ及びアルファ-パルビンタンパク質の活性化レベルが関与している。
所定の目的において、本発明は、癌を治療するためのエルロチニブ塩酸塩の使用に関し、ここで、ＩＬＫ及びＰＩＮＣＨタンパク質の活性化レベルが関与している。
所定の目的において、本発明は、癌を治療するためのエルロチニブ塩酸塩の使用に関し、ここで、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質の活性化レベルが関与している。
所定の目的において、本発明は、ＩＬＫに関するここに記載の使用に関する。
所定の目的において、本発明は、アルファ-パルビンに関するここに記載の使用に関する。
所定の目的において、本発明は、ＰＩＮＣＨに関するここに記載の使用に関する。
所定の目的において、本発明は、癌がＮＳＣＬＣであるここに記載の使用に関する。
所定の目的において、本発明は、癌患者がゲフィチニブを用いた治療に対して応答しないここに記載の使用に関する。
所定の目的において、本発明は、ＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子からなる群から選択される１、２又は３の遺伝子の発現レベルを検出するためのキットであって、ｉ）ＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子からなる群から選択される１、２又は３の遺伝子の発現レベルを特異的に検出可能な化合物と、ｉｉ）エルロチニブ塩酸塩を用いた癌治療を受けた患者の応答性を予測するために、該キットを使用することについての使用説明書を含み、参照試料と比較して、ＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子からなる群から選択される１、２又は３の遺伝子の発現レベルが低下していると、患者がエルロチニブ塩酸塩での治療から恩恵を受けうることを示しているキットに関する。
所定の目的において、本発明は、ＩＬＫに関するここに記載のキットに関する。
所定の目的において、本発明は、アルファ-パルビンに関するここに記載のキットに関する。
所定の目的において、本発明は、ＰＩＮＣＨに関するここに記載のキットに関する。
所定の目的において、本発明は、癌がＮＳＣＬＣであるここに記載のキットに関する。
所定の目的において、本発明は、癌患者がゲフィチニブを用いた治療に対して応答しないここに記載のキットに関する。
さらなる目的において、本発明は、本発明のインビトロ方法により同定された患者を治療する治療方法を提供する。前記治療方法は、配列番号：１、２及び３でコードされる遺伝子の予測発現及び／又は活性化パターンに基づいて治療のために選択された患者に、エルロチニブ塩酸塩を投与することを含む。
配列番号１はヒトＩＬＫのヌクレオチド配列を示す。
配列番号２はヒトアルファ-パルビンのヌクレオチド配列を示す。
配列番号３はヒトＰＩＮＣＨのヌクレオチド配列を示す。
配列番号２はヒトアルファ-パルビンのヌクレオチド配列を示す。
配列番号３はヒトＰＩＮＣＨのヌクレオチド配列を示す。
本発明は、本発明を例証するものであってその範囲を限定することを意図したものではない以下の実施例においてさらに記載する。
細胞培養
Ｈ２９２細胞を、１０％のＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミンが補填されたＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco-31870）に維持した。１・１０８のＨ２９２細胞のペレットを、２．５ｍＬのバッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌ（塩化ナトリウム）、１ｍＭのＣａＣｌ２（塩化カルシウム）、ＭｇＣｌ２（二塩化マグネシウム）、１％のＮＰ４０（ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール）、完全ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、遊離プロテアーゼ阻害剤、１ｍＭのオルトバナデート、及び５０ｍＭのヘペス）に溶解させた。氷上で１０分インキュベートした後、可溶化液を１２０００ｘｇ、４℃で１５分遠心分離して清澄化させた。
Ｈ２９２細胞を、１０％のＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミンが補填されたＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco-31870）に維持した。１・１０８のＨ２９２細胞のペレットを、２．５ｍＬのバッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌ（塩化ナトリウム）、１ｍＭのＣａＣｌ２（塩化カルシウム）、ＭｇＣｌ２（二塩化マグネシウム）、１％のＮＰ４０（ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール）、完全ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、遊離プロテアーゼ阻害剤、１ｍＭのオルトバナデート、及び５０ｍＭのヘペス）に溶解させた。氷上で１０分インキュベートした後、可溶化液を１２０００ｘｇ、４℃で１５分遠心分離して清澄化させた。
化合物合成と固定
エルロチニブ塩酸塩とゲフィチニブを化学的に変性させ、エポキシ活性化セファロース６Ｂビーズ（GE Healthcare）に共有結合させた。エポキシ活性化セファロース６Ｂへの誘導体のカップリングを、暗所で室温にて一晩、１０ｍＭの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）の存在下、５０％のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）／０．１Ｍの炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）、ｐＨ１１において実施した。５０％のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）／０．１Ｍの炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）で３回洗浄した後、残存した反応基を１Ｍのエタノールアミンでブロックした。続いて洗浄工程を製造者の使用説明書に従って実施した。結合効率を、最大吸収波長２４７及び３３０ｎｍでカップリング前後に化合物溶液の光学密度を比較することにより推定した。
エルロチニブ塩酸塩とゲフィチニブを化学的に変性させ、エポキシ活性化セファロース６Ｂビーズ（GE Healthcare）に共有結合させた。エポキシ活性化セファロース６Ｂへの誘導体のカップリングを、暗所で室温にて一晩、１０ｍＭの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）の存在下、５０％のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）／０．１Ｍの炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）、ｐＨ１１において実施した。５０％のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）／０．１Ｍの炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）で３回洗浄した後、残存した反応基を１Ｍのエタノールアミンでブロックした。続いて洗浄工程を製造者の使用説明書に従って実施した。結合効率を、最大吸収波長２４７及び３３０ｎｍでカップリング前後に化合物溶液の光学密度を比較することにより推定した。
競合実験及びアフィニティークロマトグラフィー
５００μｇの各タンパク質を、濃度を増大させた（０、０．０８５６、０．２８６２、０．９５７、３．２、１０．７、３５．７８、１１９．６及び４００μＭの最終濃度）エルロチニブ塩酸塩又はゲフィチニブと共に、回転させつつ４℃で１時間プレインキュベートした。ついで、試料を、固定化エルロチニブ塩酸塩又はゲフィチニブを伴う平衡化させたエポキシ活性化セファロースビーズと、回転させつつ４℃で３時間、混合した。ついで、溶解バッファーでビーズを３回洗浄し、最終的に１００μＬのＳＤＳ充填バッファーに再懸濁させ、８５℃で５分沸騰させ、１２０００ｘｇで５分、遠心分離した。
５００μｇの各タンパク質を、濃度を増大させた（０、０．０８５６、０．２８６２、０．９５７、３．２、１０．７、３５．７８、１１９．６及び４００μＭの最終濃度）エルロチニブ塩酸塩又はゲフィチニブと共に、回転させつつ４℃で１時間プレインキュベートした。ついで、試料を、固定化エルロチニブ塩酸塩又はゲフィチニブを伴う平衡化させたエポキシ活性化セファロースビーズと、回転させつつ４℃で３時間、混合した。ついで、溶解バッファーでビーズを３回洗浄し、最終的に１００μＬのＳＤＳ充填バッファーに再懸濁させ、８５℃で５分沸騰させ、１２０００ｘｇで５分、遠心分離した。
ＳＤＳ-ＰＡＧＥ
溶出試料を４−２０％のトリスグリシンＳＤＳ-ＰＡＧＥ（Invitrogen, EC6025BOX）で分離させた。ゲルを４０％のエタノールと１０％の酢酸に１時間固定し、クーマシーブルーを使用して一晩染色した（Invitrogen LC6025）。
溶出試料を４−２０％のトリスグリシンＳＤＳ-ＰＡＧＥ（Invitrogen, EC6025BOX）で分離させた。ゲルを４０％のエタノールと１０％の酢酸に１時間固定し、クーマシーブルーを使用して一晩染色した（Invitrogen LC6025）。
質量分析
ゲル内消化について、Shevchenkoら（1996）の適合化プロトコルを使用した。簡潔に述べると、ゲルの各レーンを９スライスに切断し、９６ウェルＰｒｏｘｅｏｎプレートに載せた。ついで、ゲル片をミリQ水及びアセトニトリルで洗浄し、ジチオスレイトールで還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化した。十分に洗浄した後、小片を５０ｎｇのトリプシン（Promega,V5111）と共にインキュベートし、一晩消化させた。消化物の上清を収集し、２５ｍＭの重炭酸アンモニウムで１回交換し、続いて５％ギ酸で２回交換し、ゲル片からペプチドを抽出した。全ての上清をプールし、乾燥させ、２％のアセトニトリル、５％のギ酸に再懸濁させ、イオンスプレートラップ質量分析計（Velos LTQ-Orbitrap, Thermo Scientific）に連結したナノフロー液体クロマトグラフィー（Proxeon EASY-nLC）により分析した。ペプチド分離を、６０分、アセトニトリル勾配に対して、ＡＱＵＡ１００ミクロントラップカラムに連結したＲｅｐｒｏＳｉｌ-ＰＵＲ Ｃ１８-ＡＱＵＡ ３μＭカラムで実施した。
ゲル内消化について、Shevchenkoら（1996）の適合化プロトコルを使用した。簡潔に述べると、ゲルの各レーンを９スライスに切断し、９６ウェルＰｒｏｘｅｏｎプレートに載せた。ついで、ゲル片をミリQ水及びアセトニトリルで洗浄し、ジチオスレイトールで還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化した。十分に洗浄した後、小片を５０ｎｇのトリプシン（Promega,V5111）と共にインキュベートし、一晩消化させた。消化物の上清を収集し、２５ｍＭの重炭酸アンモニウムで１回交換し、続いて５％ギ酸で２回交換し、ゲル片からペプチドを抽出した。全ての上清をプールし、乾燥させ、２％のアセトニトリル、５％のギ酸に再懸濁させ、イオンスプレートラップ質量分析計（Velos LTQ-Orbitrap, Thermo Scientific）に連結したナノフロー液体クロマトグラフィー（Proxeon EASY-nLC）により分析した。ペプチド分離を、６０分、アセトニトリル勾配に対して、ＡＱＵＡ１００ミクロントラップカラムに連結したＲｅｐｒｏＳｉｌ-ＰＵＲ Ｃ１８-ＡＱＵＡ ３μＭカラムで実施した。
配列同定
生データファイルを、ＳＥＱＵＥＳＴサーチアリゴリズム２７（SEQUEST バージョン27.0, 改訂12, Thermo Electron）を使用して処理した。サーチは、親イオンについては＋／−１０ｐｐｍ、フラグメントイオンについては＋／−１．０Ｄａの質量許容差を用い、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔヒトデータベース（バージョン48, 219024エントリー）に対して実施した。メチオニン（還元／酸化；＋１５．４９９４９Ｄａ）は差次的修飾と考え、システインは完全にカルバミドメチル化していると考えた（＋５８．０１３３Ｄａ）。データ解析に対しては、ミス切断が一つ以下の完全なトリプシン性ペプチドのみを考慮した。それらのＸＣｏｒｒスコアが、それぞれ１重、２重及び３重荷電イオンについて、２．０、２．５又は３．０を超え、対応するｄＣｎスコアが０．１より大きい場合に、ペプチドは一義的に同定されたと考えた。この報告において、少なくとも２の異なるペプチドが同定されたタンパク質のみを、定量目的でさらに処理した。
生データファイルを、ＳＥＱＵＥＳＴサーチアリゴリズム２７（SEQUEST バージョン27.0, 改訂12, Thermo Electron）を使用して処理した。サーチは、親イオンについては＋／−１０ｐｐｍ、フラグメントイオンについては＋／−１．０Ｄａの質量許容差を用い、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔヒトデータベース（バージョン48, 219024エントリー）に対して実施した。メチオニン（還元／酸化；＋１５．４９９４９Ｄａ）は差次的修飾と考え、システインは完全にカルバミドメチル化していると考えた（＋５８．０１３３Ｄａ）。データ解析に対しては、ミス切断が一つ以下の完全なトリプシン性ペプチドのみを考慮した。それらのＸＣｏｒｒスコアが、それぞれ１重、２重及び３重荷電イオンについて、２．０、２．５又は３．０を超え、対応するｄＣｎスコアが０．１より大きい場合に、ペプチドは一義的に同定されたと考えた。この報告において、少なくとも２の異なるペプチドが同定されたタンパク質のみを、定量目的でさらに処理した。
Ｇｅｎｅｄａｔａ ＲｅｆｉｎｅｒＭＳ５．２．６による質量分析データ処理
各化合物と各バンドについて独立して、それぞれのサーモ生ファイルを、Ｇｅｎｅｄａｔａ ＲｅｆｉｎｅｒＭＳ５．２．６によってロードした：セントロイドデータを破棄してメモリ使用量を減らした。一つのみのスペクトルで生じているシグナルを除去した；試料の全てのデータ表示（＝クロマトグラフ）は一般的な２Ｄ ｍ／ｚ-ＲＴグリッドで与えた。適切なピーク発見パラメーターに依存するクロマトグラムアラインメントの前に、ピーク発見パラメーターを視覚的に調べた。クロマトグラムアラインメントは、見出された共通のピークに基づくクロマトグラムとトリビアルツリーアルゴリズムの間の保持時間を修正する。この操作の成功は視覚的に調べた。ＲＴレンジ制限はクロマトグラフィーの２３−５２ｍｉｎの情報リッチ領域の外側のシグナルとデータを破棄する。クロマトグラム平均活性は、全ての入力クロマトグラムの仮想平均クロマトグラムを計算する。ノイズのレベルは、１０００ａｕ閾値以下のシグナルを除去する「強度閾値」ワークフローステップにより低減される。ＲＴ及びｍ／ｚ方向のピーク及びそれらの境界が見出されピーク包囲スクエアとして可視化される。スクエアは各クロマトグラムに投影され、ｅＸｔｒａｃｔｅｄイオンカウント（ＸＩＣ）がこれらの境界内で決定される。ピーク当たりの横１列とクロマトグラム当たりの縦１列での得られるスプレッドシートが次のワークフローステップにおけるファイルとしてセーブされる。これらのシグナル境界内に見出されるＭＳ／ＭＳスキャンのスキャンＩＤが同様にしてセーブされる。ワークフローステップ、それらのオーダーパラメーター及びステップからの診断情報（例えば、試料当たりの局所クロマトグラフィーシフトの度合い、見出されたシグナルの数）を要約するレポートが作成される。
各化合物と各バンドについて独立して、それぞれのサーモ生ファイルを、Ｇｅｎｅｄａｔａ ＲｅｆｉｎｅｒＭＳ５．２．６によってロードした：セントロイドデータを破棄してメモリ使用量を減らした。一つのみのスペクトルで生じているシグナルを除去した；試料の全てのデータ表示（＝クロマトグラフ）は一般的な２Ｄ ｍ／ｚ-ＲＴグリッドで与えた。適切なピーク発見パラメーターに依存するクロマトグラムアラインメントの前に、ピーク発見パラメーターを視覚的に調べた。クロマトグラムアラインメントは、見出された共通のピークに基づくクロマトグラムとトリビアルツリーアルゴリズムの間の保持時間を修正する。この操作の成功は視覚的に調べた。ＲＴレンジ制限はクロマトグラフィーの２３−５２ｍｉｎの情報リッチ領域の外側のシグナルとデータを破棄する。クロマトグラム平均活性は、全ての入力クロマトグラムの仮想平均クロマトグラムを計算する。ノイズのレベルは、１０００ａｕ閾値以下のシグナルを除去する「強度閾値」ワークフローステップにより低減される。ＲＴ及びｍ／ｚ方向のピーク及びそれらの境界が見出されピーク包囲スクエアとして可視化される。スクエアは各クロマトグラムに投影され、ｅＸｔｒａｃｔｅｄイオンカウント（ＸＩＣ）がこれらの境界内で決定される。ピーク当たりの横１列とクロマトグラム当たりの縦１列での得られるスプレッドシートが次のワークフローステップにおけるファイルとしてセーブされる。これらのシグナル境界内に見出されるＭＳ／ＭＳスキャンのスキャンＩＤが同様にしてセーブされる。ワークフローステップ、それらのオーダーパラメーター及びステップからの診断情報（例えば、試料当たりの局所クロマトグラフィーシフトの度合い、見出されたシグナルの数）を要約するレポートが作成される。
さらなる処理
各化合物と各バンドについて独立して、Ｑｕａｎｔｉｌｅアプローチ（Smyth 2003）を使用して各試料を基準化した。ＲｅｆｉｎｅｒＭＳで見出されるピークに、それぞれの測定におけるスキャンＩＤを介し配列情報を割り当てる。同定されなかった又はより曖昧に同定されたピークは除去される。定量情報はｌｏｇ２変換される。プロセスコントロールでは、定量データがプリンシパルコンポーネント解析に供される：最初の４つのプリンシパルコンポーネントのスコアを、化合物濃度及びプロセスパラメーター、例えばゲルレーン数、ＬＣ-ＭＳバッチＩＤ又はＬＣ-ＭＳ実施数と相関させた。マハラノビス距離異常値は、最初の２つのプリンシパルコンポーネントのスコアに基づき推定される；９５％信頼区間外の試料を異常値とみなし、さらなる解析から除外した。
各化合物と各バンドについて独立して、Ｑｕａｎｔｉｌｅアプローチ（Smyth 2003）を使用して各試料を基準化した。ＲｅｆｉｎｅｒＭＳで見出されるピークに、それぞれの測定におけるスキャンＩＤを介し配列情報を割り当てる。同定されなかった又はより曖昧に同定されたピークは除去される。定量情報はｌｏｇ２変換される。プロセスコントロールでは、定量データがプリンシパルコンポーネント解析に供される：最初の４つのプリンシパルコンポーネントのスコアを、化合物濃度及びプロセスパラメーター、例えばゲルレーン数、ＬＣ-ＭＳバッチＩＤ又はＬＣ-ＭＳ実施数と相関させた。マハラノビス距離異常値は、最初の２つのプリンシパルコンポーネントのスコアに基づき推定される；９５％信頼区間外の試料を異常値とみなし、さらなる解析から除外した。
タンパク質代替物にペプチド強度の組合せ
ペプチドをそれらの潜在的タンパク質前駆体に割り当てる。タンパク質前駆体の見出された各組合せに、典型的には唯一のタンパク質メンバー、又はタンパク質及びそのスプライスバリアントの、別のタンパク質定量群を付与する。Irizarryら（2003）に従い、各タンパク質定量群についての相対的存在量を、基準化されｌｏｇ変換されたｅＸｔｒａｃｔｅｄイオンカウント（ＸＩＣ）から得、線形加算モデルに適合させる：
ＸＩＣｉｊｎ＝μｉｎ＋αｊｎ＋εｉｊｎ
ここで、αｊはペプチド効果、μｉはタンパク質定量群のｌｏｇスケール相対的存在量、εｉｊは平均０の独立で同一の分布に従う誤差項である。Irizarryら（2003）及びHolderら（2001）に記載されているようにして、メディアンポリッシュを使用してモデルパラメーターを確実に推定する。
ペプチドをそれらの潜在的タンパク質前駆体に割り当てる。タンパク質前駆体の見出された各組合せに、典型的には唯一のタンパク質メンバー、又はタンパク質及びそのスプライスバリアントの、別のタンパク質定量群を付与する。Irizarryら（2003）に従い、各タンパク質定量群についての相対的存在量を、基準化されｌｏｇ変換されたｅＸｔｒａｃｔｅｄイオンカウント（ＸＩＣ）から得、線形加算モデルに適合させる：
ＸＩＣｉｊｎ＝μｉｎ＋αｊｎ＋εｉｊｎ
ここで、αｊはペプチド効果、μｉはタンパク質定量群のｌｏｇスケール相対的存在量、εｉｊは平均０の独立で同一の分布に従う誤差項である。Irizarryら（2003）及びHolderら（2001）に記載されているようにして、メディアンポリッシュを使用してモデルパラメーターを確実に推定する。
有意な用量応答の検出
ヒロツ（Hirotsu）コントラスマトリックスを、番号付けした化合物濃度（Bretzら（2001）を参照）から誘導し、最初及び最後のコントラストを除外する。調整統計ＴＳＣを各コントラスト及びタンパク質定量群から得る（Smythら（2004）を参照）。各タンパク質定量群について、ＴＭＣ＝最大値（ＴＳＣ）を得る（Bretzら（2001）を参照）。Ｐ値を、Westfall及びYoung（1993）によって考案され、Geら（2003）に基づく１０００順列を用い、ステップダウン最大Ｔ調節ｐ値についてのアルゴリズムに基づいて得る。｜Ｔ｜ではなくＴを選択することにより、統計の一方性に対して修正する。
可視化と任意の計算はＲ２．１０．１（引用「Ｒ」）で実施する。
タンパク質 シグナル減少率（%）
ゲフィチニブ エルロチニブ塩酸塩
ＩＬＫ 0.0 77.3
ＰＩＮＣＨ 0.0 87.7
アルファ-パルビン 0.0 79.5
ヒロツ（Hirotsu）コントラスマトリックスを、番号付けした化合物濃度（Bretzら（2001）を参照）から誘導し、最初及び最後のコントラストを除外する。調整統計ＴＳＣを各コントラスト及びタンパク質定量群から得る（Smythら（2004）を参照）。各タンパク質定量群について、ＴＭＣ＝最大値（ＴＳＣ）を得る（Bretzら（2001）を参照）。Ｐ値を、Westfall及びYoung（1993）によって考案され、Geら（2003）に基づく１０００順列を用い、ステップダウン最大Ｔ調節ｐ値についてのアルゴリズムに基づいて得る。｜Ｔ｜ではなくＴを選択することにより、統計の一方性に対して修正する。
可視化と任意の計算はＲ２．１０．１（引用「Ｒ」）で実施する。
タンパク質 シグナル減少率（%）
ゲフィチニブ エルロチニブ塩酸塩
ＩＬＫ 0.0 77.3
ＰＩＮＣＨ 0.0 87.7
アルファ-パルビン 0.0 79.5
他のＮＳＣＬＣ細胞株における結合プロファイルの確認
Ｈ２９２、Ｈ４４１、Ｈ４６０及びＨ１２９９細胞を、１０％の仔ウシ血清及び２ｍｍｏｌ／ＬのＬ-グルタミンが補填されたＲＰＭＩ１６４０培地に維持した。化合物合成、固定及びアフィニティークロマトグラフィーは上述したようにして実施した。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱ ＤｅｃａＸに連結したＬＣシステム（LC-Packings）で質量分析を実施した。簡潔に述べると、ペプチド抽出物（５％のアセトニトリル、０．５％の酢酸、０．０１２％のＨＦＢＡ（ヘプタフルオロ酪酸）、１％のギ酸中）をトラップカラム（PepMapＴＭ C18、５μｍ（LC-Packings）、内径５ｍｍ×３００ｍｍ）に２０μＬ／分で充填した。続いて、ペプチドを分析用カラム（Magic C18ＴＭ、５μｍ（Spectronex）、内径１０ｃｍ×７５μｍ）において溶媒Ａ（５％のアセトニトリル、０．５％の酢酸、０．０１２％のＨＦＢＡ）に移した。溶離は、８分の５から１５％の溶媒Ｂ（８０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル中、０．５％の酢酸、０．０１２％のＨＦＢＡ）、６５分の１５から３８％の溶媒Ｂ、及び２５分の３８から８０％の溶媒Ｂの３ステップの線形勾配で実施した。カラム溶離液は質量分析計のＥＳＩ源に直接導入した。質量分析計はポジティブイオンモードで操作し、親イオンをデータ依存方式でフラグメント化のために選択した。生のＭＳ／ＭＳデータを、ＳＥＱＵＥＳＴ（version 27）を使用してヒトＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースに対して探索した。パラメーターは、一つの切断ミスと１．５Ｄａのペプチド質量許容を含んでいた。
Ｈ２９２、Ｈ４４１、Ｈ４６０及びＨ１２９９細胞を、１０％の仔ウシ血清及び２ｍｍｏｌ／ＬのＬ-グルタミンが補填されたＲＰＭＩ１６４０培地に維持した。化合物合成、固定及びアフィニティークロマトグラフィーは上述したようにして実施した。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱ ＤｅｃａＸに連結したＬＣシステム（LC-Packings）で質量分析を実施した。簡潔に述べると、ペプチド抽出物（５％のアセトニトリル、０．５％の酢酸、０．０１２％のＨＦＢＡ（ヘプタフルオロ酪酸）、１％のギ酸中）をトラップカラム（PepMapＴＭ C18、５μｍ（LC-Packings）、内径５ｍｍ×３００ｍｍ）に２０μＬ／分で充填した。続いて、ペプチドを分析用カラム（Magic C18ＴＭ、５μｍ（Spectronex）、内径１０ｃｍ×７５μｍ）において溶媒Ａ（５％のアセトニトリル、０．５％の酢酸、０．０１２％のＨＦＢＡ）に移した。溶離は、８分の５から１５％の溶媒Ｂ（８０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル中、０．５％の酢酸、０．０１２％のＨＦＢＡ）、６５分の１５から３８％の溶媒Ｂ、及び２５分の３８から８０％の溶媒Ｂの３ステップの線形勾配で実施した。カラム溶離液は質量分析計のＥＳＩ源に直接導入した。質量分析計はポジティブイオンモードで操作し、親イオンをデータ依存方式でフラグメント化のために選択した。生のＭＳ／ＭＳデータを、ＳＥＱＵＥＳＴ（version 27）を使用してヒトＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースに対して探索した。パラメーターは、一つの切断ミスと１．５Ｄａのペプチド質量許容を含んでいた。
ＴＧＦベータ３治療時に上皮から間葉系状態にスイッチすることが以前に記載されているモデルＮＳＣＬＣ細胞株Ｈ３５８を使用した（Thomson 2008）。結果は、ＴＧＦベータ３処理の１３日後にＥ-カドヘリンの減少を示しており、細胞が実際に転移していることが示されている（図５ａ）。ＴＧＦベータ３及びエルロチニブで処理されたＨ３５８細胞中のＥ-カドヘリンのレベルは、ＴＧＦベータ３及びゲフィチニブで処理された細胞における場合とは異なり、未変化のままであった。ウエスタンブロットシグナルの定量は、未処理細胞と、ＴＧＦベータ３で１３日間処理された細胞の間でＥ-カドヘリンのレベルが１／３以上低減していることを示している（図６ｂ）。エルロチニブを用いた処理はこの減少を防止しているが、ゲフィチニブはＥ-カドヘリンレベルのＴＧＦｂ３媒介性減少の阻害に失敗している（図５ｂ）。ＩＬＫ及びＰＩＮＣＨ発現に対する効果は、ＴＧＦｂ３処理後に双方のタンパク質のレベルが増加することを示している（図５ｃ及びｄ）。ＩＬＫ及びＰＩＮＣＨ発現レベルは、細胞がエルロチニブで処理されても変化せず、ゲフィチニブ処理時においても明白な効果はなかった。よって、このＥＭＴモデルは、エルロチニブが、Ｅ-カドヘリンの損失を阻害することによってＥＭＴの程度を低減することを示しており、ＩＬＫ及びＰＩＮＣＨのＴＧＦｂ３媒介性の増加が防止されることが示唆される。
複合体ＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨの３つの成分を、個々の基準に基づいて研究し、複合体全体の発現の可能性がＥＭＴ状態に相関していることに取り組んではいない。８つのＥＧＦＲ野生型ＮＳＣＬＣ細胞株を、この状態に基づいて選択し（Thomson 2005；Thomson 2008）、上皮マーカーとしてＥ-カドヘリン、間葉系マーカーとしてビメンチンの発現によって評価した。全てのＩＰＰタンパク質を、Ｈ３５８におけるアルファ-パルビンを除き、８つ全ての細胞株で様々な強度で検出した（図６ａ）。定量及び基準化の後、ＩＰＰ複合体強度の全合計は、上皮細胞に対して間葉系は１．８倍高かった。ＰＩＮＣＨ１は最も高く発現したタンパク質であり（上皮及び間葉系細胞それぞれにおいて、全ＩＰＰ発現の５６％及び５８％）、ついでＩＬＫ（２５％及び２２％）、アルファ-パルビン（１９％及び２０％）であった（図６ｂ）。
Ｅ-カドヘリン及びＩＬＫ発現
ＩＰＰとＥＭＴに関与するより広範囲の遺伝子との間の潜在的関連性を評価した。特に、エルロチニブに対して臨床的利益を有する患者及び有さない患者におけるそれらの発現プロファイル間の差である。全体で２１の事前選択された遺伝子のうち１６のみが、検出されたプローブセットで同定され、統計的に解析された。３１のプローブセット（１６の独特な遺伝子に対応）のなかで、臨床的利益を有する患者及び有さない患者からの腫瘍試料において、２つが統計的に有意な差次的に発現された。２つの対応する遺伝子はＩＬＫとＣＤＨ１（Ｅ-カドヘリン）であり、これらは、臨床的利益を有する患者においてそれぞれダウンレギュレート（０．９３倍、ｐ＝０．０１１）され、アップレギュレート（１．３８倍、ｐ＝０．０３３）されている。
ＩＰＰとＥＭＴに関与するより広範囲の遺伝子との間の潜在的関連性を評価した。特に、エルロチニブに対して臨床的利益を有する患者及び有さない患者におけるそれらの発現プロファイル間の差である。全体で２１の事前選択された遺伝子のうち１６のみが、検出されたプローブセットで同定され、統計的に解析された。３１のプローブセット（１６の独特な遺伝子に対応）のなかで、臨床的利益を有する患者及び有さない患者からの腫瘍試料において、２つが統計的に有意な差次的に発現された。２つの対応する遺伝子はＩＬＫとＣＤＨ１（Ｅ-カドヘリン）であり、これらは、臨床的利益を有する患者においてそれぞれダウンレギュレート（０．９３倍、ｐ＝０．０１１）され、アップレギュレート（１．３８倍、ｐ＝０．０３３）されている。
ＥＧＦＲ及びＩＬＫ結晶タンパク質構造のアラインメント
ＥＧＦＲ結合エルロチニブ又はゲフィチニブの公的に入手可能な結晶構造ｐｄｂファイル及びアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）と複合したＩＬＫの結晶構造を結晶データベースＰＤＢ（Berman 2000）（ｐｄｂコード１Ｍ１７、２ＩＴＹ、３ＫＭＷ；Stamos 2002；Yun 2007；Fukuda2009）からダウンロードした。３つのキナーゼ構造を、ＡＴＰ結合部位を形成する残基サブセットのＣα原子からの座標を使用して構造的に整列させた（ＥＧＦＲ番号付けに基づく残基番号６９１−６９３、７０１−７０３、７１９−７２（１９）１、７５１、７６６−７７２、８２０−８２３、８３１−８３２）。アラインメント及び距離測定はＰｙＭＯＬ可視化パッケージを用いて実施した。
ＥＧＦＲ結合エルロチニブ又はゲフィチニブの公的に入手可能な結晶構造ｐｄｂファイル及びアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）と複合したＩＬＫの結晶構造を結晶データベースＰＤＢ（Berman 2000）（ｐｄｂコード１Ｍ１７、２ＩＴＹ、３ＫＭＷ；Stamos 2002；Yun 2007；Fukuda2009）からダウンロードした。３つのキナーゼ構造を、ＡＴＰ結合部位を形成する残基サブセットのＣα原子からの座標を使用して構造的に整列させた（ＥＧＦＲ番号付けに基づく残基番号６９１−６９３、７０１−７０３、７１９−７２（１９）１、７５１、７６６−７７２、８２０−８２３、８３１−８３２）。アラインメント及び距離測定はＰｙＭＯＬ可視化パッケージを用いて実施した。
Ｈ３５８ＮＳＣＬＣ細胞株でのＥＭＴ転移試験
Ｈ３５８細胞を、３、６、１０及び１３日間、組換え１０ｎｇ／ｍＬのＴＦＧβ３（Peprotech, New York, NY, USA）及びエルロチニブ又はゲフィチニブ５μＭで処理した。細胞培養培地は３日毎に新しくした。細胞溶解を１％のＮＰ-４０及びプロテアーゼ阻害剤を含むＰＢＳで実施した。４℃で１２０００ｇで１５分、遠心分離によって清澄化させた後、タンパク質をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離させ、ウエスタンブロット分析で処理した。コンパクトデジタルカメラ（Luminescent Image Analyzer: Fujifilm, Tokyo, Japan）を使用して画像を得、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ（GE Healthcare, Waukesha, WI, USA）を用いて定量した。
Ｈ３５８細胞を、３、６、１０及び１３日間、組換え１０ｎｇ／ｍＬのＴＦＧβ３（Peprotech, New York, NY, USA）及びエルロチニブ又はゲフィチニブ５μＭで処理した。細胞培養培地は３日毎に新しくした。細胞溶解を１％のＮＰ-４０及びプロテアーゼ阻害剤を含むＰＢＳで実施した。４℃で１２０００ｇで１５分、遠心分離によって清澄化させた後、タンパク質をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離させ、ウエスタンブロット分析で処理した。コンパクトデジタルカメラ（Luminescent Image Analyzer: Fujifilm, Tokyo, Japan）を使用して画像を得、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ（GE Healthcare, Waukesha, WI, USA）を用いて定量した。
ＭＥＲＩＴデータの解析
遺伝子発現プロファイルを、エルロチニブで治療（１５０ｍｇ／日）したステージＩＩＩｂ／ＩＶの１０２名のＮＳＣＬＣ患者からの腫瘍バイオプシー試料で測定した。腫瘍バイオプシーを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３Ａ ２．０ Ａｒｒａｙ（Affymetrix, Santa Clara, CA, USA）を用いた遺伝子発現プロファイリングを使用して解析した。ここに記載された全ての遺伝子発現結果（倍数変化及びｐ値）は既に報告されている統計的解析からのものである（Tan 2010）。我々は、エルロチニブからの臨床的利益を有するか又は有さない患者の遺伝子発現プロファイル間の差異を特に調べた。ＥＭＴの転写調節又はＩＰＰ複合体に潜在的に関与している次の２１のタンパク質を、対応する遺伝子及びマイクロアレイプローブセットにマッピングした：Ｔｗｉｓｔ，Ｓｎａｉｌ［Ｓｍａ１］，Ｚｅｂ［ＴＣＦ８］，Ｌｅｆ-１，Ｅ１２／Ｅ４７塩基性ループヘリックス［ｂＨＬＨ］，Ｓｌｕｇ［Ｓｍａ２］，Ｅ−カドヘリン［ＣＤＨ１］，Ｎ-カドヘリン［ＣＤＨ２］，Ｍｙｃ，ビメンチン，カテニンベータ，カテニンデルタ，フィブロネクチン，エピモルフィン，インテグリン結合キナーゼ［ＩＬＫ］，Ｐａｒｖｉｎアルファ，パルビンベータ，ＰＩＮＣＨ１，ＰＩＮＣＨ２，転移関連タンパク質３［ＭＴＡ３］，Ｙボックス結合タンパク質１［ＹＢ−１］）。
遺伝子発現プロファイルを、エルロチニブで治療（１５０ｍｇ／日）したステージＩＩＩｂ／ＩＶの１０２名のＮＳＣＬＣ患者からの腫瘍バイオプシー試料で測定した。腫瘍バイオプシーを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３Ａ ２．０ Ａｒｒａｙ（Affymetrix, Santa Clara, CA, USA）を用いた遺伝子発現プロファイリングを使用して解析した。ここに記載された全ての遺伝子発現結果（倍数変化及びｐ値）は既に報告されている統計的解析からのものである（Tan 2010）。我々は、エルロチニブからの臨床的利益を有するか又は有さない患者の遺伝子発現プロファイル間の差異を特に調べた。ＥＭＴの転写調節又はＩＰＰ複合体に潜在的に関与している次の２１のタンパク質を、対応する遺伝子及びマイクロアレイプローブセットにマッピングした：Ｔｗｉｓｔ，Ｓｎａｉｌ［Ｓｍａ１］，Ｚｅｂ［ＴＣＦ８］，Ｌｅｆ-１，Ｅ１２／Ｅ４７塩基性ループヘリックス［ｂＨＬＨ］，Ｓｌｕｇ［Ｓｍａ２］，Ｅ−カドヘリン［ＣＤＨ１］，Ｎ-カドヘリン［ＣＤＨ２］，Ｍｙｃ，ビメンチン，カテニンベータ，カテニンデルタ，フィブロネクチン，エピモルフィン，インテグリン結合キナーゼ［ＩＬＫ］，Ｐａｒｖｉｎアルファ，パルビンベータ，ＰＩＮＣＨ１，ＰＩＮＣＨ２，転移関連タンパク質３［ＭＴＡ３］，Ｙボックス結合タンパク質１［ＹＢ−１］）。
文献
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Claims (18)
- エルロチニブ塩酸塩での治療に対する癌患者の応答性を予測するインビトロ方法において、
患者の腫瘍試料中におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子からなる群から選択される１、２又は３の遺伝子の発現レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の併せた又は個々の発現レベルを代表する値と、ＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の併せた又は個々の発現レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の併せた又は個々の低い発現レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示している方法。 - 発現レベルがマイクロアレイ技術により決定される請求項１に記載の方法。
- エルロチニブ塩酸塩での治療に対する癌患者の応答性を予測するインビトロ方法において、
患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質からなる群から選択される１、２又は３のタンパク質の活性化レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質の併せた又は個々の活性化レベルを代表する値と、ＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質の併せた又は個々の活性化レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質の併せた又は個々の低い活性化レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示している方法。 - エルロチニブ塩酸塩での治療に対する癌患者の応答性を予測するインビトロ方法において、
患者の腫瘍試料におけるＩＬＫタンパク質のリン酸化レベルを決定し、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫのリン酸化レベルを代表する値と、ＩＬＫタンパク質のリン酸化レベルを比較することを含み、ここで、患者の腫瘍試料におけるＩＬＫタンパク質の種々のリン酸化レベルが、治療から臨床的利益が引き出されるであろう患者を示している方法。 - ＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨに併せて関する請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
- ＩＬＫに関する請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
- アルファ-パルビンに関する請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
- ＰＩＮＣＨに関する請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
- 癌がＮＳＣＬＣである請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
- 癌患者がゲフィチニブを用いた治療に応答しない請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
- エルロチニブ塩酸塩治療に対する癌患者の応答性を予測するための、ＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子からなる群から選択される１、２又は３の遺伝子の使用。
- 癌を治療するためのエルロチニブ塩酸塩の使用であって、
ｉ）患者の腫瘍試料におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨタンパク質からなる群から選択される１、２又は３のタンパク質の活性化レベルを決定し、
ｉｉ）ＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の併せた又は個々の発現レベルを、治療から臨床的利益が引き出されない患者集団の腫瘍におけるＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の併せた又は個々の発現レベルの代表値と比較し、
ｉｉｉ）エルロチニブ塩酸塩を、ＩＬＫ、アルファ-パルビン及びＰＩＮＣＨ遺伝子の併せた又は個々の発現レベルが低い患者に投与する、使用。 - ＩＬＫに関する請求項１１又は１２に記載の使用。
- アルファ-パルビンに関する請求項１１又は１２に記載の使用。
- ＰＩＮＣＨに関する請求項１１又は１２に記載の使用。
- 癌がＮＳＣＬＣである請求項１１から１５のいずれか一項に記載の使用。
- 癌患者がゲフィチニブを用いた治療に応答しない請求項１１から１６のいずれか一項に記載の使用。
- 明細書に記載された発明。
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