WO2011115458A2 - 자가 면역 질환 예방 및 치료용 ＴＮＦ－α와 ＩＬ－２１ 이중 길항제 - Google Patents

자가 면역 질환 예방 및 치료용 ＴＮＦ－α와 ＩＬ－２１ 이중 길항제 Download PDF

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송은정
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조선정
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing and treating autoimmune diseases containing a double antagonist against TNF- ⁇ and IL-21.
  • the immune system protects the body from harmful foreign antigens.
  • antigens include bacteria, viruses, toxins, cancer cells and blood and tissues from other people or animals.
  • the immune system produces antibodies to destroy these harmful substances.
  • autoimmune disorders occur, the immune system cannot distinguish between organs of its healthy body and harmful antigens, destroying normal tissues, and this reaction is called autoimmune disease.
  • These reactions are allergic to hypersensitivity reactions, but allergic reactions to foreign substances that do not harm the body, but when the autoimmune is abnormal, the reaction occurs in the normal tissue of the body . It is not clear what causes the immune system to distinguish between organs and antigens in the body, but it is hypothesized that microorganisms or drugs, such as bacteria, cause illness in people born with genes susceptible to autoimmune diseases.
  • Types of autoimmune diseases include Hashimoto's thyroiditis, pernicious anemia, Addison's disease, type 1 diabetes, autoimmune arthritis, systemic lupus erythematosus, dermatitis, show Sjogren syndrome, Lupus erythematosus, Multiple sclerosis, Myasthenia gravis, Reactive arthritis, Graves' disease and Celiac disease sprue).
  • Treatment of the autoimmune response is aimed at regulating the autoimmune response and restoring impaired immune function of the body, which differs in the method of treatment depending on the type of various autoimmune diseases. For example, if you have a problem with blood, you need to have a blood transfusion. If you have a problem with your bones, joints, or muscles, you may need exercise or other functional therapy. Drugs are also prescribed to regulate the immune system's response. Immunosuppressive medicine is called immunosuppressive medicine. Prednisone, a corticosteroids drug, and cyclophosphamide, azathioprine, a nonsteroidal drug, are used. , And tacrolimus.
  • autoimmune arthritis is an autoimmune disease of unknown origin, despite a high prevalence of 21 million people, or about 1% of the world's population.
  • Autoimmune arthritis is a systemic chronic inflammatory finding in which the pathological symptoms are mainly symmetric in the diarthrodial joint and, in severe cases, are serious diseases leading to joint failure.
  • it also penetrates the joints and surrounding tissues, as well as organs, and can lead to osteoporosis, lungs, skin and eyes. It causes poor quality and makes life impossible for normal people.
  • Tumor necrosis factor is a pleiotropic cytokine, which plays an important role in the immune system as well as an inflammatory response, and in patients with joint and Crohn's disease of autoimmune arthritis. It is found in the colon and has also been reported to play an important role in the osteoclast process.
  • the therapeutic agents are designed to bind to ligands belonging to the TNF superfamily to inhibit signaling or to interfere with the binding between the TNF ligand and the receptor in order to inhibit the action of TNF acting as a etiology.
  • the development has been made by using a single antibody against TNF ligand and using a synthetic protein.
  • Treatment with a single antibody such as Remicade's infliximab or Humira's adalimumab, and CTLA-4 Ig and Enbrel's Entracept Recombinant proteins, such as entracept, are also used.
  • Infliximab, entracept, and adalimumab are the first biological treatments certified for the treatment of autoimmune arthritis, and have been used as therapeutic agents in clinical practice for nearly 10 years.
  • Targeting other cytokines other than TNF has led to the development of therapeutic agents, and is developing target IL-6 or IL-1 as DMARD (disease-modyfying anti-rheumatic drugs) that inhibit interleukin. It does not appear to be superior to the treatment.
  • the side effects of treatment include the administration of an anti-TNF treatment, which stops the mechanism of TNF, thereby increasing the risk of fungal or bacterial infection due to dysfunction in the immune system, and in particular, increases the risk of latent pulmonary tuberculosis.
  • Demyelinating disorders are known to lead to multiple sclerosis or hematologic malignancies, and according to the Rheumatoid Society, patients with autoimmune arthritis who have received anti-TNF treatments have received conventional treatments. Compared to this, skin cancer is more likely to develop.
  • autoimmune arthritis therapies do not appear in all patients. Two-thirds of the treated patients are effective, and one-third are not effective. This confirms the limitation of treatment depending on the patient's medical history or genetic factors. Moreover, not only the pain caused by the disease, but also the side effects that may be caused when the therapeutic agent is administered, and the safety problem are to be solved. In pregnant women with autoimmune arthritis, the safety of the fetus has been discussed when receiving anti-TNF therapy. In addition, the diagnostic problem that can predict the efficacy and side effects of therapeutic agents remains a challenge for some patients.
  • Interleukin is a type of cytokine that acts as a chemical signal between red blood cells.
  • IL-2 When IL-2 was approved by the FDA in the treatment of late stage cancer in 1992, it was the first single immunotherapy used to treat cancer. Since then, IL-2 has also been used for metastatic melanoma. IL-2 has been used to treat cancer and has been treated with vaccines. Il-2 helps the immune system to grow and divide cells faster. However, treatment with IL-2 showed side effects such as colds, chills, fever, fatigue and confusion.
  • IL-15 and IL-21 which belong to the IL-2 family, are also being studied as single agents or adjuvants as cancer therapeutics.
  • IL-21 is a type of cytokine with alpha-helix structure, which causes an inflammatory response through signaling through the receptor and gamma chain of IL-21.
  • IL-21 has been reported to induce maturation of NK cell precursors from bone marrow (Parrish-Novak J., et al., Nature, 408: 57-63, 2000), in particular cytokine production and apoptosis of NK cells It has been reported to increase effector functions such as performance (Strengell M, et al., J Immunol., 170: 5464-5469, 2003; Brady J, et al., J Immunol., 172: 2048-).
  • the present inventors have attempted to develop a novel autoimmune disease therapeutic agent that can overcome the disadvantages of safety and efficacy of a single antagonist used as an existing anti-TNF therapeutic agent, and for TNF-alpha (alpha, ⁇ ) and IL-21.
  • TNF-alpha alpha, ⁇
  • IL-21 TNF-alpha
  • IL-17 TNF-alpha
  • RORc inflammatory cytokines
  • An object of the present invention is to provide a composition for the prevention and treatment of autoimmune diseases containing TNFR2-IL21R fusion protein, which acts as a double antagonist against TNF- ⁇ (alpha, alpha) and IL-21 as an active ingredient.
  • the present invention comprises a Tumor necrosis factor receptor type 2 (TNFR2) protein or a fragment comprising an extracellular region of the TNFR2 and an interleukin-21 receptor (IL21R) protein or an extracellular region of the IL21R.
  • TNFR2 Tumor necrosis factor receptor type 2
  • IL21R interleukin-21 receptor
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding a TNFR2-IL21R fusion protein.
  • the present invention also provides an expression vector comprising a polynucleotide encoding a TNFR2-IL21R fusion protein.
  • the present invention also provides a transformant transformed into a host cell with an expression vector comprising a polynucleotide encoding a TNFR2-IL21R fusion protein.
  • the present invention also provides a composition for the prevention and treatment of autoimmune diseases containing TNFR2-IL21R fusion protein as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for treating autoimmune disease comprising administering a pharmaceutically effective amount of a TNFR2-IL21R fusion protein to an individual suffering from an autoimmune disease.
  • the present invention also provides a method for preventing autoimmune disease comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of a TNFR2-IL21R fusion protein.
  • the present invention provides a fusion protein according to the present invention for use as a medicament for preventing and treating autoimmune diseases.
  • the present invention is a composition containing a TNFR2-IL21R fusion protein that antagonizes TNF- ⁇ and IL-21, known as the pathogenesis of autoimmune arthritis, which is one of autoimmune diseases, as an active ingredient, TNFR2-Fc and IL21R-Fc
  • the TNFR2-IL21R fusion protein inhibits the secretion of inflammatory cytokines, increases the production of anti-inflammatory cytokines, and is significantly superior in preventing osteoclast differentiation, as well as in the articulation of CIA arthritis-induced mouse models.
  • TNFR2-IL21R fusion protein according to the present invention is effective in preventing and treating autoimmune diseases because it shows the effect of alleviating invasion, inflammation and cartilage destruction, and increases the expression of Treg cells, which are immunosuppressive cells. It can be usefully used as an active ingredient of a composition having an effect.
  • FIG. 1 is a diagram showing the structure of IL21R-Fc in which the IL21R gene is cloned into the expression vector pYK602-HIS-Fc.
  • Figure 2 shows the Western blot confirming the expression of the cloned IL21R-Fc in the expression vector pYK602-HIS-Fc, and the purified protein using protein A beads, showing the results of Western blot using the HIS antibody Picture.
  • FIG. 3 is a diagram showing the structure of a TNF- ⁇ single antagonist cloned with the TNFR2 gene in the expression vector pYK602-HIS-Fc.
  • Figure 4 shows the Western blot confirmed that the cloned TNFR2-Fc single antagonist expressed in the expression vector pYK602-HIS-Fc and the expressed protein using protein A beads, and then the result of Western blot using the HIS antibody Figure shown.
  • FIG. 5 shows the structure of a PCR primer for preparing an expression vector expressing a TNFR2-IL21R fusion protein.
  • FIG. 6 is a diagram showing the structure of the TNFR2-IL21R fusion protein cloned with the expression vector pYK602-HIS-Fc IL21R gene and TNFR2 gene.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of Western blot confirming the expression of the TNFR2-IL21R fusion protein cloned into the expression vector pYK602-HIS-Fc.
  • FIG. 8 is a diagram illustrating the binding affinity between the purified TNFR2-IL21R fusion protein and its ligand, TNF- ⁇ and IL-21.
  • FIG. 9 shows the results of RT-PCR confirming the expression of IL-21, IL-17, RORc, and ⁇ -actin after treatment of TNFR2-IL21R fusion protein in the differentiation process of Th17 cells, and TNFR2- in the differentiation process of Th17 cells. It is a graph showing the amount of inflammatory cytokines IL-17 secreted when treated with Fc, IL21R-Fc and TNFR2-IL21R fusion proteins.
  • FIG. 10 is a graph showing the expression of FoxP3 and the amount of secreted anti-inflammatory cytokine IL-10 after treatment with TNFR2-IL21R fusion protein during differentiation of Th17 cells.
  • FIG. 11 is a diagram showing the inhibition of osteoclast differentiation of TNFR2-IL21R fusion protein.
  • FIG. 12 is a graph confirming the therapeutic effect of arthritis in CIA arthritis-induced mice of the TNFR2-IL21R fusion protein according to the present invention:
  • 12A is a graph showing the clinical scores observed when the TNFR2-IL21R fusion protein or Enbrel according to the present invention is administered to CIA arthritis-induced mice;
  • IL21R / TNFR2-Fc group administered with TNFR2-IL21R fusion protein in a CIA arthritis animal model
  • Enbrel group administered with Enbrel, an arthritis treatment agent, in a CIA arthritis animal model;
  • FIG. 12B is a graph showing the incidence observed when the TNFR2-IL21R fusion protein or Enbrel according to the present invention was administered to CIA arthritis-induced mice;
  • FIG. 12B is a graph showing the incidence observed when the TNFR2-IL21R fusion protein or Enbrel according to the present invention was administered to CIA arthritis-induced mice;
  • IL21R / TNFR2-Fc group administered with TNFR2-IL21R fusion protein in a CIA arthritis animal model
  • Enbrel A group of animals receiving Enbrel, a therapeutic agent for arthritis, in a CIA arthritis animal model.
  • Figure 13 shows the arthritis relief effect of CN arthritis-induced mice of the TNFR2-IL21R fusion protein through immunohistochemical staining:
  • CIA collagen induced arthritis
  • IL21R / TNFR2-Fc group administered with TNFR2-IL21R fusion protein in a CIA arthritis animal model
  • Enbrel A group of animals receiving Enbrel, a therapeutic agent for arthritis, in a CIA arthritis animal model.
  • Figure 14 shows the reduction of inflammation in CIA arthritis-induced mice of the TNFR2-IL21R fusion protein by immunohistochemical staining:
  • CIA collagen induced arthritis
  • IL21R / TNFR2-Fc group administered with TNFR2-IL21R fusion protein in a CIA arthritis animal model
  • Enbrel A group of animals receiving Enbrel, a therapeutic agent for arthritis, in a CIA arthritis animal model.
  • 6th 6 administrations of TNFR2-IL21R fusion protein or Enbrel;
  • CIA collagen induced arthritis
  • IL21R / TNFR2-Fc group administered with TNFR2-IL21R fusion protein in a CIA arthritis animal model
  • Enbrel A group of animals receiving Enbrel, a therapeutic agent for arthritis, in a CIA arthritis animal model.
  • Figure 16 shows the measurement of Th17 and Treg expression in the spleen of CIA arthritis induced mice by immunostaining:
  • CIA collagen induced arthritis
  • IL21R / TNFR2-Fc group administered with TNFR2-IL21R fusion protein in a CIA arthritis animal model
  • Enbrel A group of animals receiving Enbrel, a therapeutic agent for arthritis, in a CIA arthritis animal model.
  • the present invention provides a fusion protein in which a TNFR2 (Tumor necrosis factor receptor type 2) protein or a fragment comprising the extracellular region of TNFR2 and an IL21R (Interleukin-21 receptor) protein or a fragment comprising the extracellular region of IL21R are connected. do.
  • TNFR2 Tumor necrosis factor receptor type 2
  • IL21R Interleukin-21 receptor
  • the fragment comprising the extracellular region of TNFR2 is preferably a polypeptide comprising 23 to 179 of amino acid SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • the fragment comprising the extracellular region of IL21R is preferably, but not limited to, a polypeptide comprising 21 to 231 of amino acid SEQ ID NO: 2.
  • the fusion protein preferably has an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • the TNFR2-IL21R fusion protein is preferably composed of 200 to 250 amino acids, but is not limited thereto.
  • the TNFR2-IL21R fusion protein preferably includes a fragment derived from the constant domain of the heavy chain of the antibody, but is not limited thereto.
  • the Fc domain included in the TNFR2-IL21R fusion protein is preferably selected from the group consisting of IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, more preferably including all or part of the CH2 and CH3 constant domains. Preferably, but not limited to.
  • the TNFR2-IL21R fusion protein preferably includes all or part of the constant domain region of the heavy chain of the antibody at the carboxyl- and amino-terminus of the extracellular soluble domains of TNFR2 and IL21R, but is not limited thereto.
  • the TNFR2-IL21R fusion protein is characterized by including a form having a constant domain region of the heavy chain of two or more equivalents of the antibody, but is not limited thereto.
  • Such two Fc heavy chains are preferably connected by disulfide bonds or other covalent bonds, but are not limited thereto.
  • the TNFR2, IL21R portion of the TNFR2-IL21R fusion protein preferably also includes a form having a region of at least two equivalents of the extracellular water soluble domain of TNFR2, IL21R, but is not limited thereto.
  • the fusion protein of TNFR2-IL21R of the present invention is prepared by a method comprising the following steps:
  • step 8 performing PCR using the generated colonies of step 8);
  • step 11 purifying the TNFR2-IL21R fusion protein expressed in 293E cells of step 10) from the cell culture;
  • the preparation of the vector is preferably performed using a PCR from a DNA library, and the DNA library is preferably used in the liver, placenta, pancreas and liver tissue, but It is not limited to this.
  • an expression vector comprising a polynucleotide encoding a fusion protein of TNFR2-IL21R is provided.
  • the expression vector is preferably pYK602-HIS-Fc, but is not limited thereto.
  • transformant transformed into a host cell with an expression vector comprising a polynucleotide encoding a fusion protein of TNFR2-IL21R.
  • the transformant is preferably DH5 ⁇ of E. coil , but is not limited thereto.
  • PCR was performed to amplify the IL21R gene and the TNFR2 gene.
  • Each amplified PCR product was ligated to a pYK602-HIS-Fc expression vector to construct TNFR2-Fc and IL21R-Fc (see FIGS. 1 and 3).
  • the resulting protein and the purified protein were confirmed by Western blot (see FIGS. 2 and 4). .
  • IL21R and TNFR2 genes were amplified by PCR using a DNA library mixture (kidney, placenta, pancreas and liver) as a template. After preparing a primer for amplifying the fusion gene of IL21R and TNFR2 (see FIG. 5), the amplified product was used as a template to encode a TNFR2-IL21R fusion protein (TNF- ⁇ and IL-21 double antagonist). Was amplified using PCR. The amplified PCR product was ligated to the pYK602-HIS-Fc expression vector to construct a TNFR2-IL21R fusion protein expression vector (see FIGS. 6 and 7).
  • the present invention also provides a composition for the prevention and treatment of autoimmune diseases containing the TNFR2-IL21R fusion protein as an active ingredient.
  • the fragment comprising the extracellular region of TNFR2 is preferably a polypeptide comprising 23 to 179 of amino acid SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • the fragment comprising the extracellular region of IL21R is preferably, but not limited to, a polypeptide comprising 21 to 231 of amino acid SEQ ID NO: 2.
  • the fusion protein preferably has an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • the TNFR2-IL21R fusion protein is preferably composed of 200 to 250 amino acids, but is not limited thereto.
  • the TNFR2-IL21R fusion protein preferably includes a fragment derived from the constant domain of the heavy chain of the antibody, but is not limited thereto.
  • the Fc domain included in the TNFR2-IL21R fusion protein is preferably selected from the group consisting of IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, more preferably including all or part of the CH2 and CH3 constant domains. Preferably, but not limited to.
  • the TNFR2-IL21R fusion protein preferably includes all or part of the constant domain region of the heavy chain of the antibody at the carboxyl- and amino-terminus of the extracellular soluble domains of TNFR2 and IL21R, but is not limited thereto.
  • the TNFR2-IL21R fusion protein is characterized by including a form having a constant domain region of the heavy chain of two or more equivalents of the antibody, but is not limited thereto.
  • Such two Fc heavy chains are preferably connected by disulfide bonds or other covalent bonds, but are not limited thereto.
  • the TNFR2, IL21R portion of the TNFR2-IL21R fusion protein preferably also includes a form having a region of at least two equivalents of the extracellular water soluble domain of TNFR2, IL21R, but is not limited thereto.
  • the autoimmune diseases include autoimmune arthritis, lupus, myasthemia gravis, ankylosing spondylitis, thyroid dysfunction, hypothyroidism, ulcerative colitis, Crohn's disease, heart valve disease, multiple sclerosis, systemic scleroderma (Scleroderma), autologous It is preferably any one selected from the group consisting of immune hepatitis, and more preferably autoimmune arthritis, but is not limited thereto.
  • the Th17 cells treated with TNFR2-Fc, IL21R-Fc and TNFR2-IL21R fusion proteins constructed through ⁇ Example> resulted in the inflammatory cytokines IL-21, IL- Expression of 17 and RORc transcription factor after treatment with the TNFR2-IL21R fusion protein, when compared with TNFR2-Fc, IL21R-Fc, it was confirmed that the expression is significantly reduced (see Fig. 9).
  • inflammatory cytokines secreted from Th17 cells were significantly reduced when treated with TNFR2-IL21R fusion protein, compared with TNFR2-Fc and IL21R-Fc (see FIG. 9).
  • the protein secretion amount of the anti-inflammatory cytokine IL-10 was measured by ELISA method. As compared with TNFR2-Fc and IL21R-Fc, the secretion amount of was further increased when the TNFR2-IL21R fusion protein was treated (see FIG. 10). In addition, the treatment of TNFR2-Fc, IL21R-Fc, and TNFR2-IL21R fusion proteins inhibited the differentiation of osteoclast differentiation was confirmed through TRAP staining and increased expression of Catespin K (see FIG. 11). .
  • the mouse model TNFR2-IL21R according to the present invention in order to confirm the in vivo arthritis treatment effect of the TNFR2-IL21R fusion protein according to the present invention, by producing a CIA arthritis-induced mouse model, the mouse model TNFR2-IL21R according to the present invention As a result of administering the fusion protein, an arthritis therapeutic effect was observed (see FIG. 12), which specifically relieves joint infiltration, inflammation and cartilage destruction (see FIG. 13), as well as reducing the expression of inflammatory factors (FIG. 13). 14), the production of CII specific IgG2a administered to prepare the arthritis-inducing mice was reduced (see FIG. 15). The treatment or palliative effect of arthritis was similar to or better than that of Enbrel used as a therapeutic agent for arthritis.
  • TNFR2-IL21R fusion protein reduces the production of the inflammatory cytokine IL-17, and this effect is more pronounced than the TNFR2-F and IL21R-Fc single proteins, and the production of the anti-inflammatory cytokine IL-10 is also TNFR2.
  • TNFR2-IL21R fusion protein according to the present invention prevents and treats autoimmune arthritis as it not only shows an effect of increasing more than -F and IL21R-Fc, but also exhibits an alleviating or treating effect of autoimmune arthritis in a CIA arthritis-induced mouse model. It can be usefully used as an active ingredient of the composition for use.
  • the therapeutically effective amount of the TNFR2-IL21R fusion protein according to the present invention may vary depending on several factors, such as the method of administration, the site of interest, the condition of the patient, and the like. Therefore, when used in humans, the dosage should be determined in an appropriate amount in consideration of both safety and efficiency. It is also possible to estimate the amount used in humans from an effective amount determined through animal testing. These considerations should be considered when determining the effective amount, for example, Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed. (2001), Pergamon Press; And E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (1990), Mack Publishing Co.
  • compositions of the present invention may also include carriers, diluents, excipients or combinations of two or more thereof conventionally used in biological agents.
  • Pharmaceutically acceptable carriers are not particularly limited so long as they are suitable for in vivo delivery of the TNFR2-IL21R fusion protein, for example, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.
  • Compounds, saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and one or more of these components can be mixed and used as needed. Conventional additives can be added.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may be additionally added to formulate into main dosage forms, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • it may be preferably formulated according to each disease or component by a suitable method in the art or using a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990).
  • composition of the present invention may further contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar functions.
  • the composition of the present invention comprises 0.0001 to 10% by weight of the protein, preferably 0.001 to 1% by weight, based on the total weight of the composition.
  • composition according to the present invention can be administered parenterally (eg, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) or orally according to the desired method, and the dosage is based on the weight, age, sex and health of the patient. The range varies depending on the diet, the time of administration, the method of administration, the rate of excretion and the severity of the disease.
  • the daily dosage of the composition according to the present invention is 0.001 to 100 mg / kg, preferably 0.01 to 10 mg / kg, and more preferably administered once to several times a day.
  • the present invention also provides a method for treating autoimmune disease comprising administering a pharmaceutically effective amount of a TNFR2-IL21R fusion protein to an individual suffering from an autoimmune disease.
  • the present invention also provides a method for preventing autoimmune disease comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of a TNFR2-IL21R fusion protein.
  • the fragment comprising the extracellular region of TNFR2 is preferably a polypeptide comprising 23 to 179 of amino acid SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • the fragment comprising the extracellular region of IL21R is preferably, but not limited to, a polypeptide comprising 21 to 231 of amino acid SEQ ID NO: 2.
  • the fusion protein preferably has an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • the TNFR2-IL21R fusion protein is preferably composed of 200 to 250 amino acids, but is not limited thereto.
  • the TNFR2-IL21R fusion protein preferably includes a fragment derived from the constant domain of the heavy chain of the antibody, but is not limited thereto.
  • the Fc domain included in the TNFR2-IL21R fusion protein is preferably selected from the group consisting of IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, more preferably including all or part of the CH2 and CH3 constant domains. Preferably, but not limited to.
  • the TNFR2-IL21R fusion protein preferably includes all or part of the constant domain region of the heavy chain of the antibody at the carboxyl- and amino-terminus of the extracellular soluble domains of TNFR2 and IL21R, but is not limited thereto.
  • the TNFR2-IL21R fusion protein is characterized by including a form having a constant domain region of the heavy chain of two or more equivalents of the antibody, but is not limited thereto.
  • Such two Fc heavy chains are preferably connected by disulfide bonds or other covalent bonds, but are not limited thereto.
  • the TNFR2, IL21R portion of the TNFR2-IL21R fusion protein preferably also includes a form having a region of at least two equivalents of the extracellular water soluble domain of TNFR2, IL21R, but is not limited thereto.
  • the autoimmune diseases include autoimmune arthritis, lupus, myasthemia gravis, ankylosing spondylitis, thyroid dysfunction, hypothyroidism, ulcerative colitis, Crohn's disease, heart valve disease, multiple sclerosis, systemic scleroderma (Scleroderma), autologous It is preferably any one selected from the group consisting of immune hepatitis, and more preferably autoimmune arthritis, but is not limited thereto.
  • the TNFR2-IL21R fusion protein according to the present invention was found to reduce the production of inflammatory cytokines IL-17 and to significantly reduce the TNFR2-F and IL21R-Fc, and the anti-inflammatory cytokine IL-10. Since the production of TNFR2-Fc and IL21R-Fc increases more, and the effect of inhibiting the differentiation of osteoclasts is more effective than TNFR2-Fc and IL21R-Fc, it can be usefully used as a method for treating autoimmune diseases.
  • the therapeutically effective amount of the TNFR2-IL21R fusion protein according to the present invention may vary depending on several factors, such as the method of administration, the site of interest, the condition of the patient, and the like. Therefore, when used in humans, the dosage should be determined in an appropriate amount in consideration of both safety and efficiency. It is also possible to estimate the amount used in humans from an effective amount determined through animal testing. These considerations should be considered when determining the effective amount, for example, Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed. (2001), Pergamon Press; And E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (1990), Mack Publishing Co.
  • compositions of the present invention may also include carriers, diluents, excipients or combinations of two or more thereof conventionally used in biological agents.
  • Pharmaceutically acceptable carriers are not particularly limited so long as they are suitable for in vivo delivery of the TNFR2-IL21R fusion protein, for example, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.
  • Compounds, saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and one or more of these components can be mixed and used as needed. Conventional additives can be added.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may be additionally added to formulate into main dosage forms, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • it may be preferably formulated according to each disease or component by a suitable method in the art or using a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990).
  • composition of the present invention may further contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar functions.
  • the composition of the present invention comprises 0.0001 to 10% by weight of the protein, preferably 0.001 to 1% by weight, based on the total weight of the composition.
  • the composition may be parenterally administered (eg, applied intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, or topically) or orally, depending on the desired method, and the dosage may be weight, age, sex, health condition, diet, administration of the patient. The range varies depending on the time, the method of administration, the rate of excretion and the severity of the disease.
  • the daily dosage of the composition according to the present invention is 0.001 to 100 mg / kg, preferably 0.01 to 10 mg / kg, and more preferably administered once to several times a day.
  • the present invention provides a fusion protein according to the present invention for use as a medicament for preventing and treating autoimmune diseases.
  • the fragment comprising the extracellular region of TNFR2 is preferably a polypeptide comprising 23 to 179 of amino acid SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • the fragment comprising the extracellular region of IL21R is preferably, but not limited to, a polypeptide comprising 21 to 231 of amino acid SEQ ID NO: 2.
  • the fusion protein preferably has an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • the TNFR2-IL21R fusion protein is preferably composed of 200 to 250 amino acids, but is not limited thereto.
  • the TNFR2-IL21R fusion protein preferably includes a fragment derived from the constant domain of the heavy chain of the antibody, but is not limited thereto.
  • the Fc domain included in the TNFR2-IL21R fusion protein is preferably selected from the group consisting of IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, more preferably including all or part of the CH2 and CH3 constant domains. Preferably, but not limited to.
  • the TNFR2-IL21R fusion protein preferably includes all or part of the constant domain region of the heavy chain of the antibody at the carboxyl- and amino-terminus of the extracellular soluble domains of TNFR2 and IL21R, but is not limited thereto.
  • the TNFR2-IL21R fusion protein is characterized by including a form having a constant domain region of the heavy chain of two or more equivalents of the antibody, but is not limited thereto.
  • Such two Fc heavy chains are preferably connected by disulfide bonds or other covalent bonds, but are not limited thereto.
  • the TNFR2, IL21R portion of the TNFR2-IL21R fusion protein preferably also includes a form having a region of at least two equivalents of the extracellular water soluble domain of TNFR2, IL21R, but is not limited thereto.
  • the autoimmune diseases include autoimmune arthritis, lupus, myasthemia gravis, ankylosing spondylitis, thyroid dysfunction, hypothyroidism, ulcerative colitis, Crohn's disease, heart valve disease, multiple sclerosis, systemic scleroderma (Scleroderma), autologous It is preferably any one selected from the group consisting of immune hepatitis, and more preferably autoimmune arthritis, but is not limited thereto.
  • IL21R-Fc expression vector To prepare an IL21R-Fc expression vector, a mixed DNA library (purchased from the 21C Frontier Human GENE Bank (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)), Clone ID: hMU007690, plate No. IRAH-24-A10, vector : pOTB7. Genes were amplified to the following conditions, treated with SfiI restriction enzymes, and then subcloned into the pYK602-HIS-Fc vector.
  • PCR condition was that the total reaction solution was 50 ⁇ l, the template was added to 100 ng, 2.5 units of pfu polymerase (Gennote, Korea), 10 pmole / 50 ⁇ l of the forward and reverse primer, respectively, the remaining volume was distilled water After a total of 50 ⁇ l of the reaction solution was formed, 94 °C 2 minutes, 94 °C 30 seconds, 58 °C 30 seconds, 72 °C 1 cycle repeated for 30 cycles to amplify the gene, and then reacted for 72 °C 10 minutes PCR The product was obtained.
  • the amplified PCR products and vectors were digested with SfiI restriction enzyme and reacted at 37 ° C. for 4 hours, and then purified using a gel purification kit (QIAGEN, # 28706, USA).
  • 1 ⁇ l T4 DNA ligase (# SDL01-R40k, Solgent, Korea) and 2 ⁇ l 10 ⁇ ligase buffer were prepared at a ratio of 3 (150 ⁇ g): 1 (50 ⁇ g) to the amplified PCR product. After mixing, the total reaction solution was 20 ⁇ l, and ligation was performed at 16 ° C. for 16 hours.
  • the ligated plasmid was transformed into E. coli DH5 ⁇ , and then sprinkled on LB plates containing ampicillin, and then incubated in a 37 ° C. incubator for 16 hours. After colony generation, the colonies were pooled in LB medium containing 10 ⁇ l ampicillin, and then colony PCR method was used to make 4-5 ⁇ l of the PCR template, followed by PCR, and the IL21R gene was expressed as pYK602-HIS-Fc. It was confirmed that the expression vector was subcloned.
  • the cells After planting 293E cells with 500 ml of DMEM and 50 ml of FBS, the cells were planted to a 70-80% area in a 150 mm plate, and then 20 ⁇ g of IL21R-Fc and 40 ⁇ g of PEI were 1: 2. After mixing for 20 minutes at room temperature, it was dropped into cells and transfected. After 16-20 hours, the cells were exchanged with 20 ml of DMEM medium containing no serum, and the supernatants of the cells were obtained every two to three days. After the supernatant was obtained, after centrifugation at 5000 rpm for 10 minutes, only the supernatant was transferred to a new bottle and stored until purification at 4 ° C.
  • a total of 1 L of supernatant was purified on 20, 150 mm plates on days 3, 5, 7, and 9. The whole supernatant was filtered using a 0.22 ⁇ m top-filter (# PR02890 Millipore USA), followed by 500 ⁇ l protein A beads (# 17-1279-03, GE packed in a 5 ml column). healthcare, Sweden). After binding at 4 ° C. overnight at 0.9 ml / min using a Peri-start pump, the column was washed with at least 100 ml of PBS and 0.1 M glycine hydrochloric acid (Glycine-HCl) (# G7126, Sigma, USA). Elution into 6 fractions and neutralize with 1 M Tris (# T-1503-5KG. Sigma.
  • Glycine-HCl glycine hydrochloric acid
  • IL21R-Fc was then quantified, 2-3 fractions of IL21R-Fc expression were collected, concentrated using amicon ultra (# UFC805024, Millipore, USA), and then washed with PBS (# 70011, Gibco, USA). The buffer was changed about times.
  • a TNFR2-Fc expression vector a mixed DNA library of kidney, placenta, pancreas and liver (purchased from 21C Frontier Human GENE Bank, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) Clone ID: hMU013725, plate No.IRAU-86-H09, vector : a forward primer (SEQ ID NO: 6: 5'-CAGGGGGCCGTGGGGGCCTTGCCCGCCCAGGTGGCATT-3 ') and a reverse primer (SEQ ID NO: 7: 5'-) using a pDNR-LIB) as a template and a restriction enzyme Sfi I sequence for expressing the TNFR2 gene
  • the gene was amplified to the following conditions using TAGCGGCCGACGCGGCCAATTCAGCTGGGGGGCTGGGGC-3 '), treated with SfiI restriction enzymes, and then subcloned into the pYK602-HIS-Fc vector.
  • PCR condition was that the total reaction solution was 50 ⁇ l, the template was put to 100 ng, 2.5 units of pfu polymerase (Gennote, Korea), 10 pmole / 50 ⁇ l of the forward and reverse primer, respectively, and the remaining volume Fill 50 mL of the reaction solution with distilled water, and repeat the cycle 30 times at 94 ° C for 2 minutes, 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute to amplify the gene, and then react for 72 minutes for PCR. The product was obtained.
  • the amplified PCR products and vectors were digested with SfiI restriction enzyme and reacted at 37 ° C. for 4 hours, and then purified using a gel purification kit.
  • the ratio of the amplified PCR product and the vector was 3 (150 ⁇ g): 1 (50 ⁇ g), and 1 ⁇ l T4 DNA ligase and 2 ⁇ l 10 ⁇ ligase buffer were mixed.
  • the total reaction solution was 20 ⁇ l and the temperature was 16 ° C. Ligation was performed at 16 hours.
  • the ligated plasmid was transformed into E. coli DH5 ⁇ , sprinkled on LB plates containing ampicillin, and then incubated in a 37 ° C. incubator for 16 hours. After colony generation, colonies were pooled in LB medium containing 10 ⁇ l ampicillin, and then, 4-5 ⁇ l of the PCR template was used as a colony PCR method, and PCR was performed.
  • the TNFR2 gene was expressed as pYK602-HIS-Fc. It was confirmed that subcloning into the expression vector.
  • the cells were planted to a 70-80% area in a 150 mm plate, and then 20 ⁇ g of TNFR2-Fc and 40 ⁇ g of PEI were added in a 1: 2 ratio. After mixing for 20 minutes at room temperature, it was dropped into cells and transfected. After 16-20 hours, the cells were exchanged with 20 ml of DMEM medium containing no serum, and the supernatants of the cells were obtained every two to three days. After the supernatant was obtained, after centrifugation at 5000 rpm for 10 minutes, only the supernatant was transferred to a new bottle and stored until purification at 4 ° C.
  • a total of 1 L of supernatant was purified on 20, 150 mm plates on days 3, 5, 7, and 9. The whole supernatant was filtered using a 0.22 ⁇ m top-filter and then bound to 500 ⁇ l of Protein A beads packed in a 5 ml column. After binding at 4 ° C. overnight at 0.9 mL / min using a Peri-start pump, the column was washed with 100 mL or more of PBS, eluted into 6 fractions using 0.1 M Glycine-HCl, and eluted with 1 M Tris ( neutralized to pH 9.0). Then, the purified protein was quantified, 2-3 fractions of TNFR2-Fc expression were collected and concentrated using amicon ultra, and the buffer was exchanged about 10 times with PBS (# 70011, Gibco, USA).
  • a forward primer and a reverse primer containing a restriction enzyme SfiI sequence for expression with TNFR2 (SEQ ID NO: 8 : Amplify the TNFR2 gene using 5'-tagcggccgacgcggccaacgtgcagactgcatccatgc-3 '), amplify the forward and reverse primers under the following conditions in order to amplify the IL21R gene, and then the two PCR products in a ratio of 1: 1 in a total of 100 ng was used as a template to PCR the TNFR2-IL21R fusion protein into the pYK602-HIS-Fc vector by using three primers.
  • the PCR conditions used were 50 ⁇ l of the total reaction solution, 100 ng of the template, 2.5 units of pfu polymerase (Genotech, Korea), 10 pmole / 50 ⁇ l of the forward and reverse primers respectively, and the remaining volume. 50 ⁇ l of the reaction solution was filled with distilled water, followed by 94 cycles of 2 minutes, followed by 30 cycles of 94 ° C 30 seconds, 55 ° C 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute to amplify the gene, followed by 72 ° C for 10 minutes. To obtain a PCR product.
  • Each amplified PCR product was digested with SfiI restriction enzyme and reacted at 37 ° C. for 4 hours, and then purified using a gel purification kit.
  • the ratio of the amplified PCR product and the vector was 3 (150 ⁇ g): 1 (50 ⁇ g), and 1 ⁇ l T4 DNA ligase and 2 ⁇ l 10 ⁇ ligase buffer were mixed.
  • the total reaction solution was 20 ⁇ l and the temperature was 16 ° C. Ligation was performed at 16 hours.
  • the ligated plasmid was transformed into E. coli DH5 ⁇ , sprinkled on LB plates containing ampicillin, and then incubated in a 37 ° C. incubator for 16 hours. After colony generation, colonies were pooled in LB medium containing 10 ⁇ l ampicillin, and then, using colony PCR method, 4 to 5 ⁇ l of them were used as PCR templates, and PCR was performed to encode TNFR2-IL21R fusion proteins. Was confirmed to be subcloned into the pYK602-HIS-Fc expression vector.
  • a total of 600 ml of the supernatant was purified on 10, 150 mm plates on days 3, 5, and 7. The entire supernatant was filtered using a 0.22 ⁇ m top-filter, followed by beading 500 ⁇ l of Protein A packed in a 5 ml column. After binding at 4 ° C. overnight at 0.9 ml / min using a Peri-start pump, the column was washed with 100 ml or more of PBS, eluted in 6 fractions with 0.1 M glycine hydrochloric acid, eluted with 1 M Tris (pH). 9.0). Then, the purified protein was quantified, and 2-3 fractions containing the expression of the TNFR2-IL21R fusion protein were collected and concentrated using amicon ultra, and the buffer was exchanged about 10 times with PBS (# 70011, Gibco, USA).
  • Binding affinity test to determine whether the TNFR2-Fc, IL21R-Fc and TNFR2-IL21R fusion proteins prepared in ⁇ Example> and their ligands, TNF- ⁇ , can be antagonized. was performed.
  • TNF- ⁇ (# C001-1 MG, enzynomics, Korea) per well using an ELISA plate (# 439454, Nunc, Denmark). Coating was carried out overnight at 4 ° C. A solution containing 4% Skim milk (Skim Milk) (# 232100, Difco, France) in 200 ⁇ l of PBS was added to the coated ELISA plate, and blocking buffer at room temperature for approximately 1 hour to suppress nonspecific reaction [ 4% skim milk in PBS].
  • each purified fusion protein was prepared at 100 nM in 100 ⁇ l of a solution containing 1% skim milk in PBS, followed by serial dilution at a dilution of 1/4. ) And then reacted at room temperature for about 2 hours. Then wash the plate 5 times with 200 ⁇ l PBS and 2 ⁇ l of secondary antibody anti-Human Fc-HRP (# 31413, Thermo, USA) in 4 ml containing 1% skim milk. After mixing in PBS, put 200 ⁇ l per well in an ELISA plate and reacted for 1 hour at room temperature.
  • the secondary antibody on the ELISA plate was removed, washed five times with 200 ⁇ l of PBS, and 10 ⁇ l of hydrogen peroxide solution (H 2 O 2, # H1009-100ML, Sigma, USA) and 10 mL of PC buffer [5.1 g Citric acid monohydrate, 7.3 g sodium phosphate (pH 5.0) / l, and one OPD tablet (# P8787-100TAB Sigma USA) were mixed to a total volume of 100 ⁇ l. Put it. After the reaction solution was added, the reaction was allowed to proceed for 10 minutes in a dark state at room temperature, and the color development was confirmed. The reaction was terminated by adding 50 ⁇ l of a stop buffer to stop the reaction, and the wavelength of 490 nm in the ELISA reader. Kd value was measured at.
  • the TNF- ⁇ ligand showed a high binding force by showing a low Kd value with the TNFR2-IL21R fusion protein (Fig. 8).
  • Ficoll Anagenital Stavage Protocol
  • Peripheral blood mononuclear cells described in Experimental Example ⁇ 2-1> were 48-well plates (well plates) with 5 ⁇ 10 5 cells / 500 ⁇ l cells in cell culture medium RPMI 1640 containing 10% fetal bovine serum (Nalge Nunc International , IL, USA) and treated with TNF2- ⁇ and TNFR2-Fc, IL21R-Fc and TNFR2-IL21R fusion proteins for TNF- ⁇ and IL-21 at 10 ⁇ g / ml and cultured for 1 hour.
  • the cells were pipetted and the cells adhered to the bottom were transferred to 48-well plates coated with anti-CD3 (BD Pharmingen, San Diego, Calif., USA) at 0.3 ⁇ g / ml, and peripheral blood mononuclear cells were transferred to Th17.
  • anti-CD3 BD Pharmingen, San Diego, Calif., USA
  • 20 ng / ml of IL-6 R & D Systems, Minneapolis, MN, USA
  • 10 ng / ml of IL-23 R & D Systems
  • 5 ng / ml of IL-1 ⁇ R & D Systems
  • RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction
  • the reaction compound for RT-PCR was made to total 25 ⁇ l per sample, and the composition of the solution was 2.5 ⁇ l of 10 ⁇ reaction buffer, 2.5 ⁇ l of 0.5 mM dNTP, 0.3 ⁇ l of Taq (Takara, shinga, Japan) and target forward and 2 ⁇ l of reverse primer and 1 ⁇ l of cDNA and 14.7 ⁇ l of distilled water, respectively.
  • Dual-bay thermal cycler system MJ Research
  • Distilled water was used instead of the cDNA extracted with the negative control group was confirmed that there is no PCR contamination by the PCR product is not observed.
  • IL-21 was repeated 30 times at 94 °C 30 seconds, 56 °C 30 seconds, 72 °C 30 seconds after undergoing a 94 °C 3 minutes denaturation, and then the reaction was carried out for 7 minutes at 72 °C for elongation.
  • IL-17 amplification conditions were 94 °C 3 minutes denaturation process, 94 °C 1 minute, 56 °C 1 minute, 72 °C 1 minute the reaction was repeated 30 times and then the reaction was carried out for 7 minutes at 72 °C.
  • RORc and ⁇ -actin were denatured at 94 ° C. for 3 minutes, the reactions were repeated 30 times and 26 times for 94 ° C 30 seconds, 60 ° C 30 seconds, and 72 ° C 30 seconds, respectively.
  • the amplification product obtained by the polymerase reaction was subjected to electrophoresis on a 1.5% agarose gel containing ethidium bromide, followed by gel-Doc 2000 (Bio-rad Laboratories, Hercules, CA).
  • the amplified product was quantified by concentration measurement using Quantity-One (Bio-rad) program. This value was converted into the ratio with ⁇ -actin to compare the mRNA expression level between each cell group.
  • the primer sequences used are as follows:
  • the amplification products were converted according to the ⁇ -actin expression ratio and compared with each mRNA expression level.
  • mRNA expression of RORc a specific transcription factor reported to be expressed during differentiation of inflammatory cytokines IL-17 and IL-21 Th17 cells, was high in the differentiation conditions of Th17 cells.
  • TNFR2-IL21R fusion protein was treated to Th17 cells under the same conditions, it was observed that the expression of IL-17, IL-21 and RORc genes was significantly suppressed (FIG. 9).
  • the amount of was measured using the ELISA method.
  • IL-10 (R & D Systems) antibody 100 ⁇ l of IL-10 (R & D Systems) antibody was added to 1 ⁇ l of 2 ⁇ g / ml in a 96 well plate for Sandwich ELISA, followed by reaction at room temperature for 2 hours, followed by 1% bovine serum albumin (BSA) 0.05% PBST [0.05% 200 ⁇ l of blocking buffer mixed with Tween20 in PBS] was added and allowed to react at room temperature for 2 hours.
  • BSA bovine serum albumin
  • PBST 0.05% 200 ⁇ l of blocking buffer mixed with Tween20 in PBS] was added and allowed to react at room temperature for 2 hours.
  • Human recombinant IL-10 (R & D Systems) to be used as a standard was prepared by serial dilution at a concentration of 5,000 to 78.125 pg / ml each.
  • PNPP phosphate disodium salt hexahydrate
  • Th17 cells increase the product of the inflammatory cytokine IL-17 protein under differentiation stimulation conditions, but TNFR2- when 10 ⁇ g / ml of the TNFR2-IL21R fusion protein of the present invention is treated It was confirmed that the production of IL-17 was reduced more effectively than the group treated with Fc and IL21R-Fc (FIG. 9).
  • TNFR2-IL21R fusion protein may induce a synergistic effect on Treg
  • an immunosuppressive cell that inhibits Th17 cell responses and balances autoantigens and protects against autoimmunity.
  • TNFR2-IL21R fusion protein may have a synergistic effect on the action of Treg, an immunosuppressive cell that inhibits Th17 cell responses and balances autoantigens and protects against autoimmunity.
  • the anti-inflammatory cytokine IL-10 protein produced at was measured using the ELISA method.
  • IL-10 (R & D Systems) antibody was added to 2 ⁇ g / ml in 1 well and allowed to react at room temperature for 2 hours, followed by blocking of 1% bovine serum albumin (BSA) in 0.05% PBST. 200 ⁇ l of the buffer was added and reacted at room temperature for 2 hours.
  • BSA bovine serum albumin
  • Human recombinant IL-10 (R & D Systems) to be used as a standard sample was prepared by sequentially diluting at a concentration of 5,000 ⁇ 78.125 pg / ml each.
  • Blood was collected using a heparinized syringe from a healthy person and diluted 1: 1 with PBS.
  • Peripheral blood mononuclear cells in the buffer coat layer were centrifuged at 2000 rpm and 20 ° C for 30 minutes after allowing the ficoll to be diluted with blood at a ratio of 1: 4. cells, PBMC) were isolated.
  • the isolated cells were washed with PBS, mixed with ⁇ MEM (Invitrogen, Burlingame, Calif., USA) containing 10% fetal bovine serum, aliquoted at 5 ⁇ 10 5 cells / 500 ⁇ L in a 24-well plate and 37 ° C., 5% CO Incubated for 2 hours in an incubator in two environments.
  • ⁇ MEM Invitrogen, Burlingame, Calif., USA
  • M-CSF human macrophage / monocyte colony-forming factor
  • the medium was exchanged with fresh 10% ⁇ MEM culture after PBS wash and 25 ng / ml rhM-CSF and receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANKL) (Peprotech, London , UK) were stimulated at 30 ng / ml and incubated with 10 ⁇ g / ml of TNFR2-Fc, IL21R-Fc and TNFR2-IL21R fusion proteins, respectively. The cultures were changed every 3 days and treated according to the above stimulation conditions. The differentiation state was observed to determine the number of stimuli.
  • RNKL nuclear factor kappa B ligand
  • the differentiated cells were treated with TNFR2-Fc, IL21R-Fc and TNFR2-IL21R fusion proteins for TNF- ⁇ and IL-21, and then osteoclast differentiation was induced by the above method.
  • Differentiated osteoclasts were fixed by adding 10% formalin for 10 minutes, and the cells were washed three times with PBS and then stained with TRAP (Tartrate-resistant acid phosphatase) staining kit (Sigma, Louis, MO, USA). Differentiated osteoclasts were examined. To 45 ml of sterilized distilled water at 37 ° C. pre-warmed, 500 ⁇ l of Fast Garmet GBC Basr solution and 500 ⁇ l of sodium nitrite solution are mixed well.
  • RNA was obtained from cells treated with TNFR2-Fc, IL21R-Fc, and TNFR2-IL21R fusion proteins in the differentiated cells, and cDNA was synthesized using the RT-PCR method described in Experimental Example ⁇ 2-3>. Expression of Catepsin K was measured .
  • TNFR2-IL21R fusion protein was administered to a collagen-induced arthritis CIA (collagen induced arthritis) mouse model to confirm the therapeutic effect.
  • collagen-induced arthritis CIA collagen induced arthritis
  • CII type II collagen
  • CFA complete Freund's adjuvant
  • the arthritis evaluation was based on the mean arthritic index by Rosolinec et al., And the average score divided by 4 was added according to the following scale, and the average obtained by summing the values obtained by three observers in each mouse was used. do. The number of outbreaks was scored with 25% of one foot and the number of swollen feet:
  • TNFR2-IL21R fusion protein according to the present invention was confirmed to exhibit an excellent arthritis therapeutic effect, this effect was more excellent than the positive control group administered Enbrel used as an arthritis treatment agent (FIG. 12).
  • mice to which TNFR2-IL21R fusion protein and Enbrel were administered to the CIA arthritis-induced mice used in Experimental Example 5 were collected and confirmed the degree of joint infiltration, inflammation and cartilage destruction by immunohistochemical staining. It was.
  • mice to which the TNFR2-IL21R fusion protein and Enbrel were administered to the CIA arthritis-induced mice used in the ⁇ Experimental Example 5> were collected and observed for expression of inflammatory factors using immunohistochemical staining.
  • the inflammatory cytokines IL-17, TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-6 in the group administered the TNFR2-IL21R fusion protein according to the present invention compared to CIA arthritis-induced mice It was observed that expression was decreased, and the expression of RANK, which can observe VEGF and osteoclast differentiation, which are major factors in neovascularization, was hardly observed.
  • the expression patterns of inflammatory cytokines, VEGF, and RANK observed in the group to which the TNFR2-IL21R fusion protein was administered were similar to those to the group to which Enbrel was administered. Through this, the TNFR2-IL21R fusion protein according to the present invention is useful for the treatment of arthritis. It could be confirmed that (Fig. 14).
  • CIA arthritis-induced mice used in Experimental Example 5 were immunized with a single administration of type II collagen (CII). Then, the TNFR2-IL21R fusion protein according to the present invention was injected three times a week for three weeks, a total of nine times. According to the injection process, the change in the content of CII in the blood was measured.
  • CII type II collagen
  • CII Type II Collagen
  • CFA complete Freund's adjuvant
  • CII antibodies were diluted 1: 1,000 and coated on 96 well plates and allowed to react for 2 hours.
  • IgG blocking buffer 200 ⁇ l was added per well, and the reaction was performed at room temperature for 1 hour. Thereafter, the serum of the experimental group and the control group was diluted and 50 ⁇ l each was reacted at room temperature for 1 hour. After washing five times with an IgG washing buffer, anti-mouse IgG HRP was diluted 1: 75,000 and 50 ⁇ l per well was added and allowed to react at room temperature for 1 hour. After the reaction, the cells were washed 5 times with IgG washing buffer, and then reacted with a TMB substrate solution. Then, the color change was stopped using 1N H 2 SO 4 . Measured.
  • the spleen tissue of the mouse used in Experimental Example 5 was collected and Th17 (CD4 + IL- 17+) cells and Treg (CD4 + CD25 + Foxp3 +) cells were observed by confocal staining.
  • ⁇ Experiment 5> The spleen of the CIA arthritis-induced mouse was taken and embedded in an OCT compound, and then rapidly cooled tissue using liquid nitrogen was attached to the slide with a thickness of 7 ⁇ m using a frozen slicer. Sections attached to the slides were fixed with acetone and blocked nonspecific reactions for 30 minutes with 10% normal goat serum. Staining of the Treg markers CD4, CD25, Foxp3 was carried out using PE-labeled anti-CD4 antibody, Allophycocyanin-labeled anti-CD25 antibody (Biolegend), FITC-labeled anti-Foxp3 Ab antibody, respectively.
  • the Th17 markers CD4 and IL-17 were used as biotinylated anti-CD4 antibodies (BD Biosciences) and PE-labeled anti-IL-17 antibodies. After diluting the antibodies at a ratio of 1: 100 in PBS (pH 7.5), the tissues attached to the slides were reacted overnight at 4 ° C, and the next day, streptavidin was added to the tissues using the biotinylated anti-CD4 antibody. (streptavidin) cy-3 was reacted at room temperature for 2 hours. After washing three times with PBS, the stained tissue was observed using confocal microscopy (LSM 510 Meta. Zeiss, Gottingen, Germany).
  • compositions of the present invention are given below.
  • tablets were prepared by tableting according to a conventional method for producing tablets.
  • the capsule was prepared by filling in gelatin capsules according to the conventional method for producing a capsule.
  • the TNFR2-IL21R fusion protein of the present invention inhibits the secretion of the proinflammatory cytokine IL-17 of Th17 cells, a major disease of autoimmune arthritis, which is one of autoimmune diseases, and expression of FoxP3 expressed in Treg cells. Increase the secretion of anti-inflammatory cytokine IL-10, inhibit osteoclast differentiation and cathespin K expression, and this effect is not only superior to TNFR2-Fc and IL21R-Fc but more effective than TNFR2-IL21R fusion protein.
  • the TNFR2-IL21R fusion protein according to the present invention when administered to a CIA (collagen induced arthritis) arthritis animal model, joint infiltration, inflammation, and cartilage destruction are alleviated, and the expression of Treg cells, which are immunosuppressive cells, is increased. Since it shows a therapeutic effect of immune arthritis, the TNFR2-IL21R fusion protein according to the present invention is an active ingredient of a composition having a prophylactic and therapeutic effect of an autoimmune disease. It can be used for.
  • CIA collagen induced arthritis

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Abstract

본 발명은 TNF-알파(alpha, α)와 IL-21에 대한 이중 길항제에의 역할을 하는 TNFR2-IL21R 융합 단백질에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 자가 면역 질환의 하나인 자가 면역 관절염의 주요 병인으로 알려진 TNF-α와 IL-21에 대한 이중 길항제(TNFR2-IL21R 융합 단백질)를 포함하는 조성물이 염증성 사이토카인의 분비를 감소시키며, 항염증성 사이토카인의 분비를 증가하며, 파골 세포의 분화를 억제하는 기능이 TNFR2-Fc와 IL21R-Fc 단일 단백질보다 TNFR2-IL21R 융합 단백질의 효과가 뛰어날 뿐만 아니라, CIA 관절염 유발 마우스에서 관절염의 치료 효과뿐만 아니라, 면역 억제 세포인 Treg 세포의 발현을 증가시켜 자가 면역 관절염의 치료 효과 나타내므로, 본 발명에 따른 TNFR2-IL21R 융합 단백질은 자가 면역 질환의 예방 및 치료 효과를 갖는 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

자가 면역 질환 예방 및 치료용 ＴＮＦ－α와 ＩＬ－２１ 이중 길항제
본 발명은 TNF-α와 IL-21에 대한 이중 길항제를 함유하는 자가 면역 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
면역체계는 해로운 외부물질인 항원(antigen)으로부터 신체를 보호하는 역할을 한다. 이러한 항원의 종류로는 박테리아, 바이러스, 독소, 암세포와 다른 사람 혹은 동물로의 혈액과 조직이 이에 해당된다. 면역체계는 이러한 해로운 물질들을 파괴하기 위하여 항체를 생산한다. 그러나 자가 면역에 이상이 생긴 경우, 면역체계는 자신의 건강한 신체의 장기와 해로운 항원을 구분하지 못하여, 정상적인 조직을 파괴하게 되며, 이러한 반응을 자가 면역 질환(autoimmune disease)라고 불린다. 이러한 반응은 알레르기하게 과민반응(hypersensitivity reaction)을 보이나, 알레르기의 경우 신체에 해가 되지 않는 외부 물질에 대해서 반응을 하지만, 자가 면역에 이상이 생긴 경우에는 신체의 정상적인 조직을 대상으로 반응이 일어나게 된다. 면역체계가 신체의 장기와 항원을 구분하지 못하게 된 원인은 확실치 않으나, 박테리아와 같은 미생물 또는 약물이 자가 면역 질환에 걸리기 쉬운 유전자를 가지고 태어난 사람들에게 병을 유발하는 것이라는 가설이 있다.
자가 면역 질환의 종류에는 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 악성 빈혈, 애디슨 병(Addison's disease), 제1형 당뇨, 자가 면역 관절염(Rheumatoid arthritis), 전신 홍반성 루프스(Systemic lupus erythematosus), 피부근염, 쇼그랜 증후군(Sjogren syndrome), 홍반성 루프스(Lupus erythematosus), 다발성 경화증(Multiple sclerosis), 중증 근무력증(Myasthenia gravis), 반응성 관절염(Reactive arthritis), 그레이브즈 병(Grave's disease) 및 셀리악 병(Celiac disease - sprue) 등이 있다.
자가 면역 반응의 치료는 자가 면역 반응을 조절하고, 신체의 손상된 면역기능을 회복시키는 것을 목적으로 이루어지며, 이는 다양한 자가 면역 질환의 종류에 따라 치료의 방법에 차이가 있다. 예를 들어, 혈액에 문제가 생긴 경우에는 수혈을 해야하며, 뼈, 관절 혹은 근육에 문제가 생긴 경우에는 운동 혹은 다른 기능적인 치료를 받아야 한다. 또한 면역 체계의 반응을 조절하기 위해서 약물이 처방된다. 면역억제약(immunosuppressive medicine)이라고 불리며, 사용되는 면역억제약의 종류에는 코르티코스테로이드(corticosteroids)약물인 프레드니손(prednisone)과 비스테로이드성(nonsteroid) 약물인 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 아자티오프린(azathioprine), 및 타크로리무스(tacrolimus) 등이 있다.
자가 면역 질환의 한 종류인 자가 면역 관절염(rheumatoid arthritis, RA)은 전 세계 인구의 약 1%에 해당하는 2,100만 명이 걸려있는 높은 유병율에도 불구하고 아직까지 발병원인이 알려지지 않은 자가 면역성 질환이다. 자가 면역 관절염은 그 병적 증상이 주로 가동관절(diarthrodial joint)에 대칭적으로 나타나는 전신성 만성염증적 소견을 보이며, 심한 경우 관절의 부전에까지 이르는 심각한 질환이다. 또한 자가 면역의 이상으로 관절의 염증 및 고통뿐만, 관절과 그 주위의 조직, 더불어 여러 장기에까지 침투하여 골다공증, 폐, 피부, 눈으로까지 침범되는 전신장기침범과 고통을 동반하여 환자에게 엄청난 삶의 질 저하를 가져오고 정상인과 같은 생활을 불가능하게 한다.
자가 면역 관절염의 치료는 과거에는 생활습관의 개선이나, 수술, 치료제의 복용으로 발병의 속도를 늦추거나, 고통을 줄이며, 감염의 억제 및 치료에 중점을 두며, 관절의 기능이 향상되는 것에 관해서는 기대하지 않았으나, 근래에 들어서는 관절의 기능적인 회복과 심지어 완치를 목표로 치료하고 있으며, 이는 근 10년 동안 자가 면역 관절염의 치료에 있어서 획기적인 치료법인 항 TNF 길항제들의 개발로 가능하게 되었다.
종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF)는 다면발현(pleiotropic) 사이토카인(cytokine)으로서, 염증성 반응뿐만 아니라 면역체계의 중요한 역할을 담당하며, 자가 면역 관절염의 관절 및 크론병(Crohn's disease) 환자의 결장(colon)에서 발견되며, 또한 골파괴(osteoclast) 과정에서 중요한 역할을 한다고 보고되었다. 따라서, 치료제들은 병인으로 작용하는 TNF 의 작용을 억제하기 위하여, TNF 슈퍼패밀리에 속하는 리간드와 결합하여 신호전달을 방해하거나 혹은 TNF 리간드와 수용체간의 결합을 방해하는 역할을 수행하도록 제작되었다. TNF 신호 전달을 억제 하기 위해 TNF 리간드에 대한 단일 항체를 사용하는 방법과 합성 단백질(recombinant protein)을 사용하는 방법으로 개발이 이루어졌다. 레미케이드 (Remicade)사의 인플릭시맙(infliximab), 또는 휴미라(Humira)의 아달리무맙(adalimumab)과 같이 단일 항체의 방식으로 치료를 하는 방법과 CTLA-4 Ig 와 엔브렐(Enbrel)의 엔트라셉트(entracept)와 같은 합성 단백질(recombinant protein)을 사용하기도 한다. 인플릭시맙, 엔트라셉트, 아달리무맙은 최초로 자가 면역 관절염 치료제로 인증받은 생물학적 치료제로서 근 10년간 임상에서 높은 효능을 보이며 치료제로서 활용되어왔다. TNF 이외의 다른 사이토카인을 타겟으로도 치료제의 개발로 이어졌으며, 인터루킨(interleukin)을 억제시키는 DMARD(disease-modyfying anti-rheumatic drugs)로서 IL-6 혹은 IL-1을 타겟으로 개발 중에 있으나, TNF 치료제보다 뛰어난 효과가 나타나지 않고 있는 실정이다.
이러한 항 TNF 치료제들은 높은 효능에도 불구하고, 극복되어야 할 많은 문제들이 있다. 치료의 부작용으로는 항 TNF 치료제를 투여받음으로써, TNF의 기작이 정지되며 이에 따라, 면역체계에서 기능 이상으로 진균 혹은 세균의 감염의 위험이 높아지며, 특히 잠복중인 폐결핵의 재발의 위험을 높인다. 탈수초 질환(demyelinating disorders)으로 다발성 경화증, 혹은 혈액암(hematologic malignancies)으로 이어질 위험이 알려져 있으며, 류마티스 학회에 따르면, 항 TNF 치료제들을 투여받은 자가 면역 관절염 환자들의 경우, 기존의 치료제들을 받은 경우에 비해서 피부암이 발병될 가능성이 높다는 보고가 있다.
또한, 자가 면역 관절염 치료제들의 효과는 모든 환자들에게 나타나는 것은 아니다. 치료를 받은 환자의 3분의 2가 치료의 효과가 있으며, 3분의 1의 경우는 효과가 나타나지 않고 있다. 이는 환자의 병력에 따라서, 혹은 유전적인 요인에 따라서 치료의 한계가 있음을 확인해 주고 있다. 더욱이 병으로 인한 고통뿐만 아니라, 치료제를 투여 받았을 때 유발될 수 있는 부작용과, 안전성에 대한 문제는 해결되어야만 하는 문제이다. 자가 면역 관절염을 갖고 있는 임산부의 경우 항 TNF 치료제를 투여 받을 경우, 태아의 안전성에 대한 문제가 거론되어 왔다. 더불어 환자에 따라서 치료제의 효능과 부작용을 예측할 수 있는 진단학적인 문제가 과제로 남아있다.
인터루킨(Interleukin, IL)은 사이토카인의 한 종류로서, 적혈구 세포 사이의 화학신호의 역할을 수행한다. IL-2가 FDA에 의해서 1992년 말기간암의 치료에 승인되었을 때, 암을 치료하는데 사용된 최초의 단일 면역치료제 였다. 그 후로, IL-2의 경우 전이된 흑생종(metastatic melanoma)에도 사용되었다. IL-2 하나로 암을 치료하는데에 사용되기도 하였으며, 백신과 함께 치료되기도 하였다. Il-2는 면역체계를 도와서 세포가 빠리 자라고 분열하게 만든다. 그러나 IL-2을 이용한 치료는 감기와 비슷한 오한, 열, 피로 및 착란증상(confusion)과 같은 부작용을 나타내었다. IL-2 패밀리(family)에 속하는 IL-15과 IL-21 역시 암 치료제로서 단일제 혹은 보조제로서 연구되고 있다.
IL-21은 알파-헬릭스(α-helix) 구조를 갖는 사이토카인의 한 종류로서, IL-21의 수용체와 감마쇄(γ-chain)를 이용한 신호전달과정을 통해서 염증성 반응을 일으킨다. IL-21은 골수로부터의 NK세포 전구체의 성숙을 유도하는 것으로 보고되었으며(Parrish-Novak J., et al., Nature, 408: 57-63, 2000), 특히 NK세포의 사이토카인 생성능과 세포사멸능과 같은 효과 기능(effector functions)을 증가시키는 것으로 보고되었으며(Strengell M, et al., J Immunol., 170: 5464-5469, 2003;Brady J, et al., J Immunol., 172: 2048-2058, 2004), CD8+ T 세포의 효과 기능도 증가시킴으로써 내재, 적응면역계의 항암반응을 촉진시키는 것으로 보고되었다(Takaki R., et al., J Immunol., 175: 2167-2173, 2005; Moroz A., et al., J Immunol, 173: 900-909, 2004). 또한, 인간의 말초혈액에서 분리한 NK세포를 활성화시키며(Parrish-Novak J., et al., Nature, 408: 57-63, 2000), 제대혈에서 분리한 조혈줄기세포로부터 성숙한 NK세포를 유도하는데 중요한 역할을 하는 것이 보고되었다(Sonia A. P, et al., Int. immunol., 18: 49-58, 2006).
이에 본 발명자들은 기존 항 TNF 치료제로 사용되고 있는 단일 길항제가 가지고 있는 안전성과 효능성의 단점을 극복할 수 있는 새로운 자가 면역질환의 치료제를 개발하고자, TNF-알파(alpha, α)와 IL-21에 대한 길항작용을 하는 TNFR2-IL21R 융합 단백질 제작하여, IL-21, IL-17과 같은 염증성 사이토카인 및 RORc의 발현 감소, 염증성 사이토카인 IL-17의 분비가 감소되었으며, FoxP3의 발현과 항염증성 사이토카인 IL-10 단백질 분비량이 증가되는 것을 확인하였으며, TNFR2-IL21R 융합 단백질의 파골 세포 분화를 억제와 카텝신(cathespin) K의 발현 감소를 확인하였으며, 이러한 감소는 TNFR2-Fc, IL21R-Fc 을 처리하였을 때보다, TNFR2-IL21R 융합 단백질을 처리하였을 때 더욱 감소되며, 아울러 CIA 관절염 유발 마우스에서 본 발명에 따른 TNFR2-IL21R 융합 단백질의 관절염 치료 효과뿐만 아니라, 면역 억제세포인 Treg 세포의 발현을 증가시켜 자가면역 관절염의 치료 효과를 확인함으로써, 본 발명에 따른 TNFR2-IL21R 융합 단백질의 자가 면역 관절염의 치료제로서의 가능성을 확인하며, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 TNF-α(alpha, 알파)와 IL-21에 대해서 이중 길항제의 역할을 하는 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 자가 면역질환 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TNFR2(Tumor necrosis factor receptor type 2) 단백질 또는 상기 TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편과 IL21R(Interleukin-21 receptor) 단백질 또는 상기 IL21R의 세포외 영역을 포함하는 단편이 연결된 융합 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 숙주세포에 형질전환시킨 형질 전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 자가 면역 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 자가 면역 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가 면역 질환 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가 면역 질환 예방방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 자가면역 질환 예방 및 치료용 의약으로 사용하기 위한 본 발명에 따른 융합 단백질을 제공한다.
본 발명은 자가 면역 질환의 하나인 자가 면역 관절염의 병인으로 알려진 TNF-α와 IL-21에 대하여 길항작용을 하는 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 조성물로서, TNFR2-Fc와 IL21R-Fc보다 TNFR2-IL21R 융합 단백질이 염증성 사이토카인의 분비를 억제하며, 항염증성 사이토카인의 생성을 증가시키며, 파골 세포의 분화를 막는데에 현저히 뛰어난 효능을 보일 뿐만 아니라, CIA 관절염 유발 마우스 모델에서 관절의 침윤, 염증 및 연골 파괴를 완화시키는 효과를 나타내고, 면역 억제 세포인 Treg 세포의 발현을 증가시켜 자가 면역 관절염의 치료 효과 나타내므로, 본 발명에 따른 TNFR2-IL21R 융합 단백질은 자가 면역 질환의 예방 및 치료 효과를 갖는 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 발현벡터 pYK602-HIS-Fc에 IL21R 유전자가 클로닝된 IL21R-Fc의 구조를 나타내는 그림이다.
도 2는 발현벡터 pYK602-HIS-Fc에 클로닝된 IL21R-Fc가 발현된 것을 확인한 웨스턴 블랏과, 발현된 단백질을 protein A 비드를 이용하여 정제한 후, HIS 항체를 이용하여 웨스턴 블랏의 결과를 나타낸 그림이다.
도 3은 발현벡터 pYK602-HIS-Fc에 TNFR2 유전자가 클로닝된 TNF-α 단일 길항제의 구조를 나타내는 그림이다.
도 4는 발현벡터 pYK602-HIS-Fc에 클로닝된 TNFR2-Fc 단일 길항제가 발현된 것을 확인한 웨스턴 블랏과 발현된 단백질을 protein A 비드를 이용하여 정제한 후, HIS 항체를 이용하여 웨스턴 블랏의 결과를 나타낸 그림이다.
도 5는 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 발현시키는 발현 벡터를 제조하기 위한 PCR 프라이머의 구조를 나타낸 것이다.
도 6은 발현벡터 pYK602-HIS-Fc에 IL21R 유전자와 TNFR2 유전자가 같이 클로닝된 TNFR2-IL21R 융합 단백질의 구조를 나타내는 그림이다.
도 7은 발현벡터 pYK602-HIS-Fc에 클로닝된 TNFR2-IL21R 융합 단백질의 발현을 확인한 웨스턴 블랏의 결과를 나타낸 그림이다.
도 8은 정제한 TNFR2-IL21R 융합 단백질과 그 리간드인 TNF-α와 IL-21와의 결합력(Binding affinity)을 측정한 그림이다.
도 9는 Th17 세포의 분화과정에 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 처리한 후, IL-21, IL-17, RORc, β-actin의 발현을 확인한 RT-PCR 결과와, Th17 세포의 분화과정에서 TNFR2-Fc, IL21R-Fc 및 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 처리하였을 때, 분비되는 염증성 사이토카인 IL-17의 양을 나타낸 그래프이다.
도 10 Th17 세포의 분화과정에서 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 처리한 후, FoxP3의 발현과, 분비되는 항염증성 사이토카인 IL-10의 양을 나타내는 그래프이다.
도 11은 TNFR2-IL21R 융합 단백질의 파골 세포 분화의 억제를 나타낸 그림이다.
도 12는 본 발명에 따른 TNFR2-IL21R 융합 단백질의 CIA 관절염 유발 마우스의 관절염 치료 효과를 확인한 그래프이다:
도 12의 A는 CIA 관절염 유발 마우스에 본 발명에 따른 TNFR2-IL21R 융합 단백질 또는 엔브렐(Enbrel)을 투여하였을 때 관찰되는 임상학적 수치(Clinical Score)를 나타낸 그래프이다;
↑: TNFR2-IL21R 융합 단백질 또는 엔브렐(Enbrel)을 투여한 시기;
Arthritis: CIA(collagen induced Arthritis) 관절염 동물 모델에 아무것도 투여하지 않은 음성 대조군;
IL21R/TNFR2-Fc: CIA 관절염 동물 모델에 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 투여한 군;
Enbrel: CIA 관절염 동물 모델에 관절염 치료제인 엔브렐(Enbrel)을 투여한 군;
도 12의 B는 CIA 관절염 유발 마우스에 본 발명에 따른 TNFR2-IL21R 융합 단백질 또는 엔브렐(Enbrel)을 투여하였을 때 관찰되는 발생수(Incidence)를 나타낸 그래프이다;
↑: TNFR2-IL21R 융합 단백질 또는 엔브렐(Enbrel)을 투여한 시기;
Arthritis: CIA(collagen induced Arthritis) 관절염 동물 모델에 아무것도 투여하지 않은 음성 대조군;
IL21R/TNFR2-Fc: CIA 관절염 동물 모델에 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 투여한 군; 및
Enbrel: CIA 관절염 동물 모델에 관절염 치료제인 엔브렐(Enbrel)을 투여한 군.
도 13은 면역조직화학염색법을 통한, TNFR2-IL21R 융합 단백질의 CIA 관절염 유발 마우스의 관절염 완화 효과 확인한 그림이다:
CIA: CIA(collagen induced Arthritis) 관절염 동물 모델에 아무것도 투여하지 않은 음성 대조군;
IL21R/TNFR2-Fc: CIA 관절염 동물 모델에 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 투여한 군; 및
Enbrel: CIA 관절염 동물 모델에 관절염 치료제인 엔브렐(Enbrel)을 투여한 군.
도 14는 면역조직화학염색법을 통한, TNFR2-IL21R 융합 단백질의 CIA 관절염 유발 마우스의 염증 감소를 확인한 그림이다:
CIA: CIA(collagen induced Arthritis) 관절염 동물 모델에 아무것도 투여하지 않은 음성 대조군;
IL21R/TNFR2-Fc: CIA 관절염 동물 모델에 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 투여한 군; 및
Enbrel: CIA 관절염 동물 모델에 관절염 치료제인 엔브렐(Enbrel)을 투여한 군.
도 15는 CIA 관절염 유발 마우스의 CII 특이적 IgG2a 생성량을 측정한 그래프이다:
0: TNFR2-IL21R 융합 단백질 또는 엔브렐(Enbrel)을 투여하기 전;
1st: TNFR2-IL21R 융합 단백질 또는 엔브렐(Enbrel)을 투여 1회;
6th: TNFR2-IL21R 융합 단백질 또는 엔브렐(Enbrel)을 투여 6회;
9th: TNFR2-IL21R 융합 단백질 또는 엔브렐(Enbrel)을 투여 9회;
CIA: CIA(collagen induced Arthritis) 관절염 동물 모델에 아무것도 투여하지 않은 음성 대조군;
IL21R/TNFR2-Fc: CIA 관절염 동물 모델에 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 투여한 군; 및
Enbrel: CIA 관절염 동물 모델에 관절염 치료제인 엔브렐(Enbrel)을 투여한 군.
도 16은 면역염색법을 통한, CIA 관절염 유발 마우스의 비장의 Th17 및 Treg 발현량을 측정한 그림이다:
CIA: CIA(collagen induced Arthritis) 관절염 동물 모델에 아무것도 투여하지 않은 음성 대조군;
IL21R/TNFR2-Fc: CIA 관절염 동물 모델에 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 투여한 군; 및
Enbrel: CIA 관절염 동물 모델에 관절염 치료제인 엔브렐(Enbrel)을 투여한 군.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 TNFR2(Tumor necrosis factor receptor type 2) 단백질 또는 상기 TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편과 IL21R(Interleukin-21 receptor) 단백질 또는 상기 IL21R의 세포외 영역을 포함하는 단편이 연결된 융합 단백질을 제공한다.
상기 TNFR2-IL21R 융합 단백질에서, TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 2번 아미노산의 23번 ~ 179번을 포함하는 폴리펩티드인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. TNFR2-IL21R 융합 단백질에서, IL21R의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 2번 아미노산의 21번 ~ 231번을 포함하는 폴리펩티드인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. TNFR2-IL21R 융합 단백질에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, TNFR2-IL21R 융합 단백질은 200 ~ 250개의 아미노산으로 구성된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 TNFR2-IL21R 융합 단백질은 항체의 중쇄(heavy chain)의 불변(constant) 도메인으로부터 유래된 단편을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. TNFR2-IL21R 융합 단백질에 포함되는 Fc 도메인(domain)은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게 CH2와 CH3 불변(constant domain) 도메인 전체 또는 일부를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 TNFR2-IL21R 융합 단백질은 TNFR2, IL21R의 세포외 수용성 도메인의 카르복실- 및 아미노-말단에 항체의 중쇄의 불변(constant) 도메인 영역 전체 또는 일부를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. TNFR2-IL21R 융합 단백질은 2 당량 이상의 항체의 중쇄의 불변 도메인 영역을 가지는 형태를 포함하는 것을 특징인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 두 개의 Fc 중쇄는 디설파이드 결합 또는 다른 공유결합으로 연결된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. TNFR2-IL21R 융합 단백질의 TNFR2, IL21R 부분은 2 당량 이상의 TNFR2, IL21R의 세포외 수용성 도메인의 영역을 가지는 형태를 또한 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 TNFR2-IL21R의 융합 단백질은 하기의 단계들을 포함하는 방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다:
1) DNA 라이브러리를 주형으로 삼고, IL21R 프라이머를 사용하여 PCR(중합효소 연쇄 반응)을 수행하는 단계;
2) DNA 라이브러리를 주형으로 삼고, TNFR2 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하는 단계;
3) 단계 1)과 단계 2)의 PCR 산물을 주형으로 삼고, TNFR2-IL21R의 융합 유전자를 코딩하는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하는 단계;
4) 단계 4)의 PCR 산물을 제한효소로 절단하는 단계;
5) pYK-602-HIS-Fc 발현 벡터를 제한효소로 절단하는 단계;
6) 단계 4)와 단계 5)의 제한효소로 절단된 플라스미드를 라이게이션(ligation)하는 단계;
7) 단계 6)의 라이게이션 반응이 완료된 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 형질전환하는 단계;
8) 단계 7)의 형질전환 후, LB 플레이트에 접종하는 단계;
9) 단계 8)의 생성된 콜로니(colony)를 이용한 PCR을 수행하는 단계;
10) 단계 9)에서 확인된 TNFR2-IL21R의 융합 단백질을 293E 세포에 형질감염(transfection)시키는 단계;
11) 단계 10)의 293E 세포에서 발현된 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 세포 배양액으로부터 정제하는 단계;
12) 단계 11)의 정제된 TNFR2-IL21R 융합 단백질의 세포독성을 제거하는 단계; 및
13) 단계 12)의 정제된 TNFR2-IL21R 융합 단백질의 결합 능력(Binding affinity)를 확인하는 단계.
본 발명의 제조방법에 있어서, 벡터의 제조는 DNA 라이브러리(library)로 부터 PCR을 이용하여 수행하는 것이 바람직하며, 상기 DNA 라이브러리는 간, 태반, 췌장 및 간 조직에서 제조된 것을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, TNFR2-IL21R의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, TNFR2-IL21R의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
발현벡터는 pYK602-HIS-Fc가 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, TNFR2-IL21R의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 형질전환시킨 형질전환체를 제공한다.
형질전환체는 E. coil의 DH5α인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, pYK602-HIS-Fc 발현 벡터에 IL21R과 TNFR2를 서브클로닝하기 위하여, PCR을 수행하여 IL21R 유전자와, TNFR2 유전자를 증폭하였다. 증폭된 각각의 PCR 산물을 pYK602-HIS-Fc 발현벡터에 라이게이션하여, TNFR2-Fc 및 IL21R-Fc를 구축하였다(도 1 및 도 3 참조). 구축한 TNFR2-Fc와 IL21R-Fc를 293E 세포에 형질감염시킨 후, 생성되는 단백질과, 이를 정제한 단백질(IL-21 단일 길항제)을 웨스턴 블랏을 이용하여 확인하였다(도 2 및 도 4 참조).
또한, DNA 라이브러리 혼합(신장, 태반, 췌장 및 간의 혼합)을 주형으로 하여 IL21R과 TNFR2 유전자를 PCR을 수행하여 증폭시켰다. IL21R과 TNFR2의 융합된 유전자를 증폭한기 위한 프라이머를 제작한 후(도 5 참조), 증폭된 산물을 주형으로 하여, TNFR2-IL21R 융합 단백질(TNF-α와 IL-21 이중 길항제)을 암호화하는 유전자를 PCR을 이용하여 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물을 pYK602-HIS-Fc 발현 벡터에 라이게이션 반응을 통해서, TNFR2-IL21R 융합 단백질 발현 벡터를 구축하였다(도 6 및 도 7 참조).
아울러, TNFR2-IL21R 융합 단백질의 리간드 중 하나인 TNF-α와의 결합력을 알아보기 위하여 결합 정도(binding affinitty)를 확인하는 실험을 수행하여, TNFR2-IL21R 융합 단백질이 TNF-α와 IL-21에 대하여 높은 결합력을 가진 것을 확인하였다(도 8 참조).
또한, 본 발명은 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 자가 면역 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
상기 TNFR2-IL21R 융합 단백질에서, TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 2번 아미노산의 23번 ~ 179번을 포함하는 폴리펩티드인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. TNFR2-IL21R 융합 단백질에서, IL21R의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 2번 아미노산의 21번 ~ 231번을 포함하는 폴리펩티드인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. TNFR2-IL21R 융합 단백질에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, TNFR2-IL21R 융합 단백질은 200 ~ 250개의 아미노산으로 구성된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 TNFR2-IL21R 융합 단백질은 항체의 중쇄(heavy chain)의 불변(constant) 도메인으로부터 유래된 단편을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. TNFR2-IL21R 융합 단백질에 포함되는 Fc 도메인(domain)은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게 CH2와 CH3 불변(constant domain) 도메인 전체 또는 일부를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 TNFR2-IL21R 융합 단백질은 TNFR2, IL21R의 세포외 수용성 도메인의 카르복실- 및 아미노-말단에 항체의 중쇄의 불변(constant) 도메인 영역 전체 또는 일부를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. TNFR2-IL21R 융합 단백질은 2 당량 이상의 항체의 중쇄의 불변 도메인 영역을 가지는 형태를 포함하는 것을 특징인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 두 개의 Fc 중쇄는 디설파이드 결합 또는 다른 공유결합으로 연결된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. TNFR2-IL21R 융합 단백질의 TNFR2, IL21R 부분은 2 당량 이상의 TNFR2, IL21R의 세포외 수용성 도메인의 영역을 가지는 형태를 또한 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 자가 면역 질환은 자가 면역 관절염, 루푸스, 중증근무력증(Myasthemia gravis), 강직성 척추염, 갑상선 기능 향진증, 갑상선 기능 저하증, 궤양성 대장염, 크론병, 심장판막증, 다발성 경화증, 전신성 경피증(Scleroderma), 자가 면역성 간염으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 자가 면역 관절염인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시 양태에서, Th17 세포에 <실시예>를 통해서 구축된 TNFR2-Fc, IL21R-Fc 및 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 처리한 결과, 염증성 사이토카인(cytokine)인 IL-21, IL-17 및 RORc 전사인자의 발현이 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 처리한 후, TNFR2-Fc, IL21R-Fc와 비교하였을 때, 그 발현이 모두 현저히 감소되는 것을 확인할 수 있었다(도 9 참조). 또한, Th17 세포에서 분비되는 염증성 사이토카인은 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 처리하였을 때, TNFR2-Fc, IL21R-Fc를 처리하였을때에 비해 현저히 감소함을 확인할 수 있었다(도 9 참조). 또한, TNFR2-Fc, IL21R-Fc 및 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 각각 처리한 후, 항염증성 사이토카인인 IL-10의 단백질 분비량을 ELISA 방법을 사용하여 측정한 결과, FoxP3의 발현과 IL-10 단백질의 분비량이 TNFR2-Fc, IL21R-Fc에 비하여, TNFR2-IL21R 융합 단백질을 처리하였을 때 더욱 증가함을 확인할 수 있었다(도 10 참조). 아울러, TNFR2-Fc, IL21R-Fc 및 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 처리한 후 파골 세포 분화의 분화가 억제되는 것을 TRAP 염색과 카텝신(Cathespin) K의 발현 증가를 통해서 확인할 수 있었다(도 11 참조).
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명에 따른 TNFR2-IL21R 융합 단백질의 생체내 관절염 치료 효과를 확인하기 위하여, CIA 관절염 유발 마우스 모델을 제조하여, 상기 마우스 모델에 본 발명에 따른 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 투여한 결과, 관절염 치료 효과가 관찰되었으며(도 12 참조), 이는 구체적으로 관절의 침윤, 염증 및 연골 파괴가 완화되며(도 13 참조), 염증 인자의 발현이 감소될 뿐만 아니라(도 14 참조), 상기 관절염 유발 마우스를 제조하기 위하여 투여된 CII 특이적 IgG2a의 생성이 감소되는 효과를 나타냈다(도 15 참조). 이러한, 관절염의 치료 또는 완화 효과는 관절염 치료제로 사용하고 있는 엔브렐(Enbrel)과 유사하거나, 우수한 것을 관찰할 수 있었다. 아울러, 본 발명에 따른 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 투여한 CIA 관절염 유발 마우스에서, 면역 반응에 관여하는 비장 조직을 채취하여 Th17과 Treg 세포의 발현을 관찰하였을 때, 염증 인자를 발현하는 Th17(CD4+IL-17+)세포의 발현이 감소한 반면, 자가 면역으로부터 보호하는 역할을 하는 면역 억제 세포인 Treg(CD4+CD25+Foxp3+) 세포의 발현이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(도 16 참조).
따라서, TNFR2-IL21R 융합 단백질은 염증성 사이토카인 IL-17의 생성을 감소시키며, 이러한 효과는 TNFR2-F와 IL21R-Fc 단일 단백질에 비하여 더욱 현저하며, 항 염증성 사이토카인인 IL-10의 생성 또한 TNFR2-F와 IL21R-Fc보다 더욱 증가시키는 효과를 나타낼 뿐만 아니라, CIA 관절염 유발 마우스 모델에서 자가 면역 관절염의 완화 또는 치료 효과를 나타내므로, 본 발명에 따른 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 자가 면역 질환 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 TNFR2-IL21R 융합 단백질의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed. (2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.
본 발명의 약학 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 생체내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%를 포함한다.
본 발명에 따른 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.001 ~ 100 ㎎/㎏이며, 바람직하게는 0.01 ~ 10 ㎎/㎏이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 자가 면역 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가 면역 질환 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가 면역 질환 예방방법을 제공한다.
상기 TNFR2-IL21R 융합 단백질에서, TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 2번 아미노산의 23번 ~ 179번을 포함하는 폴리펩티드인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. TNFR2-IL21R 융합 단백질에서, IL21R의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 2번 아미노산의 21번 ~ 231번을 포함하는 폴리펩티드인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. TNFR2-IL21R 융합 단백질에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, TNFR2-IL21R 융합 단백질은 200 ~ 250개의 아미노산으로 구성된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 TNFR2-IL21R 융합 단백질은 항체의 중쇄(heavy chain)의 불변(constant) 도메인으로부터 유래된 단편을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. TNFR2-IL21R 융합 단백질에 포함되는 Fc 도메인(domain)은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게 CH2와 CH3 불변(constant domain) 도메인 전체 또는 일부를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 TNFR2-IL21R 융합 단백질은 TNFR2, IL21R의 세포외 수용성 도메인의 카르복실- 및 아미노-말단에 항체의 중쇄의 불변(constant) 도메인 영역 전체 또는 일부를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. TNFR2-IL21R 융합 단백질은 2 당량 이상의 항체의 중쇄의 불변 도메인 영역을 가지는 형태를 포함하는 것을 특징인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 두 개의 Fc 중쇄는 디설파이드 결합 또는 다른 공유결합으로 연결된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. TNFR2-IL21R 융합 단백질의 TNFR2, IL21R 부분은 2 당량 이상의 TNFR2, IL21R의 세포외 수용성 도메인의 영역을 가지는 형태를 또한 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 자가 면역 질환은 자가 면역 관절염, 루푸스, 중증근무력증(Myasthemia gravis), 강직성 척추염, 갑상선 기능 향진증, 갑상선 기능 저하증, 궤양성 대장염, 크론병, 심장판막증, 다발성 경화증, 전신성 경피증(Scleroderma), 자가 면역성 간염으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 자가 면역 관절염인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 TNFR2-IL21R 융합 단백질은 염증성 사이토카인 IL-17의 생성을 감소시키며 TNFR2-F와 IL21R-Fc와 비교하였을 때 더욱 유의하게 감소시킴을 확인할 수 있었으며, 항염증성 사이토카인인 IL-10의 생성을 TNFR2-Fc와 IL21R-Fc 보다 더욱 증가시키며, 또한 파골 세포의 분화를 억제하는 효능이 TNFR2-Fc와 IL21R-Fc보다 효과적이므로, 자가 면역 질환 치료방법으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 TNFR2-IL21R 융합 단백질의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed. (2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.
본 발명의 약학 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 생체내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%를 포함한다.
조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.001 ~ 100 ㎎/㎏이며, 바람직하게는 0.01 ~ 10 ㎎/㎏이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
아울러, 본 발명은 자가면역 질환 예방 및 치료용 의약으로 사용하기 위한 본 발명에 따른 융합 단백질을 제공한다.
상기 TNFR2-IL21R 융합 단백질에서, TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 2번 아미노산의 23번 ~ 179번을 포함하는 폴리펩티드인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. TNFR2-IL21R 융합 단백질에서, IL21R의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 2번 아미노산의 21번 ~ 231번을 포함하는 폴리펩티드인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. TNFR2-IL21R 융합 단백질에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, TNFR2-IL21R 융합 단백질은 200 ~ 250개의 아미노산으로 구성된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 TNFR2-IL21R 융합 단백질은 항체의 중쇄(heavy chain)의 불변(constant) 도메인으로부터 유래된 단편을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. TNFR2-IL21R 융합 단백질에 포함되는 Fc 도메인(domain)은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게 CH2와 CH3 불변(constant domain) 도메인 전체 또는 일부를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 TNFR2-IL21R 융합 단백질은 TNFR2, IL21R의 세포외 수용성 도메인의 카르복실- 및 아미노-말단에 항체의 중쇄의 불변(constant) 도메인 영역 전체 또는 일부를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. TNFR2-IL21R 융합 단백질은 2 당량 이상의 항체의 중쇄의 불변 도메인 영역을 가지는 형태를 포함하는 것을 특징인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 두 개의 Fc 중쇄는 디설파이드 결합 또는 다른 공유결합으로 연결된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. TNFR2-IL21R 융합 단백질의 TNFR2, IL21R 부분은 2 당량 이상의 TNFR2, IL21R의 세포외 수용성 도메인의 영역을 가지는 형태를 또한 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 자가 면역 질환은 자가 면역 관절염, 루푸스, 중증근무력증(Myasthemia gravis), 강직성 척추염, 갑상선 기능 향진증, 갑상선 기능 저하증, 궤양성 대장염, 크론병, 심장판막증, 다발성 경화증, 전신성 경피증(Scleroderma), 자가 면역성 간염으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 자가 면역 관절염인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> IL21R-Fc의 제조
<1-1> IL21R-Fc의 발현벡터 제조
IL21R-Fc 발현벡터를 제조하기 위하여, 신장, 태반, 췌장 및 간의 혼합 DNA Library(21C Frontier Human GENE Bank(한국생명공학연구원)에서 구입. Clone ID:hMU007690, plate No. IRAH-24-A10, 벡터: pOTB7.)를 주형으로 사용하여, IL21R 유전자를 발현시키기 위한 제한효소 SfiⅠ 서열을 포함하는 정방향 프라이머(서열번호 4: 5'-agggggccgtgggggcccccgacctcgtctgctacac-3') 및 역방향 프라이머(서열번호 5: 5'-tagcggccgacgcggccaattcctttaactcctctgact-3')를 사용하여 유전자를 하기 조건으로 증폭한 후, SfiⅠ 제한효소로 처리한 후, pYK602-HIS-Fc 벡터에 서브클로닝하였다. PCR 조건은 전체 반응액이 50 ㎕일 때, 주형은 100 ng이 되도록 넣어 주었고, pfu 폴리머라제(제노텍, 한국) 2.5 unit, 정방향과 역방향 프라이머를 각각 10 pmole/50 ㎕ 넣고, 남은 부피를 증류수로 채워 총 50 ㎕의 반응액을 조성한 후, 94℃ 2 분 후, 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 1분으로 30 사이클 반복하여 유전자를 증폭시킨 후, 72℃ 10분간 반응시켜 PCR 산물을 얻었다.
증폭된 PCR 산물 및 벡터를 각각 SfiI 제한효소로 절단하고 37℃에서 4시간 반응시킨 후 젤 정제 키트(gel purification kit)(QIAGEN, # 28706, USA)를 이용하여 정제하였다. 증폭된 PCR 산물과 벡터의 비율을 3(150 ㎍):1(50 ㎍)로 하여 1 ㎕ T4 DNA 리가아제(ligase)(#SDL01-R40k, Solgent, Korea)와 2 ㎕ 10× 리가아제 버퍼를 섞은 후, 총 반응액을 20 ㎕로 하여 16℃에서 16시간 라이게이션을 수행하였다.
라이게이션된 플라스미드(plasmid)를 E. coli DH5α에 형질변환(transfromation)한 후 암피실린(ampicillin)이 포함된 LB 플레이트에 뿌린(spreading)후 37℃ 배양기에서 16시간 배양시켰다. 콜로니 생성 후 콜로니를 10 ㎕ 암피실린이 포함된 LB 배지에 풀은 후, 콜로니 PCR 방법을 이용하여, 그 중 4 ~ 5 ㎕를 PCR 주형으로 삼고, PCR을 수행하여, IL21R 유전자가 pYK602-HIS-Fc 발현 벡터에 서브클로닝(subcloning)됨을 확인하였다.
<1-2> IL21R-Fc의 발현 및 정제
293E 세포를 DMEM 500 ㎖에 FBS가 50 ㎖이 첨가된 배지를 이용하여, 150 ㎜ 플레이트에 70 ~ 80% 면적을 차지할 정도로 세포를 심은 후, IL21R-Fc 20 ㎍과 PEI 40 ㎍을 1:2 비율로 혼합하여 상온에 20분 정도 반응시킨 후, 세포에 떨어뜨려 형질감염시켰다. 16 ~ 20시간 경과 후, 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지 20 ㎖로 교환해주며, 세포의 상층액은 2 ~ 3일 마다 한 번씩 수득하였다. 상측액을 수득한 후, 5000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 상층액만을 새로운 병에 옮겨서 4℃에 정제하기 전까지 보관하였다.
20개의 150 mm 플레이트에서 3일, 5일, 7일, 9일째에 걷은 상층액 총 1 ℓ를 정제하였다. 전체 상층액을 0.22 ㎛ top-filter(#PR02890 Millipore USA)를 사용하여 필터한 후, 5 ㎖ 컬럼(column)에 패킹(packing)되어 있는 500 ㎕의 protein A 비드(#17-1279-03 ,GE healthcare, Sweden)에 결합시켜준다. Peri-start 펌프를 사용하여 0.9 ㎖/분으로 4℃ 오버나잇(overnight)으로 결합시킨후, 100 ㎖ 이상의 PBS로 컬럼을 세척하고, 0.1 M 글리신 염산(Glycine-HCl)(#G7126, Sigma, USA)을 이용하여 6개 분획으로 나누어 용리(elution)하고, 1 M Tris(#T-1503-5KG. Sigma. USA)(pH 9.0)으로 중화시켜준다. 그 다음 IL21R-Fc를 정량하고, IL21R-Fc의 발현이 있는 분획을 2 ~ 3개 모아 amicon ultra(#UFC805024, Millipore, USA)를 사용하여 농축한 후 PBS(#70011, Gibco, USA)로 10 번 정도 버퍼를 교환하였다..
그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이 배양 상층액 1 ℓ에서 IL21R-Fc를 740 ng/㎕로 총 1.0 ㎎을 얻었다.
<실시예 2> TNFR2-Fc의 제조
<2-1> TNFR2-Fc의 발현벡터 제조
TNFR2-Fc 발현 벡터를 제조하기 위하여,신장, 태반, 췌장 및 간의 혼합 DNA Library(21C Frontier Human GENE Bank(한국생명공학연구원)에서 구입. Clone ID:hMU013725, plate No. IRAU-86-H09, 벡터: pDNR-LIB)를 주형으로 사용하여, TNFR2 유전자를 발현시키기 위한 제한효소 SfiⅠ 서열을 포함하는 정방향 프라이머(서열번호 6: 5'-CAGGGGGCCGTGGGGGCCTTGCCCGCCCAGGTGGCATT-3') 및 역방향 프라이머(서열번호 7: 5'-TAGCGGCCGACGCGGCCAATTCAGCTGGGGGGCTGGGGC-3')를 사용하여 유전자를 하기 조건으로 증폭한 후, SfiⅠ 제한효소로 처리한 후, pYK602-HIS-Fc 벡터에 서브클로닝하였다. PCR 조건은 전체 반응액이 50 ㎕일 때, 주형은 100 ng이 되도록 넣어 주었고, pfu 폴리머라제(제노텍, 한국) 2.5 unit, 정방향과 역방향 프라이머를 각각 10 pmole/50 ㎕를 넣고, 남은 부피를 증류수로 채워 총 50 ㎕의 반응액을 조성한 후, 94℃ 2 분, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분으로 30 사이클 반복하여 유전자를 증폭시킨 후, 72℃ 10분간 반응시켜 PCR 산물을 얻었다.
증폭된 PCR 산물 및 벡터를 각각 SfiI 제한효소로 절단하고 37℃에서 4시간 반응시킨 후 젤 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 증폭된 PCR 산물과 벡터의 비율을 3(150 ㎍):1(50 ㎍)로 하여 1 ㎕ T4 DNA 리가아제와 2 ㎕ 10×리가아제 버퍼를 섞은 후, 총 반응액을 20 ㎕로 하여 16℃에서 16시간 라이게이션을 수행하였다.
라이게이션 된 플라스미드를 E. coli DH5α에 형질변환한 후 암피실린이 포함된 LB 플레이트에 뿌린 후, 37℃ 배양기에서 16시간 배양시켰다. 콜로니 생성 후 콜로니를 10 ㎕ 암피실린이 포함된 LB 배지에 풀은 후, 콜로니 PCR 방법을 이용하여, 그 중 4 ~ 5 ㎕를 PCR 주형으로 삼고, PCR을 수행하여, TNFR2 유전자가 pYK602-HIS-Fc 발현벡터에 서브클로닝 됨을 확인하였다.
<2-2> TNFR2-Fc의 발현 및 정제
293E 세포를 DMEM 500 ㎖에 FBS가 50 ㎖이 첨가된 배지를 이용하여, 150 ㎜ 플레이트에 70 ~ 80% 면적을 차지할 정도로 세포를 심은 후, TNFR2-Fc 20 ㎍과 PEI 40 ㎍을 1:2 비율로 혼합하여 상온에 20분 정도 반응시킨 후, 세포에 떨어뜨려 형질감염시켰다. 16 ~ 20시간 경과 후, 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지 20 ㎖로 교환해주며, 세포의 상층액은 2 ~ 3일 마다 한 번씩 수득하였다. 상측액을 수득한 후, 5000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 상층액만을 새로운 병에 옮겨서 4℃에 정제하기 전까지 보관하였다.
20개의 150 mm 플레이트에서 3일, 5일, 7일, 9일째에 걷은 상층액 총 1 ℓ를 정제하였다. 전체 상층액을 0.22 ㎛ top-filter를 사용하여 필터한 후, 5 ㎖ 컬럼에 패킹되어 있는 500 ㎕의 protein A 비드에 결합시켜준다. Peri-start 펌프를 사용하여 0.9㎖/분으로 4℃ 오버나잇으로 결합시킨 후, 100 ㎖ 이상의 PBS로 컬럼을 세척하여 0.1 M Glycine-HCl을 이용하여 6개 분획으로 나누어 용리하고, 1 M Tris(pH 9.0)으로 중화시켜준다. 그 다음 정제된 단백질을 정량하고 TNFR2-Fc의 발현이 있는 분획을 2 ~ 3개 모아 amicon ultra를 사용하여 농축한 후 PBS(#70011, Gibco, USA)로 10 번 정도 버퍼를 교환하였다.
그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 배양 상층액 총 1ℓ에서 TNFR2-Fc를 1 ㎎/㎖로 총 정제된 단백질 1.5 ㎎을 얻었다.
<실시예 3> TNFR2-IL21R 융합 단백질의 제조
<3-1> TNFR2-IL21R 융합 단백질의 발현벡터 제조
TNFR2-IL21R 융합 단백질의 발현벡터를 제조하기 위하여, 신장, 태반, 췌장 및 간의 혼합 DNA Library를 주형으로 사용하여, TNFR2과 발현시키기 위한 제한효소 SfiⅠ 서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(서열번호 8: 5'-tagcggccgacgcggccaacgtgcagactgcatccatgc-3')를 사용하여 TNFR2유전자를 증폭하고, IL21R 유전자를 증폭시키기 위하여 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 하기 조건으로 증폭한 후, 두 개의 PCR 산물을 1:1의 비율로 총 100 ng을 주형으로 넣어 세 가지의 프라이머를 이용하여, PCR 하여 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 pYK602-HIS-Fc 벡터에 서브클로닝하고자 하였다. 사용된 PCR 조건은 전체 반응액이 50 ㎕일 때, 주형은 100 ng이 되도록 넣어 주었고, pfu 폴리머라제(제노텍, 한국) 2.5 unit, 정방향과 역방향 프라이머를 각각 10 pmole/50 ㎕ 넣고, 남은 부피를 증류수로 채워 총 50 ㎕의 반응액을 조성한 후, 94℃ 2 분 후, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분으로 30 사이클 반복하여 유전자를 증폭시킨 후, 72℃ 10분간 반응시켜 PCR 산물을 얻었다.
증폭된 각각의 PCR 산물을 SfiI 제한효소로 절단하고 37℃에서 4시간 반응시킨 후 젤 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 증폭된 PCR 산물과 벡터의 비율을 3(150 ㎍):1(50 ㎍)로 하여 1 ㎕ T4 DNA 리가아제와 2 ㎕ 10×리가아제 버퍼를 섞은 후, 총 반응액을 20 ㎕로 하여 16℃에서 16시간 라이게이션을 수행하였다.
라이게이션 된 플라스미드를 E. coli DH5α에 형질변환한 후 암피실린이 포함된 LB 플레이트에 뿌린 후, 37℃ 배양기에서 16시간 배양시켰다. 콜로니 생성 후 콜로니를 10 ㎕ 암피실린이 포함된 LB 배지에 풀은 후, 콜로니 PCR 방법을 이용하여, 그 중 4 ~ 5 ㎕를 PCR 주형으로 삼고, PCR을 수행하여, TNFR2-IL21R 융합 단백질를 암호화하는 유전자가 pYK602-HIS-Fc 발현벡터에 서브클로닝됨을 확인하였다.
<3-2> TNFR2-IL21R 융합 단백질의 발현 및 정제
293E 세포를 DMEM 500 ㎖에 FBS가 50 ㎖이 첨가된 배지를 이용하여, 150 ㎜ 플레이트에 70 ~ 80% 면적을 차지할 정도로 세포를 심은 후, TNFR2-IL2R 융합 단백질 20 ㎍과 PEI 40 ㎍을 1:2 비율로 혼합하여 상온에 20분 정도 반응시킨 후, 세포에 떨어뜨려 형질감염시켰다. 16 ~ 20시간 경과 후, 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지 20 ㎖로 교환해주며, 세포의 상층액은 2 ~ 3일 마다 한 번씩 걷었다. 상측액을 수득한 후, 5000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 상층액만을 새로운 병에 옮겨서 4℃에 정제하기 전까지 보관하였다.
10개의 150 mm 플레이트에서 3일, 5일, 7일째에 걷은 상층액 총 600 ㎖을 정제하였다. 전체 상층액을 0.22 ㎛ top-filter를 사용하여 필터한 후, 5 ㎖ 컬럼(column)에 패킹되어 있는 500 ㎕의 protein A 비드켜준다. Peri-start 펌프를 사용하여 0.9㎖/분으로 4℃ 오버나잇으로 결합시킨후, 100 ㎖ 이상의 PBS로 컬럼을 세척하여 0.1 M 글리신 염산을 이용하여 6개 분획으로 나누어 용리하고, 1 M Tris(pH 9.0)으로 중화시켜준다. 그 다음 정제된 단백질을 정량하고 TNFR2-IL21R 융합 단백질의 발현이 있는 분획을 2 ~ 3개 모아 amicon ultra를 사용하여 농축한 후 PBS(#70011, Gibco, USA)로 10 번 정도 버퍼를 교환하였다.
그 결과, 도 7에서 나타난 바와 같이 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 380 ㎍/㎖로 총 1 ㎎을 얻었다(도 7).
<실험예 1> TNFR2-IL21R 융합 단백질과 리간드의 결합력 측정
<실시예>에서 제조한 TNFR2-Fc, IL21R-Fc 및 TNFR2-IL21R 융합 단백질과 그 리간드인 TNF-α와 결합하여 길항 작용을 할 수 있을지 알아보기 위하여, 결합력을 측정하는 실험(Binding affinity test)을 수행하였다.
ELISA 플레이트(#439454, Nunc, Denmark)를 이용하여 웰(well)당 100 ng의 TNF-α(#C001-1 MG, enzynomics, Korea)로 코팅을 하였다. 코팅은 4℃에서 오버나잇으로 수행하였다. 코팅이 완료된 ELISA 플레이트에 PBS 200 ㎕에 4% Skim milk(스킴 밀크)(#232100, Difco, France)를 넣은 용액을 넣고, 비특이적인 반응을 억제하기 위하여 상온에서 대략 1시간 블로킹(blocking) 버퍼[4% 스킴 밀크 in PBS]로 블로킹시켰다. 블로킹이 끝나면 ELISA 플레이트에서 블로킹 버퍼를 제거하고, 각각의 정제된 융합 단백질을 1% 스킴 밀크를 PBS에 섞은 용액 100 ㎕에 100 nM로 준비한 뒤, 이를 1/4의 희석농도로 순차희석(serial dilution)을 한 다음 상온에서 대략 2시간 반응시켰다. 그 다음, 200 ㎕ PBS로 플레이트를 5회 세척을 해주고 2 ㎕의 2차 항체(secondary antibody)인 anti-Human Fc-HRP(#31413, Thermo, USA)를 1% 스킴 밀크가 함유된 4 ㎖의 PBS에 섞은 다음, ELISA 플레이트에 한 웰당 200㎕씩 넣어 준 다음 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응후, ELISA 플레이트의 2차 항체를 제거한 후, 200 ㎕의 PBS로 5회 세척해주고 한 웰당 10 ㎕의 과산화수소 용액(H2O2,#H1009-100ML, Sigma, USA)과 10 ㎖의 PC버퍼[5.1 g 구연산 모노하이드레이트(Citric acid monohydrate), 7.3 g 인산나트륨(Sodium phosphate)(pH 5.0)/ℓ], 그리고 OPD 정제(#P8787-100TAB Sigma USA) 1개를 혼합하여 총 100 ㎕의 부피로 만든 반응액을 넣어준다. 반응액을 넣은 다음, 상온의 어두운 상태에서 10분간 반응시킨 뒤, 발색을 확인하고, 반응을 중단시키는 STOP 버퍼를 한 웰당 50 ㎕씩 넣어 반응을 종료시키고, ELISA 리더(reader)에서 490 nm의 파장에서 Kd value를 측정하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, TNF-α 리간드는 TNFR2-IL21R 융합 단백질과 낮은 Kd value를 보임으로써, 높은 결합력을 확인할 수 있었다(도 8).
<실험예 2> TNFR2-IL21R 융합 단백질의 염증성 사이토카인 억제 측정
<2-1> 말초혈액 단핵세포 분리
건강인으로부터 헤파린(Heparin) 처리된 주사기를 이용하여 혈액을 체취한 후 PBS와 1:1 비율로 희석하였다. 피콜(Ficoll)(Amercham Biosciences, Burkinghamshire, England)과 희석한 혈액의 비율이 1:4로 되게 하여 피콜층에 섞이지 않게 혈액을 띄운 뒤에 2000rpm, 20℃ 조건으로 30분간 원심분리하여 연막층에서 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)를 분리하였다. 분리된 세포를 PBS로 세척한 후 10% 우태아 혈청(Gibco, Burlingame, CA, USA)이 포함된 세포배양액 RPMI 1640(Gibco BRL)에 1×106 세포/㎖로 희석하였다.
<2-2> Th17 세포 배양
실험예 <2-1>에 기재된 말초혈액 단핵세포를 10% 우태아혈청이 포함된 세포배양액 RPMI 1640으로 5×105 세포/500 ㎕ 수의 세포로 48웰 plate(웰 플레이트) (Nalge Nunc International, IL, USA)에 분주하여 이들 세포에 TNF-α와 IL-21에 대한 TNFR2-Fc, IL21R-Fc 및 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 10 ㎍/㎖ 농도로 처리하여 1시간 배양하였다. 1시간 후, 세포를 파이펫을 사용하여 바닥에 붙은 세포를 뜯어 anti-CD3(BD Pharmingen, San Diego, CA, USA)가 0.3 ㎍/㎖로 코팅 48웰 플레이트로 옮기고, 말초혈액 단핵 세포를 Th17 세포로 분화 유도시키기 위해 IL-6(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) 20 ng/㎖, IL-23(R&D Systems) 10 ng/㎖ 및 IL-1β(R&D Systems) 5 ng/㎖을 처리하여 37℃, 5% CO2 환경의 배양기에서 72시간 배양하였다. 72 시간 배양 동안 배지 교환 및 추가 자극은 하지 않았다.
<2-3> RT-PCR
실시예 <2-2>의 72시간 배양한 세포로부터 총 RNA를 RNA zol-B(Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA)를 이용하여 추출하였다. 총 2 ㎍의 RNA에 랜덤 프라이머(random primer)(Genotech, Daejeon, Korea) 1 ㎕를 가하여, 70℃에서 5분간 방치한 후 바로 얼음에 넣어 급냉 시키고, 4 ㎕의 5×M-MULV 버퍼, 1 ㎕의 10 mM dNTP, 0.5 ㎕ 알엔아제 억제제(RNase inhibitor)(Takara, Shiga, Japan)와 혼합한 후 총 반응액이 19 ㎕가 되도록 증류수 9.5 ㎕를 가하였다. 25℃에서 5분간 반응한 후 1 ㎕의 역 전사 효소 M-MULV (Takara, Shiga, Japan)를 처리하여 25℃에서 5분, 42℃에서 60분, 72℃에서 10분간 반응시켜 cDNA를 얻었다.
이렇게 생성된 cDNA산물을 주형으로 하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 시행하였다. RT-PCR을 위한 반응 화합물은 한 샘플당 총 25 ㎕가 되도록 하였고, 용액의 조성은 10×반응버퍼 2.5 ㎕, 0.5 mM의 dNTP 2.5 ㎕, Taq 0.3 ㎕(Takara, shinga, Japan) 및 타깃 정방향과 역방향 프라이머 각각 2 ㎕와 cDNA 1㎕ 및 14.7 ㎕의 증류수를 포함한다. 증폭을 위해 Dual-bay Thermal cycler system(MJ Research)을 사용하였다. 음성대조군으로 추출한 cDNA 대신 증류수를 사용하여 PCR 산물이 관찰되지않는 것을 통해 PCR 오염이 없음을 확인하였다. IL-21은 94℃ 3분 변성과정을 거친 후 94℃ 30초, 56℃ 30초, 72℃ 30초간 반응을 30 회 반복한 후, 신장을 위해 72℃에서 7분간 반응을 실행하였다. IL-17 증폭조건은 94℃ 3분 변성과정을 거친 후 94℃ 1분, 56℃ 1분, 72℃ 1분간 반응을 30 회 반복한 후 72℃에서 7분간 반응을 실행하였다. RORc와 β-actin은 94℃에서 3분간 변성과정을 거친 후 94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초간 반응을 각각 30 회, 26회 반복하였다. 중합효소반응에 의해 얻어진 증폭 산물은 브롬화에티듐(ethidium bromide)가 포함된 1.5% 아가로즈 젤(agarose gel)에 전기 영동을 시킨 후 Gel-Doc 2000(Bio-rad Laboratories, Hercules, CA)으로 영상을 얻고 Quantity-One(Bio-rad) 프로그램을 이용하여 증폭산물을 농도 계측법으로 정량하였다. 이 값을 β-actin과의 비율로 환산하여 각 세포군 간의 mRNA 발현 정도를 비교하였다. 사용한 프라이머 서열은 아래와 같다:
IL-21;
5'-CTT ACC TGG CAA GAC CAG TAT GA-3'(서열번호 9);
5'-GTA GAA GGC AGG GTC TTC GTA AT-3'(서열번호 10);
IL-17;
5'-TGA AGT GCT GTC TGG AGC AG-3'(서열번호 11);
5'-TCC TCA GAA TCA TCC ATG TC-3'(서열번호 12);
RORc;
5'-AGT CGG AAG GCA AGA TCA GA-3'(서열번호 13);
5'-CAA GAG AGG TTC TGG GCA AG-3'(서열번호 14);
β-actin;
5'-GGA CTT CGA GCA AGA GAT GG-3'(서열번호 15);
5'-TGT GTT GGC GTA CAG GTC TTT G-3'(서열번호 16).
증폭 산물을 β-actin 발현 비율에 따라 환산하여 각 mRNA 발현 정도를 비교하였다.
그 결과, Th17 세포의 분화 조건에서는 염증성 사이토카인인 IL-17 및 IL-21 Th17 세포의 분화과정에서 발현된다고 보고된 특정 전사인자인 RORc의 mRNA 발현이 높았다. 하지만 동일한 조건의 Th17 세포에 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 처리한 경우, IL-17, IL-21 및 RORc 유전자의 발현이 현저히 억제되는 것을 관찰할 수 있었다(도 9).
<2-4> TNFR2-IL21R 융합 단백질의 IL-17 생성 감소 측정
TNFR2-IL21R 융합 단백질에 의해 IL-17 단백질의 생성이 감소하는지 확인하기 위해 실험예 <2-3>에서 배양한 TNFR2-IL21R 융합 단백질이 처리된 Th17 세포의 상층액에서 염증성 사이토카인 IL-17 단백질의 양을 ELISA 방법을 사용하여 측정하였다.
Sandwich ELISA용 96웰 플레이트에 IL-10(R&D Systems) 항체를 2 ㎍/㎖로 1웰에 100 ㎕ 넣어 상온에서 2시간 반응시킨 후, 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 0.05% PBST[0.05% Tween20 in PBS]에 섞은 블로킹 버퍼 200 ㎕를 첨가하여 실온에서 2시간 반응시켰다. 표준시료(standard)로 사용할 인간 재조합 IL-10(R&D Systems)은 각 5,000∼78.125 pg/㎖ 농도로 순차희석(serial dilution)하여 준비하였다. 표준시료와 함께 측정할 실험예 <3-1>의 세포배양 상층액을 100 ㎕/웰씩 넣고 실온에서 2 시간 반응시켰다. 반응 후 0.05% PBST 300 ㎕로 4번 세척하고, 바이오틴(Biotin)이 결합된 anti-human IL-10(R&D Systems)을 200 ng/㎖의 농도로 희석하여 100 ㎕/웰씩 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응 후, 4번 PBST로 세척하고, 엑스트라아비딘 포스파타아제 접합체(ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate)(Sigma, Louis, MO, USA)를 1：2,000으로 희석하여 100 ㎕/웰씩 넣고 실온에서 2시간 반응시키고, PBST로 세척 후 포스페이트 디소디윰 솔트 헥사하이드레이트(Phosphate Disodium salt Hexahydrate, PNPP)/DEA 용액을 1 ㎎/㎖ 농도로 100 ㎕ 첨가하여 반응했다. 반응 후 0.2 N NaOH 100 ㎕를 넣어 반응을 멈추고, 405 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, Th17 세포가 분화 자극 조건하에서 염증성 사이토카인인 IL-17 단백질의 생성물이 증가되나, 본 발명의 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 10 ㎍/㎖을 처리한 경우 TNFR2-Fc, IL21R-Fc를 처리한 군에 비하여 IL-17의 생성이 더욱 효과적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 9).
<실험예 3> TNFR2-IL21R 융합 단백질의 FoxP3 발현 및 IL-10 생성 증가 측정
<3-1> TNFR2-IL21R 융합 단백질의 FoxP3 발현 측정
TNFR2-IL21R 융합 단백질이 Th17 세포 반응을 억제함과 동시에 자가 항원에 대한 균형을 유지하고 자가 면역으로부터 보호하는 역할을 하는 면역 억제 세포인 Treg의 작용에 상승효과를 유도할 수 있을지 알아보기 위하여, Treg 세포에서 생성되는 유전자인 FoxP3의 발현을 유세포 분석(Flow cytometry) 방법을 이용하여 측정하였다.
실험예 <2-2>에 기재된 방법으로 분화가 유도된 Th17 세포에 TNFR2-Fc, IL21R-Fc 및 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 10 ㎍/㎖ 처리하여, 3일 동안 배양한 후, 상기와 동일한 세포자극에 따라 세포를 3일간 배양하고, PMA 25 ng/㎖, 이노노마이신(Inonomycine) 250 ng/㎖과 고지스톱(Gogistop)(BD Pharmingen, San Diego, CA, USA)을 5시간 전처리하였다. 세포를 모아 페리디닌 엽록소 단백질이 융합된 인간 CD4에 대한 항체(Peridinin chlorophyll protein(PerCP)-anti-human CD4, Bioscience, San Diego, CA, USA) 및 알로피코시아닌이 융합된 인간 CD 25에 대한 항체(allophycocyanin (APC)-anti-human CD25(e-Bioscience, San Diego, CA, USA)항체를 20 ㎕/1×106 세포로 처리하여, 4 ℃ 암시야에서 30분간 반응시킨 뒤 FACS 버퍼[0.002% 아지드화 나트륨(sodium azide), 0.2% BSA in PBS]로 세척하였다. 침투성(Permeabilization) 버퍼 1 ㎖을 처리하여 30분간 반응시켰다. 침투성 버퍼로 세포를 세척한 후에 인간 FoxP3에 대한 플루오레세인 항체(Fluorescein isothiocanate-anti-human FoxP3, e-Bioscience, San Diego, CA, USA)를 20 ㎕/1×106 세포에 처리하여, 4 ℃, 암시야에서 30분간 반응시켰다. 침투성 버퍼로 세포를 세척한 후, 상층액을 버리고 FACS 버퍼를 넣어 유세포 분석기(FACS Calibur, Becton Dickinson, San Diego, CA, USA) 로 분석하였다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, Treg의 대표적 전사인자인 FoxP3의 발현은 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 처리하였을 때, TNFR2-Fc나 IL21R-Fc에 비해 더욱 효과적으로 FoxP3의 발현을 증가함을 확인할 수 있었다(도 10).
<3-2> TNFR2-IL21R 융합 단백질의 IL-10 생성 증가 측정
TNFR2-IL21R 융합 단백질이 Th17 세포 반응을 억제함과 동시에 자가항원에 대한 균형을 유지하고 자가 면역으로부터 보호하는 역할을 하는 면역 억제 세포인 Treg의 작용에 상승효과를 줄 수 있을지 알아보기 위하여, Treg 세포에서 생성되는 항염즘성 사이토카인 IL-10 단백질을 ELISA 방법을 사용하여 측정하였다.
Sandwich ELISA용 96웰 플레이트에 IL-10 (R&D Systems) 항체를 2 ㎍/㎖로 1웰에 100 ㎕ 넣어 상온에서 2시간 반응시킨 후, 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 0.05% PBST에 섞은 블로킹 버퍼 200 ㎕를 첨가하여 실온에서 2시간 반응시켰다. 표준시료로 사용할 인간 재조합 IL-10(R&D Systems)은 각 5,000 ∼ 78.125 pg/㎖ 농도로 순차희석하여 준비하였다. 표준시료와 함께 측정할 실험예 <3-1>의 세포배양 상층액을 100 ㎕/웰씩 넣고 실온에서 2 시간 반응시켰다. 반응 후 0.05% PBST 300 ㎕로 4번 세척하고, 바이오틴(Biotin)이 결합된 anti-human IL-10(R&D Systems)을 200 ng/㎖의 농도로 희석하여 100 ㎕/웰씩 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응 후, 4번 PBST로 세척하고, ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate(Sigma, Louis, MO, USA)를 1：2,000으로 희석하여 100 ㎕/웰씩 넣고 실온에서 2시간 반응시키고, PBST로 세척 후 Phosphate Disodium salt Hexahydrate(PNPP)/DEA 용액을 1 ㎎/㎖ 농도로 100 ㎕ 첨가하여 반응했다. 반응 후 0.2 N NaOH 100 ㎕를 넣어 반응을 멈추고, 405 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, Th17 세포 분화 조건에 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 처리하였을 때, TNFR2-Fc, IL21R-Fc를 처리한 것에 비해 통계적으로 유의하게 IL-10의 생성이 더욱 증가함을 확인하였다(도 10).
<실험예 4> TNFR2-IL21R 융합 단백질의 파골 세포 분화 감소 측정
<4-1> 파골 세포 배양
건강인으로부터 헤파린 처리된 주사기를 이용하여 혈액을 채취한 후 PBS와 1:1 비율로 희석하였다. Ficoll과 희석한 혈액의 비율이 1:4로 되게 하여 Ficoll 층에 섞이지 않게 혈액을 띄운 뒤에 2000 rpm, 20℃ 조건으로 30분간 원심분리하여 연막(buffy coat)층에서 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)를 분리하였다. 분리된 세포를 PBS로 세척한 후 10% 우태아 혈청이 포함된 αMEM(Invitrogen, Burlingame, CA, USA)에 섞어 24 웰 플레이트에 5 ×105 세포/500 ㎕로 분주하고 37℃, 5% CO2 환경의 배양기에서 2시간 동안 배양하였다. 2시간 후 플레이트 바닥에 붙지 않은 세포를 제거하고, PBS로 세척한 후 새로운 10% αMEM 세포 배양액을 500 ㎕ 넣고 재조합 인간 대식세포 콜로니 자극인자(recombinant human macrophage/monocyte colony-forming factor, M-CSF)(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) 100 ng/㎖로 세포를 자극하여 3일간 배양하였다. 3일 뒤, PBS 세척 후 배지를 새로운 10% αMEM 배양액으로 교환하고, rhM-CSF 25 ng/㎖ 및 핵 인자 카파비 리간드의 수용체 활성제(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand, RANKL)(Peprotech, London, UK) 30 ng/㎖으로 자극하고 TNFR2-Fc, IL21R-Fc 및 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 조건에 따라 각각 10 ㎍/㎖ 처리하여 배양하였다. 매 3일마다 배양액을 교환하고 상기 자극 조건에 따라 처리하였다. 세포 분화 상태를 관찰하여 자극 횟수를 결정하였다.
<4-2> 파골 세포 염색
상기의 분화된 세포에 TNF-α와 IL-21에 대한 TNFR2-Fc, IL21R-Fc 및 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 처리한 후, 상기 방법으로 파골 세포 분화를 유도하였다. 분화된 파골 세포를 10% 포르말린(formalin)을 넣어 10분간 반응시켜 고정하고, 이들 세포를 PBS로 3회 세척하고 TRAP(Tartrate-resistant acid phosphatase) 염색 Kit(Sigma, Louis, MO, USA)를 통해 분화된 파골 세포를 조사하였다. 미리 가온해 놓은 37℃ 멸균한 증류수 45 ㎖에 키트 내의 fast Garmet GBC Basr 용액 500 ㎕와 아질산나트륨(sodium nitrite) 용액 500 ㎕를 잘 혼합한 후 섞는다. 이 혼합 용액에 나프톨 AS-BI 포스페이트(Naphthol AS-BI Phosphate) 용액 500 ㎕, 아세테이트(acetate) 용액 2 ㎖, 타르타르산염(Tartrate) 용액 1 ㎖을 순차적으로 넣은 후 잘 혼합하여 고정한 세포에 200 ㎕씩 넣고, 37℃에서 30 분간 염색 반응을 실시한 후, 염색 정도를 관찰하며 반응 시간을 조절한다. TRAP 양성(적자색)이며 핵이 3개 이상인 다핵세포를 파골양세포로 간주하였으며, 이를 광학 현미경으로 계측하였다. 실험은 3회 이상 시행하였으며 4개 웰로 나누어 실험한 결과는 평균치 ± 표준편차로 나타내었다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, M-CSF 및 RANKL의 자극으로 파골 세포의 분화가 활발하게 일어난 것을 관찰할 수 있었으며, 이러한 분화는 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 처리하였을 때, TNFR2-Fc 와 IL21R-Fc를 처리한 것에 비해서 더욱 효과적으로 분화를 억제하는 것을 확인할 수 있었다(도 11).
<4-3> Cathepsin K의 발현 측정
상기의 분화된 세포에 TNFR2-Fc, IL21R-Fc 및 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 처리한 세포로부터 RNA를 얻어 실험예 <2-3>에 기재된 RT-PCR 방법을 이용하여 cDNA를 합성한 후, 카텝신(Cathepsin) K의 발현을 측정하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, M-CSF 및 RANKL의 자극으로 발현된 Cathepsin K가 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 처리하였을 때, TNFR2-Fc 와 IL21R-Fc를 처리한 것에 비해서 더욱 효과적으로 발현이 감소되는 것을 확인할 수 있었다(도11).
<실험예 5> TNFR2-IL21R 융합 단백질의 CIA 관절염 유발 마우스의 관절염 치료 효과 확인
본 발명에 따른 TNFR2-IL21R 융합 단백질의 관절염 치료 효과를 확인하기 위하여, 콜라엔 유도에 의한 관절염 CIA(collagen induced Arthritis)) 마우스 모델에 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 투여하여 치료 효과를 확인하였다.
구체적으로, CIA 유도를 시키기 위하여, 6주령 수컷 DBA/1J 마우스(오리엔트바이오)에 complete Freund’s adjuvant (CFA)와 동량으로 섞어준 제2형 교원질(Type II Collagen: CII) 100 ㎍을 꼬리에 주사하여, 1회 면역화 반응을 수행하였다. 6마리씩, 각 실험군으로 나눈 후, 한 주(7일) 뒤부터 IL21R/TNFR2-Fc(TNFR2-IL21R 융합 단백질) 50 ㎍, Enbrel 100 ㎍을 각각 복강내 주사(intraperitoneal injection, I.P.) 방법으로 주 3회씩 3주간 (총 9회) 주입하였다. 1회 면역화 반응을 시작점으로 하여 관찰자 세 명이 매 주 세 번씩 관절 염증의 위증도를 평가하였다. 관절염 평가는 Rosoliniec 등에 의한 평균 관절염 지수(mean arthritic index)에 기준하여 아래의 척도에 따라 매긴 점수를 합하여 4으로 나눈 평균치를 얻고, 다시 각 마우스에서 3명의 관찰자가 얻은 수치를 합산하여 나눈 평균치를 사용한다. 발생수는 한 발을 25%로 하여 부은 발의 수를 점수화 하였다:
0점 : 부종이나 종창이 없다;
1점 : 발 또는 발목관절에 국한된 경한 부종과 발적;
2점 : 발목관절에서 족근골(metatarsal)에 걸친 경한 부종과 발적;
3점 : 발목관절에서 족근골에 걸친 중등도의 부종과 발적; 및
4점 : 발목에서 다리 전체에 걸쳐 부종과 발적이 있는 경우.
그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이 본 발명에 따른 정제된 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 CIA 관절염 유발 마우스 모델에 투여한 후, 임상학적 수치(clinical score)와 발생수(incidence)를 관찰하였을 때, 본 발명에 따른 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 투여한 군에서 우수한 관절염 치료 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, 이러한 효과는 관절염 치료제로 사용되는 Enbrel을 투여한 양성대조군에 비하여 더욱 우수하였다(도 12).
<실험예 6> 면역조직화학염색법을 통한,TNFR2-IL21R 융합 단백질의 CIA 관절염 유발 마우스의 관절염 완화 효과 확인
상기 <실험예 5>에서 이용한 CIA 관절염 유발 마우스에 TNFR2-IL21R 융합 단백질 및 Enbrel을 투여한 실험군 마우스의 관절을 채취하여, 면역조직화학염색법을 이용하여 관절의 침윤, 염증 및 연골의 파괴정도를 확인하였다.
구체적으로, 면역염색조직화학염색법을 수행하기 위하여 우선 상기 TNFR2-IL21R 융합 단백질 및 Enbrel을 각각 투여한 CIA 관절염 유발 마우스의 관절을 채취하여, 10% 중성완충포르말린에서 고정시키고, EDTA를 이용하여 뼈를 탈회시켰다. 이어서 파라핀에 포매하여 관절 조직을 7 μm 두께의 절편으로 만들어 슬라이드에 부착하였다. 기본염색을 진행하기 전에 자일렌(xylene)을 이용하여 탈 파라핀 과정을 거쳐 에탄올을 고농도에서 저농도까지 함수 시켰으며, 염색과정은 헤마톡실린(haematoxylin)과 에오신(eosin) 염색을 진행하였다. 또한, 연골에 포함된 프로테오글리칸(proteoglycans)을 감지할 수 있는 사파린 O(Safranin O)와 톨루이딘 블루(Toluidine blue) 방법을 사용하여 염증과 연골조직의 파괴 정도 측정하였다.
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이 CIA 관절염 유발 마우스 모델에 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 투여하였을 때, 아무것도 투여하지 않은 CIA 관절염 마우스 모델에 비하여 세포의 침윤이 감소되고 있음을 관찰할 수 있었으며, 사파린 O(Safranin O) 및 톨루이딘 블루(Toluidine blue) 방법을 통하여 염증 및 연골의 파괴 또한 완화되는 것을 관찰할 수 있었다(도 13).
<실험예 7> 면역조직화학염색법을 통한,TNFR2-IL21R 융합 단백질의 CIA 관절염 유발 마우스의 염증 감소 효과 확인
상기 <실험예 5>에서 이용한 CIA 관절염 유발 마우스에 TNFR2-IL21R 융합 단백질 및 Enbrel을 투여한 실험군 마우스의 관절을 채취하여, 면역조직화학염색법을 이용하여 염증인자의 발현을 관찰하였다.
우선 상기 TNFR2-IL21R 융합 단백질 및 Enbrel을 투여한 CIA 관절염 유발 마우스의 관절을 채취하여, 10% 중성완충포르말린에서 고정시키고, EDTA를 이용하여 뼈를 탈회시켰다. 이어서 파라핀에 포매하여 관절 조직을 7 μm 두께의 절편으로 만들어 슬라이드에 부착하였다. 기본염색을 진행하기 전에 자일렌(xylene)을 이용하여 탈 파라핀 과정을 거쳐 에탄올을 고농도에서 저농도까지 함수 시켰다. 면역화학염색법 이용하여 염증성 사이토카인인 IL-17, TNF-α, IL-1β, IL-6과 RANK(Receptor activator of nuclear factor-κB), VEGF(Vascular endothelial growth factor )를 염색하여 광학현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, CIA 관절염 유발 마우스에 비하여 본 발명에 따른 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 투여한 군에서 염증성 사이토카인인 IL-17, TNF-α, IL-1β, IL-6의 발현이 감소하는 것을 관찰할 수 있었으며, 신생혈관 생성의 주요 인자인 VEGF 및 파골세포 분화를 관찰할 수 있는 RANK의 발현은 거의 관찰되지 않았다. 이러한 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 투여한 군에서 관찰되는 염증성 사이토카인, VEGF, RANK의 발현 양상은 Enbrel을 투여한 군과 유사하였으며, 이를 통하여 본 발명에 따른 TNFR2-IL21R 융합 단백질이 관절염의 치료에 유용할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다(도 14).
<실험예 8> CIA 관절염 유발 마우스의 CII 특이적 IgG2a 생성량 측정
상기 <실험예 5>에서 이용한 CIA 관절염 유발 마우스는 제2형 교원질(Type II Collagen: CII)을 1회 투여하여 면역화하였다. 그 후, 본 발명에 따른 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 주 3회씩 3주간, 총 9회에 걸쳐서 주입하였다. 이렇게 주입하는 과정에 따라, 혈액 중 CII의 함량의 변화를 측정하였다.
DAB 마우스에 complete Freund’s adjuvant (CFA)와 동량으로 섞어준 제2형 교원질(Type II Collagen: CII) 100 ㎍을 꼬리에 주사한 후, 1주일 뒤 본 발명에 따른 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 3주에 걸쳐 총 9회 주입하였다. 그 과정 중, TNFR2-IL21R 융합 단백질을 주입하기 전(0회), 첫 번째 주입 후, 여섯 번째 주입후, 및 마지막 주입 후 6시간에서 12시간 이내에, 마우스의 눈에서 혈액을 체혈하여 혈청을 획득하였다. CII-specific IgG2a의 양을 측정하기 위해, CII 항체를 1:1,000으로 희석하여 96 웰 플레이트에 코팅하여 2시간 반응시켰다. 코팅버퍼를 제거한 후, IgG 블로킹 버퍼(blocking buffer)를 웰당 200 ㎕씩 넣고, 상온에서 1시간동안 반응시켰다. 그 후, 실험군 및 대조군의 혈청을 희석하여 50 ㎕씩 넣고 상온에서 1시간 반응시켰다. IgG 워싱 버퍼(washing buffer)로 5회 세척한 후, anti-mouse IgG HRP를 1:75,000으로 희석하여 웰당 50 ㎕씩 넣고 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, IgG워싱 버퍼로 5회 세척한 후, TMB 기질 용액(substrate solution)과 반응시킨 후, 색 변화를 1N H2SO4를 이용하여 정지시킨 후, ELISA 리더기를 사용하여 450nm 파장에서 O.D를 측정하였다.
그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이 어떠한 Fc 융합단백질도 주입되지 않은 CIA 관절염 유발 마우스에서는 시간에 따른 CII-특이적 IgG2a의 양에 변화가 관찰되지 않았으나, TNFR2-IL21R 융합 단백질을 주입한 군에서는 주입 횟수가 증가할 수록 CII-특이적 IgG2a의 양이 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, Enbrel 주입군에서도 1차 주입 후의 측정된 O.D 값이 주입 전에 비하여 약간 증가한 듯 관찰되지만, enbrel 추가 주입 후 생성이 감소되는 경향을 나타냈다(도 15).
<실험예 9> CIA 관절염 유발 마우스의 비장의 Th17 및 Treg 발현량 측정
본 발명에 따른 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 주입한 CIA 관절염 유발 마우스의 Th17과 Treg인자에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 <실험예 5>에서 이용한 마우스의 비장 조직을 채취하여 Th17(CD4+IL-17+)인 세포 및 Treg(CD4+CD25+Foxp3+)인 세포를 공초점 염색을 통하여 관찰하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 5> CIA 관절염 유발 마우스의 비장을 채취하여 OCT 화합물로 포매 시킨 후, 액화질소를 이용하여 급속 냉각시킨 조직을 냉동 절편기를 이용하여 7 μm 두께로 슬라이드에 부착하였다. 슬라이드에 부착한 절편을 아세톤으로 고정 후 10% 정상 염소 혈청으로 30분 간 비특이적 반응을 차단시켰다. Treg 마커인 CD4, CD25, Foxp3의 염색은 각각 PE-표지된 항-CD4 항체, 알로피코시아닌 (Allophycocyanin)-표지된 항-CD25 항체(Biolegend), FITC-표지된 항-Foxp3 Ab항체를 이용하여 수행하였고, Th17 마커인 CD4, IL-17은 바이오티닐화 항-CD4 항체(BD Biosciences), PE-표지된 항-IL-17 항체를 사용하였다. 상기 항체들을 PBS(pH 7.5)에 1:100의 비율로 희석한 후, 상기 슬라이드에 부착된 조직과 4℃에서 하룻밤 반응시키고, 다음날 바이오티닐화 항-CD4 항체를 이용한 조직에는 추가로 스트렙타비딘(streptavidin) cy-3을 상온에서 2시간동안 반응시켰다. PBS를 이용하여 3회 세척한 후, 염색된 조직을 공초점 현미경(LSM 510 Meta. Zeiss, Gottingen, Germany)을 이용하여 관찰하였다.
그 결과, 도 16에 나타난 바와 같이, CIA 관절염 유발 마우스에 본 발명에 따른 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 주입한 마우스의 비장 조직에서 Foxp3+인 세포의 수가 아무것도 주입하지 않은 CIA 관절염 마우스에 비하여 중가하는 것을 관찰할 수 있었으나, 반면 CD4+IL-17+인 Th17의 발현의 경우, TNFR2-IL21R 융합 단백질 또는 Enbrel을 주입한 군에서에서 아무것도 주입하지 않은 CIA 관절염 마우스에 비하여 발현이 감소된 것을 관찰할 수 있었다(도 16).
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제조예를 제시한다.
<제조예 1> 약학적 제제의 제조
<1-1> 산제의 제조
TNFR2-IL21R 융합 단백질 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<1-2> 정제의 제조
TNFR2-IL21R 융합 단백질 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<1-3> 캡슐제의 제조
TNFR2-IL21R 융합 단백질 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<1-4> 환의 제조
TNFR2-IL21R 융합 단백질 1 g
유당 1.5 g
글리세린 1 g
자일리톨 0.5 g
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1 환 당 4 g이 되도록 제조하였다.
<1-5> 과립의 제조
TNFR2-IL21R 융합 단백질 150 ㎎
대두 추출물 50 ㎎
포도당 200 ㎎
전분 600 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.
상기에서 보는 바와 같이 본 발명의 TNFR2-IL21R 융합 단백질은 자가 면역 질환의 하나인 자가 면역 관절염의 주요 병인 Th17 세포의 염즘성 사이토카인 IL-17의 분비를 억제시키며, Treg 세포에서 발현되는 FoxP3의 발현 증가와, 항염증성 사이토카인 IL-10의 분비가 증가시키고, 파골 세포의 분화와 cathespin K의 발현을 억제하며, 이러한 효과는 TNFR2-Fc와 IL21R-Fc보다 TNFR2-IL21R 융합 단백질의 효과가 뛰어날 뿐만 아니라, CIA(collagen induced Arthritis) 관절염 동물 모델에 본 발명에 따른 TNFR2-IL21R 융합 단백질을 투여하였을 때, 관절의 침윤, 염증 및 연골 파괴가 완화되며, 면역 억제 세포인 Treg 세포의 발현을 증가시켜 자가 면역 관절염의 치료 효과 나타내므로, 본 발명에 따른 TNFR2-IL21R 융합 단백질은 자가 면역 질환의 예방 및 치료 효과를 갖는 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (16)

  1. TNFR2(Tumor necrosis factor receptor type 2) 단백질 또는 상기 TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편과 IL21R(Interleukin-21 receptor) 단백질 또는 상기 IL21R의 세포외 영역을 포함하는 단편이 연결된 융합 단백질.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 200 ~ 250개의 아미노산으로 구성된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  4. 제 1항에 있어서, TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 2번의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  5. 제 1항에 있어서, TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열 중 N 말단으로부터 23번 ~ 179번을 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  6. 제 1항에 있어서, IL21R의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 3번의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  7. 제 1항에 있어서, IL21R의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열 중 N 말단으로부터 21번 ~ 231번을 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  8. 제 7항의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  9. 제 8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
  10. 제 9항의 발현 벡터를 숙주세포에 형질전환시킨 형질 전환체.
  11. 제 1항의 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 자가 면역 질환 예방 및 치료용 조성물.
  12. 제 11항에 있어서, 자가 면역 질환은 악성빈혈, 제1형 당뇨, 자가 면역 관절염, 루프스, 다발성 경화증, 반응성 관절염 및 피부근염으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 자가 면역 질환은 자가 면역 관절염인 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 약학적으로 유효한 양의 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 자가 면역 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가 면역 질환 치료방법.
  15. 약학적으로 유효한 양의 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가 면역 질환 예방방법.
  16. 자가면역 질환 예방 및 치료용 의약으로 사용하기 위한 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 융합 단백질.
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