CN102906119A

CN102906119A - 用于预防和治疗自身免疫疾病的tnf-a和il-21的双重拮抗剂

Info

Publication number: CN102906119A
Application number: CN2011800248586A
Authority: CN
Inventors: 朴荣祐; 赵基沅; 刘奭镐; 柳奵; 尹善河; 朴芝贤; 宋恩贞; 李钟镐; 徐敏智; 赵善贞; 曹美罗; 金浩渊; 朴美京; 吴惠左; 朴真实; 禹赟珠; 边财耿; 柳俊杰
Original assignee: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB; Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University of Korea
Current assignee: Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University of Korea
Priority date: 2010-03-19
Filing date: 2011-03-18
Publication date: 2013-01-30
Anticipated expiration: 2031-03-18
Also published as: US20130022642A1; CN102906119B; EP2548893B1; KR101004363B1; EP2548893A4; EP2548893A2; WO2011115458A2; JP2013521798A; WO2011115458A3; US9200058B2; JP5706959B2

Abstract

本发明涉及TNFR 2-IL21R融合蛋白，其作为TNF-alpha (α)和IL-21的双重拮抗剂。包含TNF-α和Il-21（被认为是自身免疫疾病之一的自身免疫类风湿性关节炎的主要原因）的双重拮抗剂（TNFR2-IL21R融合蛋白）的组合物可以减少炎性细胞因子的分泌，增加抗炎细胞因子的分泌，抑制破骨细胞分化，作用优于单一蛋白质如TNFR2-Fc和IL21R-Fc。本发明的TNFR2-IL21R融合蛋白，不仅对CIA小鼠模型的关节炎有很好的治疗作用，而且通过增加免疫抑制细胞Treg的表达，对自身免疫类风湿性关节炎也有很好的治疗作用。因此，本发明的TNFR2-IL21R融合蛋白可以有效地用作用于预防和治疗自身免疫疾病的组合物的活性成分。

Description

用于预防和治疗自身免疫疾病的TNF-A和IL-21的双重拮抗剂

相关申请的交叉引用

本专利申请是2011年3月18日提交的PCT/KR2011/001902号PCT国际申请的中国国家阶段，其要求韩国专利申请No.10-2010-0024700的优先权，其内容全文以引用的方式并入本文。

背景技术

1、技术领域

本发明涉及一种用于预防和治疗自身免疫疾病的组合物，所述组合物包含一种TNF-α和IL-21的双重拮抗剂。

2、相关技术描述

免疫系统在保护人体免于遭受抗原这种有害的外来物质时发挥作用。这类抗原例如细菌、病毒、有毒物质、癌细胞和其他人或动物的血液或组织。免疫系统产生抗体来破坏这类引入的有害外来物。然而，如果免疫系统功能不正常，它就无法区分自己的正常健康器官和有害的外来抗原，因此它也会破坏正常组织。这种反应被称为自身免疫疾病。这种反应显示了过敏性的超敏反应。过敏是抵抗对人体无害的外来物时的反应，但在自身免疫疾病的情况下，反应目标包括正常组织。免疫系统不能区分正常器官和抗原的原因尚未知。仅有假设理论认为，在那些特定地继承了易受到自身免疫疾病攻击的基因的机体内，微生物如细菌或药物可能导致这种疾病。

自身免疫疾病例如桥本氏甲状腺炎、恶性贫血、阿狄森氏病、1型糖尿病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、皮肌炎、干燥综合征、红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、反应性关节炎、凸眼性甲状腺肿、和腹腔疾病—口炎性腹泻等。

治疗自身免疫疾病的目的是调节自身免疫应答和恢复受损的免疫功能。治疗方法可能随自身免疫疾病的类型不同而异。例如，如果血液有问题，那么输血是必需的。如果观察到骨、关节或者肌肉有任何的异常，就需要体育锻炼或其他功能治疗。此外，开具药物以便调节免疫应答。这种药称为免疫抑制药，例如皮质类固醇类（如强的松）和非类固醇类（如环磷酰胺、硫唑嘌呤和他克莫司）等等。

尽管全世界有约占地球上人口总数的1%的2100万人患有类风湿性关节炎（RA，一种自身免疫疾病），这种疾病的病因目前也尚未披露。这种类风湿性关节炎的症状是在动关节处有对称性系统慢性炎症。当它变得严重时，甚至会发生关节功能障碍。更严重的是，这种自身免疫系统功能不正常带来的炎症和疼痛不仅在关节处，也在关节周围的其他组织以及进一步在全身的其他器官，包括肺、皮肤、以及眼睛且伴有疼痛和骨质疏松症，导致严重降低生活质量，不能正常地进行日常生活。

以前类风湿性关节炎的治疗着重在通过改善生活习惯、外科手术、以及治疗剂的给药来延缓疾病的发展或者缓解伴随的疼痛，其抑制了感染，但不期待关节功能的任何改善。然而，最近的治疗是针对于关节功能的全面复苏。随着抗TNF的拮抗剂的发展，这已经成为可能，所述抗TNF的拮抗剂已被认为是用于治疗类风湿性关节炎最引人注目的发现。

肿瘤坏死因子(TNF)是多效性细胞因子，它不仅在炎症反应中也在免疫系统中发挥重要作用。它被发现于类风湿关节炎患者的关节以及克罗恩氏病患者的结肠中。肿瘤坏死因子还被报道在破骨细胞中也发挥重要作用。因此，已开发的所有治疗药剂的目的均为抑制TNF活性，通过结合属于TNF超家族的配体来精确地中断信号转导或者中断TNF配体和受体之间的结合。为了抑制TNF信号转导，已经使用了对抗TNF配体的单克隆抗体或重组蛋白。准确地说，已采用了使用单克隆抗体如英利昔单抗(Remicade)或阿达木单抗(Humira)的治疗方法。也已经采用了使用重组蛋白如CTLA-4Ig或依那西普(Enbrel)的治疗方法。英利昔单抗、依那西普、以及阿达木单抗是首先被认可的作为类风湿性关节炎的治疗药剂的生物药剂，已经使用了10年，显示出高效率。除了TNF，其他细胞因子也被致力于开发成一种治疗药剂。作为抑制白介素的DMARD（缓解疾病的抗风湿药），已经开发了以IL-6或IL-1为目标的治疗药剂。然而，治疗作用不如那些抗TNF的药剂好。

尽管有很好的治疗作用，抗TNF的药剂也有许多需要克服的问题。一个例子就是给予抗TNF的药剂具有副作用，就是当TNF的机制停止工作时，会导致免疫系统功能异常，增加真菌或病毒感染的风险。尤其是，休眠肺结核复发的概率增加。此外，可能造成脱髓鞘障碍，例如多发性硬化症或恶性血液病。根据患风湿性疾病的群体，用抗TNF的药剂给药的类风湿性关节炎患者比用普通治疗剂治疗的那些患者得皮肤癌的机率更高。

在类风湿性关节炎患者中药剂的治疗作用并不完全相同。三分之二的患者显示出治疗作用，但三分之一的患者并没有得到改善。这一结果表明治疗被医疗史或遗传因素所限制。不得不考虑和克服的不仅有疾病带来的疼痛，而且还有伴随治疗的副作用以及安全问题。对于有类风湿性关节炎的孕妇而言，在施用抗TNF的药剂时胎儿的安全是个问题。因此科学家担负着开发诊断方法来预测治疗作用和副作用的责任。

白介素（IL）是一种细胞因子，它充当血红细胞之间的一种化学信号。IL-2在1992年被FDA批准用于晚期肝癌的治疗。当时，它是第一个单一的免疫治疗剂。自此以后，IL-2也被用于治疗转移性黑色素瘤。IL-2本身用来治疗癌症或联合疫苗治疗。IL-2帮助免疫系统发挥作用以快速生长或分化细胞。然而，也被报道有副作用如发冷、发烧和疲劳，类似伴随发冷的症状以及神经错乱。IL-15和IL-21，属于IL-2家族，已被研究作为单一的癌症治疗药剂或者佐剂。

IL-21是一种具有α螺旋结构的细胞因子。这种细胞因子在使用IL-21受体和γ链进行信号转导中诱导炎性反应。已知IL-21诱导骨髓中NK细胞前体成熟（Parrish-Novak J等人,Nature,408:57-63,2000）。尤其是，IL-21被报道增加效应物功能，例如细胞因子的产生和NK细胞的凋亡活性（StrengellM等人,J Immunol.,170:5464-5469,2003；Brady J等人,J Immunol.,172:2048-2058,2004）。它还提高了CD8+T细胞加速内源适应性免疫系统内的抗癌应答的作用（Takaki R等人,J Immunol.,175:2167-2173,2005；Moroz A等人,J Immunol,173:900-909,2004）。IL-21还被报道能活化从人外周血液分离出来的NK细胞（Parrish-Novak J等,Nature,408:57-63,2000）并且在诱导NK细胞由造血干细胞（分离自脐带血）成熟中发挥重要作用（SoniaA.P等人,Int.immunol.,18:49-58,2006）。

本发明人试图开发一种新的用于自身免疫疾病的治疗剂，在克服用作抗TNF的治疗药剂的传统单一拮抗剂的功效和安全问题的局限性方面，所述治疗剂是有利的。准确地说，本发明人构建了对TNF-alpha(α)和IL-21有拮抗作用的TNFR2-IL21R融合蛋白。然后，本发明人采用该融合蛋白证实，炎性细胞因子如IL-21和IL-17以及RORc的表达都降低了，但FoxP3的表达和抗炎细胞因子IL-10的分泌增加了。本发明人进一步证实，TNFR2-IL21R融合蛋白抑制破骨细胞的分化和减少组织蛋白酶K的表达，作用大于用TNFR2-Fc或IL21R-Fc治疗。在CIA（胶原诱导关节炎）小鼠模型中，本发明人证实，通过增加免疫抑制性Treg细胞的表达，本发明的TNFR2-IL21R融合蛋白不仅有关节炎治疗作用还有自身免疫关节炎的治疗作用。通过证实本发明的TNFR2-IL21R融合蛋白作为一种用于自身免疫类风湿性关节炎治疗药剂的巨大可能性，本发明人最终完成了此发明。

发明概述

本发明的目的是提供一种用于预防和治疗自身免疫疾病的组合物，所述组合物包含TNFR2-IL21R融合蛋白作为活性成分，所述TNFR2-IL21R融合蛋白为TNF-α和IL-21的双重拮抗剂。

为实现上述目的，本发明提供了一种融合蛋白，在这种融合蛋白中，包含TNFR2（肿瘤坏死因子受体2型）蛋白或所述TNFR2的胞外结构域的片段与包含IL21R（白介素21受体）蛋白或所述IL21R的胞外结构域的片段相连接。

本发明还提供了一种编码所述TNFR2-IL21R融合蛋白的多核苷酸。

本发明进一步提供了一种包含编码所述TNFR2-IL21融合蛋白的多核苷酸的表达载体。

本发明还提供了一种通过用包含编码所述TNFR2-IL21R融合蛋白的多核苷酸的表达载体转染宿主细胞而得到的转化体。

本发明还提供了一种用于预防和治疗自身免疫疾病的组合物，所述组合物包含TNFR2-IL21R融合蛋白作为活性成分。

本发明还提供了一种用于治疗自身免疫疾病的方法，该方法包括给患有自身免疫疾病的受试者施用药物有效剂量的TNFR2-IL21R融合蛋白的步骤。

本发明还提供了一种用于预防自身免疫疾病的方法，该方法包括给受试者施用药物有效剂量的TNFR2-IL21R融合蛋白的步骤。

此外，本发明提供了本发明的一种融合蛋白，其用于预防和治疗自身免疫疾病。

有益效果

如上所述，本发明涉及一种组合物，该组合物包含以对抗TNF-α和IL-21的拮抗作用为特征的TNFR2-IL21R融合蛋白，所述TNF-α和IL-21被认为是自身免疫疾病之一的自身免疫类风湿性关节炎的主要病因。TNFR2-IL-21R融合蛋白抑制炎性细胞因子的分泌，增加抗炎细胞因子的产生，并对破骨细胞分化具有良好的抑制作用。此外，在CIA小鼠模型中，所述融合蛋白对关节的浸润、炎症和软骨破坏显示出很好的缓解作用。本发明的融合蛋白也被证明增加免疫抑制细胞Treg细胞表达，对自身免疫类风湿性关节炎有治疗作用。因此，本发明的TNFR2-IL21R融合蛋白可以有效地用作对自身免疫疾病具有预防和治疗作用的组合物的活性成分。

附图说明

结合附图能最好地理解本发明的优选实施方案的应用，其中:

图1为示出了IL21R-Fc结构的图，其中IL21R基因被克隆到表达载体pYK602-HIS-Fc中。

图2为一组照片，示出了证明被克隆到表达载体pYK602-HIS-Fc中的IL21R-Fc表达的蛋白质印迹的结果，以及在通过用蛋白质A珠子纯化所表达蛋白后使用组氨酸抗体进行的另一个蛋白质印迹的结果。

图3为示出了TNF-α单拮抗剂结构的图，其中TNFR2基因已经被克隆到表达载体pYK602-HIS-Fc中。

图4为一组照片，示出了确认被克隆到表达载体pYK602-HIS-Fc中的TNFR2-Fc单拮抗剂的表达的蛋白质印迹的结果，以及在通过用蛋白质A珠子纯化所表达蛋白后使用组氨酸抗体进行的另一个蛋白质印迹的结果。

图5为示出了PCR引物结构的图，所述PCR引物用来构建诱导TNFR2-IL21R融合蛋白表达的表达载体。

图6为一组图，示出了TNFR2-IL21R融合蛋白的结构，所述TNFR2-IL21R融合蛋白通过在表达载体pYK602-HIS-Fc中克隆TNFR2R基因连同IL21基因而制得。

图7为一组照片，示出了确认被克隆到表达载体pYK602-HIS-Fc中的TNFR2-IL21R融合蛋白的表达的蛋白质印迹的结果。

图8的图示出了TNFR2-IL21R融合蛋白与其配体TNF-α和IL-21的结合亲和力。

图9为一组照片和图，示出了确认在用TNFR2-IL21R融合蛋白处理的Th17细胞中IL-21、IL-17、RORc、以及β-肌动蛋白的表达的RT-PCR结果，还示出了在分别用TNFR2-Fc、IL21R-Fc、以及TNFR2-IL21R融合蛋白处理的Th17极化态下分泌的炎性细胞因子IL-17的定量。

图10为一组图，示出了FoxP3的表达以及在用TNFR2-IL21R融合蛋白处理的Th17极化态下抗炎细胞因子IL-10的定量。

图11为一组照片和图，示出了TNFR2-IL21R融合蛋白对破骨细胞分化的抑制作用。

图12为一组图，示出了TNFR2-IL21R融合蛋白对CIA小鼠模型的关节炎的治疗作用。

图12A的图示出了在给CIA小鼠模型施用本发明的TNFR2-IL21R融合蛋白或依那西普后观察到的临床评分；

↑：施用TNFR2-IL21R融合蛋白或依那西普的时间；

关节炎：阴性对照—不作治疗的CIA（胶原诱导关节炎）动物模型组；

IL21R/TNFR2-Fc：用TNFR2-IL21R融合蛋白治疗的CIA动物模型组；

依那西普：用关节炎治疗药剂依那西普治疗的CIA动物模型组；

图12B的图示出了给CIA小鼠模型施用本发明的TNFR2-IL21R融合蛋白或依那西普后观察到的发病率；

↑：施用TNFR2-IL21R融合蛋白或依那西普的时间；

IL21R/TNFR2-Fc：用TNFR2-IL21R融合蛋白治疗的CIA动物模型组；和

依那西普：用关节炎治疗药剂依那西普治疗的CIA动物模型组。

图13为一组照片，示出了TNFR2-IL21R融合蛋白对CIA小鼠模型的关节炎缓解作用，其通过免疫组织化学染色法确认：

CIA：阴性对照—不作治疗的CIA（胶原诱导关节炎）动物模型组；

IL21R/TNFR2-Fc：用TNFR2-IL21R融合蛋白治疗的CIA动物模型组；和

依那西普：用关节炎治疗剂依那西普治疗的CIA动物模型组。

图14为一组照片，示出了CIA动物模型中TNFR2-IL21R融合蛋白的抗炎作用，其通过免疫组织化学染色法确认：

CIA：阴性对照—不作治疗的CIA动物模型组；

IL21R/TNFR2-Fc：用TNFR2-IL21R融合蛋白治疗的CIA动物模型组；和

图15为一组图，示出了CIA小鼠模型中CII特异性IgG2a的产生：

0：施用TNFR2-IL21R融合蛋白或依那西普前；

1：第一次施用TNFR2-IL21R融合蛋白或依那西普；

6：第六次施用TNFR2-IL21R融合蛋白或依那西普；

9：第九次施用TNFR2-IL21R融合蛋白或依那西普；

IL21R/TNFR2-Fc：用TNFR2-IL21R融合蛋白治疗的CIA动物模型组；和

图16为一组照片，示出了CIA小鼠模型的脾脏中Th17和Treg细胞的表达，其通过免疫组织化学染色法确认：

CIA：阴性对照—不作治疗的CIA动物模型组；

IL21R/TNFR2-Fc：用TNFR2-IL21R融合蛋白治疗的CIA动物模型组；和

优选实施方案的说明

以下，详细描述本发明。

本发明提供了一种融合蛋白，在这种融合蛋白中，包含TNFR2（肿瘤坏死因子受体2型）蛋白或所述TNFR2的胞外结构域的片段与包含IL21R（白介素21受体）蛋白或所述IL21R的胞外结构域的片段相连接。

在TNFR2-IL21R融合蛋白中，包含TNFR2的胞外结构域的片段优选地为这样的多肽：所述多肽包含范围为由SEQ.ID.NO:2表示的氨基酸序列的第23位~第179位残基的序列，但不总是限于此。在TNFR2-IL21R融合蛋白中，包含IL21R的胞外结构域的片段优选地为这样的多肽：所述多肽包含范围为由SEQ.ID.NO:2表示的氨基酸序列的第21位~第231位残基的序列，但不总是限于此。所述融合蛋白优选地具有由SEQ.ID.NO:1表示的氨基酸序列，但不总是限于此。还优选的是，所述TNFR2-IL21R融合蛋白由200~250个氨基酸组成，但不总是限于此。

TNFR2-IL21R融合蛋白优选地包含源自抗体重链恒定结构域的片段，但不总是限于此。包含在TNFR2-IL21R融合蛋白中的Fc结构域优选地选自IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，更优选地，它包含全部或部分的CH2和CH3恒定结构域，但不总是限于此。

在TNFR2-IL21R融合蛋白中，IL21R和TNFR2的胞外可溶性结构域的羧基端和氨基端优选地包含全部或部分的抗体重链恒定结构域，但不总是限于此。所述TNFR2-IL21R融合蛋白优选地包含至少2当量的抗体重链恒定结构域，但不总是限于此。其中的两条Fc重链优选地通过二硫键或其它共价键缀合，但不总是限于此。所述TNFR2-IL21R融合蛋白的TNFR2和IL21R部分优选地包含至少2当量的TNFR2和IL21R胞外可溶性结构域，但不总是限于此。

本发明的TNFR2-IL21R融合蛋白优选地通过包括以下步骤的方法制备，但不总是限于此：

1)使用DNA文库为模板，用IL21R引物进行PCR（聚合酶链反应）；

2)使用DNA文库为模板，用TNFR2引物进行PCR；

3)使用步骤1)和步骤2)的PCR产物为模板，用编码TNFR2-IL21R融合基因的引物进行PCR；

4)用限制性酶消化步骤3)的PCR产物；

5)用限制性酶消化表达载体pYK-602-HIS-Fc；

6)进行用步骤4）和步骤5）的限制性酶消化的质粒的连接；

7)转化用步骤6）的连接反应完成的TNFR2-IL21R融合蛋白；

8)在完成步骤7）的转化反应后，把所述蛋白接种到LB平板上；

9)用步骤8)中产生的菌落进行PCR；

10)用步骤9)中确认的TNFR2-IL21R融合蛋白转染293E细胞；

11)从细胞培养基中纯化步骤10)的293E细胞中表达的TNFR2-IL21R融合蛋白；

12)去除步骤11)中纯化的TNFR2-IL21R融合蛋白的细胞毒性；

13)确认步骤12)中纯化的TNFR2-IL21R融合蛋白的结合亲和力。

在本发明的制备方法中，载体的构建优选地通过使用DNA文库的PCR进行，所述DNA文库优选地构建自肝、胎盘、胰腺和肝组织，但不总是限于此。

本发明还提供了一种编码TNFR2-IL21R融合蛋白的多核苷酸。

本发明进一步提供了一种包含编码TNFR2-IL21融合蛋白的多核苷酸的表达载体。

本文的表达载体优选地为pYK602-HIS-Fc，但不总是限于此。

本发明还提供了一个通过用包含编码TNFR2-IL21R融合蛋白的多核苷酸的表达载体转染宿主细胞而得到的转化体。

本文的转化体优选地为大肠杆菌DH5α，但不总是限于此。

在本发明的优选实施方案中，IL21R和TNFR2基因通过PCR扩增以将IL21R和TNFR2亚克隆到表达载体pYK602-HIS-Fc中。每个扩增的PCR产物均被连接到表达载体pYK602-HIS-Fc中，以构建TNFR2-Fc和IL21R-Fc（见图1和图3）。构建的TNFR2-Fc和IL21R-Fc转染293E细胞。在完成转染后，产生且经纯化的蛋白（IL-21的单拮抗剂）通过蛋白质印迹来确认（见图2和图4）。

IL21R和TNFR2基因通过使用DNA文库混合物（肾脏、肝、胰腺和胎盘的混合物）为模版进行PCR扩增。在构建用于扩增IL21R和TNFR2融合基因（见图5）的引物后，通过使用上述扩增的产品为模版，用编码TNFR2-IL21R融合蛋白（TNF-α和IL-21的双重拮抗剂）的基因进行PCR。扩增的PCR产物继续连接到表达载体pYK602-HIS-Fc中，从而实现TNFR2-IL21R融合蛋白表达载体的构建（见图6和图7）。

此外，研究了TNFR2-IL21R融合蛋白和它的一个配体TNF-α之间的亲和力，结果证实TNFR2-IL21R融合蛋白与TNF-α和IL-21有高亲和力（见图8）。

本发明还提供了一种用于预防和治疗自身免疫疾病的组合物，所述组合物包含所述TNFR2-IL21R融合蛋白作为活性成分。

在TNFR2-IL21R融合蛋白中，包含TNFR2胞外结构域的片段优选地为这样的多肽：所述多肽包含范围为由SEQ.ID.NO:2表示的氨基酸序列的第23位~第179位残基的序列，但不总是限于此。在TNFR2-IL21R融合蛋白中，包含IL21R胞外结构域的片段优选地为这样的多肽：所述多肽包含范围为由SEQ.ID.NO:3表示的氨基酸序列的第21位~第231位残基的序列，但不总是限于此。所述融合蛋白优选地具有由SEQ.ID.NO:1表示的氨基酸序列，但不总是限于此。还优选的是，所述TNFR2-IL21R融合蛋白由200~250个氨基酸组成，但不总是限于此。

在TNFR2-IL21R融合蛋白中，TNFR2和IL21R的胞外可溶性结构域的羧基端和氨基端优选地包含全部或部分的抗体重链恒定结构域，但不总是限于此。所述TNFR2-IL21R融合蛋白优选地包含至少2当量的抗体重链恒定结构域，但不总是限于此。其中的两条Fc重链优选地通过二硫键或其它的共价键缀合，但不总是限于此。所述TNFR2-IL21R融合蛋白的TNFR2和IL21R部分优选地包含至少2当量的TNFR2和IL21R胞外可溶性结构域，但不总是限于此。

所述自身免疫疾病优选地为选自下述的疾病：自身免疫类风湿性关节炎、狼疮、重症肌无力、强直性脊柱炎、甲状腺机能亢进、甲状腺功能减退症、溃疡性结肠炎、克罗恩病、心脏瓣膜疾病、多发性硬化症、硬皮病和自身免疫肝炎，更优选地为自身免疫类风湿性关节炎，但不总是限于此。

在本发明的优选实施方案中，Th17细胞用上面构建的TNFR2-Fc，IL21R-Fc以及TNFR2-IL21R融合蛋白处理。结果是，相比于用TNFR2-Fc或IL21R-Fc处理，当用TNFR2-IL21R融合蛋白处理时，炎性细胞因子IL-21和IL17，以及转录因子RORc都显著地减量调节（见图9）。相比于用TNFR2-Fc或IL21R-Fc处理，当用TNFR2-IL21R融合蛋白处理时，Th17中分泌的炎性细胞因子显著降低（见图9）。分别用TNFR2-Fc、IL21R-Fc、和TNFR2-IL21R融合蛋白处理至Th17极化态，然后通过ELASA测定抗炎细胞因子IL-10的水平。结果是，相比于用TNFR2-Fc或IL21R-Fc处理细胞，当用TNFR2-IL21R融合蛋白处理细胞时，FoxP3的表达以及IL-10的分泌都显著提高（见图10）。此外，分别用TNFR2-Fc、IL21R-Fc、以及TNFR2-IL21R融合蛋白处理后，破骨细胞分化受到抑制，这是通过TRAP染色然后通过观察组织蛋白酶K表达的增加来确认的（见图11）。

在本发明的优选实施方案中，构建CIA（胶原诱导关节炎）小鼠模型，来证实本发明的TNFR2-IL21R融合蛋白对于关节炎的体内治疗作用。然后，小鼠模型用本发明的TNFR2-IL21R融合蛋白治疗。结果是，证实了对关节炎的治疗作用（见图12）。准确地说，关节中的浸润和炎症减少了，软骨破坏也同样减少（见图13）。炎性因子的表达也减少了（见图14），以及施用以构建关节炎诱导小鼠模型的CII特异性IgG2a的产生被抑制（见图15）。本发明的融合蛋白的关节炎治疗作用或缓解作用类似于或者更优于目前用作关节炎治疗药剂的依那西普。从用本发明的TNFR2-IL21R融合蛋白治疗的CIA小鼠模型中提取涉及于免疫应答的脾组织，随后观察Th17和Treg细胞的表达。结果是，表达炎性因子的Th17细胞(CD4+IL17+)的表达减少，而来自自身免疫应答的免疫抑制细胞Treg细胞(CD4+CD25+Foxp3+)的表达增加（见图16）。

总之，TNFR2-IL21R融合蛋白减少炎性细胞因子IL-17的产生，这比TNFR2-Fc和IL21R-Fc实现的更显著，比TNFR2-Fc和IL21R-Fc更能增加抗炎细胞因子IL-10的产生，在CIA小鼠模型中表现出自身免疫类风湿性关节炎的治疗或缓解作用。因此，本发明的TNFR2-IL21R融合蛋白可以有效地用作用于预防和治疗自身免疫疾病的组合物的活性成分。

可以通过考虑各种因素来确定本发明TNFR2-IL21R融合蛋白的药物有效剂量，所述因素如给药方法、目标区域、患者病症等等。因此，必须同时考虑安全性和效率来确定用于人体的剂量。该有效剂量还可以基于通过动物试验确定的有效剂量来预测。下列文章中描述了用于确定有效剂量时必须考虑的各种因素：Hardman和Limbird编,Goodman and Gilman's ThePharmacological Basis of Therapeutics,10th ed.(2001),Pergamon Press；和E.W.Martin编,Remington's Pharmaceutical Sciences,18th ed.(1990),MackPublishing Co。

本发明的药物组合物可以包括任何通常使用的载体、稀释剂、赋形剂、或者它们中的至少两种的组合。药学上可接受的载体可以是能够没有限制地在人体内递送本发明的TNFR2-IL21R融合蛋白的任何载体，例如在Merck Index,13th ed.,Merck & Co.Inc中描述的化合物，如盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇、脂质体以及包含这些组分中的一种或多种的混合物。如果有必要，常规添加剂如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂可以另外添加。本发明的组合物可以配制成不同形式，包括通过与稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘结剂和润滑剂混合而成的水性溶液、悬浮液以及注射用乳液、丸剂、胶囊、颗粒或片剂。按照Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company,EastonPA,18^th,1990)提供的方法，组合物还可以根据成分进一步制成合适的形式。

本发明的组合物可以另外包含一种或多种与所述活性成分具有相同或相似功能的有效成分。本发明的组合物可以包含以组成物总重量计的0.0001–10重量%的所述蛋白，优选0.001–1重量%。

本发明的药物组合物可以经口服或经肠胃外（例如，静脉内、皮下、腹膜或局部注射）给药。组合物的有效剂量可以根据体重、年龄、性别、健康状况、饮食、给药频率、给药方法、排泄以及疾病的严重性来确定。剂量为每天0.001~100㎎/㎏，优选为每天0.01~10㎎/㎏，给药频率为一天一次或者优选一天几次。

在TNFR2-IL21R融合蛋白中，包含TNFR2的胞外结构域的片段优选地为这样的多肽：所述多肽包含范围为由SEQ.ID.NO:2表示的氨基酸序列的第23位~第179位残基的序列，但不总是限于此。在TNFR2-IL21R融合蛋白中，包含IL21R的胞外结构域的片段优选地为这样的多肽：所述多肽包含范围为由SEQ.ID.NO:3表示的氨基酸序列的第21位~第231位残基的序列，但不总是限于此。所述融合蛋白优选地具有由SEQ.ID.NO:1表示的氨基酸序列，但不总是限于此。还优选的是，所述TNFR2-IL21R融合蛋白由200~250个氨基酸组成，但不总是限于此。

在TNFR2-IL21R融合蛋白中，IL21R和TNFR2的胞外可溶性结构域的羧基端和氨基端优选地包含全部或部分的抗体重链恒定结构域，但不总是限于此。所述TNFR2-IL21R融合蛋白优选地包含至少2当量的抗体重链恒定结构域，但不总是限于此。其中的两条Fc重链优选地通过二硫键或其它的共价键缀合，但不总是限于此。所述TNFR2-IL21R融合蛋白的TNFR2和IL21R部分优选地包含至少2当量的TNFR2和IL21R胞外可溶性结构域，但不总是限于此。

已经证实，本发明的TNFR2-IL21R融合蛋白减少炎性细胞因子IL-17的产生，这比TNFR2-Fc和IL21R-Fc实现的更显著，比TNFR2-Fc和IL21R-Fc更能增加抗炎细胞因子IL-10的产生。此外，相比于TNFR2-Fc和IL21R-Fc，所述融合蛋白对破骨细胞分化的抑制作用更特异，因此所述融合蛋白可以有效地用于治疗自身免疫疾病。

本发明的药物组合物可以包括任何通常使用的载体、稀释剂、赋形剂、或者它们中的至少两种的组合。药学可接受的载体可以是能够没有限制地在人体内递送本发明的TNFR2-IL21R融合蛋白的任何载体，例如在MerckIndex,13th ed.,Merck & Co.Inc.中描述的化合物，如盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇、脂质体以及包含这些组分中的一种或多种的混合物。如果有必要，常规添加剂如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂可以另外添加。本发明的组合物可以配制成不同形式，包括通过与稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘结剂和润滑剂混合而成的水性溶液、悬浮液以及注射用乳液、丸剂、胶囊、颗粒或片剂。按照Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company,Easton PA,18th,1990)提供的方法，组合物还可以根据成分进一步制成合适的形式。

本发明的组合物可以另外包含一种或多种与所述活性成分具有相同或相似功能的有效成分。本发明的组合物可以包含以组成物总重量计的0.0001-10重量%的所述蛋白，优选0.001-重量1%。

此外，本发明提供一种用于预防和治疗自身免疫疾病的融合蛋白。

本发明的实际且目前优选的实施方案在以下的实施例、实验例和制备例中示例性地示出。

然而，将被理解的是，本领域技术人员在考虑本公开内容后，可以在本发明的精神和范围内做出修改和改进。

实施例1：IL21R-Fc的构建

<1-1>IL21R-Fc表达载体的构建

为了构建IL21R-Fc表达载体，通过使用DNA文库混合物（肾脏、肝、胰腺和胎盘的混合；购自21C Frontier Human GENE Bank (Korea ResearchInstitute of Bioscience and Biotechnology)，克隆ID:hMU007690，板NO.IRAH-24-A10，载体：pOTB7）作为模板，采用包含SfiI位点的正向引物(SEQ.ID.NO:4:5'-agggggccgtgggggcccccgacctcgtctgctacac-3’)和反向引物(SEQ.ID.NO:5:5'-tagcggccgacgcggccaattcctttaactcctctgact-3’)进行PCR，扩增了IL21R基因。PCR产物用SfiI处理，然后亚克隆到pYK602-HIS-Fc中。PCR反应混合物准备如下。混合100ng的模板DNA、2.5单位的pfu聚合酶(Genotech,Korea)、10pmole/50μl的每个引物和蒸馏水，制得最终体积为50μl。PCR进行如下：94℃下预变性2分钟，94℃下变性30秒，58℃下退火30秒，72℃下聚合1分钟，从变性到聚合循环30次，并在72℃下最终延伸10分钟。

扩增的PCR产物和载体用SfiI进行消化，随后在37℃下反应4小时。然后通过使用凝胶纯化试剂盒(QIAGEN,#28706,USA)进行纯化。PCR扩增产物与载体的比率为3(150μg):1(50μg)，1μl T4 DNA连接酶(#SDL01-R40k,Solgent,Korea)和2μl 10×连接酶缓冲液被添加进去，使反应溶液总体积为20μl，随后在16℃下连接16小时。

用连接的质粒转化大肠杆菌DH5α，然后涂布在包含氨苄青霉素的LB平板上，随后在37℃保温箱中孵育16小时。生成的菌落重新悬浮在包含10μl的氨苄青霉素的LB培养基中，随后使用4~5μl培养基作为模板进行菌落PCR。结果证明，IL21R基因被成功亚克隆到表达载体pYK602-HIS-Fc中。

<1-2>IL21R-Fc的表达和纯化

293E细胞在500ml的补加了50mlFBS的DMEM中培养，然后以70~80%的汇合度接种在150㎜平板上。IL21R-Fc(20μg)与PEI(40μg)以1:2的比率混合，然后在室温下反应20分钟，滴到用于转染的细胞上。16~20小时后，将培养基替换为20ml无血清DMEM，每2~3天取上清液。获得的上清液以5000rpm离心10分钟。把得到的上清液转移到新的瓶子中，将它储存在4℃下，直到纯化。

在第3、5、7、和9天从20个150mm的平板获得总共1l的上清液，将它继续纯化。所有的上清液用0.22μm顶级过滤器(#PR02890Millipore USA)过滤，然后结合到500μl蛋白质A珠子(#17-1279-03,GE healthcare,Sweden)上，所述蛋白质A珠子填充于5ml柱子中。在4℃下通过使用Peri-start泵（0.9ml/分钟）诱导结合反应过夜。柱子用至少100ml的PBS洗涤。通过使用0.1M甘氨酸-HCl(#G7126,Sigma,USA)进行洗脱，得到6个级份，接下来用1MTris(#T-1503-5KG，Sigma,USA)(pH 9.0)中和。然后，定量IL21R-Fc。通过使用超滤器(amicon ultra,#UFC805024,Millipore,USA)收集和浓缩2~3个示出IL21R-Fc表达的级份。将缓冲液替换为约10倍量的新鲜PBS(#70011,Gibco,USA)。

结果，如图2所示，从1l上清液(740ng/μl)中总共获得1.0㎎ IL21R-Fc。

实施例2：TNFR2-Fc的构建

<2-1>TNFR2-Fc表达载体的构建

为了构建TNFR2-Fc表达载体，通过使用DNA文库混合物（肾脏、胎盘、胰腺和肝的混合物；购自21C Frontier Human GENE Bank (KoreaResearch Institute of Bioscience and Biotechnology)，克隆ID:hMU013725，板NO.IRAU-86-H09，载体：pDNR-LIB）作为模板，采用包含SfiI位点的正向引物(SEQ.ID.NO:6:5'-

CAGGGGGCCGTGGGGGCCTTGCCCGCCCAGGTGGCATT-3')和反向引物(SEQ.ID.NO:7:5'-

TAGCGGCCGACGCGGCCAATTCAGCTGGGGGGCTGGGGC-3')进行PCR，扩增了TNFR2-Fc基因。PCR产物用SfiI处理，然后亚克隆到pYK602-HIS-Fc中。PCR混合物准备如下。混合100ng的模板DNA、2.5单位的pfu聚合酶(Genotech,Korea)、10pmole/50μl的每个引物和蒸馏水，制得最终体积为50μl。PCR进行如下：94℃下预变性2分钟，94℃下变性30秒，55℃下退火30秒，72℃下聚合1分钟，从变性到聚合循环30次，并在72℃最终延伸10分钟。

扩增的PCR产物和载体用SfiI进行消化，随后在37℃下反应4小时。然后通过使用凝胶纯化试剂盒进行纯化。PCR扩增产物与载体的比率为3(150μg):1(50μg)，1μlT4DNA连接酶和2μl10×连接酶缓冲液被添加进去，使反应溶液总体积为20μl，随后在16℃下连接16小时。

用连接的质粒转化大肠杆菌DH5α，然后涂布在包含氨苄青霉素的LB平板上，随后在37℃保温箱中孵育16小时。生成的菌落重新悬浮在包含10μl的氨苄青霉素的LB培养基中，随后使用4~5μl培养基作为模板进行菌落PCR。结果证明，TNFR2基因被成功亚克隆到表达载体pYK602-HIS-Fc中。<2-2>TNFR2-Fc的表达和纯化

293E细胞在500ml的补加了50mlFBS的DMEM中培养，然后以70~80%的汇合度接种在150㎜平板上。TNFR2-Fc(20μg)与PEI(40μg)以1:2的比率混合，然后在室温下反应20分钟，滴到用于转染的细胞上。16~20小时后，将培养基替换为20ml无血清DMEM，每2~3天取上清液。获得的上清液以5000rpm离心10分钟。把得到的上清液转移到新的瓶子中，将它储存在4℃下，直到纯化。

在第3、5、7、和9天从20个150mm的平板获得总共1l的上清液，将它继续纯化。所有的上清液用0.22μm顶级过滤器过滤，然后结合到500μl蛋白质A珠子上，所述蛋白质A珠子填充于5ml柱子中。在4℃下通过使用Peri-start泵（0.9ml/分钟）诱导结合反应过夜。柱子用至少100ml的PBS洗涤。通过使用0.1M甘氨酸-HCl进行洗脱，得到6个级份，然后用1M Tris(pH9.0)中和。然后，定量经纯化的蛋白。通过使用amicon ultra收集和浓缩2~3个示出TNFR2-Fc表达的级份。将缓冲液替换为约10倍量的新鲜PBS(#70011,Gibco,USA)。

结果，如图4所示，从1l上清液(1mg/μl)中总共获得1.5㎎TNFR2-Fc。

实施例3：TNFR2-IL21R融合蛋白的制备

<3-1>TNFR2-IL21R融合蛋白表达载体的构建

为了构建TNFR2-IL21R融合蛋白表达载体，通过使用DNA文库混合物（肾脏、胎盘、胰腺和肝的混合物）作为模板，采用包含SfiI位点的正向引物和反向引物(SEQ.ID.NO:8:5'-

tagcggccgacgcggccaacgtgcagactgcatccatgc-3')进行PCR，扩增了TNFR2基因。

同样通过使用正向引物和反向引物在以下条件下进行PCR扩增了IL21R基因。两个PCR产物以1：1的比率混合，作为模版，总体积达100ng，然后继续用三个引物进行PCR，使得TNFR2-IL21R融合蛋白亚克隆到

pYK602-HIS-Fc载体中。PCR反应混合物准备如下。混合100ng的模板DNA、2.5单位的pfu聚合酶(Genotech,Korea)、10pmole/50μl的每个引物和蒸馏水，制得最终体积为50μl。PCR进行如下：94℃下预变性2分钟，94℃下变性30秒，55℃下退火30秒，72℃下聚合1分钟，从变性到聚合循环30次，并在72℃下最终延伸10分钟。

每一个扩增的PCR产物用SfiI进行消化，随后在37℃下反应4小时。然后通过使用凝胶纯化试剂盒进行纯化。PCR产物与载体以3(150μg):1(50μg)的比率混合，1μlT4DNA连接酶和2μl10×连接酶缓冲液被添加进去，使反应溶液总体积为20μl，随后在16℃下连接16小时。

用连接的质粒转化大肠杆菌DH5α，然后涂布在包含氨苄青霉素的LB平板上，随后在37℃保温箱中孵育16小时。生成的菌落重新悬浮在包含10μl的氨苄青霉素的LB培养基中，随后使用4~5μl培养基作为模板进行菌落PCR。结果证明，编码TNFR2-IL21R融合蛋白的基因被成功亚克隆到表达载体pYK602-HIS-Fc中。

<3-2>TNFR2-IL21R融合蛋白的表达和纯化

293E细胞在500ml的补加了50ml FBS的DMEM中培养，然后以70~80%的汇合度接种在150㎜平板上。TNFR2-IL21R融合蛋白(20μg)与PEI(40μg)以1:2的比率混合，然后在室温下反应20分钟，滴到用于转染的细胞上。16~20小时后，将培养基替换为20ml无血清DMEM，每2~3天取上清液。获得的上清液以5000rpm离心10分钟。把得到的上清液转移到新的瓶子中，将它储存在4℃下，直到纯化。

在第3、5、和7天从10个150mm的平板获得总共600l的上清液，将它继续纯化。所有的上清液用0.22μm顶级过滤器过滤，然后结合到500μl蛋白质A珠子上，所述蛋白质A珠子填充于5ml柱子中。在4℃下通过使用Peri-start泵（0.9ml/分钟）诱导结合反应过夜。柱子用至少100ml的PBS洗涤。通过使用0.1M甘氨酸-HCl进行洗脱，得到6个级份，然后用1M Tris(pH9.0)中和。然后，定量经纯化的蛋白。通过使用amicon ultra收集和浓缩2~3个示出TNFR2-IL21R融合蛋白表达的级份。将缓冲液替换为约10倍量的新鲜PBS(#70011,Gibco,USA)。

结果，如图7所示，总共得到1㎎TNFR2-IL21R融合蛋白(380μg/ml)。

实验例1：测定TNFR2-IL21R融合蛋白和其配体间的结合亲和力

为了测定上述构建的TNFR2-Fc、IL21R-Fc、和TNFR2-IL21R融合蛋白与他们的配体TNF-α之间的拮抗作用，进行结合亲和力试验。

在4℃下用100ng TNF-α(#C001-1MG，enzynomics,Korea)过夜涂布ELISA板(#439454,Nunc,Denmark)的每个孔。完成涂布后，添加200μl含有4%脱脂牛奶(#232100,Difco,France)的PBS到ELISA板的每个孔中，接下来用封闭缓冲液（含4%脱脂牛奶的PBS）在室温下封闭约1小时，以便抑制非特异性反应。完成封闭后，从ELISA板上除去封闭缓冲液。每个纯化的融合蛋白被添加到100μl含有1%脱脂牛奶的PBS中，浓度为100nM，接着进行连续稀释（1/4倍稀释度）。然后，在室温下诱导反应大约2小时。接下来，板用200μl PBS洗涤5次。2μl的抗人Fc-HRP (#31413,Thermo,USA)即第二抗体，被添加到4ml的具有1%脱脂牛奶的PBS中，分配到ELISA板的每个孔中（200μl/孔），接下来在室温下反应1小时。反应完成后，第二抗体从ELISA板中除去，接下来用200μl PBS洗涤5次。如下准备100μl反应混合液：混合10μl过氧化氢溶液(H₂O₂,#H1009-100ML,Sigma,USA)、10μl PC缓冲液[5.1g柠檬酸一水合物,7.3g磷酸钠(pH 5.0)/l]以及1片OPD(#P8787-100TAB Sigma USA)，并添加到板的每个孔中，接下来在暗处于室温下反应10分钟。确认颜色变化之后，通过添加终止缓冲液（50μl/孔）终止反应。在490nm下通过使用ELISA读取器测定Kd值。

结果，如图8所示，TNF-α配体表现出低Kd值，从而表明配体与TNFR2-IL21R融合蛋白具有高亲和力（图8）。

实验例2：TNFR2-IL21R融合蛋白对炎性细胞因子的抑制

<2-1>分离外周血单核细胞

通过使用经肝素处理的注射器从健康人获得血液，然后用PBS以1:1的比率稀释所述血液。以1:4的比率添加Ficoll(Amercham Biosciences,Burkinghamshire,England)到经稀释的血液中，使血液浮在Ficoll层的上面，接下来在20℃下以2000rpm离心30分钟。外周血单核细胞(PBMC)从血沉棕黄层分离。分离出来的细胞用PBS洗涤，然后在补充了10%胎牛血清(Gibco,Burlingame,CA,USA)的RPMI 1640(Gibco BRL)中以1×10⁶个细胞/ml的密度进行稀释。

<2-2>Th17细胞的培养

在实验例<2-1>中获得的PBMC在补加了10%FBS的RPMI1640中以5×10⁵个细胞/500μl的密度进行稀释，分布到48孔平板(Nalgen NuncInternational,IL,USA)的每个孔中。向其中以10μg/ml的浓度加入TNF-α和IL-21拮抗剂TNFR2-Fc、IL21R-Fc、以及TNFR2-IL21R融合蛋白，接下来培养1小时。1小时后，通过使用移液管收集沉积在底部上的细胞，然后转移到涂布了浓度为0.3μg/ml的抗-CD3(BD Pharmingen,San Diego,CA,USA)的48孔板中。为了诱导PBMC分化成Th17细胞，向其中加入IL-6(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA;20ng/ml)、IL-23(R&D Systems;10ng/ml)、以及IL-1β(R&D Systems;5ng/ml)，接下来在37℃、5%CO₂的培育箱中培养。培育72小时，不改变培养基，避免额外刺激。

<2-3>RT-PCR

通过使用RNA zol-B (Molecular Research Center,Cincinnati,OH,USA)从实施例<2-2>中培养72小时的细胞中提取总RNA。1μg的随机引物(Genotech,Daejeon,Korea)被添加到总的2μg RNA中，在70℃下保持5分钟，接下来在冰中速冻。将RNA-引物混合物与4μl的5×M-MULV缓冲液、1μl的10mM dNTP、和0.5μl的RNA酶抑制剂(Takara,Shiga,Japan)混合，9.5μl蒸馏水添加到其中，使反应溶液总体积为19μl。在25℃下诱导反应5分钟，然后向其中加入1μl逆转录酶M-MULV(Takara,Shiga,Japan)。逐步诱导反应（25℃下5分钟，42℃下60分钟，然后在72℃下10分钟），以获取cDNA。

提供使用上述生成的cDNA作为模板进行RT-PCR。每一个样品的RT-PCR反应混合物总体积为25μl[2.5μl10×反应缓冲液，2.5μl0.5mMdNTP，0.3μlTaq(Takara,shinga,apan)，每个引物（正向引物，反向引物）2μl，1μl cDNA，和14.7μl蒸馏水]。双元热循环仪系统(MJ Research)被用于扩增。替代提取的cDNA，将蒸馏水用于阴性对照。通过使用阴性对照（其未产生任何PCR产物），PCR被证实是无污染的。IL-21的PCR扩增如下进行：94℃下预变性3分钟，94℃下变性30秒，56℃下退火30秒，72℃下聚合30秒，从变性到聚合循环30次，并在72℃下最终延伸7分钟。IL-17的PCR扩增如下进行：94℃下预变性3分钟，94℃下变性1分钟，56℃下退火1分钟，72℃下聚合1分钟，从变性到聚合循环30次，并在72℃下最终延伸7分钟。RORc和β-肌动蛋白的PCR扩增如下进行：94℃下预变性3分钟，94℃下变性30秒，60℃下退火30秒，72℃下聚合30秒，从变性到聚合循环30次或26次。通过PCR获得的扩增产品继续在含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶上电泳，提供使用Gel-Doc 2000(Bio-rad Laboratories,Hercules,CA)获得图片。通过浓度测量技术，使用Quantity-One program(Bio-rad)定量扩增产品。得到的值被转换成与β-肌动蛋白的比率，然后比较细胞组之间的mRNA的表达。本文使用的引物序列如下：

IL-21：

5'-CTT ACC TGG CAA GAC CAG TAT GA-3'(SEQ.ID.NO:9);

5'-GTA GAA GGC AGG GTC TTC GTA AT-3'(SEQ.ID.NO:10);

IL-17：

5'-TGA AGT GCT GTC TGG AGC AG-3'(SEQ.ID.NO:11);

5'-TCC TCA GAA TCA TCC ATG TC-3'(SEQ.ID.NO:12);

RORc：

5'-AGT CGG AAG GCA AGA TCA GA-3'(SEQ.ID.NO:13);

5'-CAA GAG AGG TTC TGG GCA AG-3'(SEQ.ID.NO:14);

β-肌动蛋白：

5'-GGA CTT CGA GCA AGA GAT GG-3'(SEQ.ID.NO:15);

5'-TGT GTT GGC GTA CAG GTC TTT G-3'(SEQ.ID.NO:16).

得到的值被转换成与β-actin的比率，然后比较细胞组之间的mRNA的表达。

结果，在分化的Th17细胞中，炎性细胞因子IL-17和IL-21的mRNA表达以及被报道在Th17极化态下的表达的特定转录因子RORc mRNA很高。然而，当Th17细胞用TNFR2-IL21R融合蛋白处理时，IL-17、IL-21、和RORc基因的表达显著地被抑制（图9）。

<2-4>TNFR2-IL21R融合蛋白减少IL-17产生

为了证实IL-17被TNFR2-IL21R融合蛋白减量调节，通过ELISA定量从实施例<2-3>中用TNFR2-IL21R融合蛋白处理的Th17细胞培养基中获得的上清液中炎性细胞因子IL-17。

以2μg/ml（100μl/孔）的浓度添加IL-10抗体(R&D Systems)到96孔板中进行夹心ELISA，接着在室温下反应2小时。向其中加入200μl通过将1%BSA与0.05%PBST[0.05%Tween 20在PBS中]混合制成的封闭缓冲液，接下来在室温下反应2小时。将用作标准物的人重组IL-10(R&D Systems)连续稀释到5,000~78.125pg/ml。向每个孔中添加在实验例<3-1>中获得的细胞培养基上清液（100μl/孔），以和标准物一起测定，接下来在室温下反应2小时。在完成反应后，板的每个孔用300μl0.05%的PBST洗涤4次。生物素缀合的抗人IL-10(R&D Systems)以200ng/m的浓度稀释，按100μl/孔分配到每一个孔中，接下来在室温反应下2小时。完成反应后，板用PBST洗涤4次。ExtraAvidin-碱性磷酸酶缀合物(Sigma,Louis,MO,USA)以1:2000的浓度稀释，按100μl/孔分配到每一个孔中，接下来在室温下反应2小时。用PBST洗涤板后，将100μl磷酸二钠盐六水合物(PNPP)/DEA溶液(1mg/ml)添加到板的每个孔中进一步反应。在完成反应后，向其中添加100μl0.2NNaOH以终止反应，然后测量OD₄₀₅。

结果，如图9所示，当Th17被分化时，炎性细胞因子IL-17的产生增加。但是，相比于其它用TNFR2-Fc和IL21R-Fc处理的细胞组，当用浓度为10μg/ml的本发明TNFR2-IL21R融合蛋白处理这些细胞时，IL-17的产生显著减少（图9）。

实验例3：TNFR2-IL21R融合蛋白增加FoxP3的表达和IL-10的产生

<3-1>TNFR2-IL21R融合蛋白增加FoxP3的表达

为了研究TNFR2-IL21R融合蛋白是否可以增加Treg的功能，通过流式细胞仪测定FoxP3（在Treg细胞中生成的转录因子）的表达，所述Treg是免疫抑制细胞之一，其与自身抗原保持平衡以保护免受自身免疫性影响，同时抑制Th17细胞响应。

用10μg/ml的TNFR2-Fc、IL21R-Fc、以及TNFR2-IL21R融合蛋白处理通过实验例<2-2>中描述的方法分化的Th17细胞，接下来培养1小时。这些细胞在受到如上述相同的刺激后培养3天，用25ng/ml的PMA、250ng/ml的Ionomycine、以及Golgistop(BD Pharmingen,San Diego,CA,USA)处理5个小时。然后，收集这些细胞并且以20μl/1×10⁶个细胞的浓度用多甲藻素叶绿素蛋白(PerCP)抗人CD4(Bioscience,San Diego,CA,USA)抗体和别藻蓝素(APC)抗人CD25(e-Bioscience,San Diego,CA,USA)抗体处理，接下来在暗处在4℃下反应30分钟。用FACS缓冲液（0.002%叠氮化钠,0.2%BSA在PBS中）洗涤细胞。向其中加入1ml透化缓冲液，接下来反应30分钟。在用透化缓冲液洗涤细胞以后，以20μl/1×10⁶个细胞的浓度，用异硫氰酸荧光素-抗人FoxP3(e-Bioscience,San Diego,CA,USA)处理所述细胞，接下来在暗处在4℃下反应30分钟。在用透化缓冲液再次洗涤细胞后，去除上清液，然后向其中加入FACS缓冲液，接下来用流式细胞仪分析(Becton Dickinson,San Diego,CA,USA)。

结果如图10所示，相比于用TNFR2-Fc或IL21R-Fc处理，当用TNFR2-IL21R融合蛋白处理时，最具代表性的Treg转录因子FoxP3的表达显著增加（图10）。

<3-2>TNFR2-IL21R融合蛋白增加IL-10的产生

为了研究TNFR2-IL21R融合蛋白是否可以增加Treg的功能，通过ELISA定量在Treg细胞中产生的抗炎细胞因子IL-10，所述Treg是免疫抑制细胞之一，其与自身抗原保持平衡以保护免受自身免疫性影响，同时抑制Th17细胞响应。

以2μg/ml（100μl/孔）的浓度添加IL-10抗体(R&D Systems)到96孔板中进行夹心ELISA，接着在室温下反应2小时。向其中加入200μl通过将1%BSA与0.05%PBST混合制成的封闭缓冲液，接下来在室温下反应2小时。将用作标准物的人重组IL-10(R&D Systems)连续稀释到5,000~78.125pg/ml。向每个孔中添加在实验例<3-1>中获得的细胞培养基上清液（100μl/孔），以和标准物一起测定，接下来在室温下反应2小时。在完成反应后，板的每个孔用300μl0.05%的PBST洗涤4次。生物素缀合的抗人IL-10(R&DSystems)以200ng/ml的浓度稀释，按100μl/孔分配到每一个孔中，接下来在室温反应下2小时。完成反应后，板用PBST洗涤4次。ExtraAvidin-碱性磷酸酶缀合物(Sigma,Louis,MO,USA)以1:2000的浓度稀释，按100μl/孔分配到每一个孔中，接下来在室温下反应2小时。用PBST洗涤板后，将100μl磷酸二钠盐六水合物(PNPP)/DEA溶液(1mg/ml)添加到板的每个孔中进一步反应。在完成反应后，向其中添加100μl0.2N NaOH以终止反应，然后测量OD₄₀₅。

结果如图10所示，相比于用TNFR2-Fc或IL21R-Fc处理，当将TNFR2-IL21R融合蛋白处理到Th17极化态中时，IL-10的产生显著增加（图10）。

实验例4：TNFR2-IL21R融合蛋白减少破骨细胞的分化

<4-1>破骨细胞的培养

通过使用经肝素处理的注射器从健康人获得血液，然后用PBS以1:1的比率稀释所述血液。以1:4的比率添加Ficoll到经稀释的血液中，使血液浮在Ficoll层的上面，接下来在20℃下以2000rpm离心30分钟。外周血单核细胞从血沉棕黄层分离。分离出来的细胞用PBS洗涤，然后在补充了10%胎牛血清的αMEM(Invitrogen,Burlingame,CA,USA)中进行稀释。这些细胞以5×10⁵个细胞/500μl的浓度分配到24孔板，接下来在37℃、5%CO₂的培养箱中培养2小时。2小时后，除去没有附在底部的细胞。用PBS洗涤后，向其中加入500μl10%的αMEM。用100ng/ml的重组人巨噬细胞/单核细胞菌落形成因子(M-CSF,R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)刺激所述细胞，接下来培养3天。3天后，这些细胞用PBS洗涤并且将培养液替换为新鲜的10%的αMEM。细胞再次用25ng/ml的rhM-CSF和30ng/ml的核因子κB受体活化体配体(RANKL,Peprotech,London,UK)刺激。然后，分别以10μg/ml的浓度，向细胞中加入TNFR2-Fc、IL21R-Fc和TNFR2-IL21R融合蛋白，接下来进一步培养。培养基每3天替换一次，并且再次用上述刺激条件处理。观察细胞分化以确定刺激频率。

<4-2>破骨细胞染色

分化的细胞用TNF-α和IL-21拮抗剂TNFR2-Fc、IL21R-Fc及TNFR2-IL21R融合蛋白处理，以通过与上述相同的方法诱导破骨细胞分化。分化的破骨细胞用10%福尔马林固定。用PBS洗涤细胞三次后，分化的破骨细胞用酒石酸盐耐酸性磷酸酶(TRAP)染色试剂盒(Sigma,Louis,MO,USA)检查。将45ml预热的消毒蒸馏水(37℃)与试剂盒中的500μl枣红色基GBC(fast Garmet GBC Basr)溶液和500μl亚硝酸钠溶液混合。500μl萘酚AS-BI溶液、2ml醋酸溶液、和1ml酒石酸盐溶液被逐步加入到混合溶液中。搅拌均匀后，将混合物按200μl加载到固定的细胞上，接下来在37℃下染色30分钟。通过观察染色程度来控制反应时间。至少含有3个核的TRAP-阳性（红紫色）的多核细胞被视为破骨细胞，其在光学显微镜下鉴定到。用4组细胞至少进行三次实验，结果用平均值±标准差表示。

结果，如图11所示，通过M-CSF和RANKL的刺激，破骨细胞的分化积极进行。然而，相比于用TNFR2-Fc和IL21R-Fc处理，这样的分化被TNFR2-IL21R融合蛋白处理有效地抑制（图11）。

<4-3>组织蛋白酶K的表达

从用TNFR2-Fc、IL21R-Fc、和TNFR2-IL21R融合蛋白处理的分化的细胞中提取RNA，通过与实施例<2-3>中描述的相同方式由所述RNA合成cDNA，以测定组织蛋白酶K的表达。

结果，如图11所示，相比于用TNFR2-Fc和IL21R-Fc处理，通过M-CSF和RANKL刺激诱导的组织蛋白酶K的表达被TNFR2-IL21R融合蛋白处理更为显著地抑制（图11）。

实验例5：CIA小鼠模型中TNFR2-IL21R融合蛋白对关节炎的治疗作用

为了研究本发明的TNFR2-IL21R融合蛋白对关节炎的治疗作用，用TNFR2-IL21R融合蛋白治疗CIA（胶原诱导关节炎）小鼠模型。然后，研究了治疗作用。

具体而言，为了诱导CIA，6周DBA/1J小鼠(OrientBio,Korea)在尾部注射100μg II型胶原(CII))，所述胶原混有相同量的完全弗氏佐剂(CFA)，从而实现初次免疫。每个实验组有6只小鼠。从免疫后的一个星期（7天），通过腹腔注射(I.P.)给小鼠施用50μg IL21R/TNFR2-Fc（TNFR2-IL21R融合蛋白）和100μg依那西普，每星期三次，持续三周（共9次）。从初次免疫后，三位研究人员观察关节炎症，每周三次。通过平均关节炎指数如下进行评估；分等级地给出分数；给出的分数全部相加，再除以4，以得到平均值；将从三位不同的研究人员对于每个小鼠获得的平均值相加，由此得到平均数。一条腿给予25%，在此基础上计算肿胀的腿的数量，从而得到发病率：

0分：没有水肿或者肿胀；

1分：轻度水肿和发红，限于food或踝关节；

2分：轻度水肿和发红，从踝关节到跖骨；

3分：严重水肿和发红，从踝关节到跖骨；

4分：水肿和发红，从脚踝到整条腿。

结果，如图12所示，经观察临床评分和发病率，证实在用本发明的TNFR2-IL21R融合蛋白治疗的CIA小鼠模型中有很好的关节炎治疗作用。这样的治疗作用优于在用传统的关节炎治疗药剂依那西普治疗的阳性对照组中观察到的（图12）。

实验例6：通过免疫组织化学染色证实RNFR2-IL21R融合蛋白对CIA小鼠模型的关节炎的缓解作用

从实验例5中的用TNFR2-IL21R融合蛋白和依那西普治疗的实验CIA小鼠模型组提取关节。进行免疫组织化学染色，以研究关节中的浸润和炎症以及软骨破坏。

具体而言，为了进行免疫组织化学染色，从分别用TNFR2-IL21R融合蛋白和依那西普治疗的CIA小鼠取得关节。然后，关节被固定在10%中性缓冲福尔马林中，并且用EDTA对骨进行脱钙。将关节组织包埋在石蜡中。将石蜡包埋的关节组织制成7μm厚的小片，然后放在载玻片上。染色前，通过使用二甲苯进行脱蜡，同时，用乙醇进行脱水（高浓度→低浓度）。然后用苏木精和曙红进行染色。通过使用番红精O和甲苯胺蓝法测定软骨破坏和炎症，所述番红精O和甲苯胺蓝法可以检测包含在软骨内的蛋白聚糖。

结果，如图13所示，相比于没有用做任何处理，当CIA小鼠模型用TNFR2-IL21R融合蛋白处理时，细胞浸润显著降低。同样通过使用番红精O和甲苯胺蓝法观察到，当用TNFR2-IL21R融合蛋白进行处理时，炎症和软骨破坏也得到缓解（图13）。

实验例7：通过免疫组织化学染色证实TNFR2-IL21R融合蛋白对CIA小鼠模型炎症的缓解作用

从实验例5中用TNFR2-IL21R融合蛋白和依那西普治疗的实验CIA小鼠模型组提取关节。进行免疫组织化学染色，以研究炎性因子的表达。

具体而言，从分别用NFR2-IL21R融合蛋白和依那西普治疗的CIA小鼠取得关节。然后，关节被固定在10%中性缓冲福尔马林中，并且用EDTA对骨进行脱钙。将关节组织包埋在石蜡中。将石蜡包埋的关节组织制成7μm厚的小片，然后放在载玻片上。染色前，通过使用二甲苯进行脱蜡，同时，用乙醇进行脱水（高浓度→低浓度）。通过免疫组织化学法染色的方法，对炎性细胞因子IL-17、TNF-α、IL-1β、和IL-6以及核因子-κB受体活化体(RANK)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)进行染色，然后在光学显微镜下观察。

结果，如图14所示，相比于其它没有用融合蛋白治疗的CIA小鼠模型组，在用本发明的TNFR2-IL21R融合蛋白治疗的组中，炎性细胞因子IL-17、TNF-α、IL-1β、和IL-6的表达均减少。此外，几乎没有观察到对血管生成最重要的因子VEGF的表达，以及显示破骨细胞分化的RANK。在用TNFR2-IL21R融合蛋白治疗的组中，炎性细胞因子VEGF和RANK的这种表达情况和依那西普治疗组的情况一致，从而表明，本发明的TNFR2-IL21R融合蛋白也可以有效地用于治疗关节炎（图14）。

实验例8：CIA小鼠模型中CII特异性IgG2a的产生

用于实验例5的CIA小鼠模型通过一次注射II型胶原(CII)进行免疫。然后，给该动物施用本发明的TNFR2-IL21R融合蛋白，每周3次，持续三周（共9次）。在给药期间测量血液CII。

将与相同数量的完全弗氏佐剂(CFA)混合的100μg CII注射到DAB老鼠的尾部。一个星期后，给小鼠施用本发明的TNFR2-IL21R融合蛋白三周共9次。在TNFR2-IL21R融合蛋白给药前(0)、第一次给药后、第六次给药后、以及最后一次给药后的6~12小时之内，从小鼠的眼睛取血。为了测定CII-特异性IgG2a的量，将CII抗体以1:1000的比率稀释，用稀释液涂布96孔板，接下来反应2小时。除去涂布缓冲液后，将200μl封闭缓冲液添加到每个孔中，接下来在室温下反应1小时。然后，稀释实验组或对照组的血清，然后加入孔中（50μl/孔），接下来在室温下反应1小时。在用IgG洗涤缓冲液洗涤板5次后，向其中添加抗小鼠IgG HRP(1:75,000)（50μl/孔），接下来在室温下反应1小时。完成反应后，用IgG洗涤缓冲液洗涤板5次，接下来与TMB底物溶液反应。通过使用1N H₂SO₄终止颜色变化，然后用ELISA读取器测定OD₄₅₀。

结果，如图15所示，在没有用任何Fc融合蛋白治疗的CIA小鼠模型组中，CII-特异性IgG2a的量随时间的变化不改变。然而，在用TNFR2-IL21R融合蛋白治疗的组中，CII-特异性IgG2a的量随着给药次数而减少。此外，在用依那西普治疗的组中，在第一次给药后OD值似乎有略微增加，但是在再次给予依那西普后开始减少（图15）。

实验例9：CIA小鼠模型脾脏中Th17和Treg细胞表达的测定

为了研究本发明的TNFR2-IL21R融合蛋白对CIA小鼠模型中Th17和Treg细胞表达的作用，从用于实验例5的小鼠提取脾组织。然后，通过免疫染色的共焦显微术观察Th17(CD4+IL-17+)和Treg(CD4+CD25+Foxp3+)细胞。

具体而言，从实验例5中的CIA小鼠模型提取脾脏，然后用OCT化合物包埋。通过使用液氮速冻组织，用cryotome切成7μm的小片，然后放在载玻片上。用丙酮固定放在载玻片上的小片，然后通过使用10%正常山羊血清封闭非特异性反应30分钟。通过使用PE标记的抗-CD4抗体、别藻蓝素标记的抗-CD25抗体(BD Biosciences)、以及FITC标记的抗-Foxp3Ab抗体进行Treg标记物CD4、CD25、和Foxp3的染色。通过使用生物素化的抗-CD4抗体(BD Biosciences)和PE标记的抗-IL-17抗体进行Th17标记物CD4和IL-17的染色。所述抗体在PBS(pH 7.5)以1:100的比率稀释，接下来与放在载玻片上的组织在4℃下反应过夜。第二天，与生物素化的抗-CD4抗体反应的组织再与链霉亲和素cy-3在室温下反应2小时。用PBS洗涤载玻片3次后，在共焦显微镜(LSM 510Meta.Zeiss,Gottingen,Germany)下观察染色的组织。

结果，如图16所示，相比于没有做任何治疗的CIA小鼠模型，在从用本发明的TNFR2-IL21R融合蛋白治疗的CIA小鼠模型中获得的脾组织中，Foxp3+细胞的数量增加。与此同时，相比于没有做任何治疗的CIA小鼠模型，在用TNFR2-IL21R融合蛋白或依那西普治疗的组中，Th17(CD4+IL-17+)的表达降低（图16）。

本发明组合物的制备实施例的描述如下。

制备例1：药物制剂的制备

<1-1>散剂的制备

TNFR2-IL21R融合蛋白 2g

乳糖 1g

通过混合上述所有组分制备散剂，按照用于制备散剂的常规方法将它们填充到密闭包装中。

<1-2>片剂的制备

按照用于制备片剂的常规方法，通过混合上述所有组分制备片剂。

<1-3>胶囊剂的制备

通过混合上述所有组分，按照用于制备胶囊剂的常规方法将他们填充到明胶胶囊中，制备胶囊剂。

<1-4>丸剂的制备

通过混合上述所有组分按照用于制备丸剂的常规方法，制备丸剂。每每颗药丸含有4g混合物。

<1-5>颗粒剂的制备

混合上述所有组分，加入100mg 30%的乙醇。混合物在60℃下干燥，然后将制备好的颗粒填充到包装中。

工业实用性

如上文所述，本发明的TNFR2-IL21R融合蛋白抑制Th17细胞中炎性细胞因子IL-17（最具代表性的自身免疫疾病之一的类风湿性关节炎的主要成因之一）的分泌，增加Treg细胞中FoxP3的表达，增加抗炎细胞因子IL-10的分泌，抑制组织蛋白酶K的表达，并且抑制破骨细胞的分化。因此，表明了本发明的TNFR2-IL21R融合蛋白显示出比TNFR2-Fc或IL21R-Fc更好的作用。当给CIA（胶原诱导关节炎）动物模型施用本发明的TNFR2-IL21R融合蛋白时，它抑制关节中的浸润和炎症，减少软骨破坏，增加免疫抑制细胞Treg的表达，并显示出了对自身免疫类风湿性关节炎的治疗作用。因此，本发明的TNFR2-IL21R融合蛋白可以有效地用作用于预防和治疗自身免疫疾病的组合物的活性成分。

本领域技术人员将会理解，在前面描述中公开的概念和具体实施方式可以容易地用作基础，以进行修改或设计其它与本发明具有相同目的的实施方案。本领域技术人员将会理解，这种等价的实施方案不偏离在所附权利要求书中说明的本发明的精神和范围。