JP5706959B2 - 自己免疫疾患を予防および治療するためのＴＮＦ−αおよびＩＬ−２１の二重拮抗剤 - Google Patents

Description

本発明は、ＴＮＦ−αとＩＬ−２１に対する二重拮抗剤を含む自己免疫疾患予防及び治療用組成物に関するものである。

免疫系は、有害な外部物質である抗原から身体を保護する役割をする。このような抗原の種類としては、バクテリア、ウイルス、毒素、癌細胞と他人あるいは動物の血液や組織がこれに該当する。免疫系は、このような有害な物質を破壊するために抗体を産生する。しかし、免疫系に異常が生じた場合、免疫系は自己の健康な身体の臓器と有害な抗原を区分することができずに、正常な組織を破壊するようになる。このような反応を自己免疫疾患と呼ぶ。このような反応は、アレルギーのように過敏反応を示すが、アレルギーの場合は身体に害にならない外部物質に対して反応をする一方、自己免疫に異常が生じた場合には身体の正常な組織を対象に反応が起きるようになる。免疫系が身体の臓器と抗原を区分することができなくなる原因は確かではないが、バクテリアのような微生物または薬物が、自己免疫疾患にかかりやすい遺伝子を持って生まれた人々に病気を誘発するのであるという仮説がある。

自己免疫疾患の種類には、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アジソン病、１型糖尿病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、シェーグレン症侯群、エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、反応性関節炎、グレーヴズ病及びセリアック病などがある。

自己免疫反応の治療は、自己免疫反応を調節して、損傷した免疫機能を回復させることを目的に行なわれ、多様な自己免疫疾患の種類によって治療方法に差がある。例えば、血液に問題が起きた場合には輸血をしなければならないし、骨、関節あるいは筋肉に問題が起きた場合には運動あるいは他の機能的な治療を受けなければならない。また、免疫系の反応を調節するために薬物が処方される。このような薬物は免疫抑制薬と呼ばれ、コルチコステロイド薬物であるプレドニゾン(prednisone)と、非ステロイド性薬物であるシクロホスファミド(cyclophosphamide)、アザチオプリン(azathioprine)、及びタクロリムス(tacrolimus)などがある。

自己免疫疾患の一つである関節リウマチ(rheumatoid arthritis, RA)は、全世界の人口の約１％にあたる２，１００万人が罹患するにもかかわらず、いまだに発病原因が知られていない。関節リウマチは、その病的症状が主に可動関節に対称的に現れる全身性慢性炎症的所見を示し、ひどい場合は関節の不全にまで至る深刻な疾患である。また、自己免疫異常によって、関節の炎症及び疼痛だけでなく、関節の周囲組織、さらに肺、皮膚、および目を含む全身の臓器において疼痛および骨粗鬆症を伴って多大な生活の質の低下をもたらし、正常な日常生活を不可能にさせる。

関節リウマチの治療は、過去には生活習慣の改善や、手術、治療剤の服用で発病の速度を緩めたり、疼痛を減らしたりし、感染の抑制及び治療に重点を置いて、関節の機能が向上することについては期待していなかったが、近来になっては関節の機能的な回復と、さらには完治を目標に治療を行っており、それはこの１０年間の関節リウマチの治療において、画期的な治療法である抗ＴＮＦ拮抗剤の開発によって可能になった。

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、多面発現性サイトカインとして、炎症性反応だけではなく免疫系の重要な役割を担当し、関節リウマチの関節及びクローン病者の結腸から発見され、また骨破壊過程で重要な役割をすることが報告された。したがって、治療剤は病因として作用するＴＮＦの作用を抑制するために、ＴＮＦスーパーファミリーに属するリガンドと結合して信号伝達を妨害するか、あるいはＴＮＦリガンドと受容体間の結合を妨害する役割を遂行するように調整された。ＴＮＦ信号伝達を抑制するために、ＴＮＦリガンドに対する単一抗体を用いる方法と合成タンパク質を用いる方法で開発が行われた。インフリキシマブ(infliximab)（レミケード(Remicade)）またはアダリムマブ(adalimumab)（フミラ(Humira)）のように単一抗体の方式で治療をする方法と、ＣＴＬＡ−４ Ｉｇとエントラセプト(entracept)（エンブレル(Enbrel)）のような合成タンパク質を用いたりする。インフリキシマブ、エントラセプト、アダリムマブは、関節リウマチ治療剤として初めて認証を受けた生物学的治療剤で、この１０年間の臨床で高い効能を示して治療剤として活用されてきた。ＴＮＦ以外の他のサイトカインをターゲットとした治療剤の開発も行なわれ、インターロイキンを抑制するＤＭＡＲＤ(disease-modyfying anti-rheumatic drugs)として、ＩＬ−６あるいはＩＬ−１をターゲットに開発中であるが、ＴＮＦ治療剤よりすぐれた効果が示されていないのが実情である。

このような抗ＴＮＦ治療剤は高い効能にもかかわらず、克服しなければならない多くの問題点がある。治療の副作用として、抗ＴＮＦ治療剤の投与を受けることで、ＴＮＦの機序が停止してそれによって、免疫系の機能異常によって真菌あるいは細菌の感染の危険が高くなり、特に潜伏中の肺結核の再発の危険性を高める。脱髄疾患で多発性硬化症、あるいは血液癌につながる危険が知られていて、リウマチ学会によると、抗ＴＮＦ治療剤の投与を受けた関節リウマチ患者等の場合、既存の治療剤を受けた場合に比較して皮膚癌が発病する可能性が高いという報告がある。

また、関節リウマチ治療剤の効果は、すべての患者に現れるものではなく、治療を受けた患者の３分の２に治療の効果があり、３分の１の場合は効果が現れない。これは患者の病歴によって、あるいは遺伝的な要因にしたがって治療に限界があることを確認させるものである。なおかつ病気による疼痛だけではなく、治療剤の投与を受けた時に誘発され得る副作用と、安全性に対する問題は解決されなければならない問題である。関節リウマチを有している妊婦の場合、抗ＴＮＦ治療剤の投与を受ける場合、胎児の安全性に対する問題が論議されて来た。併せて、患者によって治療剤の効能と副作用を予測することができる診断学的な問題が課題として残っている。

インターロイキン（ＩＬ）は、サイトカインの一種で、赤血球細胞間の化学信号の役割を遂行する。ＩＬ−２が、ＦＤＡによって１９９２年に末期肝臓癌の治療に承認された時、癌を治療するのに使用された最初の単一免疫治療剤であった。その後、ＩＬ−２の場合、転移性黒色腫にも使用された。ＩＬ−２一つで癌を治療するのに使用されたり、ワクチンとともに治療されたりした。ＩＬ−２は、免疫系を助けて細胞が早く成長して分裂するようにする。しかし、ＩＬ−２を用いた治療は風邪に似た悪寒、熱、疲労及び錯乱症状のような副作用を示した。ＩＬ−２ファミリーに属するＩＬ−１５とＩＬ−２１も癌治療剤として単一剤あるいは補助剤として研究されている。

ＩＬ−２１は、αヘリックス(α-helix)構造を有するサイトカインの一種で、ＩＬ−２１の受容体とγチェーン(γ-chain)を用いた信号伝達過程を通じて炎症性反応を起こす。ＩＬ−２１は、骨髄からのＮＫ細胞前駆体の成熟を誘導することが報告され（非特許文献１）、特に、ＮＫ細胞のサイトカイン生成能力と細胞死滅能力のような効果機能を増加させることが報告された（非特許文献２、３）、ＣＤ８＋Ｔ細胞の効果機能も増加させることで、内在、適応免疫系の抗癌反応を促進させることが報告された（非特許文献４、５）。また、ヒトの末梢血液から分離したＮＫ細胞を活性化させて（非特許文献６）、臍帯血から分離した造血幹細胞から成熟したＮＫ細胞を誘導するのに重要な役割をすることが報告された（非特許文献７）。

そこで、本発明者らは既存の抗ＴＮＦ治療剤に使用されている単一拮抗剤が有している安全性と効能性の短所を克服することができる新しい自己免疫疾患の治療剤を開発しようと、ＴＮＦ−αとＩＬ−２１に対する拮抗作用をするＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を製作して、ＩＬ−２１、ＩＬ−１７のような炎症性サイトカイン及びＲＯＲｃの発現減少、炎症性サイトカインＩＬ−１７の分泌が減少して、ＦｏｘＰ３の発現と抗炎症性サイトカインＩＬ−１０タンパク質分泌量が増加することを確認し、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質の破骨細胞分化抑制とカテプシン(cathespin)Ｋの発現減少を確認し、このような減少が、ＴＮＦＲ２−Ｆｃ、ＩＬ２１Ｒ−Ｆｃを処理した時より、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を処理した時にさらに減少して、同時にＣＩＡ関節炎誘発マウスにおいて、本発明によるＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質の関節炎治療効果のみならず、免疫抑制細胞であるＴｒｅｇ細胞の発現を増加させて関節リウマチの治療効果を確認することによって、本発明によるＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質の関節リウマチの治療剤としての可能性を確認して、本発明を完成した。

Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋ Ｊ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，２０００年，第４０８巻，ｐ．５７−６３ Ｓｔｒｅｎｇｅｌｌ Ｍ．ら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３年，第１７０巻，ｐ．５４６４−５４６９ Ｂｒａｄｙ Ｊ．ら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００４年，第１７２巻，ｐ．２０４８−２０５８ Ｔａｋａｋｉ Ｒ．ら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００５年，第１７５巻，ｐ．２１６７−２１７３ Ｍｏｒｏｚ Ａ．ら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４年，第１７３巻，ｐ．９００−９０９ Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋ Ｊ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，２０００年，第４０８巻，ｐ．５７−６３ Ｓｏｎｉａ Ａ．Ｐ．ら，Ｉｎｔ．ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００６年，第１８巻，ｐ．４９−５８

本発明の目的は、ＴＮＦ−αとＩＬ−２１に対して二重拮抗剤の役割をする、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を有効成分として含む自己免疫疾患予防及び治療用組成物を提供することである。

前記の目的を達成するために、本発明は、ＴＮＦＲ２(Tumor necrosis factor receptor type2)タンパク質またはＴＮＦＲ２の細胞外領域を含む断片とＩＬ２１Ｒ(Interleukin-21 receptor)タンパク質またはＩＬ２１Ｒの細胞外領域を含む断片が連結された融合タンパク質を提供する。

また、本発明は、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。

また、本発明は、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。

また、本発明は、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主細胞に形質転換させた形質転換体を提供する。

また、本発明は、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を有効成分として含む、自己免疫疾患予防及び治療用組成物を提供する。

また、本発明は、薬学的に有効な量のＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を自己免疫疾患にかかった個体に投与する工程を含む、自己免疫疾患の治療方法を提供する。

また、本発明は、薬学的に有効な量のＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を個体に投与する工程を含む、自己免疫疾患の予防方法を提供する。

同時に、本発明は、自己免疫疾患の予防及び治療用医薬に用いるための本発明による融合タンパク質を提供する。

本発明は、自己免疫疾患の一つである関節リウマチの病因として知られたＴＮＦ−αとＩＬ−２１に対して、拮抗作用をするＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を有効成分として含む組成物として、ＴＮＦＲ２−ＦｃとＩＬ２１Ｒ−ＦｃよりＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質が炎症性サイトカインの分泌を抑制して、抗炎症性サイトカインの生成を増加させて、破骨細胞の分化を防ぐのに顕著な効能を示すだけでなく、ＣＩＡ関節炎誘発マウスモデルで関節浸潤、炎症及び軟骨破壊を緩和させる効果を示して、免疫抑制細胞であるＴｒｅｇ細胞の発現を増加させて関節リウマチの治療効果を示すので、本発明によるＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質は、自己免疫疾患の予防及び治療効果を有する組成物の有効成分として有用に使用することができる。
[本発明1001]
ＴＮＦＲ2（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ2）タンパク質または該ＴＮＦＲ2の細胞外領域を含む断片が、ＩＬ21Ｒ（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−21 ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質または該ＩＬ21Ｒの細胞外領域を含む断片に連結されている、融合タンパク質。
[本発明1002]
配列番号1で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、本発明1001の融合タンパク質。
[本発明1003]
200〜250個のアミノ酸からなることを特徴とする、本発明1001の融合タンパク質。
[本発明1004]
ＴＮＦＲ2の細胞外領域を含む断片が、配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、本発明1001の融合タンパク質。
[本発明1005]
ＴＮＦＲ2の細胞外領域を含む断片が、配列番号2で表されるアミノ酸配列のＮ末端から23〜179番目のアミノ酸残基を含むポリペプチドである、本発明1001の融合タンパク質。
[本発明1006]
ＩＬ21Ｒの細胞外領域を含む断片が、配列番号3で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、本発明1001の融合タンパク質。
[本発明1007]
ＩＬ21Ｒの細胞外領域を含む断片が、配列番号3で表されるアミノ酸配列のＮ末端から21〜231番目のアミノ酸残基を含むポリペプチドである、本発明1001の融合タンパク質。
[本発明1008]
本発明1007の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[本発明1009]
本発明1008のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
[本発明1010]
本発明1009の発現ベクターで宿主細胞を形質転換させて調製した形質転換体。
[本発明1011]
本発明1001の融合タンパク質を有効成分として含む、自己免疫疾患予防及び治療用組成物。
[本発明1012]
自己免疫疾患が、悪性貧血、1型糖尿病、自己免疫性関節炎、ループス、多発性硬化症、反応性関節炎、及び皮膚筋炎からなる群から選択される、本発明1011の組成物。
[本発明1013]
自己免疫疾患が自己免疫性関節炎である、本発明1012の組成物。
[本発明1014]
薬学的に有効な量の本発明1001〜本発明1007のいずれかの融合タンパク質を、自己免疫疾患にかかった個体に投与する工程を含む、自己免疫疾患治療方法。
[本発明1015]
薬学的に有効な量の本発明1001〜本発明1007のいずれかの融合タンパク質を、個体に投与する工程を含む、自己免疫疾患予防方法。
[本発明1016]
自己免疫疾患予防及び治療に用いるための本発明1001〜本発明1007のいずれかの融合タンパク質。

発現ベクターｐＹＫ６０２−ＨＩＳ−ＦｃにＩＬ２１Ｒ遺伝子がクローニングされたＩＬ２１Ｒ−Ｆｃの構造を示す図である。 発現ベクターｐＹＫ６０２−ＨＩＳ−ＦｃにクローニングされたＩＬ２１Ｒ−Ｆｃが発現したことを確認したウエスタンブロットと、発現したタンパク質をプロテインＡビーズを用いて精製した後、ＨＩＳ抗体を用いたウエスタンブロットの結果を示した図である。 発現ベクターｐＹＫ６０２−ＨＩＳ−ＦｃにＴＮＦＲ２遺伝子がクローニングされたＴＮＦ−α単一拮抗剤の構造を示す図である。 発現ベクターｐＹＫ６０２−ＨＩＳ−ＦｃにクローニングされたＴＮＦＲ２−Ｆｃ単一拮抗剤が発現したことを確認したウエスタンブロットと、発現したタンパク質をプロテインＡビーズを用いて精製した後、ＨＩＳ抗体を用いたウエスタンブロットの結果を示した図である。 ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を発現させる発現ベクターを製造するためのＰＣＲプライマーの構造を示したものである。 発現ベクターｐＹＫ６０２−ＨＩＳ−ＦｃにＩＬ２１Ｒ遺伝子とＴＮＦＲ２遺伝子が一緒にクローニングされたＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質の構造を示す図である。 発現ベクターｐＹＫ６０２−ＨＩＳ−ＦｃにクローニングされたＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質の発現を確認したウエスタンブロットの結果を示した図である。 精製したＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質とそのリガンドであるＴＮＦ−αとＩＬ−２１との結合力を測定した図である。 Ｔｈ１７細胞の分化過程にＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を処理した後、ＩＬ−２１、ＩＬ−１７、ＲＯＲｃ、βアクチンの発現を確認したＲＴ−ＰＣＲ結果と、Ｔｈ１７細胞の分化過程でＴＮＦＲ２−Ｆｃ、ＩＬ２１Ｒ−Ｆｃ及びＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を処理した時、分泌する炎症性サイトカインＩＬ−１７の量を示したグラフである。 Ｔｈ１７細胞の分化過程でＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を処理した後、ＦｏｘＰ３の発現と、分泌する抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の量を示すグラフである。 ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質の破骨細胞分化の抑制を示した図である。 本発明によるＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質のＣＩＡ関節炎誘発マウスの関節炎治療効果を確認したグラフである：図１２のＡは、ＣＩＡ関節炎誘発マウスに本発明によるＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質またはエンブレルを投与した時に観察される臨床スコアを示したグラフである；↑：ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質またはエンブレルを投与した時期；関節炎：ＣＩＡ(collagen induced Arthritis)関節炎動物モデルに何も投与しない陰性対照群；ＩＬ２１Ｒ／ＴＮＦＲ２−Ｆｃ：ＣＩＡ関節炎動物モデルにＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を投与した群；エンブレル：ＣＩＡ関節炎動物モデルに関節炎治療剤であるエンブレルを投与した群；図１２のＢは、ＣＩＡ関節炎誘発マウスに本発明によるＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質またはエンブレルを投与した時に観察される発生率を示したグラフである；↑：ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質またはエンブレルを投与した時期；関節炎：ＣＩＡ関節炎動物モデルに何も投与しない陰性対照群；ＩＬ２１Ｒ／ＴＮＦＲ２−Ｆｃ：ＣＩＡ関節炎動物モデルにＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を投与した群；及びエンブレル：ＣＩＡ関節炎動物モデルに関節炎治療剤であるエンブレルを投与した群。 免疫組織化学染色法を通じた、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質のＣＩＡ関節炎誘発マウスの関節炎緩和効果を確認した図である：ＣＩＡ：ＣＩＡ関節炎動物モデルに何も投与しない陰性対照群；ＩＬ２１Ｒ／ＴＮＦＲ２−Ｆｃ：ＣＩＡ関節炎動物モデルにＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を投与した群；及びエンブレル：ＣＩＡ関節炎動物モデルに関節炎治療剤であるエンブレルを投与した群。 免疫組織化学染色法を通じた、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質のＣＩＡ関節炎誘発マウスの炎症減少を確認した図である：ＣＩＡ：ＣＩＡ関節炎動物モデルに何も投与しない陰性対照群；ＩＬ２１Ｒ／ＴＮＦＲ２−Ｆｃ：ＣＩＡ関節炎動物モデルにＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を投与した群；及びエンブレル：ＣＩＡ関節炎動物モデルに関節炎治療剤であるエンブレルを投与した群。 ＣＩＡ関節炎誘発マウスのＣＩＩ特異的ＩｇＧ２ａ生成量を測定したグラフである：０：ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質またはエンブレルを投与する前；１ｓｔ：ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質またはエンブレルを１回投与；６ｔｈ：ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質またはエンブレルを６回投与；９ｔｈ：ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質またはエンブレルを９回投与；ＣＩＡ：ＣＩＡ関節炎動物モデルに何も投与しない陰性対照群；ＩＬ２１Ｒ／ＴＮＦＲ２−Ｆｃ：ＣＩＡ関節炎動物モデルにＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を投与した群；及びエンブレル：ＣＩＡ関節炎動物モデルに関節炎治療剤であるエンブレルを投与した群。 免疫染色法を通じた、ＣＩＡ関節炎誘発マウスの脾臓のＴｈ１７及びＴｒｅｇ細胞発現量を測定した図である：ＣＩＡ：ＣＩＡ関節炎動物モデルに何も投与しない陰性対照群；ＩＬ２１Ｒ／ＴＮＦＲ２−Ｆｃ：ＣＩＡ関節炎動物モデルにＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を投与した群；及びエンブレル：ＣＩＡ関節炎動物モデルに関節炎治療剤であるエンブレルを投与した群。

以下、本発明を詳しく説明する。

本発明は、ＴＮＦＲ２(Tumor necrosis factor receptor type 2)タンパク質またはＴＮＦＲ２の細胞外領域を含む断片とＩＬ２１Ｒ(Interleukin-21 receptor)タンパク質またはＩＬ２１Ｒの細胞外領域を含む断片が連結された融合タンパク質を提供する。

前記ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質において、ＴＮＦＲ２の細胞外領域を含む断片は配列番号２のアミノ酸の２３番〜１７９番を含むポリペプチドであることが好ましいが、これに限定されない。ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質において、ＩＬ２１Ｒの細胞外領域を含む断片は、配列番号３のアミノ酸の２１番〜２３１番を含むポリペプチドであることが好ましいが、これに限定されない。ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質において、前記融合タンパク質は配列番号１で表されるアミノ酸配列を有することが好ましいが、これに限定されない。また、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質は、２００〜２５０個のアミノ酸からなるものが好ましいが、これに限定されない。

また、前記ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質は、抗体の重鎖の不変領域ドメインに由来した断片を含むことが好ましいが、これに限定されない。ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質に含まれるＦｃドメインは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭからなる群から選択されることが好ましく、より好ましくはＣＨ２とＣＨ３不変ドメイン全体または一部を含むことが好ましいが、これに限定されない。

また、前記ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質は、ＴＮＦＲ２、ＩＬ２１Ｒの細胞外水溶性ドメインのカルボキシル−及びアミノ−末端に抗体の重鎖の不変領域ドメイン領域全体または一部を含むことが好ましいが、これに限定されない。ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質は、少なくとも２つの等価な抗体重鎖の不変領域ドメインを有する形態を含むことが好ましいが、これに限定されない。このような二つのＦｃ重鎖は、ジスルフィド結合または他の共有結合で連結されたものが好ましいが、これに限定されない。ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質のＴＮＦＲ２、ＩＬ２１Ｒ部分は、少なくとも２つの等価なＴＮＦＲ２、ＩＬ２１Ｒの細胞外水溶性ドメイン領域を有する形態を含むことが好ましいが、これに限定されない。

本発明のＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒの融合タンパク質は、下記の工程を含む方法によって製造されることが好ましいが、これに限定されない：
１）ＤＮＡライブラリーを鋳型にして、ＩＬ２１Ｒプライマーを用いてＰＣＲ（重合酵素連鎖反応）を遂行する工程；
２）ＤＮＡライブラリーを鋳型にして、ＴＮＦＲ２プライマーを用いてＰＣＲを遂行する工程；
３）工程１）と工程２）のＰＣＲ産物を鋳型にして、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒの融合遺伝子をコードするプライマーを用いてＰＣＲを遂行する工程；
４）工程４）のＰＣＲ産物を制限酵素で切断する工程；
５）ｐＹＫ−６０２−ＨＩＳ−Ｆｃ発現ベクターを制限酵素で切断する工程；
６）工程４）と工程５）の制限酵素で切断したプラスミドをライゲーションする工程；
７）工程６）のライゲーション反応が完了したＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を形質転換する工程；
８）工程７）の形質転換後、ＬＢプレートに接種する工程；
９）工程８）の生成されたコロニーを用いたＰＣＲを遂行する工程；
１０）工程９）で確認されたＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒの融合タンパク質を２９３Ｅ細胞にトランスフェクションさせる工程；
１１）工程１０）の２９３Ｅ細胞で発現したＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を細胞培養液から精製する工程；
１２）工程１１）の精製されたＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質の細胞毒性を除去する工程；及び
１３）工程１２）の精製されたＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質の結合能力を確認する工程。

本発明の製造方法において、ベクターの製造はＤＮＡライブラリーからＰＣＲを用いて遂行することが好ましく、ＤＮＡライブラリーは、肝臓、胎盤、膵臓及び肝組織で製造されたものを用いることが好ましいが、これに限定されない。

また、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。

また、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。

発現ベクターは、ｐＹＫ６０２−ＨＩＳ−Ｆｃが好ましいが、これに限定されない。

また、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主細胞に形質転換させた形質転換体を提供する。

形質転換体は、Ｅ．ｃｏｉｌのＤＨ５αであることが好ましいが、これに限定されない。

本発明の具体的な実施例で、ｐＹＫ６０２−ＨＩＳ−Ｆｃ発現ベクターにＩＬ２１ＲとＴＮＦＲ２をサブクローニングするために、ＰＣＲを行なってＩＬ２１Ｒ遺伝子と、ＴＮＦＲ２遺伝子を増幅した。増幅されたそれぞれのＰＣＲ産物をｐＹＫ６０２−ＨＩＳ−Ｆｃ発現ベクターにライゲーションして、ＴＮＦＲ２−Ｆｃ及びＩＬ２１Ｒ−Ｆｃを構築した（図１及び図３参照）。構築したＴＮＦＲ２−ＦｃとＩＬ２１Ｒ−Ｆｃを２９３Ｅ細胞にトランスフェクションさせた後、生成されるタンパク質と、これを精製したタンパク質（ＩＬ−２１単一拮抗剤）をウエスタンブロットを用いて確認した（図２及び図４参照）。

また、ＤＮＡライブラリー混合（腎臓、胎盤、膵臓及び肝臓の混合）を鋳型にしてＩＬ２１ＲとＴＮＦＲ２遺伝子をＰＣＲを行なって増幅させた。ＩＬ２１ＲとＴＮＦＲ２の融合された遺伝子を増幅するためのプライマーを製作した後（図５参照）、増幅された産物を鋳型にして、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質（ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２１二重拮抗剤）をコードする遺伝子をＰＣＲを用いて増幅した。増幅されたＰＣＲ産物をｐＹＫ６０２−ＨＩＳ−Ｆｃ発現ベクターにライゲーション反応を通じて、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質発現ベクターを構築した（図６及び図７参照）。

併せて、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質のリガンド中の一つであるＴＮＦ−αとの結合力を調べるために、結合程度を確認する実験を行なって、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質がＴＮＦ−αとＩＬ−２１に対して高い結合力を有していることを確認した（図８参照）。

また、本発明は、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を有効成分として含む自己免疫疾患の予防及び治療用組成物を提供する。

前記ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質において、ＴＮＦＲ２の細胞外領域を含む断片は、配列番号２のアミノ酸の２３番〜１７９番を含むポリペプチドであることが好ましいが、これに限定されない。ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質において、ＩＬ２１Ｒの細胞外領域を含む断片は配列番号３のアミノ酸の２１番〜２３１番を含むポリペプチドであることが好ましいが、これに限定されない。ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質において、前記融合タンパク質は配列番号１で表されるアミノ酸配列を有することが好ましいが、これに限定されない。また、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質は、２００〜２５０個のアミノ酸からなることが好ましいが、これに限定されない。

また、前記ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質は、抗体の重鎖の不変領域ドメインに由来した断片を含むことが好ましいが、これに限定されない。ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質に含まれるＦｃドメインは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭからなる群から選択されることが好ましく、より好ましくはＣＨ２とＣＨ３不変ドメイン全体または一部を含むことが好ましいが、これに限定されない。

また、前記ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質は、ＴＮＦＲ２、ＩＬ２１Ｒの細胞外水溶性ドメインのカルボキシル−及びアミノ−末端に抗体の重鎖の不変領域ドメイン領域全体または一部を含むことが好ましいが、これに限定されない。ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質は、２当量以上の抗体の重鎖の不変領域ドメインを有する形態を含むことを特徴とすることが好ましいが、これに限定されない。このような二つのＦｃ重鎖は、ジスルフィド結合または他の共有結合で連結されたものが好ましいが、これに限定されない。ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質のＴＮＦＲ２、ＩＬ２１Ｒ部分はまた、２当量以上のＴＮＦＲ２、ＩＬ２１Ｒの細胞外水溶性ドメインの領域を有する形態を含むことが好ましいが、これに限定されない。

前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、ループス、重症筋無力症、強直性脊柱炎、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、潰瘍性大腸カタル、クローン病、心臓弁膜症、多発性硬化症、全身性強皮症、自己免疫性肝炎からなる群から選択されるいずれか一つであることが好ましく、関節リウマチであることがさらに好ましいが、これに限定されない。

本発明の具体的な実施態様において、Ｔｈ１７細胞に＜実施例＞を通じて構築されたＴＮＦＲ２−Ｆｃ、ＩＬ２１Ｒ−Ｆｃ及びＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を処理した結果、炎症性サイトカインであるＩＬ−２１、ＩＬ−１７及びＲＯＲｃ転写因子の発現がＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を処理した後、ＴＮＦＲ２−Ｆｃ、ＩＬ２１Ｒ−Ｆｃと比較した時、その発現がすべて顕著に減少することを確認することができた（図９参照）。また、Ｔｈ１７細胞から分泌される炎症性サイトカインは、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を処理した時、ＴＮＦＲ２−Ｆｃ、ＩＬ２１Ｒ−Ｆｃを処理した時に比較して顕著に減少することを確認することができた（図９参照）。また、ＴＮＦＲ２−Ｆｃ、ＩＬ２１Ｒ−Ｆｃ及びＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質をそれぞれ処理した後、抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０のタンパク質分泌量をＥＬＩＳＡ法を用いて測定した結果、ＦｏｘＰ３の発現とＩＬ−１０タンパク質の分泌量がＴＮＦＲ２−Ｆｃ、ＩＬ２１Ｒ−Ｆｃに比較して、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を処理した時さらに増加することを確認することができた（図１０参照）。併せて、ＴＮＦＲ２−Ｆｃ、ＩＬ２１Ｒ−Ｆｃ及びＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を処理した後、破骨細胞分化の分化が抑制されることをＴＲＡＰ染色とカテプシンＫの発現増加を通じて確認することができた（図１１参照）。

また、本発明の具体的な実施例で、本発明によるＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質の生体内関節炎治療効果を確認するために、ＣＩＡ関節炎誘発マウスモデルを製造して、マウスモデルに本発明によるＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を投与した結果、関節炎治療効果が観察され（図１２参照）、これは具体的に関節浸潤、炎症及び軟骨破壊が緩和されて（図１３参照）、炎症因子の発現が減少するだけでなく（図１４参照）、前記関節炎誘発マウスを製造するために投与されたＣＩＩ特異的ＩｇＧ２ａの生成が減少する効果を示した（図１５参照）。このような、関節炎の治療または緩和効果は、関節炎治療剤に用いているエンブレルと類似かまたは、優れていることを観察することができた。同時に、本発明によるＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を投与したＣＩＡ関節炎誘発マウスで、免疫反応に関与する脾臓組織を採取してＴｈ１７とＴｒｅｇ細胞の発現を観察した時、炎症因子を発現するＴｈ１７（ＣＤ４＋ＩＬ−１７＋）細胞の発現が減少した一方、自己免疫から保護する役割をする免疫抑制細胞であるＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）細胞の発現が増加することを観察することができた（図１６参照）。

したがって、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質は、炎症性サイトカインＩＬ−１７の生成を減少させ、このような効果はＴＮＦＲ２−ＦとＩＬ２１Ｒ−Ｆｃ単一タンパク質と比較してより顕著で、抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０の生成もまた、ＴＮＦＲ２−ＦとＩＬ２１Ｒ−Ｆｃよりさらに増加させる効果を示すのみならず、ＣＩＡ関節炎誘発マウスモデルで関節リウマチの緩和または治療効果を示すので、本発明によるＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を自己免疫疾患予防及び治療用組成物の有効成分として有用に使用することができる。

本発明によるＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質の治療的に有効な量は、多くの要素、例えば投与方法、目的部位、患者の状態などによって変化し得る。したがって、人体に使用時の投与量は、安全性及び効率性をともに考慮して適正量に決定されなければならない。動物実験を通じて決定した有効量からヒトに使用され得る量を推定することも可能である。有効量の決定時に考慮するこのような事項は、例えば、Ｈａｒｄｍａｎ ａｎｄ Ｌｉｍｂｉｒｄ，ｅｄｓ．，Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ'ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ ｅｄ．（２００１年），Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ；及びＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ．（１９９０年），Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．に記述されている。

本発明の薬学組成物はまた、生物学的製剤に通常的に使用される担体、希釈剤、賦形剤または二つ以上のこれらの組み合わせを含むことができる。薬学的に許容可能な担体は、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質の生体内送達に相応しいものなら特別に制限されず、例えば、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ，１３ｔｈ ｅｄ．，Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．Ｉｎｃ．に記載された化合物、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エチルアルコール及びそれらの成分の中で１成分以上を混合して用いることができ、必要によって抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。さらに当分野の適正な方法で、または Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ，１８ｔｈ，１９９０年）に開示されている方法を用いて、各疾患によって、または成分によって好ましく製剤化することができる。

本発明の組成物に追加で同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上含むことができる。本発明の組成物は、組成物総重量に対して前記タンパク質を０．０００１〜１０重量％で、好ましくは０．００１〜１重量％を含む。

本発明による組成物は目的とする方法によって、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）するか、経口投与することができ、投与量は患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度等によってその範囲が多様である。本発明による組成物の一日投与量は、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇであり、一日に一回ないし数回に分けて投与することがさらに好ましい。

また、本発明は、薬学的に有効な量のＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を自己免疫疾患にかかった個体に投与する工程を含む、自己免疫疾患治療方法を提供する。

また、本発明は、薬学的に有効な量のＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を個体に投与する工程を含む、自己免疫疾患予防方法を提供する。

前記ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質において、ＴＮＦＲ２の細胞外領域を含む断片は、配列番号２のアミノ酸の２３番〜１７９番を含むポリペプチドであることが好ましいが、これに限定されない。ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質において、ＩＬ２１Ｒの細胞外領域を含む断片は、配列番号３のアミノ酸の２１番〜２３１番を含むポリペプチドであることが好ましいが、これに限定されない。ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質において、前記融合タンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有することが好ましいが、これに限定されない。また、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質は、２００〜２５０個のアミノ酸からなることが好ましいが、これに限定されない。

また、前記ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質は、抗体の重鎖の不変領域ドメインに由来した断片を含むことが好ましいが、これに限定されない。ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質に含まれるＦｃドメインは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭからなる群から選択されることが好ましく、より好ましくはＣＨ２とＣＨ３不変ドメイン全体または一部を含むことが好ましいが、これに限定されない。

また、前記ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質は、ＴＮＦＲ２、ＩＬ２１Ｒの細胞外水溶性ドメインのカルボキシル−及びアミノ−末端に抗体の重鎖の不変領域ドメイン領域全体または一部を含むことが好ましいが、これに限定されない。ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質は、２当量以上の抗体の重鎖の不変領域ドメインを有する形態を含むことを特徴とすることが好ましいが、これに限定されない。このような二つのＦｃ重鎖は、ジスルフィド結合または他の共有結合で連結されたものが好ましいが、これに限定されない。ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質のＴＮＦＲ２、ＩＬ２１Ｒ部分は、２当量以上のＴＮＦＲ２、ＩＬ２１Ｒの細胞外水溶性ドメインの領域を有する形態を含むことが好ましいが、これに限定されない。

前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、ループス、重症筋無力症、強直性脊柱炎、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、潰瘍性大腸カタル、クローン病、心臓弁膜症、多発性硬化症、全身性強皮症、自己免疫性肝炎からなる群から選択されるいずれか一つであることが好ましく、関節リウマチであることがさらに好ましいが、これに限定されない。

本発明によるＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質は、炎症性サイトカインＩＬ−１７の生成を減少させ、ＴＮＦＲ２−ＦとＩＬ２１Ｒ−Ｆｃと比較した時、より有意に減少させることを確認することができ、抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０の生成をＴＮＦＲ２−ＦｃとＩＬ２１Ｒ−Ｆｃよりさらに増加させ、また破骨細胞の分化を抑制する効能がＴＮＦＲ２−ＦｃとＩＬ２１Ｒ−Ｆｃより効果的なので、自己免疫疾患の治療方法として有用に使用することができる。

本発明によるＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質の治療的に有効な量は、多くの要素、例えば投与方法、目的部位、患者の状態などによって変化し得る。したがって、人体に使用時の投与量は、安全性及び効率性をともに考慮して適正量に決定されなければならない。動物実験を通じて決定された有効量からヒトに使用する量を推定することも可能である。有効な量の決定時に考慮するこのような事項は、例えば、Ｈａｒｄｍａｎ ａｎｄ Ｌｉｍｂｉｒｄ，ｅｄｓ．，Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ'ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ ｅｄ．（２００１年）、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ；及びＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ．（１９９０年），Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．に記述されている。

本発明の薬学組成物はまた、生物学的製剤に通常的に使用される担体、希釈剤、賦形剤または二つ以上のこれらの組み合わせを含むことができる。薬学的に許容可能な担体は、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質の生体内送達に相応しいものなら特別に制限されず、例えば、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ，１３ｔｈ ｅｄ．，Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．Ｉｎｃ．に記載された化合物、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エチルアルコール及びそれらの成分の中で１成分以上を混合して用いることができ、必要によって抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。さらに当分野の適正な方法で、または Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ，１８ｔｈ，１９９０年）に開示されている方法を用いて、各疾患によって、または成分によって好ましく製剤化することができる。

本発明の組成物に追加で同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上含むことができる。本発明の組成物は、組成物総重量に対して前記タンパク質を０．０００１〜１０重量％で、好ましくは０．００１〜１重量％を含む。

組成物は目的とする方法によって、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）するか、経口投与することができ、投与量は患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度等によってその範囲が多様である。本発明による組成物の一日投与量は、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇであり、一日に一回ないし数回に分けて投与することがさらに好ましい。

同時に、本発明は、自己免疫疾患予防及び治療用医薬として用いるための本発明による融合タンパク質を提供する。

前記ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質において、ＴＮＦＲ２の細胞外領域を含む断片は、配列番号２のアミノ酸の２３番〜１７９番を含むポリペプチドであることが好ましいが、これに限定されない。ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質において、ＩＬ２１Ｒの細胞外領域を含む断片は、配列番号３のアミノ酸の２１番〜２３１番を含むポリペプチドであることが好ましいが、これに限定されない。ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質において、前記融合タンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有することが好ましいが、これに限定されない。また、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質は、２００〜２５０個のアミノ酸からなることが好ましいが、これに限定されない。

また、前記ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質は、抗体の重鎖の不変領域ドメインに由来した断片を含むことが好ましいが、これに限定されない。ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質に含まれるＦｃドメインは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭからなる群から選択されることが好ましく、より好ましくはＣＨ２とＣＨ３不変ドメイン全体または一部を含むことが好ましいが、これに限定されない。

また、前記ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質は、ＴＮＦＲ２、ＩＬ２１Ｒの細胞外水溶性ドメインのカルボキシル−及びアミノ−末端に抗体の重鎖の不変領域ドメイン領域全体または一部を含むことが好ましいが、これに限定されない。ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質は、２当量以上の抗体の重鎖の不変領域ドメインを有する形態を含むことを特徴とすることが好ましいが、これに限定されない。このような二つのＦｃ重鎖は、ジスルフィド結合または他の共有結合で連結されたものが好ましいが、これに限定されない。ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質のＴＮＦＲ２、ＩＬ２１Ｒ部分は、２当量以上のＴＮＦＲ２、ＩＬ２１Ｒの細胞外水溶性ドメインの領域を有する形態を含むことが好ましいが、これに限定されない。

前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、ループス、重症筋無力症、強直性脊柱炎、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、潰瘍性大腸カタル、クローン病、心臓弁膜症、多発性硬化症、全身性強皮症、自己免疫性肝炎からなる群から選択されるいずれか一つであることが好ましく、関節リウマチであることがさらに好ましいがこれに限定されない。

以下、本発明を実施例、実験例及び製造例によって詳しく説明する。

但し、下記の実施例、実験例及び製造例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例、実験例及び製造例に限定されるのではない。

＜実施例１＞ＩＬ２１Ｒ−Ｆｃの製造
＜１−１＞ＩＬ２１Ｒ−Ｆｃの発現ベクター製造
ＩＬ２１Ｒ−Ｆｃ発現ベクターを製造するために、腎臓、胎盤、膵臓及び肝臓の混合 ＤＮＡライブラリー（２１Ｃ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｈｕｍａｎ ＧＥＮＥ Ｂａｎｋ（韓国生命工学研究院）から購入。Ｃｌｏｎｅ ＩＤ：ｈＭＵ００７６９０，ｐｌａｔｅ Ｎｏ．ＩＲＡＨ−２４−Ａ１０，ベクター：ｐＯＴＢ７．）を鋳型に用いて、ＩＬ２１Ｒ遺伝子を発現させるための制限酵素ＳｆｉＩ配列を含む正方向プライマー（配列番号４：５'−ａｇｇｇｇｇｃｃｇｔｇｇｇｇｇｃｃｃｃｃｇａｃｃｔｃｇｔｃｔｇｃｔａｃａｃ−３'）及び逆方向プライマー（配列番号５：５'−ｔａｇｃｇｇｃｃｇａｃｇｃｇｇｃｃａａｔｔｃｃｔｔｔａａｃｔｃｃｔｃｔｇａｃｔ−３'）を用いて、遺伝子を下記の条件で増幅した後、ＳｆｉＩ制限酵素で処理した後、ｐＹＫ６０２−ＨＩＳ−Ｆｃベクターにサブクローニングした。ＰＣＲ条件は、全体反応液が５０μｌの時、鋳型は１００ｎｇになるように入れ、ｐｆｕポリメラーゼ（ゼノテック、韓国）２．５ｕｎｉｔ、正方向と逆方向プライマーをそれぞれ１０ｐｍｏｌｅ／５０μｌ入れて、残りの量を蒸留水で満たして総５０μｌの反応液を調製した後、９４℃で２分後、９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で１分を３０サイクル反復して遺伝子を増幅させた後、７２℃で１０分間反応させてＰＣＲ産物を得た。

増幅されたＰＣＲ産物及びベクターを、それぞれＳｆｉＩ制限酵素で切断して３７℃で４時間反応させた後、ゲル精製用キット（ＱＩＡＧＥＮ，＃２８７０６，米国）を用いて精製した。増幅されたＰＣＲ産物とベクターの割合を３（１５０μｇ）：１（５０μｇ）にして、１μｌ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（＃ＳＤＬ０１−Ｒ４０ｋ，Ｓｏｌｇｅｎｔ，韓国）と２μｌ １０×リガーゼバッファーを混合した後、総反応液を２０μｌにして１６℃で１６時間ライゲーションを行なった。

ライゲーションしたプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換した後、アンピシリンを含んだＬＢプレートに撤いた（spreading）後、３７℃培養器で１６時間培養させた。コロニー生成後コロニーを１０μｌアンピシリンを含んだＬＢ培地に広げた後、コロニーＰＣＲ方法を用いて、その中の４〜５μｌをＰＣＲ鋳型にして、ＰＣＲを行なって、ＩＬ２１Ｒ遺伝子がｐＹＫ６０２−ＨＩＳ−Ｆｃ発現ベクターにサブクローニングされることを確認した。

＜１−２＞ＩＬ２１Ｒ−Ｆｃの発現及び精製
２９３Ｅ細胞を、ＤＭＥＭ５００ｍｌにＦＢＳを５０ｍｌ添加した培地を用いて、１５０ｍｍプレートに７０〜８０％の面積を占める程度に細胞を植えた後、ＩＬ２１Ｒ−Ｆｃ ２０μｇとＰＥＩ ４０μｇを１：２の割合で混合して常温で２０分程度反応させた後、細胞に滴下してトランスフェクションさせた。１６〜２０時間経過後、血清が含まれていないＤＭＥＭ培地２０ｍｌと交換して、細胞の上澄み液を２〜３日に一回ずつ集めた。上澄み液を得た後、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄み液のみを新しいビンに移して精製する前まで４℃で保管した。

２０個の１５０ｍｍプレートから３日、５日、７日、９日目に集めた上澄み液総１ｌを精製した。上澄み液全体を０．２２μｍ ｔｏｐ−ｆｉｌｔｅｒ（＃ＰＲ０２８９０ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，米国）を用いてフィルターした後、５ｍｌカラムにパッキングされている５００μｌのプロテインＡビーズ（＃１７−１２７９−０３，ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）に結合させた。Ｐｅｒｉ−ｓｔａｒｔポンプを用いて０．９ｍｌ／分で４℃で一晩中結合させた後、１００ｍｌ以上のＰＢＳでカラムを洗浄して、０．１Ｍグリシン塩酸（＃Ｇ７１２６，Ｓｉｇｍａ，米国）を用いて６個の分画に分けて溶離し、１Ｍトリス（＃Ｔ−１５０３−５ＫＧ．Ｓｉｇｍａ．米国）（ｐＨ９．０）で中和させた。その次に、ＩＬ２１Ｒ−Ｆｃを定量して、ＩＬ２１Ｒ−Ｆｃの発現がある分画を２〜３個集めてアミコンウルトラ（＃ＵＦＣ８０５０２４，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，米国）を用いて濃縮した後、ＰＢＳ（＃７００１１，Ｇｉｂｃｏ，米国）で１０回程度バッファーを交換した。

その結果、図２に示されるように培養上澄み液１ｌからＩＬ２１Ｒ−Ｆｃを７４０ｎｇ／μｌで総１．０ｍｇを得た。

＜実施例２＞ＴＮＦＲ２−Ｆｃの製造
＜２−１＞ＴＮＦＲ２−Ｆｃの発現ベクター製造
ＴＮＦＲ２−Ｆｃ発現ベクターを製造するために、腎臓、胎盤、膵臓及び肝臓の混合 ＤＮＡライブラリー（２１Ｃ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｈｕｍａｎ ＧＥＮＥ Ｂａｎｋ（韓国生命工学研究院）から購入。Ｃｌｏｎｅ ＩＤ：ｈＭＵ０１３７２５，ｐｌａｔｅ Ｎｏ．ＩＲＡＵ−８６−Ｈ０９，ベクター：ｐＤＮＲ−ＬＩＢ）を鋳型に用いて、ＴＮＦＲ２遺伝子を発現させるための制限酵素ＳｆｉＩ配列を含む正方向プライマー（配列番号６：５'−ＣＡＧＧＧＧＧＣＣＧＴＧＧＧＧＧＣＣＴＴＧＣＣＣＧＣＣＣＡＧＧＴＧＧＣＡＴＴ−３'）及び逆方向プライマー（配列番号７：５'−ＴＡＧＣＧＧＣＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＡＡＴＴＣＡＧＣＴＧＧＧＧＧＧＣＴＧＧＧＧＣ−３'）を用いて遺伝子を下記の条件で増幅した後、ＳｆｉＩ制限酵素で処理した後、ｐＹＫ６０２−ＨＩＳ−Ｆｃベクターにサブクローニングした。ＰＣＲ条件は、全体反応液が５０μｌの時、鋳型は１００ｎｇになるように入れて、ｐｆｕポリメラーゼ（ゼノテック、韓国）２．５ｕｎｉｔ、正方向と逆方向プライマーをそれぞれ１０ｐｍｏｌｅ／５０μｌを入れて、残りを蒸留水で満たして総５０μｌの反応液を調製した後、９４℃で２分、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分の３０サイクル反復して遺伝子を増幅させた後、７２℃で１０分間反応させてＰＣＲ産物を得た。

増幅されたＰＣＲ産物及びベクターを、それぞれＳｆｉＩ制限酵素で切断して３７℃で４時間反応させた後、ゲル精製キットを用いて精製した。増幅されたＰＣＲ産物とベクターの割合を３（１５０μｇ）：１（５０μｇ）にして、１μｌ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼと２μｌ １０×リガーゼバッファーを混合した後、総反応液を２０μｌにして１６℃で１６時間ライゲーションを行なった。

ライゲーションしたプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換した後アンピシリンを含んだＬＢプレートに撤いた後、３７℃の培養器で１６時間培養させた。コロニー生成後、コロニーを１０μｌアンピシリンを含んだＬＢ培地に広げた後、コロニーＰＣＲ方法を用いて、その中の４〜５μｌをＰＣＲ鋳型にして、ＰＣＲを行なって、ＴＮＦＲ２遺伝子がｐＹＫ６０２−ＨＩＳ−Ｆｃ発現ベクターにサブクローニングされることを確認した。

＜２−２＞ＴＮＦＲ２−Ｆｃの発現及び精製
２９３Ｅ細胞を、ＤＭＥＭ５００ｍｌにＦＢＳを５０ｍｌ添加した培地を用いて、１５０ｍｍプレートに７０〜８０％の面積を占める程度に細胞を植えた後、ＴＮＦＲ２−Ｆｃ２０μｇとＰＥＩ４０μｇを１：２の割合で混合して常温で２０分程度反応させた後、細胞に滴下してトランスフェクションさせた。１６〜２０時間経過後、血清を含まないＤＭＥＭ培地２０ｍｌと交換して、細胞の上澄み液は２〜３日に一回ずつ集めた。上澄み液を得た後、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄み液のみを新しいビンに移して、精製する前まで４℃で保管した。

２０個の１５０ｍｍプレートから３日、５日、７日、９日目に集めた上澄み液総１ｌを精製した。全体上澄み液を０．２２μｍ ｔｏｐ−ｆｉｌｔｅｒを用いてフィルターした後、５ｍｌカラムにパッキングされている５００μｌのプロテインＡビーズに結合させた。Ｐｅｒｉ−ｓｔａｒｔポンプを用いて０．９ｍｌ／分で４℃で一晩中結合させた後、１００ｍｌ以上のＰＢＳでカラムを洗浄して０．１Ｍグリシン塩酸を用いて６個の分画に分けて溶離して、１Ｍトリス（ｐＨ９．０）で中和させた。その次に、精製したタンパク質を定量してＴＮＦＲ２−Ｆｃの発現がある分画を２〜３個集めてアミコンウルトラを用いて濃縮した後、ＰＢＳ（＃７００１１，Ｇｉｂｃｏ，米国）で１０回程度バッファーを交換した。

その結果、図４に示されるように培養上澄み液総１ｌからＴＮＦＲ２−Ｆｃを１ｍｇ／ｍｌで精製されたタンパク質１．５ｍｇを得た。

＜実施例３＞ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質の製造
＜３−１＞ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質の発現ベクター製造
ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質の発現ベクターを製造するために、腎臓、胎盤、膵臓及び肝臓の混合ＤＮＡライブラリーを鋳型に用いて、ＴＮＦＲ２を発現させるための制限酵素ＳｆｉＩ配列を含む正方向プライマー及び逆方向プライマー（配列番号８：５'−ｔａｇｃｇｇｃｃｇａｃｇｃｇｇｃｃａａｃｇｔｇｃａｇａｃｔｇｃａｔｃｃａｔｇｃ−３'）を用いてＴＮＦＲ２遺伝子を増幅して、ＩＬ２１Ｒ遺伝子を増幅させるために正方向プライマーと逆方向プライマーを下記の条件で増幅した後、二つのＰＣＲ産物を１：１の割合で混合し、総１００ｎｇで鋳型として、三種類のプライマーを用いてＰＣＲしてＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質をｐＹＫ６０２−ＨＩＳ−Ｆｃベクターにサブクローニングした。使用したＰＣＲ条件は、全体反応液が５０μｌの時、鋳型は１００ｎｇになるように入れて、ｐｆｕポリメラーゼ（ゼノテック、韓国）２．５ｕｎｉｔ、正方向と逆方向プライマーをそれぞれ１０ｐｍｏｌｅ／５０μｌ入れて、残りを蒸留水で満たして総５０μｌの反応液を調製した後、９４℃で２分後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分の３０サイクル反復して遺伝子を増幅させた後、７２℃で１０分間反応させてＰＣＲ産物を得た。

増幅されたそれぞれのＰＣＲ産物を、ＳｆｉＩ制限酵素で切断して３７℃で４時間反応させた後、ゲル精製キットを用いて精製した。増幅されたＰＣＲ産物とベクターの割合を３（１５０μｇ）：１（５０μｇ）にして、１μｌ Ｔ４ＤＮＡリガーゼと２μｌ １０×リガーゼバッファーを混合した後、総反応液を２０μｌにして１６℃で１６時間ライゲーションを行なった。

ライゲーションされたプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換した後、アンピシリンを含んだＬＢプレートに撤いた後、３７℃の培養器で１６時間培養させた。コロニー生成後、コロニーを１０μｌアンピシリンを含んだＬＢ培地に広げた後、コロニーＰＣＲ法を用いて、その中の４〜５μｌをＰＣＲ鋳型にして、ＰＣＲを行なって、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質をコードする遺伝子がｐＹＫ６０２−ＨＩＳ−Ｆｃ発現ベクターにサブクローニングされることを確認した。

＜３−２＞ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質の発現及び精製
２９３Ｅ細胞をＤＭＥＭ５００ｍｌにＦＢＳを５０ｍｌ添加した培地を用いて、１５０ｍｍプレートに７０〜８０％の面積を占める程度に細胞を植えた後、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２Ｒ融合タンパク質２０μｇとＰＥＩ４０μｇを１：２の割合で混合して常温で２０分程度反応させた後、細胞に滴下してトランスフェクションさせた。１６〜２０時間経過後、血清を含まないＤＭＥＭ培地２０ｍｌと交換して、細胞の上澄み液を２〜３日ごとに一回ずつ集めた。上澄み液を得た後、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄み液のみを新しいビンに移して精製する前まで４℃で保管した。

１０個の１５０ｍｍプレートから３日、５日、７日目に集めた上澄み液総６００ｍｌを精製した。上澄み液全体を０．２２μｍ ｔｏｐ−ｆｉｌｔｅｒを用いてフィルターした後、５ｍｌカラムにパッキングされている５００μｌのプロテインＡビーズに結合させた。Ｐｅｒｉ−ｓｔａｒｔポンプを用いて０．９ｍｌ／分で４℃で一晩中結合させた後、１００ｍｌ以上のＰＢＳでカラムを洗浄して０．１Ｍグリシン塩酸を用いて６個の分画に分けて溶離して、１Ｍトリス（ｐＨ９．０）で中和させた。その次に、精製したタンパク質を定量してＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質の発現がある分画を２〜３個集めてアミコンウルトラを用いて濃縮した後、ＰＢＳ（＃７００１１，Ｇｉｂｃｏ，米国）で１０回程度バッファーを交換した。

その結果、図７に示されるようにＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を３８０μｇ／ｍｌで、総１ｍｇを得た（図７）。

＜実験例１＞ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質とリガンドの結合力測定
＜実施例＞で製造したＴＮＦＲ２−Ｆｃ、ＩＬ２１Ｒ−Ｆｃ及びＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質とそのリガンドであるＴＮＦ−αと結合して拮抗作用するかどうかを調べるために、結合力を測定する実験を行なった。

ＥＬＩＳＡプレート（＃４３９４５４，Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いてウェル当り１００ｎｇのＴＮＦ−α（＃Ｃ００１−１ＭＧ，ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ，韓国）でコーティングをした。コーティングは、４℃で一晩中行なった。コーティングが完了したＥＬＩＳＡプレートに、ＰＢＳ２００μｌに４％スキムミルク（＃２３２１００，Ｄｉｆｃｏ，Ｆｒａｎｃｅ）を入れた溶液を入れて、非特異的な反応を抑制するために常温でおおよそ１時間ブロッキングバッファー［ＰＢＳ中、４％スキムミルク］でブロッキングさせた。ブロッキングが終わったあと、ＥＬＩＳＡプレートからブロッキングバッファーを除去して、それぞれの精製された融合タンパク質を１％のスキムミルクをＰＢＳに混合した溶液１００μｌに１００ｎＭで準備した後、それを１／４の希釈濃度で段階希釈をした後、常温でおおよそ２時間反応させた。その次に、２００μｌＰＢＳでプレートを５回洗浄して２μｌの２次抗体である抗ヒトＦｃ−ＨＲＰ（＃３１４１３，Ｔｈｅｒｍｏ，米国）を１％スキムミルクを含有した４ｍｌのＰＢＳに混合した後、ＥＬＩＳＡプレートに一ウェル当り２００μｌずつ入れた後、常温で１時間反応させた。反応後、ＥＬＩＳＡプレートの２次抗体を除去した後、２００μｌのＰＢＳで５回洗浄し、ウェル当り１０μｌの過酸化水素溶液（Ｈ_２Ｏ_２，＃Ｈ１００９−１００ＭＬ，Ｓｉｇｍａ，米国）と１０ｍｌのＰＣバッファー［５．１ｇクエン酸モノハイドレート 、７．３ｇリン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）／ｌ］、そしてＯＰＤ錠剤（＃Ｐ８７８７−１００ＴＡＢ，Ｓｉｇｍａ，米国）１個を混合して総１００μｌに調製した反応液を入れた。反応液を入れた後、常温の暗い状態で１０分間反応させた後、発色を確認して、反応を中断させるＳＴＯＰバッファーを一ウェル当り５０μｌずつ入れて反応を終了させ、ＥＬＩＳＡリーダーで４９０ｎｍの波長でＫｄの値を測定した。

その結果、図８に示されるように、ＴＮＦ−αリガンドはＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質と低いＫｄ値を示すことから、高い結合力を確認することができた（図８）。

＜実験例２＞ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質の炎症性サイトカイン抑制測定
＜２−１＞末梢血液単核細胞分離
健康な人からヘパリン処理された注射器を用いて血液を採取した後、ＰＢＳと１：１の割合で希釈した。フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）（Ａｍｅｒｃｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｕｒｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，英国）と希釈した血液の割合が１：４になるようにして、フィコール層に混じらないように血液を浮かべた後、２０００ｒｐｍ、２０℃の条件で３０分間遠心分離して軟膜層から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。分離した細胞をＰＢＳで洗浄した後、１０％牛胎児血清（Ｇｉｂｃｏ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，米国）を含んだ細胞培養液ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）に１×１０^６細胞／ｍｌで希釈した。

＜２−２＞Ｔｈ１７細胞培養
実験例＜２−１＞に記載した末梢血単核細胞を１０％牛胎児血清を含んだ細胞培養液ＲＰＭＩ１６４０で５×１０^５細胞／５００μｌの細胞で４８ウェルプレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＩＬ，米国）に分注し、これら細胞にＴＮＦ−αとＩＬ−２１に対するＴＮＦＲ２−Ｆｃ、ＩＬ２１Ｒ−Ｆｃ及びＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を１０μｇ／ｍｌの濃度で処理して１時間培養した。１時間後、細胞をピペットを用いて底に付いた細胞を取り離して、抗−ＣＤ３（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，米国）が０．３μｇ／ｍｌでコーティングされた４８ウェルプレートに移して、末梢血液単核細胞をＴｈ１７細胞に分化誘導させるためにＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，米国）２０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−２３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）１０ｎｇ／ｍｌ及びＩＬ−１β（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）５ｎｇ／ｍｌを処理して、３７℃、５％ＣＯ_２環境の培養器で７２時間培養した。７２時間培養の間、培地交換及び追加刺激はしなかった。

＜２−３＞ＲＴ−ＰＣＲ
実施例＜２−２＞の７２時間培養した細胞から総ＲＮＡをＲＮＡ ｚｏｌ−Ｂ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ，米国）を用いて抽出した。総２μｇのＲＮＡにランダムプライマー（Ｇｅｎｏｔｅｃｈ，Ｄａｅｊｅｏｎ，韓国）１μｌを加えて、７０℃で５分間放置した後、すぐ氷に入れて急冷させて、４μｌの５×Ｍ−ＭＵＬＶバッファー、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５μｌリボヌクレアーゼ阻害剤（Ｔａｋａｒａ，Ｓｈｉｇａ，日本）と混合した後、総反応液が１９μｌになるように蒸留水９．５μｌを加えた。２５℃で５分間反応後、１μｌの逆転写酵素Ｍ−ＭＵＬＶ（Ｔａｋａｒａ，Ｓｈｉｇａ，日本）を処理して２５℃で５分、４２℃で６０分、７２℃で１０分間反応させてｃＤＮＡを得た。

このように生成されたｃＤＮＡ産物を鋳型にして、逆転写重合酵素連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を施行した。ＲＴ−ＰＣＲのための反応化合物は、一サンプル当り総２５μｌになるようにし、溶液の組成は１０×反応バッファー２．５μｌ、０．５ｍＭのｄＮＴＰ２．５μｌ、Ｔａｑ０．３μｌ（Ｔａｋａｒａ，ｓｈｉｎｇａ，日本）及びターゲット正方向と逆方向プライマーそれぞれ２μｌとｃＤＮＡ１μｌ及び１４．７μｌの蒸留水を含む。増幅のために、Ｄｕａｌ−ｂａｙ Ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ ｓｙｓｔｅｍ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いた。陰性対照群に抽出したｃＤＮＡの代わりに蒸留水を用いて、ＰＣＲ産物が観察されないことを通じてＰＣＲ汚染がないことを確認した。ＩＬ−２１は、９４℃で３分変性過程を経た後、９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で３０秒間の反応を３０回反復した後、伸長のために７２℃で７分間反応を行った。ＩＬ−１７増幅条件は、９４℃で３分の変性過程を経た後、９４℃で１分、５６℃で１分、７２℃で１分間の反応を３０回反復した後、７２℃で７分間反応を行った。ＲＯＲｃとβアクチンは、９４℃で３分間の変性過程を経た後、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒間の反応をそれぞれ３０回、２６回反復した。重合酵素反応によって得られた増幅産物は、臭化エチジウムを含んだ１．５％アガロースゲルに電気泳動させた後、Ｇｅｌ−Ｄｏｃ ２０００（Ｂｉｏ−ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で画像を得て、Ｑｕａｎｔｉｔｙ−Ｏｎｅ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）プログラムを用いて増幅産物を濃度計測法で定量した。この値をβアクチンとの比率に換算して各細胞群間のｍＲＮＡ発現程度を比較した。用いたプライマー配列は下記のとおりである：

ＩＬ−２１；
５'−ＣＴＴ ＡＣＣ ＴＧＧ ＣＡＡ ＧＡＣ ＣＡＧ ＴＡＴ ＧＡ−３'（配列番号９）；
５'−ＧＴＡ ＧＡＡ ＧＧＣ ＡＧＧ ＧＴＣ ＴＴＣ ＧＴＡ ＡＴ−３'（配列番号１０）；
ＩＬ−１７；
５'−ＴＧＡ ＡＧＴ ＧＣＴ ＧＴＣ ＴＧＧ ＡＧＣ ＡＧ−３'（配列番号１１）；
５'−ＴＣＣ ＴＣＡ ＧＡＡ ＴＣＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＴＣ−３'（配列番号１２）；
ＲＯＲｃ；
５'−ＡＧＴ ＣＧＧ ＡＡＧ ＧＣＡ ＡＧＡ ＴＣＡ ＧＡ−３'（配列番号１３）；
５'−ＣＡＡ ＧＡＧ ＡＧＧ ＴＴＣ ＴＧＧ ＧＣＡ ＡＧ−３'（配列番号１４）；
βアクチン；
５'−ＧＧＡ ＣＴＴ ＣＧＡ ＧＣＡ ＡＧＡ ＧＡＴ ＧＧ−３'（配列番号１５）；
５'−ＴＧＴ ＧＴＴ ＧＧＣ ＧＴＡ ＣＡＧ ＧＴＣ ＴＴＴ Ｇ−３'（配列番号１６）。

増幅産物をβアクチン発現の割合によって換算して各ｍＲＮＡの発現程度を比較した。

その結果、Ｔｈ１７細胞の分化条件では、炎症性サイトカインであるＩＬ−１７及びＩＬ−２１ Ｔｈ１７細胞の分化過程で発現されると報告された特定転写因子であるＲＯＲｃのｍＲＮＡ発現が高かった。しかし、同一条件のＴｈ１７細胞にＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を処理した場合、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１及びＲＯＲｃ遺伝子の発現が顕著に抑制されることを観察することができた（図９）。

＜２−４＞ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質のＩＬ−１７生成減少測定
ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質によってＩＬ−１７タンパク質の生成が減少するかどうかを確認するために、実験例＜２−３＞で培養したＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質が処理されたＴｈ１７細胞の上澄み液で、炎症性サイトカインＩＬ−１７タンパク質の量をＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。

サンドイッチＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに、ＩＬ−１０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）抗体を２μｇ／ｍｌで１ウェルに１００μｌ入れて常温で２時間反応させた後、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を０．０５％ＰＢＳＴ［ＰＢＳ中０．０５％ツイーン２０］に混合したブロッキングバッファー２００μｌを添加して室温で２時間反応させた。標準試料に用いるヒト組換えＩＬ−１０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、各５，０００〜７８．１２５ｐｇ／ｍｌの濃度で段階希釈して準備した。標準試料とともに測定する実験例＜３−１＞の細胞培養上澄み液を１００μｌ／ウェルずつ入れて室温で２時間反応させた。反応後、０．０５％ＰＢＳＴ３００μｌで４回洗浄して、ビオチンが結合された抗−ヒトＩＬ−１０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を２００ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈して、１００μｌ／ウェルずつ入れて室温で２時間反応させた。反応後、ＰＢＳＴで４回洗浄して、エクストラアビジンアルカリフォスファターゼ接合体（Ｓｉｇｍａ，Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）を１：２，０００に希釈して、１００μｌ／ウェルずつ入れて室温で２時間反応させて、ＰＢＳＴで洗浄後、フォスファートジナトリウム塩ヘキサハイドレート（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ Ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ，ＰＮＰＰ）／ＤＥＡ溶液を１ｍｇ／ｍｌ濃度で１００μｌ添加して反応させた。反応後、０．２Ｎ ＮａＯＨ１００μｌを入れて反応を止めて、４０５ｎｍ波長で吸光度を測定した。

その結果、図９に示されるように、Ｔｈ１７細胞が分化刺激条件の下で炎症性サイトカインであるＩＬ−１７タンパク質の生成物が増加するが、本発明のＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を１０μｇ／ｍｌを処理した場合、ＴＮＦＲ２−Ｆｃ、ＩＬ２１Ｒ−Ｆｃを処理した群に比較してＩＬ−１７の生成がより効果的に減少することを確認した（図９）。

＜実験例３＞ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質のＦｏｘＰ３発現及びＩＬ−１０生成増加測定
＜３−１＞ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質のＦｏｘＰ３発現測定
ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質が、Ｔｈ１７細胞反応を抑制するのと同時に自己抗原に対する均衡を維持して自己免疫から保護する役割をする免疫抑制細胞であるＴｒｅｇの作用に相乗効果を誘導することができるかどうかを調べるために、Ｔｒｅｇ細胞で生成される転写因子であるＦｏｘＰ３の発現をフローサイトメトリー法を用いて測定した。

実験例＜２−２＞に記載した方法で分化が誘導されたＴｈ１７細胞に、ＴＮＦＲ２−Ｆｃ、ＩＬ２１Ｒ−Ｆｃ及びＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を１０μｇ／ｍｌ処理して、１時間培養した後、前記と同一な細胞刺激によって細胞を３日間培養して、ＰＭＡ２５ｎｇ／ｍｌ、イオノマイシン（Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎｅ）２５０ｎｇ／ｍｌとゴルジストップ（Ｇｏｌｇｉｓｔｏｐ）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，米国）を５時間前処理した。細胞を集めてペリジニン葉緑素タンパク質が融合されたヒトＣＤ４に対する抗体（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＰｅｒＣＰ）−ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ４，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，米国）及びアロピコシアニンが融合されたヒトＣＤ２５に対する抗体（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）−抗−ヒトＣＤ２５（ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，米国）抗体を２０μｌ／１×１０^６細胞で処理して、４℃暗所で３０分間反応させた後、ＦＡＣＳバッファー［０．００２％アジ化ナトリウム、０．２％ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳ］で洗浄した。浸透性バッファー１ｍｌを処理して３０分間反応させた。浸透性バッファーで細胞を洗浄した後、ヒトＦｏｘＰ３に対するフルオレセイン抗体（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃａｎａｔｅ−ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＦｏｘＰ３，ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，米国）を２０μｌ／１×１０^６細胞に処理して、４℃、暗所で３０分間反応させた。浸透性バッファーで細胞を洗浄した後、上澄み液を捨ててＦＡＣＳバッファーを入れてフローサイトメトリー機（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，米国）で分析した。

その結果、図１０に示されるように、Ｔｒｅｇの代表的転写因子であるＦｏｘＰ３の発現は、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を処理した時、ＴＮＦＲ２−ＦｃやＩＬ２１Ｒ−Ｆｃに比較してより効果的にＦｏｘＰ３の発現を増加することを確認することができた（図１０）。

＜３−２＞ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質のＩＬ−１０生成増加測定
ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質が、Ｔｈ１７細胞反応を抑制するのと同時に自己抗原に対する均衡を維持して自己免疫から保護する役割をする免疫抑制細胞であるＴｒｅｇの作用に相乗効果を誘導することができるかどうかを調べるために、Ｔｒｅｇ細胞で生成される抗炎症性サイトカインＩＬ−１０タンパク質をＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。

サンドイッチＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに、ＩＬ−１０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）抗体を２μｇ／ｍｌで１ウェルに１００μｌ入れて常温で２時間反応させた後、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を０．０５％ＰＢＳＴに混合したブロッキングバッファー２００μｌを添加して室温で２時間反応させた。標準試料に用いるヒト組換えＩＬ−１０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、各５，０００〜７８．１２５ｐｇ／ｍｌ濃度に段階希釈して準備した。標準試料とともに測定する実験例＜３−１＞の細胞培養上澄み液を１００μｌ／ウェルずつ入れて室温で２時間反応させた。反応後、０．０５％ＰＢＳＴ３００μｌで４回洗浄して、ビオチンが結合された抗ヒトＩＬ−１０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を２００ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈して、１００μｌ／ウェルずつ入れて室温で２時間反応させた。反応後、ＰＢＳＴで４回洗浄して、エクストラアビジンアルカリフォスファターゼ接合体（Ｓｉｇｍａ，Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）を１：２，０００に希釈して１００μｌ／ウェルずつ入れて室温で２時間反応させて、ＰＢＳＴで洗浄後、フォスファートジナトリウム塩ヘキサハイドレート（ＰＮＰＰ）／ＤＥＡ溶液を１ｍｇ／ｍｌ濃度で１００μｌ添加して反応させた。反応後、０．２Ｎ ＮａＯＨ１００μｌを入れて反応を止めて、４０５ｎｍ波長で吸光度を測定した。

その結果、図１０に示されるように、Ｔｈ１７細胞分化条件にＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を処理した時、ＴＮＦＲ２−Ｆｃ、ＩＬ２１Ｒ−Ｆｃを処理したものに比較して、ＩＬ−１０の生成が統計的に有意にさらに増加することを確認した（図１０）。

＜実験例４＞ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質の破骨細胞分化減少測定
＜４−１＞破骨細胞培養
健康な人からヘパリン処理された注射器を用いて血液を採取した後、ＰＢＳと１：１の割合で希釈した。フィコールと希釈した血液の割合が１：４になるようにして、フィコール層に混じらないように血液を浮かべた後、２０００ｒｐｍ、２０℃の条件で３０分間遠心分離して軟膜層から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。分離した細胞をＰＢＳで洗浄した後、１０％牛胎児血清を含んだαＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，米国）に混合して、２４ウェルプレートに５×１０^５細胞／５００μｌで分注して３７℃、５％ＣＯ_２環境の培養器で２時間培養した。２時間後プレート底に付かない細胞を除去して、ＰＢＳで洗浄した後、新しい１０％αＭＥＭ細胞培養液を５００μｌ入れて組換えヒト大食細胞コロニー刺激因子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ／ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，Ｍ−ＣＳＦ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，米国）１００ｎｇ／ｍｌで細胞を刺激して３日間培養した。３日後、ＰＢＳ洗浄後、培地を新しい１０％αＭＥＭ培養液に交換して、ｒｈＭ−ＣＳＦ２５ｎｇ／ｍｌ及び核因子カッパーＢリガンドの受容体活性剤（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ Ｂ ｌｉｇａｎｄ，ＲＡＮＫＬ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）３０ｎｇ／ｍｌで刺激して、ＴＮＦＲ２−Ｆｃ、ＩＬ２１Ｒ−Ｆｃ及びＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を条件によってそれぞれ１０μｇ／ｍｌ処理して培養した。３日ごとに培養液を交換して前記刺激条件によって処理した。細胞分化状態を観察して刺激回数を決定した。

＜４−２＞破骨細胞染色
前記の分化された細胞に、ＴＮＦ−αとＩＬ−２１に対するＴＮＦＲ２−Ｆｃ、ＩＬ２１Ｒ−Ｆｃ及びＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を処理した後、前記方法で破骨細胞分化を誘導した。分化された破骨細胞を、１０％ホルマリンを入れて１０分間反応させて固定し、それら細胞をＰＢＳで３回洗浄して、ＴＲＡＰ（Ｔａｒｔｒａｔｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）染色Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ，Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）を通じて、分化された破骨細胞を調査した。あらかじめ加温しておいた３７℃の滅菌した蒸留水４５ｍｌにキット内のｆａｓｔ Ｇａｒｍｅｔ ＧＢＣ Ｂａｓｒ溶液５００μｌと亜硝酸ナトリウム溶液５００μｌをよく混合した。この混合溶液に、ナフトールＡＳ−ＢＩフォスファート溶液５００μｌ、アセテート溶液２ｍｌ、酒石酸塩溶液１ｍｌを順に入れた後、よく混合して固定した細胞に２００μｌずつ入れて、３７℃で３０分間染色反応を実施した後、染色程度を観察して反応時間を調節した。ＴＲＡＰ陽性（赤紫色）で核が３個以上の多核細胞を破骨細胞とみなし、これを光学顕微鏡で計測した。実験は、３回以上施行し４群ウェルに分けて実験し、結果を平均値±標準偏差で示した。

その結果、図１１に示されるように、Ｍ−ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬの刺激で破骨細胞の分化が活発に起きたことを観察することができ、このような分化はＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を処理した時、ＴＮＦＲ２−ＦｃとＩＬ２１Ｒ−Ｆｃを処理したものに比較してより効果的に分化を抑制することを確認することができた（図１１）。

＜４−３＞カテプシン（Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ）Ｋの発現測定
前記の分化された細胞にＴＮＦＲ２−Ｆｃ、ＩＬ２１Ｒ−Ｆｃ及びＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を処理した細胞からＲＮＡを得て、実験例＜２−３＞に記載したＲＴ−ＰＣＲ方法を用いてｃＤＮＡを合成した後、カテプシンＫの発現を測定した。

その結果、図１１に示されるように、Ｍ−ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬの刺激で発現したカテプシンＫがＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を処理した時、ＴＮＦＲ２−ＦｃとＩＬ２１Ｒ−Ｆｃを処理したものに比較してより効果的に発現が減少することを確認することができた（図１１）。

＜実験例５＞ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質のＣＩＡ関節炎誘発マウスの関節炎治療効果確認
本発明によるＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質の関節炎治療効果を確認するために、コラーゲン誘導による関節炎ＣＩＡ（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）マウスモデルにＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を投与して治療効果を確認した。

具体的に、ＣＩＡ誘導をさせるために、６週齢の雄ＤＢＡ／１Ｊマウス（オリエントバイオ）に、ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ'ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ（ＣＦＡ）と同量で混合したＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）１００μｇを尾に注射して、１回免疫化反応を行なった。６匹ずつ、各実験群に分けた後、７日後からＩＬ２１Ｒ／ＴＮＦＲ２−Ｆｃ（ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質）５０μｇ、エンブレル１００μｇをそれぞれ腹腔内注射（Ｉ．Ｐ．）方法で週３回ずつ３週間（総９回）注入した。１回免疫化反応を開始点にして観察者三人が毎週３回ずつ関節炎症の重症度を評価した。関節炎評価は、Ｒｏｓｏｌｉｎｉｅｃなどによる平均関節炎指数（ｍｅａｎ ａｒｔｈｒｉｔｉｃ ｉｎｄｅｘ）に基づいて下記の尺度によって付けた点数を合わせて４で割った平均値を得て、再び各マウスから３人の観察者が得た数値を合算して割った平均値を用いる。発生率は、一足を２５％にして腫れた足の数を点数化した：

０点：むくみや腫脹がない；
１点：足または足首関節に限った軽いむくみと発赤；
２点：足首関節から中足骨にかけた軽いむくみと発赤；
３点：足首関節から中足骨にかけた中程度のむくみと発赤；及び
４点：足首から足全体にかけてむくみと発赤がある場合。

その結果、図１２に示されるように本発明による精製されたＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質をＣＩＡ関節炎誘発マウスモデルに投与した後、臨床スコアと発生率を観察した時、本発明によるＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を投与した群で優れた関節炎治療効果を示すことを確認することができ、このような効果は関節炎治療剤に使用されるエンブレルを投与した陽性対照群と比較してより優れていた（図１２）。

＜実験例６＞免疫組織化学染色法を通じたＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質のＣＩＡ関節炎誘発マウスの関節炎緩和効果確認
前記＜実験例５＞で用いたＣＩＡ関節炎誘発マウスに、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質及びエンブレルを投与した実験群マウスの関節を採取して、免疫組織化学染色法を用いて関節浸潤、炎症及び軟骨の破壊程度を確認した。

具体的に、免疫組織化学染色法を行なうために、まず前記ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質及びエンブレルをそれぞれ投与したＣＩＡ関節炎誘発マウスの関節を採取して、１０％中性緩衝ホルマリンで固定させて、ＥＤＴＡを用いて骨を脱灰させた。続いてパラフィンに包埋して関節組織を７μｍの厚さの切片に作ってスライドに付着した。基本染色を進行する前にキシレンを用いた脱パラフィン過程を経て、エチルアルコールを高濃度から低濃度まで含水させ、染色過程はヘマトキシリンとエオジン染色を進行した。また、軟骨に含まれたプロテオグリカンを感知することができるサフラニンＯとトルイジンブルー法を用いて炎症と軟骨組織の破壊程度を測定した。

その結果、図１３に示されるようにＣＩＡ関節炎誘発マウスモデルにＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を投与した時、何も投与しないＣＩＡ関節炎マウスモデルと比較して、細胞の浸潤が減少していることを観察することができ、サフラニンＯ及びトルイジンブルー法を通じて炎症及び軟骨の破壊も緩和されることを観察することができた（図１３）。

＜実験例７＞免疫組織化学染色法を通じたＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質のＣＩＡ関節炎誘発マウスの炎症減少効果確認
前記＜実験例５＞で用いたＣＩＡ関節炎誘発マウスに、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質及びエンブレルを投与した実験群マウスの関節を採取して、免疫組織化学染色法を用いて炎症因子の発現を観察した。

まず、前記ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質及びエンブレルを投与したＣＩＡ関節炎誘発マウスの関節を採取して、１０％中性緩衝ホルマリンで固定させて、ＥＤＴＡを用いて骨を脱灰させた。続いてパラフィンに包埋して関節組織を７μｍの厚さの切片に作ってスライドに付着した。基本染色を進行する前に、キシレンを用いた脱パラフィン過程を経てエチルアルコールを高濃度から低濃度まで含水させた。免疫化学染色法用いて炎症性サイトカインであるＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６とＲＡＮＫ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ−κＢ）、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）を染色して光学顕微鏡で観察した。

その結果、図１４に示されるように、ＣＩＡ関節炎誘発マウスと比較して、本発明によるＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を投与した群で、炎症性サイトカインであるＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６の発現が減少することを観察することができ、新生血管生成の主要因子であるＶＥＧＦ及び破骨細胞分化を示す因子であるＲＡＮＫの発現はほとんど観察されなかった。このようなＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を投与した群で観察される炎症性サイトカイン、ＶＥＧＦ、ＲＡＮＫの発現様相は、エンブレルを投与した群と類似で、これを通じて本発明によるＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質が関節炎の治療に有用できることを確認することができた（図１４）。

＜実験例８＞ＣＩＡ関節炎誘発マウスのＣＩＩ特異的ＩｇＧ２ａ生成量測定
前記＜実験例５＞で用いたＣＩＡ関節炎誘発マウスはＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）を１回投与して免疫化した。その後、本発明によるＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を週３回ずつ３週間、総９回にわたって注入した。このように注入する過程によって、血液の中でＣＩＩの含量の変化を測定した。

ＤＡＢマウスにｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ'ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ（ＣＦＡ）と同量で混合したＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）１００μｇを尾に注射した後、１週間後、本発明によるＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を３週にわたって総９回注入した。その過程中、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を注入する前（０回）、一回目注入後、六回目注入後、及び最後の注入後から６時間〜１２時間以内に、マウスの目から血液を採血して血清を獲得した。ＣＩＩ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ２ａの量を測定するため、ＣＩＩ抗体を１：１，０００に希釈して９６ウェルプレートにコーティングして２時間反応させた。コーティングバッファーを除去した後、ＩｇＧブロッキングバッファーをウェル当り２００μｌずつ入れて、常温で１時間反応させた。その後、実験群及び対照群の血清を希釈して５０μｌずつ入れて常温で１時間反応させた。ＩｇＧウォシングバッファーで５回洗浄した後、抗マウスＩｇＧ ＨＲＰを１：７５，０００に希釈してウェル当り５０μｌずつ入れて常温で１時間反応させた。反応後、ＩｇＧウォシングバッファーで５回洗浄した後、ＴＭＢ基質溶液と反応させた後、色変化を１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を用いて停止させた後、ＥＬＩＳＡリーダー機を用いて４５０ｎｍ波長でＯ．Ｄを測定した。

その結果、図１５に示されるようにどのようなＦｃ融合タンパク質も注入されないＣＩＡ関節炎誘発マウスでは、時間によるＣＩＩ−特異的ＩｇＧ２ａの量に変化が観察されなかったが、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を注入した群では、注入回数が増加するほどＣＩＩ−特異的ＩｇＧ２ａの量が減少することを観察することができた。また、エンブレル注入群でも１次注入後の測定されたＯ．Ｄ値が注入前と比較して若干増加したように観察されるが、エンブレル追加注入後は生成が減少する傾向を示した（図１５）。

＜実験例９＞ＣＩＡ関節炎誘発マウスの脾臓のＴｈ１７及びＴｒｅｇ細胞発現量測定
本発明によるＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を注入したＣＩＡ関節炎誘発マウスのＴｈ１７とＴｒｅｇ細胞発現に及ぼす影響を確認するために、前記＜実験例５＞で用いたマウスの脾臓組織を採取して、Ｔｈ１７（ＣＤ４＋ＩＬ−１７＋）である細胞及びＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）である細胞を共焦点染色を通じて観察した。

具体的に、前記＜実験例５＞ＣＩＡ関節炎誘発マウスの脾臓を採取して、ＯＣＴ化合物で包埋させた後、液化窒素を用いて急速冷凍させた組織を冷凍切片機を用いて７μｍ厚さでスライドに付着した。スライドに付着した切片をアセトンで固定後、１０％正常ヤギ血清で３０分間非特異的反応を遮断させた。ＴｒｅｇマーカーであるＣＤ４、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３の染色は、それぞれＰＥ−標識された抗−ＣＤ４抗体、アロピコシアニン（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）−標識された抗−ＣＤ２５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＦＩＴＣ−標識された抗−Ｆｏｘｐ３ Ａｂ抗体を用いて行ない、Ｔｈ１７マーカーであるＣＤ４、ＩＬ−１７はビオチニル化抗−ＣＤ４抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＥ−標識された抗−ＩＬ−１７抗体を用いた。前記抗体をＰＢＳ（ｐＨ７．５）に１：１００の比率で希釈した後、前記スライドに付着した組織と４℃でひと晩反応させて、翌日バイオチニル化抗−ＣＤ４抗体を用いた組織には追加でストレプトアビジンｃｙ−３を常温で２時間反応させた。ＰＢＳを用いて３回洗浄した後、染色された組織を共焦点顕微鏡（ＬＳＭ ５１０ Ｍｅｔａ．Ｚｅｉｓｓ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて観察した。

その結果、図１６に示されるように、ＣＩＡ関節炎誘発マウスに本発明によるＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を注入したマウスの脾臓組織で、Ｆｏｘｐ３＋である細胞の数が、何も注入されていないＣＩＡ関節炎マウスに比較して増加することを観察することができたが、一方、ＣＤ４＋ＩＬ−１７＋であるＴｈ１７の発現の場合、ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質またはエンブレルを注入した群で、何も注入されていないＣＩＡ関節炎マウスに比較して発現が減少したことを観察することができた（図１６）。

下記では、本発明の組成物のための製造例を提示する。

＜製造例１＞薬学的製剤の製造
＜１−１＞散剤の製造
ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質 ２ｇ
乳糖 １ｇ
前記の成分を混合して気密包に充填して散剤を製造した。

＜１−２＞錠剤の製造
ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質 １００ｍｇ
とうもろこし澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法にしたがって打錠して錠剤を製造した。

＜１−３＞カプセル剤の製造
ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質 １００ｍｇ
とうもろこし澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法にしたがってゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。

＜１−４＞丸薬の製造
ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質 １ｇ
乳糖 １．５ｇ
グリセリン １ｇ
キシリトール ０．５ｇ
前記の成分を混合した後、通常の方法によって１丸薬当り４ｇになるように製造した。

＜１−５＞顆粒の製造
ＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質 １５０ｍｇ
台も抽出物 ５０ｍｇ
ブドウ糖 ２００ｍｇ
澱粉 ６００ｍｇ
前記の成分を混合した後、３０％エチルアルコール１００ｍｇを添加して６０℃で乾燥して顆粒を形成した後、包に充填した。

前記でみたように、本発明のＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質は、自己免疫疾患のひとつである関節リウマチの主要病因であるＴｈ１７細胞の炎症性サイトカインＩＬ−１７の分泌を抑制させて、Ｔｒｅｇ細胞で発現されるＦｏｘＰ３の発現増加と、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の分泌を増加させて、破骨細胞の分化とカテプシンＫの発現を抑制し、このような効果は、ＴＮＦＲ２−ＦｃとＩＬ２１Ｒ−ＦｃよりＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質の効果が優れているのみならず、ＣＩＡ（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）関節炎動物モデルに本発明によるＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質を投与した時、関節浸潤、炎症及び軟骨破壊が緩和されて、免疫抑制細胞であるＴｒｅｇ細胞の発現を増加させて関節リウマチの治療効果を示すので、本発明によるＴＮＦＲ２−ＩＬ２１Ｒ融合タンパク質は、自己免疫疾患の予防及び治療効果を有する組成物の有効成分として有用に使用することができる。

Claims (13)

1. ＴＮＦＲ２（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ２）タンパク質または該ＴＮＦＲ２の細胞外領域を含む断片が、ＩＬ２１Ｒ（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質または該ＩＬ２１Ｒの細胞外領域を含む断片に連結されている、融合タンパク質。
2. 配列番号１で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１記載の融合タンパク質。
3. ２００〜２５０個のアミノ酸からなることを特徴とする、請求項１記載の融合タンパク質。
4. ＴＮＦＲ２の細胞外領域を含む断片が、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１記載の融合タンパク質。
5. ＴＮＦＲ２の細胞外領域を含む断片が、配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端から２３〜１７９番目のアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項１記載の融合タンパク質。
6. ＩＬ２１Ｒの細胞外領域を含む断片が、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１記載の融合タンパク質。
7. ＩＬ２１Ｒの細胞外領域を含む断片が、配列番号３で表されるアミノ酸配列のＮ末端から２１〜２１３番目のアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項１記載の融合タンパク質。
8. 請求項７記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
9. 請求項８記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
10. 請求項９記載の発現ベクターで宿主細胞を形質転換させて調製した形質転換体。
11. 請求項１記載の融合タンパク質を有効成分として含む、自己免疫疾患予防及び治療用組成物。
12. 自己免疫疾患が、悪性貧血、１型糖尿病、自己免疫性関節炎、ループス、多発性硬化症、反応性関節炎、及び皮膚筋炎からなる群から選択される、請求項１１記載の組成物。
13. 自己免疫疾患が自己免疫性関節炎である、請求項１２記載の組成物。