MX2013004037A - Complejo de ipp como marcador para tratamiento de erlotinib. - Google Patents

Abstract

La presente inencion provee biomarcadores que son predictivos por el beneficio clínico del tratamiento con clorhidrato de erlotinib en pacientes con cáncer.

Description

COMPLEJO DE IPP COMO MARCADOR PARA TRATAMIENTO DE ERLOTINIB DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee biomarcadores que son predictivos en cuanto al beneficio clínico del tratamiento con clorhidrato de erlotinib en pacientes con cáncer.

Una diversidad de malignidades humanas ' está asociadas con la expresión aberrante o sobre expresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) . EGF, factor de crecimiento transformante (TGF-a) y un numero de otros ligandos se enlazan a EGFR, estimulando la auto fosforilación del dominio de cinasa de tirosina intracelular del receptor. Una variedad de rutas intracelulares son activadas subsecuentemente y estos eventos corrientes abajo dan como resultado proliferación de células de tumor in vitro. Se ha postulado que la estimulación de células de tumor vía el EGFR puede ser importante tanto para el crecimiento del tumor como la supervivencia del tumor in vivo.

Los datos clínicos prematuros con Tarce.va®, un inhibidor de la cinasa de tirosina de EGFR, indican que el compuesto es seguro y en general bien tolerado a dosis' que proveen la concentración efectiva objetivo (tal como es determinada por datos pre-clínicos) . Estudios clínicos fase I y fase II en pacientes con enfermedad avanzada han demostrado que Tarceva® tiene actividad clínica promisoria en un intervalo de tumores epiteliales. Por supuesto, Tarceva® ha mostrado se apto de inducir remisiones parciales durables en pacientes tratados previamente con cáncer de cabeza y cuello y NSCLC (Cáncer de Pulmón de Célula No Pequeña) de un orden similar a la quimioterapia de segunda linea establecida pero con el beneficio agregado de mejor perfil de seguridad de la quimioterapia y conveniencia mejorada (tableta en lugar de administración intravenosa [i.v.]). Un estudio placebo-controlado doble ciego aleatorizado (BR.21) ha demostrado que el agente individual Tarceva® prolonga significativamente y mejora la supervivencia de pacientes con NSCLC para quienes la terapia estándar por enfermedad avanzada ha fracasado.

Tarceva® (clorhidrato de erlotinib) : es una molécula química pequeña; es un inhibidor oralmente activo, potente de la cinasa de tirosina de EGFR (EGFR-TK1) .

Iressa™ (gefitinib) es una molécula química pequeña; es un inhibidor oralmente activo de la cinasa ¡de tirosina de EGFR (EGFR-TK1) .

El cáncer del pulmón es la causa principal de muerte cáncer-relacionada en Norte América y Europa. En los Estados Unidos de América, el número de muertes secundarias de cáncer de pulmón excede las muertes totales combinadas de las segundas (colon), terceras (pecho) y cuarta (próstata) causas principales de muerte por cáncer combinadas. Aproximadamente 75% a 80% de todos los canceres de pulmón son NSCLC, con aproximadamente 40% de pacientes que se · presentan con enfermedad avanzada localmente y/o irresecables . Este grupo incluye comúnmente aquellos con enfermedad .etapa IIIA y IIIB global, excluyendo efusiones pleurales malignas.

La incidencia cruda de cáncer de pulmón en la Unión Europea es de 52.5, la proporción de muerte 48.7 casos/100000/año. Entre hombres las proporciones son 79.3 y 78.3, entre mujeres 21.6 y 20.5, respectivamente. NSCLC cuenta el 80% de todos los casos de cáncer de pulmón. Aproximadamente 90% de mortalidad de cáncer de pulmón entre hombres y 80% entre mujeres, es atribuible a fumar.

En los Estados Unidos de América, de acuerdo con la Sociedad de Cáncer Estadounidense, durante 2004, hubieron aproximadamente 173,800 nuevos casos de cáncer de pulmón (93,100 en hombres y 80,700 en mujeres) y fueron contando alrededor de 13% de todos los nuevos canceres. La mayoría de los pacientes mueren como consecuencia de su enfermedad en el transcurso de dos años de diagnosis. Para muchos pacientes con NSCLC, el tratamiento exitoso sigue siendo elusivo. Los tumores avanzados frecuentemente no son propensos a cirugía y pueden también ser resistentes a dosis tolerables de radioterapia y quimioterapia. En pruebas aleátorizadas, las quimioterapias de combinación más activas actualmente obtuvieron proporciones de respuesta de aproximadamente 30% o 40% y una proporción de supervivencia de 1 año entre 35% y 40%. Este es realmente un avance con respecto a la proporción de supervivencia de 1 año del 10% observada con cuidado de apoyo solo (Shepherd 1999) .

Hasta recientemente, las opciones terapéuticas para pacientes con recaída enseguida de la recaída estaban limitadas al mejor cuidado de apoyo o paliación. Un estudio reciente que compara docetaxel (Taxoteré) con el mejor cuidado de apoyo demostró que los pacientes con NSCLC se podrían beneficiar de la terapia de segunda línea después de que los regímenes de primera línea a base de cisplatino habían fallado. Los pacientes de todas las edades y con estatus de desempeño de ECOG de 0, 1 o 2 demostraron supervivencia mejorada con docetaxel, como lo hicieron aquellos que habían sido refractarios ha previo tratamiento a base de platino. Los pacientes que no se beneficiaron de la terapia incluyeron aquellos con pérdida de peso del 10%, niveles de deshidrogenasa lactato altos, implicación de multi órganos o implicación del hígado. Adicionalmente, el beneficio de la monoterapia con docetaxel no se extendió más allá del ajuste de segunda línea. Los pacientes que reciben docetaxel como tratamiento de tercera línea o más allá no mostraron prolongación de supervivencia. El docetaxel como un solo agente se convirtió en una terapia de segunda línea estándar para NSCLC. Recientemente, otro estudio fase III aleatorizado en terapia de segunda línea de NSCLC comparo pemetrexel (Alimta®) con docetaxel. El tratamiento con pemetrexel dio como resultado una eficacia clínicamente equivalente pero con significativamente menos efectos secundarios en comparación con docetaxel. , Se ha reconocido por mucho tiempo que hay necesidad de desarrollar métodos de individualizar el tratamiento de cáncer. Con el desarrollo de tratamientos de cáncer apuntados, hay un interés particular en < metodologías que podrían proveer un perfil molecular del objetivo de tumor (esto es, aquellos que. son predictivos por beneficio clínico) . La prueba de principio para el perfilado de expresión genética en cáncer ya ha sido establecido con la clasificación molecular de tipos de tumor que no son evidentes en base a las pruebas morfológicas e inmunohistoquímicas actuales. Dos entidades de enfermedad separadas fueron diferenciadas con diferentes prognosis de la clasificación actual individual de linfoma de célula B difuso utilizando perfilado de expresión genética.

Se ha demostrado que los pacientes con NSCLC que portan una mutación de EGFR activante en su tumor responden especialmente bien al tratamiento con inhibidores de cinasa de tirosina como erlotinib y gefitinib. (Paz-Ares et al. 2010) . Mientras que gefitinib no parece conferir beneficio clínico a una población de pacientes , sin seleccionar (Thatcher et al. Lancet 2005) erlotinib si' (Shepherd et al. NEJM 2005; Cappuzzo et al 2010) . Por consiguiente, es el objetivo de la presente invención proveer biomarcadores de expresión que son predictivos para el beneficio clínico para el tratamiento con clorhidrato de erlotinib en pacientes con cáncer y que no son predictivos para el beneficio clínico para el tratamiento con gefitinib en pacientes con cáncer.

La ECM (Matriz Extra Celular) provee el armazón estructural para la formación de tejidos y órganos. La ECM se enlaza a moléculas de adhesión de sustrato sobre la superficie de células e influencia varias rutas de señalización intracelulares que regulan la supervivencia, proliferación, polaridad y diferenciación. Las familias importantes de moléculas de adhesión que se enlazan a ECM son las integrinas. Las integrinas consisten de sub unidades Alfa y Beta y están compuestas de dominios extra celulares grandes y dominios citoplásmicos relativamente pequeños. El enlace de ligando activa cascadas de señalización que conducen al ensamble de un complejo de multi proteína en el sitio de adhesión celular a la ECM. Estos eventos tienen dos impactos importantes sobre la célula: forjan una conexión entre la ECM y el cito esqueleto de actina y alteran los flujos de muchas rutas de señalización intra celulares. Tres proteínas que actúan como reguladores importantes de señalización moderada por integrina son la ILK (Cinasa Integrina Enlazada) y las proteínas de adaptador PINCH (Proteína Rica en Cys-His Particularmente Interesantes) y Parv (Parvina) entre las cuales ILK es el regulador mayor de señalización moderada por integrina. Estas moléculas forman un complejo hetero trimérico, que es denominado como el complejo de IPP. La función principal de ILK es conectar integrinas al cito esqueleto. ILK se enlaza a PINCH por medio, de su dominio N-terminal y se enlaza a alfa-Parvina por medio de su dominio C-terminal, dando como resultado la formación de complejos ternarios de PINCH-ILK-alfa-Parvina (complejo de IPP) . El complejo de IPP funciona tanto como adaptador entre integrinas y el cito esqueleto de actina y como un centro que regula varias rutas de señalización. 1 Las lineas de NSCLC humanas que contienen EGFR tipo silvestre muestran mayor sensibilidad a clorhidrato de erlotinib antes de EMT (Thomson et al. (2005)),. La transición epitelial-mesenquimal (EMT) es una conversión fenotipica de i células biológicas caracterizada por perdida de adhesión celular, represión de expresión de E-cadérina y movilidad celular incrementada. Se cree que varias rutas oncogénicas (por ejemplo, factores de crecimiento de péptido, integrina, etc.) inducen EMT. EMT es un aspecto característico de células que sufren proliferación, se ha sugerido que juegan un papel significativo en el avance del tumor y metástasis. La expresión incrementada de la cinasa integrina-enlazada está asociada con la supervivencia más corta en cáncer de pulmón de célula no pequeña (Takanami et al.( (2005)).

El estudio MERIT es un estudio de identificación de marcador de eficacia de etiqueta abierta no aleatorizado para Tarceva en pacientes con cáncer de pulmón de célula no pequeña de segunda linea.

El término "biomarcador" significa una sustancia usada como indicador de un estado biológico, esto es, de procesos biológicos o respuestas farmacológicas a una interacción terapéutica. Un biomarcador indica un cambio en la expresión o estado de una proteina que se correlaciona con el riesgo o avance de una enfermedad o por la susceptibilidad de una enfermedad a un tratamiento dado.

El término "gen marcador" significa un gen usado para determinar si una pieza de ADN ha sido insertada exitosamente al organismo huésped.

La expresión genética es el proceso én el cual la información de un gen es usada en la síntesis de un producto de gen funcional, por ejemplo una proteína. El término "nivel de expresión" significa el nivel al cual un ¡gen particular es expresado dentro de una célula, tejido ;u organismo. El término "nivel de expresión" en contexto con proteínas refleja la cantidad de una proteína particular presente en una célula a un cierto tiempo.

"Proteomicos químicos" es un procedimiento de cromatografía de afinidad a base de espectrometría de masas i que usa moléculas pequeñas inmovilizadas como cebo para capturar e identificar complejos de proteína, interactuantes de un proteoma entero. Puede ser aplicado , sqbre inhibidores de cinasa por ejemplo para explorar su modo de acción o sobre productos naturales para identificación objetivo.

El término "nivel de activación" refleja el potencial de una proteina particular para estar activa en una célula en un cierto tiempo. Un ejemplo son cinasas que son fosforiladas en un cierto sitio para ser aptas de modificar su sustrato.

El término "un valor representativo de un nivel de expresión del complejo de IPP en tumores de una población de pacientes que no deriva ningún benefició clínico del tratamiento" se refiere a un valor estimativo de un nivel de expresión medio del gen marcador en tumores- de una población de pacientes que no derivan un benefi;cip clínico del tratamiento. El beneficio clínico fue definido ya sea por no tener una respuesta objetivo o estabilización de enfermedad por = 12 semanas.

En una modalidad particular, el nivel de expresión del gen marcador es determinado mediante tecnología de microarreglo u otras tecnologías que determinan niveles de expresión de ARN como RT-PCR cuantitativa o mediante cualquier método que busca en el nivel de expresión de la proteína respectiva, por ejemplo inmunohistoquímica (IHC) . La construcción y uso de chips de gen son bien conocidos en el arte. Véanse, por ejemplo Patentes Estadounidenses 5,202,231; 5, 445, 934; 5, 525, 464; 5, 695, 940; 5, 744, 305;, 5,795, 716 and 1 5,800,992. Véase también, Johnston, M. Curr. Biol. 8:R171-174 (1998); Iyer VR et al., Science 283:83-87 (1999) . Por supuesto, el nivel de expresión genética puede ser determinado mediante otros métodos que son bien conocidos para la persona experimentada en el arte tai como por ejemplo Northern blot, RT-PCR, PCR cuantitativa en tiempo real, extensión de cebador, protección de ARN-ása, perfilado de expresión de ARN.

El gen marcador de la presente invención puede ser combinado con otros biomarcadores a conjuntos de biomarcador, en particular con biomarcadores de EGFR., Conjuntos de biomarcador pueden ser integrados a partir de cualquier combinación de biomarcadores predictivos para hacer predicciones acerca del efecto del tratamiento con clorhidrato de erlotinib en pacientes con cáncer. Los biomarcadores y conjuntos de biomarcadores descritos en la presente pueden ser usados por ejemplo para predecir como los pacientes con cáncer responderán a intervención terapéutica con clorhidrato de erlotinib.

El término "gen" como es usado en la presente comprende variantes del gen. El término "variante" es concerniente con secuencias de ácido nucleico que son sustancialmente similares a las secuencias de ácido nucleico dadas por el número de acceso de GenBank. El término "sustancialmente similar" es bien entendido por la persona experimentada en el arte. En particular, una variante de gen puede ser un alelo que muestra intercambios de nucleótido en comparación con la secuencia de ácido nucleico del alelo más prevaleciente en la población humana. Preferiblemente, tal secuencia de ácido nucleico sustancialmente similar tiene una 1 similaridad de secuencia al alelo más prevaleciente de por lo menos 80%, preferiblemente 85%, más preferiblemente 90%, más preferiblemente por lo menos 95%. El término "variante" también pretende relacionarse con variantes de empalme.

Técnicas para la detección y cuantificáción de expresión genética para los genes descritos por esta invención incluyen pero no están limitadas a Northern blot, RT-PCR, PCR cuantitativa en tiempo real, extensión de cebador, protección de ARN-asa, perfilado de expresión de ARN y técnicas relacionadas. Estas técnicas son bien conocidas para aquellas de habilidad en el arte, véase por ejemplo Sambrook J et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edición (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 2000) .

Técnicas para la detección de expresión de proteina dé los respectivos genes descritos por esta invención incluyen pero no están limitadas a inmunohistoquímica (IHC) .

Los biomarcadores de la presente invención son una terapia individualizada para pacientes con cáncer, en particular pacientes con NSCLC refractario. Esta terapia individualizada permitirá a los médicos ^de tratamiento seleccionar el agente más apropiado de los fármacos existentes para terapia de cáncer, en partipular NSCLC. El beneficio de la terapia individualizada para cada paciente futuro son: proporciones de respuesta/número de pacientes que se benefician se incrementara y el riesgo de efectos secundarios adversos debido al tratamiento no efectivo será reducido.

Se comprenderá que la terminología empleada en la presente es por el propósito de describir modalidades particulares y no pretende ser limitante. Además, aunque cualesquier métodos, dispositivos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente pueden ser usados en la práctica o pruebas de la invención, se describen ahora los métodos, dispositivos y materiales preferidos.

La presente invención encontró sorprendentemente que la respuesta de un paciente con cáncer al , tratamiento con clorhidrato de erlotinib puede ser predicha al determinar los niveles de activación de ILK, alfa-parvina y proteínas de PINCH conjuntamente, de manera individual o cada uno combinado individualmente en una muestra 1 de tumor de un paciente. Además, la diferencia en resultados clínicos puede ser atribuida a diferencias en los perfiles !de interacción de proteína de erlotinib y gefitinib, determinados mediante proteomicos químicos.

En un cierto objeto, la presente . invención es concerniente con un método in vitro para producir la respuesta de un paciente con cáncer al tratamiento con clorhidrato de erlotinib que comprende: determinar los niveles de expresión de uno, dos o tres genes seleccionados del grupo que consiste de ILK, alfa-parvina y genes de PINCH en una muestra de tumor de un paciente y comparar los niveles de expresión de los genes de ILK, alfa-parvina y PINCH conjunta o individualmente con un valor representativo de los niveles de expresión de ILK, alfa-parvina y genes de PINCH conjunta o individualmente en tumores de una población de pacientes que : no deriva ningún beneficio clínico del tratamiento, en donde un nivel de expresión más baja de genes de ILK, alfa-parvina y PINCH conjunta o individualmente en la muestra de tumor del paciente es indicador de que un paciente derivara beneficio clínico del tratamiento.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con un método in vitro para predecir la respuesta de un paciente con cáncer al tratamiento con clorhidrato de erlotinib que comprende: determinar los niveles de expresión genes consiste de ILK, alfa-parvina y genes de PINCH conjuntamente con un valor representativo de los niveles de expresión de ILK, alfa-parvina y genes de PINCH conjuntamente en tumores de una población de pacientes que no deriva ningún beneficio clínico del tratamiento, en donde un nivel de expresión más bajo de genes de ILK, alfa-parvina y PINCH conjuntamente en la muestra de tumor del paciente es indicador de que un paciente derivara beneficio clínico del tratamiento.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con un método in vitro para predecir la respuesta de un paciente con cáncer al 1 tratamiento con clorhidrato de erlotinib que comprende: determinar los niveles de expresión en los genes consiste de ILK y PINCH en una muestra de tumor de un paciente y comparar los niveles de expresión de los genes de ILK y PINCH conjuntamente con un valor representativo de los niveles de expresión de ILK y PINCH conjuntamente en tumores de una población de pacientes que no deriva ningún beneficio i clínico del tratamiento, en donde un nivel de expresión más bajo de genes de ILK y PINCH conjuntamente en la muestra de tumor del paciente es indicador de que un paciente derivara beneficio clínico del tratamiento.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con un método in vitro para predecir la respuesta de un paciente con cáncer al tratamiento con clorhidrato de erlotinib que comprende: determinar los niveles de expresión de los genes de ILK y alfa-parvina en una muestra del tumor de un paciente y comparar los niveles de expresión de los genes de ILK y alfa-parvina conjuntamente con un valor representativo de los niveles de expresión de los genes de ILK y alfa-parvina conjuntamente en tumores de una población dé pacientes que no deriva ningún beneficio clínico del tratamiento, en donde un nivel de expresión más bajo de los genes de ILK y alfa-parvina conjuntamente en la muestra de tumor del paciente es indicador de que un paciente derivara benejficio clínico del tratamiento.

En un cierto objeto, la presente ; invención es concerniente con un método in vitro p'ara predecir la respuesta de un paciente con cáncer al tratamiento con clorhidrato de erlotinib que comprende: determinar los niveles de expresión de los genes de alfa-parvina y PINCH en una muestra del tumor de un paciente y comparar los niveles de expresión de los genes de alfa-parvina y PINCH conjuntamente con un valor representativo' de los niveles de expresión de los genes de alfa-parvina y PINCH conjuntamente en tumores de una población dei pacientes que no deriva ningún beneficio clínico del tratamiento, en donde un nivel de expresión más. bajo de los genes de alfa-parvina y PINCH conjuntamente en la muestra de tumor del paciente es indicador de que un paciente derivara beneficio clínico del tratamiento.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con un método in vitro para predecir la respuesta de un paciente con cáncer al; tratamiento con clorhidrato de erlotinib que comprende: determinar los niveles de expresión del gen de IL en una muestra del tumor de un paciente y comparar el nivel de expresión del gen de ILK con un valor representativo del nivel de expresión del gen de ILK en tumores de una población de pacientes que no deriva ningún beneficio clínico del tratamiento, en donde un nivel de expresión más bajo del gen de ILK en la muestra de tumor del paciente es indicador de que un paciente derivara beneficio clínico del tratamiento.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con un método in vitro para predecir la respuesta de un paciente con cáncer al tratamiento con clorhidrato de erlotinib que comprende: determinar los niveles de expresión del gen de PINCH en una muestra del tumor de un paciente y comparar el nivel de expresión del gen de PINCH con un valor representativo del nivel de expresión del gen de PINCH en, tumores de una población de pacientes que no deriva ningún beneficio clínico del tratamiento, en donde un nivel de expresión más bajo del gen de PINCH en la muestra de tumor del paciente es indicador de que un paciente derivara beneficio clínico del tratamiento.

En un cierto objeto, la presenté invención es concerniente con un método in vitro para predecir la respuesta de un paciente con cáncer al tratamiento con clorhidrato de erlotinib que comprende: determinar los niveles de expresión del gen de alfa-parvina en una muestra del tumor de un paciente y comparar el nivel de expresión del gen de alfa-parviná con un valor representativo del nivel de expresión del gen de alfa-parvina en tumores de una población de pacientes qué no deriva ningún beneficio clínico del tratamiento, en donde un nivel de expresión más bajo del gen de alfa-parvina! en la muestra de tumor del paciente es indicador de que un paciente derivara beneficio clínico del tratamiento. i En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con un método como se describe en la presente, en donde el nivel de expresión es determinado mediante tecnología de microarreglo .

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con un método in vitro para predecir la respuesta de un paciente con cáncer al; tratamiento con clorhidrato de erlotinib que comprende: determinar el nivel de activación de una, dos o tres proteínas seleccionadas del grupo que consiste de proteínas de ILK, alfa-parvina y genes de PINCH en una muestra de tumor del paciente1 y comparar los niveles de activación de las proteínas de ILK, alfa-parvina y PINCH conjunta o individualmente con un valor representativo de los niveles de activación de proteina ILK, alfa-parvina y PINCH conjunta o individualmente en tumores de una población de pacientes que no deriva ningún beneficio clínico del tratamiento, en donde un nivel de activación más baja de genes de ILK, alfa-parvina y PINCH conjunta o individualmente en la muestra de tumor del paciente es indicador de que un paciente derivara beneficio clínico del tratamiento.

En un cierto objeto, la presente , invención es concerniente con un método in vitro para predecir la respuesta de un paciente con cáncer al1 tratamiento con clorhidrato de erlotinib que comprende: determinar el nivel de activación de las proteínas de ILK, alfa-parvina y genes de PINCH en una muestra de tumor del paciente y comparar los niveles de activación de las proteínas de ILK, alfa-parvina y PINCH conjuntamente con un valor representativo de los niveles de activación de proteína ILK, alfa-parvina y PINCH conjuntamente en tumores de una población de pacientes que no deriva ningún beneficio clínico del tratamiento, en donde un nivel de activación más baja de las proteínas de ILK, alfa-parvina y PINCH! conjuntamente en la muestra de tumor del paciente es indicador de que un paciente derivara beneficio clínico del tratamiento.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con un método in vitro para predecir la respuesta de un paciente con cáncer al tratamiento con clorhidrato de erlotinib que comprende: determinar el nivel de activación de las proteínas de ILK en una muestra de tumor del paciente y comparar el nivel de. activación de la proteínas de ILK con un valor representativo del nivel de activación de l proteína de ILK, en tumores de una población de pacientes qué no deriva ningún beneficio clínico del tratamiento, en donde un nivel de activación más bajo de la proteína de ILK en la muestra de tumor del paciente es indicador de que un paciente derivara beneficio clínico del tratamiento.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con un método in vitro para predecir la respuesta de un paciente con cáncer al ; tratamiento con clorhidrato de erlotinib que comprende: ; determinar el nivel de activación de las proteínas de PINCH en una muestra de tumor del paciente y comparar el nivel de activación de la proteína de PINCH con un valor representativo del nivel de activación de la proteína de PINCH, en tumores de una población de pacientes que no deriva ningún beneficio clínico del tratamiento, en donde un nivel de activación más bajo de la proteína de PINCH en la muestra de tumor del paciente es indicador de que un paciente derivara beneficio clínico del tratamiento.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con un método in vitro para predecir la respuesta de un paciente con cáncer al! tratamiento con clorhidrato de erlotinib que comprende: i determinar el nivel de activación de la proteínas de ILK y PINCH en una muestra de tumor del paciente y comparar los niveles de activación de la proteínas de ILK y PINCH con un valor representativo de los niveles de ac ivación de las proteínas de ILK y PINCH, en tumores de una población de pacientes que no deriva ningún beneficio clínico del tratamiento, en donde un nivel de activación más bajo de las proteínas de ILK y PINCH en la muestra de tumor del paciente es indicador- de que un paciente derivara beneficio clínico del tratamiento.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con un método in vitro para predecir la respuesta de un paciente con cáncer al tratamiento con clorhidrato de erlotinib que comprende: determinar el nivel de activación de la proteínas de alfa-parvina y PINCH conjuntamente en una muestra de tumor del paciente y comparar los niveles de activación de la proteínas de alfa-parvina y PINCH con un valor representativo de los niveles de activación de las proteínas de alfa-parvina y PINCH conjuntamente, en tumores de una población de pacientes que no deriva ningún beneficio clínico del tratamiento, en donde un nivel de activación más bajo de las proteínas de alfa-parvina y PINCH con untamente en las muestras de tumor del paciente es indicador de que un paciente derivara beneficio clínico del tratamiento.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con un método in vitro para predecir la respuesta de un paciente con cáncer al tratamiento con clorhidrato de erlotinib que comprende: determinar el nivel de activación de la proteínas de ILK y alfa-parvina en una muestra de tumor del paciente y comparar los niveles de activación de la proteínas de ILK y alfa-parvina conjuntamente con un valor representativo de los niveles de activación de las proteínas de ILK y alfa-parvina conjuntamente, en tumores de una población de pacientes que no deriva ningún beneficio clínico del tratamiento, en donde un nivel de activación más bajo de las proteínas de ILK y alfa-parvina conjuntamente en la muestra de tumor del paciente es indicador de que un paciente derivara beneficio clínico del tratamiento.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con un método in vitro para predecir la respuesta de un paciente con cáncer al ; tratamiento con clorhidrato de erlotinib que comprende: determinar el nivel de activación de las proteínas de alfa-parvina en una muestra de tumor del paciente y comparar el nivel de activación de la proteína de alfa-parvina con un valor representativo del nivel de activación de la alfa-parvina en tumores de una población de pacientes que no deriva ningún beneficio clínico del tratamiento, en donde un nivel de activación más bajo de la proteína de alfa-parvina en la muestra de tumor del paciente es indicador de que un paciente derivara beneficio clínico del tratamiento.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con un método in vitro para predecir la respuesta de un paciente con cáncer al tratamiento con clorhidrato de erlotinib que comprende: determinar los niveles de proteína de fosforilación de ILK en una muestra de tumor del paciente y comparar los niveles de fosforilación de la proteína de ILK con un valor representativo de los niveles de fosforilación de los niveles de ILK en tumores de una población de pacientes que no derivan ningún beneficio clínico del tratamiento, en donde un nivel de fosforilación diferente de la protéina de ILK en la muestra de tumor del paciente es indicador de que un paciente derivara beneficio clínico del tratamiento.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con un método para la selección de tratamiento de cáncer para un paciente humano, el método comprende: I (i) determinar los niveles de expresión de uno, dos o tres genes seleccionados del grupo que consiste de genes de ILK, alfa-parvina y PINCH en una muestra de tumor de un paciente y (ii) comparar los niveles de expresión1 de uno, dos o tres genes seleccionados del grupo que consiste de genes de ILK, alfa-parvina y PINCH con un valor representativo de los niveles de expresión de uno, dos o tres genes seleccionados del grupo que consiste de ILK, alfa-parvina y genes de PINCH en tumores de una población de pacientes que no deriva ningún beneficio clínico del tratamiento, (iii) en donde los niveles de expresión más bajos de genes seleccionados del grupo que consiste de genes de ILK, alfa-parvina y PINCH en la muestra de tumor del paciente es indicador de que un paciente derivara beneficio clínico del tratamiento con clorhidrato de erlotinib y (iv) seleccionar el tratamiento con clorhidrato de erlotinib como el tratamiento de cáncer para el paciente.

En un cierto objeto,' la presente invención es concerniente con un método de tratamiento, de cáncer en un paciente que comprende administrar una cantidad efectiva de clorhidrato de erlotinib al paciente, a condición de que los niveles de expresión de uno, dos o tres genes seleccionados del grupo que consiste de ILK, alfa-parvina y PINCH, en una muestra de tumor del paciente sean más bajos que los niveles de expresión de uno, dos o tres genes seleccionados del grupo que consiste de genes de ILK, alfa-parvina y PINCH, en los tumores de una población de pacientes que no derivan ningún beneficio clínico del tratamiento con clorhidrato de erlotinib.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con un método para la selección de tratamiento de cáncer para un paciente humano, el método comprende: (i) determinar los niveles de expresión: de una, dos o tres proteínas seleccionadas del grupo que consiste de proteínas de ILK, alfa-parvina y PINCH en una muestra de tumor de un paciente y (ii) comparar los niveles de activación de una, dos o tres proteínas seleccionadas del grupo qué consiste de ILK, alfa-parvina y PINCH con un valor representativo de los niveles de activación de una, dos o tres proteínas seleccionadas del grupo que consiste de proteínas de ILK, alfa-parvina y PINCH en tumores de una población de pacientes que no deriva ningún beneficio clínico del tratamiento, (iii) en donde un nivel de activación más bajos de una, dos o tres proteínas seleccionadas del grupo que consiste de proteínas de ILK, alfa-parvina y PINCH en la muestra de tumor del paciente es indicador de que un paciente derivara beneficio clínico del tratamiento con ¡ clorhidrato de erlotinib y (iv) seleccionar el tratamiento con clorhidrato de erlotinib como el tratamiento de cáncer para el paciente.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con un método de tratamiento d cáncer en un paciente que comprende administrar una cantidad efectiva de clorhidrato de erlotinib al paciente, a condición de que los niveles de activación de una, dos o tres proteínas seleccionadas del grupo que consiste de proteínas de ILK, alfa-parvina y PINCH, en una muestra de tumor del paciente sean más bajos que los niveles de activación de una, dos o tres proteínas seleccionadas del grupo que consiste de proteínas de ILK, alfa-parvina y PINCH, en los tumores de una población de pacientes que no derivan ningún beneficio clínico del tratamiento con clorhidrato de erlotinib.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con un método como se describe en la presente que es concerniente con ILK, alfa-parvina y PINCH conjuntamente.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con un método como se describe en la presente que es concerniente con ILK y PINCH conjuntamente.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con un método como se describe en la presente que es concerniente con alfa-parvina y PINCH conjuntamente.

En un cierto objeto, la presenté invención es concerniente con un método como se describé en la presente que es concerniente con ILK y alfa-parvina conjuntamente.

En un cierto objeto, la presenté invención es concerniente con un método como se describe en la presente que es concerniente con ILK.

En un cierto objeto, la presente 1 invención es concerniente con un método como se describé en la presente, concerniente con alfa-parvina .

En un cierto objeto, la presente : invención es concerniente con un método como se describe en la presente que es concerniente con PINCH.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con un método como se describe en la presente, en donde el cáncer es cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC) .

En un cierto objeto, la presente | invención es concerniente con un método como se describé en la presente, en donde un paciente con cáncer no responde al tratamiento con getifinib.

En un cierto objeto, la presenté ' invención es concerniente con el uso de uno, dos o tres genes seleccionados del grupo que consiste de ILK, alfa-parvina y PINCH para predecir la respuesta de un paciente con cáncer al tratamiento con clorhidrato de erlotinib.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con el uso de genes de ILK, alfa-parvina y PINCH para predecir la respuesta de un paciente con cáncer al tratamiento con clorhidrato de erlotinib. 1 En un cierto objeto, la presente invención es I concerniente con el uso de genes de alfa-parvina y PINCH para i predecir la respuesta de un paciente 1 con cáncer al tratamiento con clorhidrato de erlotinib. ·.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con el uso dé genes de ILK y PINCH para predecir la respuesta de un paciente con cáncer al tratamiento con clorhidrato de erlotinib.

En un cierto objeto, la presente i invención es concerniente con el uso de genes de ILK y alfa-parvina para predecir la respuesta de un paciente con cáncer al tratamiento con clorhidrato de erlotinib.

En un cierto objeto, la presente i invención es concerniente con el uso de clorhidrato de erlotinib para el tratamiento de cáncer, en donde i) los niveles de activación de una, dos o tres proteínas seleccionadas del grupo que consiste de proteínas de ILK, alfa-parvina y PINCH en una muestra de tumor del paciente son medidos, ii) los niveles de expresión de los genes de ILK, alfa-parvina y PINCH conjunta o individualmente son comparados con un valor representativo de los niveles de expresión de los genes de ILK, alfa-parvina y PINCH conjunta ¡o individualmente en tumores de una población de pacientes, que no derivan ningún beneficio clínico del tratamiento iii) se administra clorhidrato de erlotinib a un paciente que tiene un nivel de expresión más bajo de genes de ILK, alfa-parvina y PINCH conjunta o individualmente.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con el uso de clorhidrato de erlotinib para el tratamiento de cáncer en donde los niveles de activación de las proteínas de ILK, alfa-parvina y PINCH , conjuntamente son concernientes.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con el uso de clorhidrato de erlotinib para tratamiento de cáncer, en donde el nivel de activación de la proteína de ILK es concerniente.

En un ciert.o objeto, la presente invención es concerniente con el uso de clorhidrato de erlotinib para tratamiento de cáncer, en donde el nivel de activación de la proteína de alfa-parvina es concerniente.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con el uso de clorhidrato de erlotinib para tratamiento de cáncer, en donde el nivel de activación de la proteína de PINCH es concerniente.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con el uso de clorhidrato de erlotinib para tratamiento de cáncer, en donde los niveles de activación de la proteína de ILK y alfa-parvina son concernientes.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con el uso de clorhidrato de erlotinib para tratamiento de cáncer, en donde los niveles de activación de la proteína de ILK y PINCH son concernientes.

En un cierto objeto, la presente , invención es concerniente con el uso de clorhidrato de 'erlotinib para tratamiento de cáncer, en donde los niveles de activación de la proteína de alfa-parvina y PINCH son concernientes.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con el uso como se describe, en la presente, concerniente con ILK.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con el uso como se describe en la presente, concerniente con alfa-parvina.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con el uso como se describe en la presente, concerniente con PINCH.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con el uso como se describe eri la presente, en donde el cáncer es NSCLC.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con el uso como se describe en la presente, en donde el paciente con cáncer no responde al! tratamiento con gefitinib .

En un cierto objeto, la presenté invención es concerniente con un kit para detectar los niveles de expresión de uno, dos o tres genes seleccionados del grupo que consiste de ILK, alfa-parvina y PINCH, ¡ el kit comprende i) un compuesto capaz de detectar específicamente niveles de expresión de uno, dos o tres genes seleccionados del grupo que consiste de ILK, alfa-parvina y PINCH y ii) instrucciones para usar dicho kit para predecir la responsividad de un paciente que sufre del tratamiento con cáncer icon clorhidrato de erlotinib, en donde los niveles de expresión disminuidos de uno, dos o tres genes seleccionados del grupo que consiste de genes de ILK, alfa-parvina y PINCH son comparados con una muestra de referencia que indica que un paciente se puede beneficiar del tratamiento con clorhidrato de erlotinib.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con un kit como se describe en la presente, concerniente con ILK.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con un kit como se describe;, en la presente, concerniente con alfa-parvina.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con un kit como se describe en la presente, concerniente con PINCH.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con un kit como se describe en la presente, en donde el cáncer es NSCLC.

En un cierto objeto, la presente invención es concerniente con un kit como se describe en la presente, en donde el paciente con cáncer no responde al tratamiento con gefitinib. en un objeto adicional, la presente invención provee un método terapéutico para tratar un paciente con cáncer identificado por el método in vitro de la presente invención. Dicho método terapéutico comprende administrar clorhidrato de erlotinib al paciente que ha sido seleccionado para tratamiento en base a la expresión predictiva y/o patrón de activación de los genes de las SEQ ID 1, 2 Y 3 adjuntas. Un cáncer particular a ser tratado es NSCLC.

SEQ ID: Seq Id No. 1 muestra la secuencia de nucleótidos de ILK humanos .

Seq Id No. 2 muestra la secuencia de nucleótidos de alfa-parvina humana.

Seq Id No. 3 muestra la secuencia de nucleótidos de PINCH humana.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: Los cambios de abundancia de proteina con la concentración del compuesto incrementada que fue cambiada significativamente mediante clorhidrato de erlotinib, gefitinib o ambos son mostrados. Los cambios están en general en buen acuerdo con las esperanzas surgidas de los valores de p (véase figura 2). Sin embargo, LIMS1 (PINCH) y M3K1 fueron solamente identificados y así cuantificádos en muestras desplazados con clorhidrato de erlotinib, mientas que EPHA1, K0564, KC1E, NUD12, SN1L1 fueron solamente encontrados en gefitinib .

Figura 2: Los valores de p ajustados de clorhidrato de erlotinib versus los valores de p ajustados de gefitinib después de transformación de logaritmo 10 son mostrados (las líneas indican 5% de probabilidad de error) .. La región A muestra proteínas que se enlazan significativamente a clorhidrato de erlotinib y gefitinib, las regiones B y C muestran proteínas que se enlazan significativamente a clorhidrato de erlotinib y gefitinib, respectivamente. Las proteínas en la región B no mostraron enlace significativo en ninguno de los dos. Esta figura puede solamente mostrar proteínas identificadas en ambos compuestos, por esta razón las proteínas nombradas anteriormente que están presentes en solamente clorhidrato de erlotinib o muestras desplazadas con gefitinib faltan en la presente.

Figura 3: Perfiles de interacción de clorhidrato de erlotinib y gefitinib en varias líneas celulares de NSCLC. Mientras que la cantidad relativas de EGFR es similar en todas las líneas celulares, esta figura muestra el enriquecimiento especifico de ILK, alfa-parvina y PINCH en fracciones enlazadas con clorhidrato de erlotinib.

Figura 4: Sitio de enlace de ATP de estructuras de proteina cristalinas de ILK y EGFR alineadas y se muestran interacciones potenciales de erlotinib y gefitinib con el are del bucle de DGF de ILK. Los átomos de oxigeno están coloreados de rojo, nitrógeno de azul, cloró de verde y flúor de ciano claro. Los átomos de carbono : dél complejo de erlotinib/EGFR (1M17) están coloreados de salmón, los de carbono del complejo de gefitinib/EGFR (2ITY) de amarillo y los átomos de carbono de ILK están coloreados de blanco. La imagen fue generada con Py OL. Las diferentes sustituciones en los anillos de anilina de erlotinib yj gefitinib (la posición 3 es sustituida con cloro en gefitinib pero con acetileno en erlotinib y la posición 4 está sin sustituir en erlotinib pero sustituida con flúor en gefitinib) . Las diferencias resultantes en proximidades de átomos sugieren que erlotinib es más probable que se enlace favorablemente al sitio de enlacé de ATP de ILK en comparación con gefitinib.

Figura 5 (que comprende de la figura 5 a la figura 5D) : Erlotinib frena la transición de H358 al estabilizar E-caderina. (A) Western blot en E-caderina. Señales cuantificadas de (B) E-caderina, (C) ILK y (D) PINCH, normalizadas en el contenido de proteina total y promediadas entre dos experimentos separados. 1 Figura 6 (que comprende de la figura 6A a: la figura 6B) : Expresión de IPP en lineas celulares de NSCLC. (A) Western blot de ILK, alfa-parvina, PINCH, E-caderina, vimentina y GAPDH sobre lineas celulares epiteliales de NSCLC tipo silvestre de EGFR H292, H441, H358, H322 y lineas celulares mesenquimales H460, H1299, H226 y Calue.1 (B) Señales de Western blot cuantificadas normalizadas en los niveles de GAPDH y promediadas para determinar el nivel de expresión del complejo de IPP.

Figura 7: Expresión de E-caderina (GDH1) e ILK en pacientes versus pacientes sin beneficio clínico. Cada punto representa la señal genética (transformada en log2) medida en una muestra. Los puntos azul y rojo corresponden a muestras de pacientes con y sin beneficio clínico,; respectivamente. (Gráficas de puntos efectuadas con los 1 elementos de programación Partek) .

Ejemplo La invención será ahora descrita en el ejemplo a continuación que pretende ser una ilustración , solamente y no pretende limitar el alcance de la invención.' Cultivo celular Células H292 fueron mantenidas en medio RPMI 1640 (Gibco-31870) complementado con FBS ¡ al 10% y penicilina/estreptomicina/glutamina. Una pelotilla de lxlO8 en células H292 fue sometida a lisis en 2.5 mi de solución reguladora del pH (NaCl 150 mM (cloruro de sodio) CaCl2 1 mM i (cloruro de calcio) MgC12 (dicloruro de magnesio), NP40 al 1% (nonil fenoxipolietoxiletanol) , EDTA completo, (Etilendiamin-tetraacetato) inhibidores de proteasa libres, ; ortovanadato 1 mM y Hepes 50 mM) . Después de 10 minutos de incubación sobre hielo, los lisados fueron despejados mediante centrifugación por 15 minutos a 12,000 x g a 4°C.

Síntesis e Inmovilización del compuesto Clorhidrato de erlotinib y gefitinib han sido modificados químicamente para ser enlazados cóvalentemente a perlas de 6B de sefarose epoxi-activadas (GE Healthcare) . El acoplamiento de los derivados a sefarose 6B epoxi-activada se realizó en dimetilformamida al 50% ( DMF) /carbonato de sodio 0.1 M (Na2CC>3) pH 11 en presencia de hidróxido de sodio (10 mM) de la noche a la mañana a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de tres lavados con dimetdilformamida al 50% (DMF) /carbonato de sodio (Na2C03) , los grupos reactivos restantes fueron bloqueados con etanolamina 1 M. etapas de lavado subsecuentes fueron efectuadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La eficiencia de enlace fue estimada al comparar las densidades ópticas de las soluciones del compuesto antes y después del acoplamiento a las longitudes de onda de absorbancia máxima 347 y 330 nm.

Experimento de competencia y cromatografia de afinidad 500 µ? de las proteínas respectivas fueron pre incubadas con concentraciones incrementadas (0, 0.0856, 0.2862, 0.957, 3.2, 10.7, 35.78, 119.6 y 400 µ? concentración final) ya sea de clorhidrato de erlotinib o gefitinib por 1 hora a 4°C bajo rotación. Luego, las muestras fueron mezcladas con perlas de sefarose-activadas equilibradas con clorhidrato de erlotinib inmovilizado o gefitinib por 3 horas a 4°C con rotación. Las perlas fueron luego lavadas tres veces con solución reguladora del pH de lisis y finalmente re suspendidas en 100 L en solución reguladora del pH de carga SDS, sometida a ebullición 5 minutos a 85°C y centrifugada 5 minutos a 12,000xg.

SDS-PAGE Muestras de elución fueron separadas en SDS-PAGE de Tris glicina al 4-20% (Invitrogen, EC6025BOX) . Los geles fueron fijados por 1 hora en etanol al 40%, ácido acético al 10% y teñidos de la noche a la mañana utilizando ; azul de comassie (Invitrogen LC6025) .

Espectrometría de masas Para la digestión en gel, se usó un protocolo adaptado de Shevchenko et al. (1996). Brevemente, cada carril del gel fue cortado en nueve rebanadas y cargado sobre' una placa Proxeon de 96 cavidades. Las piezas de gel fueron subsecuentemente lavadas con agua rniliQ y acetonitrilo, reducidas en ditiotreitol y alquiladas con yodo acetamida. Después de lavado completo, las piezas fueron incubadas con 50 ng de tripsina (Promega, V5111) y se les permite experimentar digestión de la noche a la mañana. Los sobrenadantes de los productos de digestión fueron recolectados y los péptidos de las piezas de gel extraídos con un cambio de bicarbonato de amonio 25 mM seguido por dos cambios de ácido fórmico al 5%. Todos los sobrenadantes fueron acumulados, secados y re suspendidos en acetonitrilo al 2%, ácido fórmico al 5% y analizados mediante LC-MS/MS utilizando un cromatografo liquido de nano flujo (Proxeon EASY-nLC) acoplado a un espectrómetro de masas de trampa iónica de electro atomizado (Velos LTQ-Orbitrap, Thermo Scientific) . La separación del péptido se realizó en una columna ReproSil-PUR C18 acoplada a una columna de trampa AQUA de 3 µ? sobre un gradiente de acetonitrilo de 60 minutos .

Identificación de secuencia Archivos de datos sin procesar fueron procesados utilizando el algoritmo de búsqueda SEQUEST 27 (SEQUEST versión 27.0, revisión 12, Thermo Electrón). Las búsquedas fueron efectuadas contra la base de datos humana SwissProt (versión 48, 219024 entradas) con una tolerancia de masa de +/-10 ppm para iones padres y +/-1.0 Da para iones de fragmentos. Las metioninas (reducidas/oxidadas; +15.9949 Da) fueron consideradas como modificaciones diferenciales mientras que la cisteína fueron consideradas como plenamente carbamidometiladas (+58.0133 Da) . Solamente los péptidos trípticos con no más de una escisión faltante fueron considerados para el análisis de datos. Lo's péptidos fueron considerados identificados no ambiguamente si sus puntuaciones de XCorr excedían de 2.0, 2.5 o 3.0 para iones individual, doble o triplemente cargados respectivamente y si las puntuaciones de dCn correspondientes eran más grandes de 0.1. en este reporte, solamente las proteínas para las cuales dos péptidos diferentes fueron identificados fueron procesadas adicionalmente por propósitos de cuantificación .

Procesamiento de datos espectro métricos de masa mediante i , Genedata Ref nerMS 5.2.6 Para cada compuesto y cada banda independientemente, los respectivos archivos sin procesar termo fueron cargados por Genedata RefinerMS 5.2.6: los datos ' centroides son descartados para reducir el uso de memoria; Las señales que se presentan en solamente un espectro son removidas; todas las representaciones de datos de : las muestras (=cromatogramas) son dadas sobre una rejilla de m/z-RT 2D común. Antes de la Alineación del Cromatograma que depende de parámetros de hallazgo pico apropiados, los parámetros de hallazgo pico fueron inspeccionados visualmente. La alineación del cromatograma corrige los desplazamientos de tiempo de retención entre cromatogramas en base a los picos comunes encontrados y el algoritmo de árbol ; trivial . El éxito de esta operación fue inspeccionado visualmente. La restricción de intervalo de RT descara señales y datos fuera de la región rica en información de 23-52 minutos de la cromatografía. La actividad promedio de cromatograma calcula un cromatograma promedio virtual de todos los cromatogramas de entrada. El nivel de ruido es reducido por la etapa de flujo de trabajo de "umbral de intensidad", que elimina cada señal por debajo de un umbral de 1000 au. Los picos y sus fronteras en dirección RT y m/ z son encontrados y visualizados como cuadrados que rodean el pico. Los cuadrados son proyectados sobre cada cromatograma y los conteos de iones eExtraidos (XIC) son determinados" dentro de estas fronteras. La hoja de trabajo resultante con una hilera por pico y una columna por cromatograma es guardada como archivo en la siguiente etapa de flujo de trabajo. Las ID de barrido o barridos de MS/MS encontrados dentro de estas fronteras de señal son guardados de la misma manera. Se genera un informe que resume las etapas de flujo de trabajo, $us parámetros de orden más información de diagnóstico de las etapas (grado de desplazamiento cromatográfico local por muestra, numero de señales encontradas) .

Procesamiento adicional Para cada compuesto y cada banda independientemente, las muestras respectivas fueron normalizadas utilizando el procedimiento cuantil (Smyth 2003) . Los picos encontrados en RefinerMS son asignados con la información de secuencia vía su ID de barrido en la medición respectiva. Los picos sin identificación o con identificación más ambigua son removidos. La información cuantitativa es transformada a log2. Para el control de proceso, los datos cuantitativos son sometidos a análisis de componente ¡ principal: las puntuaciones de los primeros cuatro componentes principales fueron correlacionadas con la concentración del compuesto y parámetros de proceso, tal como numero de carril de gel, ID de lote de LC- S o número de corrida de LC-MS. Los valores dispersos de distancia de Mahalanobis son estimados en base a las puntuaciones de los primeros dos componentes principales; muestras fuera del intervalo de confianza del 95% fueron consideradas como valores dispersos y son removidos del análisis adicional.

Combinación de intensidades de péptido con subrogado de proteina Los péptidos son asignados a sus precursores de proteína potenciales. Cada combinación encontrada de precursores de proteína es asignada a un grupo de cuantificación de proteína separado, comúnmente con solo un miembro de proteína o una proteína y sus variantes de empalme. Siguiendo Irizarry et al. (2003), se tiene abundancia relativa para cada grupo de cuantificación de proteína de los conteos de ion eExtraidos y normalizados a log (XIC) , ajustándose a un modelo aditivo lineal : i XICijn = ]i n + cíjn + E-ij„, con oíj el efecto de péptido, la abundancia relativa en escala logarítmica del grupo de cuantificación de proteína y eij que representa un término de error distribuido idénticamente independiente con media 0. Como se describe en Irizarry et al. (2003) y Holder et al. (2001), el pulido mediano es empleado para estimar robustamente parámetros de modelo. ' Detección de respuesta de dosis significativa Una matriz de contras Hirotsu es derivada de las concentraciones de numero de compuesto (véase Bretz et al. (2001)), los primeros y últimos contrastes son eliminados. Tsc de estadística t moderada son obtenidos para cada grupo de cuantificación de contraste y proteína (véase Smyth et al. (2004)). Para cada grupo de cuantificación de; proteína, TMC = max (Tsc) es obtenido (véase Bretz et al. (2001)). Los valores p son obtenidos en base al algoritmo para ] los valores de p Tmax ajustados escalados hacia abajo con 100,0 permutaciones en base a Ge et al. (2003), que se origina de estfall y Young (1993) . Es modificado con respecto a un lado de la estadística al no escoger |T| sino T.

Visualizaciones y cualesquier cálculos son efectuados con R 2.10.1 (cita "R") .

Reducción de señal (%) Proteina Clorhidrato de Gefitinib · ; Erlotinib ILK 0.0 77.3 PINCH 0.0 87 L 7 alfa-parvina 0.0 79^5 Confirmación de perfiles de enlace en otras lineas celulares de NSCLC Células H292, H441, H460 y H1299 fueron mantenidos en medio RPMI 1640 complementado con suero bovino fetal al 10% y 2 mmol/litro de L-glutamina. La síntesis del compuesto, inmovilización y cromatografía de afinidad fueron efectuados como se describe anteriormente. El análisis de espectrometría de masas fue efectuado en un sistema de LC LC-Packings) conectado a un dispositivo Thermo Finnigan LCQ Deca XP fue usado. Brevemente, extractos de péptido (en acetonitrilo al 5%, ácido acético al 0.5%, HFBA al : 0.012% (ácido heptafluorobutirico) con ácido fórmico al 1%) fueron inyectados sobre una columna de trampa (PepMap™ C18, 5 pm (LC-Packings) , 5 mm * 300 µp\ I.D.) ' át 20 L/min. subsecuentemente, los péptidos fueron transferidos en el solvente A (acetonitrilo al 5%, ácido acético al 0.5%, HFBA al 0.012%) sobre la columna analítica (Magic C18™ 5 µ?? (Spectronex) , 10 cm ? 75 µp I.D.) . la elución fue efectuada con un gradiente lineal de tres etapas de 5 a 15% de solvente B (ácido acético al 0.5%, HFBA al 0.012% en acetonitrilo al 80% (v/v) ) en 8 min, de 15 a 38% de solvente B en 65 minutos ! i y de 38 a 80% de solvente B en 25 minutos. ;E1; efluente de la columna fue introducido directamente a la fuente de ESI del espectrómetro de masas. El espectrómetro de masas se puso en operación en el modo de ion positive y los iones padre fueron seleccionados para fragmentación en el modo dependiente de datos. Los datos de MS/MS sin procesar fueron buscados contra la base de datos Swiss Prot humana utilizando SEQUEST (versión 27) . Los parámetros incluían una escisión faltante permitida y una tolerancia de masa de péptido de 1.25 Dalton Se usó una línea celular de NSCLC modelo, H358 que ha sido descrita previamente que cambia de estado epitelial a mesenquimal en el tratamiento con TGFbeta3 (Thomson 2008) . Los resultados muestran una disminución de E-caderina después I de 13 días de tratamiento con TGFbeta3, indicando que las células están realmente efectuando la transición (Figura 5a) . El nivel de E-caderina en células H358 tratadas con TGFbeta3 y erlotinib permaneció sin cambios, a diferencia de las células tratadas con TGFbeta3 y gefitinib. La cuantificación de las señales de Western blot muestran una disminución de más de 1/3 el niveles de E-caderina (Figura 6b) entre las células sin tratar y las células tratadas por 13 días con TGFbeta3. El tratamiento con erlotinib1 impide esta disminución, mientras que gefitinib fallá en inhibir la disminución moderada por TGFbeta3 de los niveles de E-caderina (Figura 5b) . Los efectos sobre la expresión de ILK y PINCH muestran que los niveles de ambas proteínas se incrementan después del tratamiento con TGFbeta3 (Figuras 5c y d) . Los niveles de expresión de ILK y PINCH no cambian cuando las células son tratadas con erlotinib, un efecto que no fue tan pronunciado después de tratamiento con gefitinib. Este modelo de EMT por consiguiente, demuestra que erlotinib reduce la extensión de EMT al inhibir la perdida de E-caderina y también sugiere impedir un incremento moderado por TGFb3 de ILK y PINCH.

Los tres componentes del complejo de ILK, alfa-parvina y PINCH son estudiados en una base individual, no tratando la posibilidad de la expresión de todo el complejo que esta correlacionado con un estatus de EMT. Ochos 1 líneas celulares de NSCLC tipo silvestre de EGFR fueron seleccionadas dependiendo de este estatus (Thomson 2005; Thomson 2008), que fue determinado por la expresión de E-caderina como marcador epitelial y vimentina como marcador mesenquimal. Todas las proteínas de IPP fueron detectadas con varias intensidades en todas las ocho líneas celulares excepto por alfa-parvina en H358 (Figura 6a). Después de la cuántificación y normalización, la suma global de intensidades del complejo de IPP fue 1.8 veces más alta en células mesenquimales versus epiteliales. PINCH1 fue la proteína más altamente expresada (56% y 58% de la expresión de IPP total en células epiteliales y mesenquimales, respectivamente) seguido por ILK (25% y 22%) alfa-parvina (19% y 20%) (Figura 6b) .

Expresión de E-caderina e ILK La relación potencial entre IPP y genes más globales involucrados en EMT ha sido evaluada. Específicamente, las diferencias entre sus perfiles de expresión' en pacientes con y sin beneficio clínico a erlotinib. En total, solamente 16 de los 21 genes pre-seleccionados fueron identificados con conjuntos de sonda detectados y fueron analizados estadísticamente. Entre los 31 conjuntos de sonda (correspondientes a 16 genes únicos) , dos fueron expresados diferencialmente de manera significativa estadísticamente en muestras de tumor de pacientes con y sin beneficio clínico.

Los dos genes correspondientes fueron ILK y CDH1 (E-caderina) , que son regulados descendentemente1 (0.93 veces, p = 0.011) y regulados ascendentemente (1.38 eces, p = 0.033) respectivamente en pacientes con beneficio clínico.

Alineación de EGFR y estructuras de proteína cristalinas de ILK Archivos de pdb de estructura cristalina disponibles públicamente de erlotinib EGFR-enlazado o¡ gefitinib y la estructura cristalina de ILK acomplejado con trifosfato de adenosina (ATP) fueron bajados de la base cristalográfica de PDB (Berman 2000) (códigos de pdb 1M17, 2ITY, 3KMW; Stamos 2002; Yun 2007; Fukuda 2009) . Las tres estructuras de cinasas fueron alineadas estructuralmente utilizando las coordenadas de átomos Ca de un subconjunto de los residuos que forman el sitio de enlace de ATP (números de residuos; basados en la numeración de EGFR 691-693, 701-703, 719-72 (19) 1, 751, 766-772, 820-823, 831-832. Las mediciones de alineación y distancia se hicieron con el paquete de visuálizacion PyMOL.

Pruebas de transición de EMT en la linea celular de NSCLC de H358 Células H358 fueron tratadas con 10 ng/ml de ?Tß3 recombinante (Peprotech, Nueva York, Y, Estados Unidos de América) y erlotinib o gefitinib 5 µ? por 3, 6, 10 y 13 días.

El medio de cultivo celular fue renovado cada 3 días. La lisis celular fue efectuada en PBS que contiene NP-40 al 1% e inhibidores de proteasa. Después del jdespeje mediante centrifugación a 12, 000g por 15 minutos a 4 i °G, las proteínas fueron separadas mediante SDS-PAGE y procesadas para el análisis de Western Blot. Las imagines fueron adquiridas utilizando una cámara digital compacta (Luminescent Image Analyzer: Fujifilm, Tokio, Japón) y cuantificadas con ImageQuant TL (GE Healthcare, Waukesha, WI, Estados Unidos de América) .

Análisis de datos MERIT Los perfiles de expresión genética fueron inhibidos en muestras de biopsia de tumor de 102 pacientes con NSCLC etapa IIIb/IV, siendo tratados con erlotinib (150 mg/día) . Las biopsias de tumor fueron analizadas utilizando perfilado de expresión genética con Affymetrix GeneChip Human Genome U133A 2.0 Array (Affymetrix, Santa Clara, CA, Estados Unidos de América) . Todos los resultados de expresión genética descritos en la presente (veces de cambio y valores p proceden del análisis estadístico ya reportado! (Tan 2010). Se observaron específicamente diferencias entre perfiles de expresión genética de pacientes con y sin beneficio clínico de erlotinib. Las siguientes 21 proteínas involucradas potencialmente en regulación transcripcional de EMT o en el complejo de IPP, fueron mapeadas a los genes correspondientes y conjuntos de sonda de microarreglo : Twist, Snail [Smal], Zeb [TCF8], Lef-1, E12/E47 basic Loop helix [bHLH] , Slug [Sma2], E-cadherin [CDH1], N-cadherin [CDH2] , Myc, Vimentin, Catenin beta, Catenin delta, Fibronectin, Epimorphin, integrin-linked kinase [ILK] , Parvin alpha, Parvin beta, PINCH 1, PINCH 2, Metástasis associated protein 3 [MTA3] , Y box binding protein 1 [YB-1] ) .

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Claims (18)

EVINDICACIONES

1. Un método in vitro para predecir la respuesta de un paciente con cáncer al tratamiento con clorhidrato de erlotinib, caracterizado porque comprende: determinar los niveles de expresión de uno, dos o tres genes seleccionados del grupo que consiste de ILK, alfa-parvina y PINCH en una muestra de tumor del paciente y comparar los niveles de expresión de los genes de ILK, alfa-parvina y PINCH conjunta o individualmente con un valor representativo de los' niveles de expresión de los genes de ILK, alfa-parvina y PINCH conjunta o individualmente en tumores de una población de pacientes que no derivan ningún beneficio clínico del tratamiento, en dónde un nivel de expresión más bajo de los genes de ILK, alfa-parvina y PINCH, conjunta o individualmente en la muestra de tumor del paciente es indicador de que un paciente derivara beneficio clínico del tratamiento.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el nivel de expresión es determinado mediante tecnología de microarreglo.

3. Un método in vitro para predecir la respuesta de un paciente con cáncer al tratamiento con clorhidrato de erlotinib, caracterizado porque comprende: determinar los niveles de activación de una, dos o tres proteínas seleccionadas del grupo que consiste de proteínas ILK, alfa-parvina y PINCH en una muestra de tumor del paciente y comparar los niveles de activación de las proteínas de ILK, alfa-parvina y PINCH conjunta o individualmente con un valor representativo de los niveles de activación de las proteínas de ILK, alfa-parvina y PINCH conjunta o individualmente en tumores de una población de pacientes que no derivan ningún beneficio clínico del tratamiento, en donde un nivel de activación más bajo de las proteínas de ILK, alfa-parvina y PINCH, conjunta o individualmente en la muestra de tumor del paciente es indicador de que un paciente derivara beneficio clínico del tratamiento .

4. Un método in vitro para predecir la respuesta de un paciente con cáncer al tratamiento con clorhidrato de erlotinib, caracterizado porque comprende: Determinar los niveles de fosforilación : de proteína de ILK en una muestra de tumor del paciente y comparar los niveles de fosforilación de la proteína de ILK con un valor representativa de los niveles de fosforilación de proteína de ILK en tumores de una población de pacientes que no derivan ningún beneficio clínico de tratamiento, en donde un nivel de fosforilación diferente de proteína de ILK, en la muestra de tumor del paciente es indicador de que un ; paciente derivara beneficio clínico del tratamiento. '

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque es concerniente con ILK, alfa-parvina y PINCH conjuntamente.1

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque es concerniente con ILK.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque, es concerniente con alfa-parvina.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque1 es concerniente con PINCH.

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porqué el cáncer es NSCLC.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las i reivindicaciones 1-9, caracterizado porque el paciente con cáncer no responde al tratamiento con gefitihib.

11. El uso de uno, dos o tres genes seleccionados del grupo que consiste de genes de ILK, alfa-parvina y PINCH caracterizado se usa para predecir la respuesta de un paciente con cáncer al tratamiento con clorhidrato de erlotinib .

12. El uso de clorhidrato de erlotinib para tratamiento de cáncer, caracterizado porque: i) se miden los niveles de activación de una, dos o tres proteínas seleccionadas del grupo que contiene proteínas de ILK, alfa-parvina y PINCH en una muestra de tumor del paciente. ii) los niveles de expresión de los genes de ILK, alfa-parvina y PINCH conjunta o individualmente son comparados con un valor representativo de los niveles de expresoin de genes de ILK, alfa-parvina y PINCH conjunta o individualmente en tumores de una población de pacientes que no derivan ningún beneficio clínico del tratamiento y iii) se administra clorhidrato de erlotinib a un paciente que tiene un nivel de expresión mas bajo de genes de' ILK, alfa-parvina y PINCH conjunta o individualmente. j i

13. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaiones 11-12, caracterizado porque es concerniente con ILK.

14. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-12, caracterizado porque es concerniente con alfa-p|arvina.

15. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-12, caracterizado porque es concerniente con PINCH.1

16. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-15, caracterizado porque el cáncer es NSCLC.

17. El uso de acuerdo con cualquiera de las ¡reivindicaciones lile, caracterizado porque el paciente con cáncer no responde al tratamiento con gefitinib. .

18. La invención como se describe en la presente.