WO2014021693A2 - Tm4sf5 단백질에 특이적으로 결합하는 신규한 단일클론항체 및 이의 용도 - Google Patents

Tm4sf5 단백질에 특이적으로 결합하는 신규한 단일클론항체 및 이의 용도 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a novel monoclonal antibody that specifically binds to a transmembrane 4 L six family member 5 (TM4SF5) protein, specifically a monoclonal antibody that specifically binds to a human TM4SF5 protein, the monoclonal antibody
  • TM4SF5 transmembrane 4 L six family member 5
  • the present invention relates to a method of treatment, a method of inhibiting metastasis of liver cancer, a method for diagnosing cancer using the monoclonal antibody, and a kit for diagnosing cancer comprising the monoclonal antibody.
  • the transmembrane 4 superfamily (TM4SF) protein is a group of about 25-50 kDa hydrophobic proteins with four transmembrane domains, two extracellular loops, and two short cytoplasmic tail sites. Also called tetraspanin or tetraspan.
  • TM4SF5 transmembrane 4 L six family member 5 or Four-transmembrane L6 superfamily member 5
  • TM4SF5 is a member of the tetraspanin group, which is a water-insoluble protein that contains four regions of the cell membrane and two extracellular structures and cytoplasm It has one ring structure and two terminal structures present in it.
  • the TM4SF5 is a homologue of TM4SF1 (tumor-associated antigen L6), and the mRNA of TM4SF5 is known to be highly overexpressed in pancreatic cancer, gastric cancer, colon cancer and soft tissue sarcoma.
  • TM4SF5 protein when artificial expression of TM4SF5 protein in COS7 cells, actin reorganization and focal adhesion turnover occur, resulting in TM4SF5 being involved in cell migration through epithelial-mesenchymal transition (EMT).
  • EMT epithelial-mesenchymal transition
  • the TM4SF5 protein has been estimated to be a cancer-related gene because of its high amino acid sequence homology with L6, a cancer-related gene, and has been reported to be involved in the development and progression of cancer.
  • TM4SF5 is involved in cell proliferation by promoting the progression of the G1 / S cycle through intracellular p27Kip1 expression and RhoA GTPase activity (Kim H et al., Biochim Biophys Acta 2010 1803 (8): 975-82).
  • Cross-talk between TGF- ⁇ 1 (transforming growth factor- ⁇ 1) and epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling pathways is known to induce expression of TM4SF5 resulting in EMT ( Kang M et al., Biochem J 2012 443 (3): 691-700).
  • TM4SF5 has emerged as a specific protein and anti-cancer target for new cancer diagnosis, and research on a method for diagnosing cancer by targeting TM4SF5 has been conducted.
  • studies have been made to inhibit the biological activity of TM4SF5 in various parts.
  • research has been conducted on compounds that inhibit TM4SF5, and for example, chalcone compounds substituted with sulfonamide and sulfonate groups have been reported to inhibit biological activity by TM4SF5 (Korea Patent No. 10-0934706) ).
  • the present inventors have made intensive efforts to develop monoclonal antibodies that specifically bind to human TM4SF5 protein and can effectively inhibit biological activity such as promoting the transfer of TM4SF5 protein.
  • the monoclonal antibody was newly prepared, and it was confirmed that the antibody can effectively block the biological activity of TM4SF5, and completed the present invention.
  • One object of the present invention is to provide a monoclonal antibody that specifically binds to TM4SF5 (transmembrane 4 L six family member 5) protein.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing the monoclonal antibody.
  • Still another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding the monoclonal antibody, an expression vector including the polynucleotide, and a transformant into which the vector is introduced.
  • Still another object of the present invention is to provide a composition comprising the monoclonal antibody.
  • Still another object of the present invention is to provide a cancer diagnostic kit comprising the monoclonal antibody.
  • Still another object of the present invention is to provide a method of treating cancer using the monoclonal antibody.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for inhibiting liver cancer metastasis, comprising administering the monoclonal antibody to a subject suspected of having liver cancer.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for diagnosing cancer, comprising detecting the TM4SF5 protein in an isolated biological sample of an individual suspected of cancer by using the monoclonal antibody.
  • Monoclonal antibodies specific for TM4SF5 according to the present invention exhibit a strong affinity for human TM4SF5 and effectively inhibit the biological activity of TM4SF5, such as inducing cancer metastasis by binding to the EC2 site of TM4SF5, thereby preventing diseases mediated by TM4SF5, such as It can be usefully used in the diagnosis or treatment of cancer, especially diseases such as liver cancer.
  • FIG. 1A is a schematic diagram showing the structure of a fusion protein construct, ie, an antigenic protein construct, used in the production of an anti-TM4SF5 antibody of the present invention. It consists of amino acid region 157, His-tag, thrombin cleavage site (TCS), immunoglobulin Fc fragment, and Myc-tag.
  • Figure 1B is a diagram confirming the expression and purification of the antigen protein by SDS-PAGE
  • Figure 1C shows a flow chart of the antibody screening process of the present invention.
  • FIG. 2 shows phage ELISA results of ELISA of 96 clones panned from the HBX library, of which 20 clones were positive for TM4SF5 EC2.
  • Figure 3 shows the results of analyzing the nucleotide sequence of the selected clones and the human germline immunoglobulin use type of the antibody variable portion.
  • Fig. 5 shows the results of analyzing the binding force of the anti-TM4SF5 antibody of the present invention.
  • 5a and b show the results of FACS analysis on control cell lines (Cp)
  • FIGS. 5c and d show the results of FACS analysis on TM4SF5-expressing cell lines (Tp).
  • Figure 5e shows the results of Western blot analysis.
  • FIG. 6 shows the results of purification of five antibodies (# 1, 27, 79, 88, 92) of the present invention using affinity chromatography, and chromatographic elution of # 79, 88, and 92. ) And the results obtained by quantifying the five antibodies and then gel (gel).
  • Figure 7 shows the results of analysis of the binding capacity of the anti-TM4SF5 antibody (# 1, # 27 and # 79) of the present invention to the control cell line (Cp) and TM4SF5 overexpressing cell lines Tp, T3, T7 and T16 by FACS will be.
  • FIG. 8 shows the results of immunocytochemical analysis using the anti-TM4SF5 antibody and one negative control antibody (HAV) of the present invention.
  • FIG. 8A shows the immunocytochemical analysis of the negative control antibody (HAV)
  • FIG. 8B shows the immunocytochemical analysis of the anti-TM4SF5 antibody # 1
  • FIG. 8C shows the immunocytochemical analysis of # 27, and
  • FIG. 8D The immunocytochemical analysis of # 79
  • Figure 8e shows the immunocytochemical analysis of # 88
  • Figure 8f shows the immunocytochemical analysis of # 92.
  • Tp, T7 and T16 represent TM4SF5 overexpressing cells and Cp represents control cells.
  • Figure 9 shows the results of immunocytochemical analysis using commercially available anti-human TM4SF5 polyclonal antibody (Proteintech group 18239-1-AP).
  • 10A-C show the results of co-immunocytochemistry using anti-Flag antibodies as anti-TM4SF5 antibodies and control antibodies of the present invention in Flag-tagged TM4SF5 (Flag-TM4SF5) overexpressing cell lines. will be.
  • FIG. 12 is a diagram confirming the change in the mobility of Huh7 liver cancer cells by # 1, a representative anti-TM4SF5 antibody of the present invention.
  • Figure 13a and b shows the results confirmed by the Wound healing assay, the effect of the anti-TM4SF5 antibody of the present invention on cell mobility.
  • Figure 15 shows the results of liver tissue staining of CCl4-mediated liver fibrosis animal model using # 27, a representative anti-TM4SF5 antibody of the present invention (A) and TM4SF5 protein expressed in human Chang hepatocytes.
  • Figure (B) shows the result of confirming whether or not with FACS.
  • the present invention provides monoclonal antibodies that specifically bind to transmembrane 4 L six family member 5 (TM4SF5) proteins.
  • antibody refers to a protein molecule that acts as a receptor that specifically recognizes an antigen, including an immunoglobulin molecule that is immunologically reactive with a specific antigen, including polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, It includes both whole antibodies and antibody fragments.
  • the term also includes chimeric antibodies, humanized antibodies and bivalent or bispecific molecules (eg, bispecific antibodies), diabodies, triabodies and tetrabodies.
  • the total antibody is a structure having two full length light chains and two full length heavy chains, each of which is linked by heavy and disulfide bonds.
  • the total antibody includes IgA, IgD, IgE, IgM and IgG, and IgG is a subtype, including IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4.
  • the antibody fragment refers to a fragment having an antigen binding function, and includes Fab, Fab ', F (ab') 2, Fv and the like.
  • the Fab has one antigen binding site in a structure having a variable region of the light and heavy chains, a constant region of the light chain, and a first constant region of the heavy chain (CH1 domain).
  • F (ab ') 2 antibodies are produced when the cysteine residues of the hinge region of Fab' form disulfide bonds.
  • Fv (variable fragment) means a minimum antibody fragment having only the heavy chain variable region and light chain variable region.
  • Double-chain Fv (dsFv) is a disulfide bond is linked to the heavy chain variable region and light chain variable region, and short-chain Fv (scFv) is generally covalently linked to the variable region of the heavy chain and the light chain through a peptide linker.
  • Such antibody fragments can be obtained using proteolytic enzymes (e.g., the entire antibody can be restricted to papain and Fab can be obtained, and pepsin can yield F (ab ') 2 fragment). Can be produced through genetic recombination techniques.
  • the term “monoclonal antibody” refers to an antibody molecule of a single molecular composition obtained from substantially the same antibody population, which monoclonal antibody exhibits single binding specificity and affinity for a particular epitope.
  • immunoglobulins have heavy and light chains and each heavy and light chain comprises a constant region and a variable region (the site is also known as a domain).
  • the variable regions of the light and heavy chains comprise three multivariable regions and four framework regions (FRs) called complementarity-determining regions (hereinafter referred to as "CDRs").
  • the CDRs mainly serve to bind epitopes of antigens.
  • the CDRs of each chain are typically called CDR1, CDR2, CDR3, starting sequentially from the N-terminus and also identified by the chain in which the particular CDR is located.
  • the monoclonal antibody may be in the form of a chimeric or humanized antibody having reduced immunogenicity for application to the human body as described above.
  • chimeric antibody refers to an antibody in which a variable region of a mouse antibody and a constant region of a human antibody are recombined by a DNA recombination technique, and the immune response of the chimeric antibody is directed to a mouse antibody. As it is greatly improved compared to the above, it can be used clinically.
  • the term "humanized antibody” refers to an antibody in which all or part of a CDR sequence of a mouse monoclonal antibody is implanted into a human antibody.
  • CDRs of a mouse monoclonal antibody are derived from a human antibody.
  • the humanized variable region may be prepared by recombination with a FR of the human antibody, and may be prepared by recombining with a constant region of a preferred human antibody, but is not limited thereto.
  • the affinity of the humanized antibody is decreased, so that the affinity may be enhanced by substituting the amino acid of the mouse antibody for the FR amino acid residue, which may be thought to affect the three-dimensional structure of the CDR.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the term "monoclonal antibody that specifically binds to TM4SF5 (transmembrane 4 L six family member 5) protein” refers to an antibody capable of binding to TM4SF5 protein and inhibiting biological activity of TM4SF5 protein. Can be used in combination with an anti-TM4SF5 antibody.
  • the monoclonal antibody that specifically binds to the TM4SF5 protein includes any monoclonal antibody that binds to TM4SF5 and inhibits the biological activity of TM4SF5.
  • the form of the monoclonal antibody may include both the whole antibody and the antibody fragment as described above, but may be a chimeric antibody or a humanized antibody, but is not limited thereto.
  • the monoclonal antibody of the present invention specifically binds to extracellular loop 2 or extracellular domain 2 (EC2) of TM4SF5, inhibits signaling by TM4SF5, and inhibits biological activity such as EMT induction by TM4SF5. It can be usefully used in the prevention or treatment of diseases such as cancer involved.
  • TM4SF5 extracellular loop 2 or extracellular domain 2
  • the antibody of the present invention that can specifically bind TM4SF5 has a high sensitivity and specificity in the diagnosis of cancer, and therefore, It can be useful for diagnosis.
  • a monoclonal antibody that specifically binds to TM4SF5 of the present invention was prepared using a fusion protein including the TM4SF5 EC2 site, that is, the sites of TM4SF5 amino acids 113-157 as an antigenic protein (FIG. 1). ).
  • Monoclonal antibodies that specifically bind to the TM4SF5 protein are preferably heavy chain CDR1 as set forth in SEQ ID NO: 2; Heavy chain CDR2 set forth in SEQ ID NO: 3; And a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR3 as set out in SEQ ID NO: 4 and a light chain CDR1 as set out in SEQ ID NO: 6; Light chain CDR2 set forth in SEQ ID NO: 7; And a light chain variable region comprising a light chain CDR3 as set forth in SEQ ID NO: 8, more preferably a single antibody comprising a heavy chain variable region as set out in SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region as set out in SEQ ID NO: 5 It may be a clone antibody, but is not limited thereto.
  • the monoclonal antibody comprising the heavy chain variable region amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the light chain variable region amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 is named # 1.
  • the polynucleotide encoding the monoclonal antibody may include, but is not limited to, a polynucleotide sequence encoding a heavy chain variable region as set out in SEQ ID NO: 9 and a polynucleotide sequence encoding a light chain variable region as set out in SEQ ID NO: 10.
  • Monoclonal antibodies that specifically bind to the TM4SF5 protein are preferably heavy chain CDR1 as set forth in SEQ ID NO: 2; Heavy chain CDR2 set forth in SEQ ID NO: 3; And a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDR3 as set out in SEQ ID NO: 12 and a light chain CDR1 as set out in SEQ ID NO: 14; Light chain CDR2 set forth in SEQ ID NO: 15; And a light chain variable region comprising a light chain CDR3 as set forth in SEQ ID NO: 16, which may be a monoclonal antibody, more preferably a single comprising a heavy chain variable region as set out in SEQ ID NO: 11 and a light chain variable region as set out in SEQ ID NO: 13 Clone antibodies, but not limited thereto.
  • the monoclonal antibody comprising the heavy chain variable region amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 and the light chain variable region amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 was named # 27.
  • the polynucleotide encoding the monoclonal antibody may include, but is not limited to, a polynucleotide sequence encoding a heavy chain variable region as set out in SEQ ID NO: 17 and a polynucleotide sequence encoding a light chain variable region as set out in SEQ ID NO: 18.
  • monoclonal antibodies that specifically bind to the TM4SF5 protein are preferably heavy chain CDR1 as set forth in SEQ ID NO: 2; Heavy chain CDR2 set forth in SEQ ID NO: 3; And a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDR3 as set out in SEQ ID NO: 20 and a light chain CDR1 as set out in SEQ ID NO: 14; Light chain CDR2 set forth in SEQ ID NO: 15; And a light chain variable region comprising a light chain CDR3 as set forth in SEQ ID NO: 22, which may be a monoclonal antibody, more preferably a single comprising a heavy chain variable region as set out in SEQ ID NO: 19 and a light chain variable region as set out in SEQ ID NO: 21 Clone antibodies, but not limited thereto.
  • a monoclonal antibody comprising a heavy chain variable region amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 and a light chain variable region amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 is named # 79.
  • the polynucleotide encoding the monoclonal antibody may include, but is not limited to, a polynucleotide sequence encoding a heavy chain variable region as set out in SEQ ID NO: 23 and a polynucleotide sequence encoding a light chain variable region as set out in SEQ ID NO: 24.
  • monoclonal antibodies that specifically bind to the TM4SF5 protein are preferably heavy chain CDR1 as set forth in SEQ ID NO: 2; Heavy chain CDR2 set forth in SEQ ID NO: 3; And a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDR3 as set out in SEQ ID NO: 26 and a light chain CDR1 as set out in SEQ ID NO: 14; Light chain CDR2 set forth in SEQ ID NO: 15; And a light chain variable region comprising the light chain CDR3 as set forth in SEQ ID NO: 28, which may be a monoclonal antibody, more preferably a single comprising a heavy chain variable region as set out in SEQ ID NO: 25 and a light chain variable region as set out in SEQ ID NO: 27 Clone antibodies, but not limited thereto.
  • a monoclonal antibody comprising a heavy chain variable region amino acid sequence as set out in SEQ ID NO: 25 and a light chain variable region amino acid sequence as set out in SEQ ID NO: 27 was designated as # 88.
  • the polynucleotide encoding the monoclonal antibody may include, but is not limited to, a polynucleotide sequence encoding a heavy chain variable region as set out in SEQ ID NO: 29 and a polynucleotide sequence encoding a light chain variable region as set out in SEQ ID NO: 30.
  • monoclonal antibodies that specifically bind to the TM4SF5 protein are preferably heavy chain CDR1 as set forth in SEQ ID NO: 32; A heavy chain CDR2 set forth in SEQ ID NO: 33; And a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR3 as set out in SEQ ID NO: 34 and a light chain CDR1 as set out in SEQ ID NO: 36; Light chain CDR2 set forth in SEQ ID NO: 15; And a light chain variable region comprising a light chain CDR3 as set forth in SEQ ID NO: 37, which may be a monoclonal antibody, more preferably a single comprising a heavy chain variable region as set out in SEQ ID NO: 31 and a light chain variable region as set out in SEQ ID NO: 35 Clone antibodies, but not limited thereto.
  • the monoclonal antibody comprising the heavy chain variable region amino acid sequence of SEQ ID NO: 31 and the light chain variable region amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 was named # 92.
  • the polynucleotide encoding the monoclonal antibody may include, but is not limited to, a polynucleotide sequence encoding a heavy chain variable region as set out in SEQ ID NO: 38 and a polynucleotide sequence encoding a light chain variable region as set out in SEQ ID NO: 39.
  • the monoclonal antibody of the present invention comprises a constant region
  • it may include a constant region derived from IgG, IgA, IgD, IgE, IgM or combinations thereof or hybrids thereof.
  • dimers or multimers can be formed from two or more constant regions selected from the group consisting of constant regions of IgG, IgA, IgD, IgE and IgM.
  • hybrid means that there is a sequence corresponding to two or more immunoglobulin heavy chain constant regions of different origin within a single chain immunoglobulin heavy chain constant region, for example IgG, IgA, IgD, IgE. And one to four domains selected from the group consisting of CH1, CH2, CH3 and CH4 of IgM.
  • IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 heavy chain constant regions which are subtypes of IgG.
  • the combination and hybridization are as described above.
  • the monoclonal antibody specific for TM4SF5 of the present invention includes a light chain constant region
  • the light chain constant region may be derived from lambda ( ⁇ ) or kappa ( ⁇ ) light chain, but is not limited thereto.
  • TM4SF transmembrane 4 L six family member 5
  • TM4SF transmembrane 4 superfamily
  • TM4SF transmembrane 4 superfamily
  • the TM4SF5 protein has four ring regions that pass through the cell membrane, two ring structures present outside the cell, and one ring structure and two terminal structures present in the cytoplasm, and EC1 (first external) among two ring structures existing outside the cell.
  • EC2 second external loop, extracellular loop 2 is longer than the loop and extracellular loop 1), and major amino acid residues in EC2 are involved in the interaction with other molecules.
  • the TM4SF5 protein is not particularly limited in kind, but may preferably be a human TM4SF5 protein.
  • the TM4SF5 protein includes, but is not limited to, both native or variant TM4SF5 protein.
  • the native TM4SF5 protein generally refers to a polypeptide comprising an amino acid sequence of a native TM4SF5 protein, and the amino acid sequence of the native TM4SF5 protein generally refers to an amino acid sequence found in a naturally occurring TM4SF5 protein.
  • the information on TM4SF5 may be obtained from a known database such as GenBank of the National Institutes of Health.
  • the TM4SF5 may be information about a TM4SF5 protein having an Accession Number of NP_003954 (Gene ID: 9032), but is not limited thereto.
  • the TM4SF5 protein is known to be overexpressed in colorectal cancer, liver cancer, or pancreatic cancer, and in cancer, the TM4SF5 protein induces an epithelial-mesenchymal transition (EMT) involved in the development, invasion, or metastasis of cancer, resulting in cell contact growth. Loss of contact inhibition is known to result in multilayer proliferation (Lee SA et al., J Clin Invest 2008, 118 (4): 1354-66).
  • EMT epithelial-mesenchymal transition
  • TM4SF5 expressed in cancer cells interact internally with integrin alpha 5 to activate FAK / c-Src / STAT3 signaling, which is an important factor in angiogenesis.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • TM4SF5 vascular endothelial growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • angiogenesis of vascular endothelial cells Choi S et al., Blood 2009 113 (8): 1845-55. Therefore, substances that inhibit the function of TM4SF5 may exhibit an anticancer effect (Korean Patent No. 10-0934706).
  • monoclonal antibodies that specifically bind to the TM4SF5 protein of the present invention can be effectively used for the prevention or treatment of cancer.
  • monoclonal antibodies # 1, # 27, # 79, # 88 and # 92 which specifically bind to TM4SF5, were constructed, and the five antibodies specifically bind to TM4SF5.
  • TM4SF5 polyclonal antibody Fig. 5, Figs. 7 to 10
  • the antibody of the present invention significantly reduces cell invasion and cell migration in TM4SF5 overexpressed hepatocellular carcinoma cell line, and the representative antibody # 1 of the present invention reduces the mobility of Huh7 cells expressing TM4SF5 by about 45%.
  • FIGGS. 11-13 show that are shown (FIGS. 11-13).
  • the antibodies of the present invention was found to reduce cell growth by 30 to 50% in the absence of serum (FIG. 14). Poorly, # 27, a representative antibody of the present invention, resulted in effective staining of mouse liver tissue expressing TM4SF5 by inducing liver fibrosis, confirming that the TM4SF5 protein can be effectively detected. In addition, when TGF-beta was induced in human Chang hepatocytes to induce the expression of TM4SF5 protein, it showed the result of effectively detecting TM4SF5 protein (FIG. 15).
  • the present invention provides a method for producing the monoclonal antibody.
  • the monoclonal antibodies of the present invention can be easily prepared by known monoclonal antibody production techniques.
  • methods for preparing monoclonal antibodies can be performed by preparing hybridomas using B lymphocytes from immunized animals (Koeher and Milstein, 1976, Nature, 256: 495), or phage display (phage). display) technology, but is not limited thereto.
  • An antibody library using phage display technology is a method of expressing an antibody on a phage surface by obtaining an antibody gene from B lymphocytes without producing hybridomas.
  • Phage display technology can overcome many of the existing difficulties associated with generating monoclonal antibodies by B-cell immortalization.
  • phage display technology includes the steps of: 1) inserting oligonucleotides of random sequence into the gene region corresponding to the coat protein pIII (or pIV) N-terminus of the phage; 2) expressing a fusion protein of a portion of the native coat protein and a polypeptide encoded by the oligonucleotide of the random sequence; 3) treating the receptor material capable of binding the polypeptide encoded by the oligonucleotide; 4) eluting peptide-phage particles bound to the receptor using low pH or binding competitive molecules; 5) amplifying the eluted phage in the host cell by panning; 6) repeating the method to obtain the desired amount; And 7) determining the sequence of the active peptide from the DNA sequence of the phage clones selected by panning.
  • the method for producing the monoclonal antibody of the present invention can be carried out using phage display technology.
  • phage display techniques such as Barbas et al. (METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 2: 119, 1991 and J. Virol. 2001 Jul; 75 (14): 6692-9) and Winter et al. (Ann. (Rev. Immunol. 12: 433, 1994) can be easily carried out with reference to the method known in the paper, etc.
  • Phages that can be used to build antibody libraries include, but are not limited to, fd, M13, f1, If1, Ike, Zj / Z, Ff, Xf, Pf1 or Pf3 phages, for example as filamentous phages. It doesn't happen.
  • a vector that can be used for expression of a heterologous gene on the surface of the filamentous phage includes, for example, phage vectors such as fUSE5, fAFF1, fd-CAT1 or fdtetDOG or phagemids such as pHEN1, pComb3, pComb8 or pSEX.
  • Vectors include, but are not limited to.
  • helper phages that may be used to provide the wild type envelope protein required for successful reinfection of recombinant phage for amplification include, for example, M13K07 or VSCM13, but are not limited thereto.
  • Polynucleotides encoding monoclonal antibodies or phage display clones derived from hybridomas of the present invention can be readily isolated and sequenced using conventional procedures. For example, oligonucleotide primers designed to specifically amplify the heavy and light chain coding regions from hybridoma or phage template DNA can be used. Once the polynucleotide is isolated, it can be put into an expression vector, which can then be introduced into a suitable host cell to produce the desired monoclonal antibody from the transformed host cell (ie, transformant).
  • the method for producing the monoclonal antibody of the present invention may be a method for producing a monoclonal antibody, including, but not limited to, amplifying an expression vector including a polynucleotide encoding a monoclonal antibody.
  • the present invention provides a polynucleotide encoding the monoclonal antibody, an expression vector comprising the polynucleotide, and a transformant into which the vector is introduced.
  • the monoclonal antibody is as described above.
  • Expression vectors comprising the polynucleotide encoding the monoclonal antibody provided in the present invention is not particularly limited, mammalian cells (eg, human, monkey, rabbit, rat, hamster, mouse cells, etc.), plant cells Can be a vector capable of replicating and / or expressing the polynucleotide in eukaryotic or prokaryotic cells, including yeast cells, insect cells or bacterial cells (e.g., E. coli, etc.), preferably in the host cell
  • the vector may be a vector operably linked to an appropriate promoter so that the nucleotides can be expressed and comprising at least one selection marker.
  • the polynucleotide may be introduced into a phage, plasmid, cosmid, mini-chromosome, virus or retroviral vector.
  • the expression vector including the polynucleotide encoding the monoclonal antibody is an expression vector containing all of the polynucleotide encoding the heavy or light chain of the monoclonal antibody or an expression vector including all of the polynucleotide encoding the heavy or light chain Can be.
  • the transformant introduced with the expression vector provided by the present invention is not particularly limited thereto, but the bacterial cells such as E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium transformed by introducing the expression vector; Yeast cells; Fungal cells such as Pchia pastoris; Insect cells such as Drozophila and Spodoptera Sf9 cells; Chinese hamster ovary cells (CHO), SP2 / 0 (mouse myeloma), human lymphoblastoid, COS, NSO (mouse myeloma), 293T, bow melanoma cells, HT-1080, BHK ( Animal cells such as baby hamster kidney cells, baby hamster kidney cells, HEK (human embryonic kidney cells), and PERC.6 (human retinal cells); Or plant cells.
  • the bacterial cells such as E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium transformed by introducing the expression vector
  • Yeast cells Fungal cells such as Pchia pastoris
  • introduction refers to a method of delivering a vector comprising a polynucleotide encoding the monoclonal antibody to a host cell.
  • introductions include calcium phosphate-DNA coprecipitation, DEAE-dextran-mediated transfection, polybrene-mediated transfection, electroshock, microinjection, liposome fusion, lipofectamine and protoplast fusion. It can be carried out by various methods known in the art.
  • transduction refers to the delivery of a target product into cells using viral particles by means of infection.
  • the vector can be introduced into the host cell by gene bombardment or the like. Introduction in the present invention can be used interchangeably with transformation.
  • the present invention provides a composition comprising the monoclonal antibody.
  • the composition may be in the form of a pharmaceutical composition or a diagnostic composition.
  • the composition may be a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer.
  • the monoclonal antibody of the present invention specifically binds to TM4SF5 and effectively blocks signaling mediated by TM4SF5, thereby inhibiting the biological activity involved in the development or metastasis of cancer such as EMT, thereby participating in the prevention or treatment of cancer.
  • TM4SF5 and monoclonal antibodies are as described above.
  • cancer includes any type of cancer that expresses TM4SF5 protein, but is not limited to, for example, esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer, rectal cancer, oral cancer, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, lung cancer, colon cancer, breast cancer, cervical cancer, Endometrial cancer, ovarian cancer, prostate cancer, testicular cancer, bladder cancer, kidney cancer, liver cancer, pancreatic cancer, bone cancer, connective tissue cancer, skin cancer, brain cancer, thyroid cancer, leukemia, Hodgkin's disease, soft tissue sarcoma , Lymphoma or multiple myeloma hematologic cancer.
  • prevention may mean any action that inhibits or delays the onset of cancer by administration of the composition.
  • treatment in the present invention may mean any action that improves or advantageously changes the symptoms of cancer by administration of the composition.
  • the pharmaceutical composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the term "pharmaceutically acceptable carrier” refers to a carrier or diluent that does not irritate an organism and does not inhibit the biological activity and properties of the administered compound.
  • Acceptable pharmaceutical carriers in compositions formulated as liquid solutions are sterile and physiologically compatible, including saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injectable solutions, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and One or more of these components may be mixed and used, and other conventional additives such as antioxidants, buffers and bacteriostatic agents may be added as necessary.
  • diluents may be additionally added to formulate injectable formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • the pharmaceutical composition may be in various oral or parenteral formulations.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants are usually used.
  • Solid form preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which form at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose (at least one compound). lactose) and gelatin.
  • lubricants such as magnesium stearate, talc and the like are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, liquid solutions, emulsions, and syrups, and various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, may be included.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition is any one selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups, sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and suppositories. It can have one formulation.
  • composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • the term "pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and an effective dose level is determined by the type of subject and its severity, age, sex, and cancer. It may be determined according to the type, activity of the drug, sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrently used drugs, and other factors well known in the medical field.
  • the compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And single or multiple administrations. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • composition may be a pharmaceutical composition for inhibiting liver cancer metastasis.
  • the term "metastasis” refers to the movement of cancer cells, to settle and proliferate in another place. Since the anti-TM4SF5 monoclonal antibody of the present invention effectively inhibits the migration of liver cancer cells, the composition comprising the monoclonal antibody can be used for inhibiting metastasis of liver cancer.
  • the anti-TM4SF5 antibodies of the present invention # 1, # 27, # 79, # 88 and # 92 not only bind specifically to TM4SF5 (Figs. 5, 7, 8 and 10), Significantly reduced invasion and cell mobility of TM4SF5 overexpressed hepatocellular carcinoma cells (FIGS. 11-13) and reduced proliferation of liver cancer cells in the absence of serum (FIG. 14), comprising a pharmaceutical composition comprising the antibody of the present invention It was confirmed that can be usefully used for the prevention or treatment of cancer.
  • composition may be a composition for diagnosing cancer.
  • TM4SF5 By detecting TM4SF5 using a composition comprising a monoclonal antibody that specifically binds to TM4SF5, a disease related to the expression or degree of TM4SF5 or a disease mediated by TM4SF5 can be diagnosed.
  • the cancer can be diagnosed because it is overexpressed in various cancers such as liver cancer or pancreatic cancer.
  • the anti-TM4SF5 antibody of the present invention specifically recognizes TM4SF5 by using an antigen-antibody reaction, wherein it has superior detection ability compared to commercially available TM4SF5 polyclonal antibody.
  • the antibody of the present invention was shown to be useful for the diagnosis of various cancers, such as liver cancer.
  • the present invention provides a kit for diagnosing cancer comprising the composition for diagnosing cancer.
  • the cancer diagnostic kit may further comprise a composition, solution or device having one or more other components suitable for the analysis method.
  • the present invention provides a method of treating cancer using the monoclonal antibody.
  • the monoclonal antibody and cancer are as described above.
  • the method of treating cancer comprises administering a pharmaceutical composition comprising the monoclonal antibody of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier to a subject having or suspected of having cancer.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is the same as described above.
  • the method of treating cancer may preferably be a method of treating cancer comprising administering a composition comprising a monoclonal antibody of the present invention to a subject with cancer.
  • Such individuals include mammals, birds, and the like, including cattle, pigs, sheep, chickens, dogs, humans, and the like, and include, without limitation, individuals whose cancer is treated by administration of the composition of the present invention.
  • the composition may be administered in a single or multiple doses in a pharmaceutically effective amount.
  • the composition may be administered in the form of a liquid, powder, aerosol, capsule, enteric skin tablets or capsules or suppositories.
  • Routes of administration include, but are not limited to, intraperitoneal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, endothelial, oral, topical, nasal, pulmonary, rectal, and the like.
  • the oral composition upon oral administration, since the peptide is digested, the oral composition must be formulated to coat the active agent or to protect it from degradation in the stomach.
  • the pharmaceutical composition may be administered by any device in which the active agent may migrate to the target cell.
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes a monoclonal antibody that specifically binds to TM4SF5 of the present invention, when the pharmaceutical composition comprising the monoclonal antibody is administered to a human body, it inhibits the occurrence, proliferation, or metastasis of cancer. Cancer can be cured by preventing or progressing.
  • the present invention provides a method for inhibiting liver cancer metastasis by administering the monoclonal antibody to a subject suspected of liver cancer.
  • the monoclonal antibody, TM4SF5 protein and administration are as described above.
  • the present invention provides a method for diagnosing cancer, using the monoclonal antibody, which detects TM4SF5 protein in an isolated biological sample of an individual suspected of having cancer through an antigen-antibody reaction.
  • the monoclonal antibody, cancer, individual and TM4SF5 protein is as described above.
  • the method for diagnosing cancer may detect TM4SF5 protein by reacting a monoclonal antibody specific for TM4SF5 of the present invention with an isolated biological sample of a suspected cancer and detecting the formation of an antigen-antibody complex. Diagnosis can be made. Since TM4SF5 is overexpressed in liver cancer, colorectal cancer, or pancreatic cancer and various cancer cells, cancer can be diagnosed by comparing expression levels with a control such as normal cells or tissues, but not limited thereto.
  • biological sample includes tissue, cells, whole blood, serum, plasma, tissue autopsy samples (brain, skin, lymph nodes, spinal cord, etc.), cell culture supernatants, ruptured eukaryotic cells, and bacterial expression systems. However, it is not limited thereto. These biological samples can be reacted with or without the engineered antibodies to confirm the presence or absence of TM4SF5 protein.
  • the term “antigen-antibody complex” means a combination of a TM4SF5 protein antigen in a sample and a monoclonal antibody according to the present invention that recognizes the same, and the formation of such antigen-antibody complex is performed by colormetric method, electrophoresis. Any method selected from the group consisting of electrochemical method, fluorimetric method, luminometry, particle counting method, visual assessment and scintillation counting method Can be detected. However, it is not necessarily limited to these and various applications and applications are possible.
  • various labels can be used for detecting the antigen-antibody complex.
  • Specific examples may be selected from the group consisting of enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, and radioisotopes, but are not limited thereto.
  • Enzymes used as detection markers include acetylcholinesterase, alkaline phosphatase, ⁇ -D-galactosidase, horseradish peroxidase, ⁇ -latamase, and the like.
  • Phosphorus, Eu 3+ , Eu 3+ chelate or cryptate and the like, and ligands include biotin derivatives and the like
  • luminescent materials include acridinium esters, isoluminol derivatives and the like
  • microparticles include colloids Gold, colored latex, and the like
  • radioisotopes include 57 Co, 3 H, 125 I, 125 I-Bolton Hunter reagent, and the like.
  • the antigen-antibody complex can be detected using enzyme immunosorbent adsorption (ELISA).
  • Enzyme immunosorbent methods include direct ELISA using labeled antibodies that recognize antigens attached to a solid support, and indirect ELISAs using labeled secondary antibodies that recognize capture antibodies in a complex of antibodies that recognize antigens attached to a solid support.
  • Various ELISA methods include indirect sandwich ELISAs using labeled secondary antibodies that recognize the antibody.
  • the monoclonal antibody may have a detection label, and if it does not have a detection label, it may capture these monoclonal antibodies and may be identified by treating another antibody having the detection label.
  • TM4SF5 antigen protein comprising amino acids 113 to 157 of TM4SF5 extracellular domain 2 (TM4SF5 EC2) was constructed.
  • the C terminus of the TM4SF5 EC2 protein was fused to a Myc protein and a human Fc protein to prepare a Fusion protein construct of TM4SF5 EC2-hFc-Myc form.
  • the fusion protein comprising the TM4SF5 extracellular domain antigen protein (TM4SF5 Extracellular domain 2, AA 113-157) was used as HEK293E by utilizing the high speed / high efficiency animal cell expression vector (Korean Patent No. 10-110365) possessed by the inventor. Expression and purification in cells.
  • the antigenic protein and antibody screening procedures used in the present invention are shown in FIG. 1.
  • the antibody library through the panning process for the antigenic protein was screened as follows.
  • mice scFv library cells were inoculated in 100 ml 2 ⁇ YT at 0.1 nm at O.D 600 nm and grown at 37 ° C. and 250 rpm until the O. D value was 0.5-0.7. Subsequently, the auxiliary phage VCSM13 (Stratagene) was superinfection for 30 minutes at 37 ° C with 10 times the cell number of the library, and incubated at 250 rpm for 30 minutes. Infected cells were centrifuged at 3500 rpm for 10 minutes and then amplified overnight at 250 ° C. at 250 ° C. in freshly prepared 200 ml 2 ⁇ YTAK medium (0.1% ampicillin, 0.1% 70 mg / ml kanamycin).
  • Antigen TM4SF5 EC2-hFc-Myc and control hFc fragments were diluted in sodium carbonate buffer (pH 9.6) at a concentration of 5 ⁇ g / ml and immuno-96-Microwell plates (Immuno-96 MicroWell plates, Nunc, Denmark). The next day, the immobilized antigen was washed twice with 200 ⁇ l Phosphate buffered saline (PBS) and then blocked with 200 ⁇ l blocking buffer (Blocking buffer, 4% skim milk in PBS, MPBS) at room temperature for 2 hours.
  • PBS Phosphate buffered saline
  • Blocking buffer 4% skim milk in PBS, MPBS
  • the library phage prepared above was mixed 1: 1 with a blocking buffer, and the phage binding to hFc was removed by reacting for 30 minutes in a well in which the hFc fragment was immobilized. Phages subjected to subtraction were reacted for 2 hours in a well immobilized with antigen TM4SF5 EC2-hFc-Myc, and then washed twice with 200 ⁇ l PBST (0.05% tween 20) for 2 minutes and twice with 200 ⁇ l PBS. To remove non-binding phage.
  • Phage bound to the antigen was eluted with 100 ⁇ l 0.2 M glycine-HCl (0.1% BSA, pH 2.5) for 10 min and immediately neutralized with 6 ⁇ l 2M Tris-HCl (pH 8.0). Eluted phages were transferred to 5 ml ER2738 (O.D 600 nm, 0.7) incubated on the day and infected at 37 ° C. for 30 minutes and incubated at 200 rpm for 30 minutes. Cells infected with phage were centrifuged at 3500 rpm for 10 minutes, dissolved in 600 ⁇ l medium, aliquoted at 300 ⁇ l, incubated overnight at 30 ° C. in SOB medium, and recovered with 2 ml 15% glycerol the next day. The recovered cells were again infected with auxiliary phage to obtain phage, and then another panning was performed as described above.
  • 96 colonies were randomly selected and incubated overnight in deep well plates containing 200 ⁇ l 2 ⁇ YTA medium (deep well plates, Bioneer, Korea). The next day, 10 ⁇ l of the culture solution was transferred to a new deep well plate to which 90 ⁇ l medium was added and incubated at 37 ° C. and 250 rpm for 6 hours. 10 ⁇ l of VCSM13 supplementary phage was added and then double-infected at 37 ° C. for 30 minutes, and then incubated at 250 rpm for 30 minutes. Then 100 ⁇ l 2 ⁇ YTAK medium (0.1% ampicillin, 0.2% kanamycin) was added and incubated overnight at 26 ° C. at 250 rpm.
  • phage was obtained by centrifugation at 2000 rpm for 10 minutes.
  • control hFc and antigen TM4SF5-EC2 surface-immobilized in 100 ⁇ l sodium carbonate buffer at 1 ⁇ g / ml overnight in an immuno-96 microwell plate at a temperature of 4 ° C., were treated with 200 ⁇ l PBS. Washed twice and reacted with 4% MPBST (skim milk in 0.05% PBST) at 37 ° C. for 1 hour. Phage was mixed with 4% MPBST at a 1: 1 ratio for 30 minutes, and then 100 ⁇ l of the blocked well was reacted for 1 hour.
  • MPBST skim milk in 0.05% PBST
  • IgG-anti-M13-HRP (Pharmacia) diluted 1: 2000 in 100 ⁇ l 0.4% MPBST was reacted for 1 hour.
  • 100 ⁇ l of a TMB substrate reaction set (TMB substrate reagent set, BD bioscience, USA) in which substrates A and B were mixed 1: 1 was added.
  • TMB substrate reaction set TMB substrate reagent set, BD bioscience, USA
  • the selected monoclonal antibody # 1 included a heavy chain variable region amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, a polynucleotide sequence encoding a heavy chain variable region of SEQ ID NO: 9, and Polynucleotide sequences encoding the light chain variable regions set forth in SEQ ID NO: 10 were included.
  • # 27 also included the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 11 and the light chain variable region of SEQ ID NO: 13, the polynucleotide sequence encoding the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 17, and the light chain variable region of SEQ ID NO: 18 Polynucleotide sequences encoding C. were included.
  • # 79 also included a heavy chain variable region amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 and a light chain variable region amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, a polynucleotide sequence encoding the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 23, and a SEQ ID NO: 24 Polynucleotide sequences encoding light chain variable regions were included.
  • # 88 also included a heavy chain variable region amino acid sequence of SEQ ID NO: 25 and a light chain variable region amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, a polynucleotide sequence encoding the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 29, and SEQ ID NO: 30 Polynucleotide sequences encoding light chain variable regions were included.
  • # 92 included a heavy chain variable region amino acid sequence as set out in SEQ ID NO: 31 and a light chain variable region amino acid sequence as set out in SEQ ID NO: 35, and a polynucleotide sequence encoding the heavy chain variable region as set out in SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO: 39. Polynucleotide sequences encoding the light chain variable regions described were included.
  • Example 1-3 After the 10 antibodies obtained in Example 1-3 were obtained from bacteria in scFv-phage state, Western blot analysis was performed on lysates of liver cancer cells, and the results are shown in FIG. 5C. As a result, it was confirmed that a total of seven, # 1, # 28, # 45, # 46, # 79, # 85 and # 92 has a binding force for TM4SF5.
  • HEK293E cells Five antibodies of # 1, # 27, # 79, # 88 and # 92 selected in Examples 1-4 were expressed and purified in large quantities in HEK293E cells. Specifically, after transfection with HEK293E 2X10e7 cells (100 mm dish, 10 sheets) with an expression vector containing the polynucleotide encoding the antibody, and then replaced with a serum-free medium, 3 Five supernatants were obtained at daily intervals. The collected supernatants were then purified with protein A excellose beads. As a result, an average of 2 mg was obtained per antibody (FIG. 6).
  • TM4SF5-overexpressing hepatocellular carcinoma cells were clearly stained in all of the groups treated with # 1, 27, 79, 88 and 92, and five antibodies (FIG. 8). At this time, in the group treated with # 92, a unique pattern was different from those of the above four antibodies in which the nuclear membrane was stained, suggesting the possibility of transfer of TM4SF5 to the nuclear membrane.
  • TM4SF5 antibody of the present invention has excellent activity of binding to TM4SF5.
  • this strong binding force suggests that the antibody of the present invention can bind with high sensitivity and specificity in the diagnosis of cancer cells overexpressing TM4SF5.
  • TM4SF5 promotes the growth of liver cancer cells and increases cell mobility (J. Clin. Invest. (2008) 118: 1354-1366; Carcinogenesis (2009) 30: 1872-1879; J. Cell.Biochem (2010) 111: 59-66), cell growth experiments, cell invasion (transwell assay) to target inhibition of the anti-TM4SF5 antibodies # 1, # 27 and # 79 of the present invention, that is, inhibit the function of TM4SF5 through TM4SF5 binding ) And cell healing (wound healing assay) experiment.
  • TM4SF5-overexpressing liver cancer cell lines The effect of treatment with the antibody of the present invention on Tp cells, TM4SF5-overexpressing liver cancer cell lines, was analyzed.
  • TM4SF5-overexpressing hepatocellular carcinoma cells were pre-incubated with the antibody of the present invention (20 ⁇ g / ml), and then placed in a transwell to induce cell migration for 48 hours. Then, the transferred cells were fixed and stained with crystal violet, and then the transferred cells were counted at 200-fold magnification to obtain an average value. As a result, it was observed that when the anti-TM4SF5 antibody of the present invention was treated, the invasion (cell mobility) of the TM4SF5-overexpressing liver cancer cell line was suppressed.
  • antibodies # 1, 27, and 79 of the present invention inhibited invasion of hepatocellular cell lines by 83%, 56%, and 49%, respectively (FIG. 11A), and in the case of antibodies # 88 and 92 of the present invention, infiltration was respectively Inhibition of 73% and 46% was shown (FIG. 11B).
  • Tp and T16 the TM4SF5-overexpressing liver cancer cell lines
  • the antibodies of the present invention did not significantly inhibit the growth of hepatocarcinoma cell lines under the presence of serum, but the cell growth was inhibited by 30% to 50% by the antibodies # 1 and # 79 of the present invention in the absence of serum.
  • FIG. 14A cell growth was inhibited by 50% by antibodies # 88 and 92
  • the antibody of the present invention specifically binds to TM4SF5, thereby effectively inhibiting the biological activity of TM4SF5, such as EMT, and effectively blocking cancer's proliferation, migration, and metastasis.
  • TM4SF5 biological activity of TM4SF5
  • EMT cancer's proliferation, migration, and metastasis
  • mice administered CCl 4 (CCl 4 -treated mouse liver fibrosis (liver fibrosis) induced model as an animal, CCl 4 - search severe liver injury and fibrosis induced by the administration), the exemplary antibodies of the present invention the liver tissue of # Stained with 27.
  • the mouse tissue tissues induced liver fibrosis through CCl 4
  • a paraffin specimen was made into a paraffin specimen, sectioned to a thickness of 4 to 5 ⁇ m and fixed on a slide, and after deparaffinization using xylene, ethanol (100% >90%>80%> 70%) dehydration process was performed.
  • the tissues were immersed in 1 mM citric acid buffer (pH 6.0), and then boiled for 10 minutes, and the tissue slides cooled at room temperature were reacted with 3% H 2 O 2 for 10 minutes (hydrogen peroxidase in methanol).
  • the anti-TM4SF5 antibody of the present invention showed a result of effectively recognizing the endogenous TM4SF5 protein.
  • anti-TM4SF5 antibody particularly antibody # 27, of the present invention can be utilized in animal model tissue and clinical tissue staining (IHC).

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Abstract

본 발명은 TM4SF5(transmembrane 4 L six family member 5) 단백질에 특이적으로 결합하는 신규한 단일클론항체에 관한 것으로, 구체적으로는 인간 TM4SF5 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 상기 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 상기 벡터가 도입된 형질전환체, 상기 단일클론항체를 제조하는 방법, 상기 단일클론항체를 포함하는 조성물, 상기 단일클론항체를 이용하여 암을 치료하는 방법, 간암 전이를 억제하는 방법, 상기 단일클론항체를 이용한 암 진단 방법, 및 상기 단일클론항체를 포함하는 암 진단용 키트에 관한 것이다.

Description

TM4SF5 단백질에 특이적으로 결합하는 신규한 단일클론항체 및 이의 용도
본 발명은 TM4SF5(transmembrane 4 L six family member 5) 단백질에 특이적으로 결합하는 신규한 단일클론항체에 관한 것으로, 구체적으로는 인간 TM4SF5 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 상기 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 상기 벡터가 도입된 형질전환체, 상기 단일클론항체를 제조하는 방법, 상기 단일클론항체를 포함하는 조성물, 상기 단일클론항체를 이용하여 암을 치료하는 방법, 간암 전이를 억제하는 방법, 상기 단일클론항체를 이용한 암 진단 방법, 및 상기 단일클론항체를 포함하는 암 진단용 키트에 관한 것이다.
TM4SF(transmembrane 4 superfamily) 단백질은 4개의 막통과 도메인, 2개의 세포외 고리(extracellular loop) 및 2개의 짧은 세포내 말단(cytoplasmic tail) 부위를 가진 약 25-50kDa의 소수성 단백질의 그룹으로서, 테트라스패닌(tetraspanin) 또는 테트라스팬(tetraspan)으로도 불린다. 상기 TM4SF 단백질들은 인테그린과 같은 세포부착 분자들과 함께 세포막에 복합체를 형성하여 거대한 테트라스패닌-풍부 마이크로도메인(tetraspanin-enriched microdomain, TERM)을 이루며, 세포의 부착, 증식 및 이동과 같은 다양한 생물학적 기능에 기여하고 있다.
TM4SF5(transmembrane 4 L six family member 5 또는 Four-transmembrane L6 superfamily member 5)는 테트라스패닌 그룹의 한 멤버로서, 비수용성 단백질로 세포막을 통과하는 4개의 영역과 세포밖에 존재하는 2개의 고리구조와 세포질 내에 존재하는 하나의 고리구조 및 2개의 말단 구조를 가지고 있다. 상기 TM4SF5는 TM4SF1(tumor-associated antigen L6)의 상동체(homologue)로서, TM4SF5의 mRNA는 췌장암, 위암, 대장암 및 연부조직육종(soft tissue sarcoma) 등에서 매우 과발현되어 있는 것으로 알려져 있다. 또한, COS7 세포에 TM4SF5 단백질을 인위적으로 발현시켰을 때, 액틴 재구성(actin reorganization) 및 초점 부착 전환(focal adhesion turnover)이 일어나는 결과를 보여, TM4SF5가 EMT(epithelial-mesenchymal transition)을 통한 세포 이동에 관여할 수 있음을 시사하였다(Lee SA et al., J Clin Invest 2008, 118(4):1354-66). 또한, 상기 TM4SF5 단백질은 암 관련 유전자인 L6와 아미노산 서열 동질성이 높아 암 관련 유전자로 추정되어 왔으며, 암의 발병 및 진행에 관련이 되어있다는 것이 보고되고 있다. TM4SF5는 세포 내 p27Kip1 발현 및 RhoA GTPase 활성을 통하여 G1/S 주기의 진행을 촉진시켜 세포 증식에 관여하고 있으며(Kim H et al., Biochim Biophys Acta 2010 1803(8):975-82), EMT에 관여하는 주요 인자인 TGF-β1(transforming growth factor-β1) 및 EGFR(epidermal growth factor receptor) 신호전달경로 간의 크로스-토크(cross-talk)가 TM4SF5의 발현을 유도하여 EMT를 가져오는 것으로 알려져 있다(Kang M et al., Biochem J 2012 443(3):691-700).
상기와 같이 TM4SF5가 새로운 암 진단에 대한 특이 단백질 및 항암 타겟으로 부각되면서, TM4SF5를 표적으로 하여 암을 진단하는 방법에 대한 연구가 진행되었다. 또한, TM4SF5를 표적으로 하여 암을 치료하기 위해, 다양한 부분에서 TM4SF5의 생물학적 활성을 저해시키기 위한 연구가 이루어지고 있다. 특히, TM4SF5를 저해하는 화합물에 대한 연구가 이루어졌으며, 그 예로 설폰아미드 및 설폰네이트기가 치환된 칼콘계 화합물이 TM4SF5에 의한 생물학적 활성을 저해시키는 것이 보고된 바 있다(대한민국 등록특허 제10-0934706호). 상기와 같은 TM4SF5의 생물학적 활성을 저해하는 화합물 외에도 TM4SF5에 특이적으로 결합하는 단일클론항체에 대한 연구의 중요성이 부각되어 왔으며, 특히 임상 연구를 위하여 TM4SF5에 특이적으로 결합이 가능하고, TM4SF5의 생물학적 활성을 효과적으로 저해시켜 암의 예방 또는 치료에 사용될 수 있는 단일클론항체의 개발이 요구되어 왔다.
이에 본 발명자들은 인간 TM4SF5 단백질에 특이적으로 결합하며 TM4SF5 단백질의 전이 촉진과 같은 생물학적 활성을 효과적으로 저해시킬 수 있는 단일클론항체를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 항체 라이브러리로부터 인간 TM4SF5에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 새롭게 제작하였고, 상기 항체가 TM4SF5의 생물학적 활성을 효과적으로 차단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 TM4SF5(transmembrane 4 L six family member 5) 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 단일클론항체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 포함하는, 암 진단 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 이용하여 암을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 간암 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 간암 전이를 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 이용하여 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료의 TM4SF5 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 TM4SF5에 특이적인 단일클론항체는 인간 TM4SF5에 대하여 강한 친화력을 나타내며, TM4SF5의 EC2 부위에 결합함으로써 암 전이 유도와 같은 TM4SF5의 생물학적 활성을 효과적으로 저해하므로, TM4SF5에 의해 매개되는 질병, 예컨대 암, 특히 간암과 같은 질병의 진단 또는 치료에 있어서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1 A는, 본 발명의 항-TM4SF5 항체의 제조에 사용된 융합 단백질 작제물(fusion protein construct), 즉 항원 단백질 작제물의 구조를 모식도로 나타낸 것으로, TM4SF5의 EC2(extracellular loop 2) 113 내지 157번 아미노산 부위와 His-태그, TCS(Thrombin cleavage site), 면역글로불린 Fc 단편 및 Myc-tag로 구성되어 있다. 도 1 B는 상기 항원 단백질을 발현 정제한 것을 SDS-PAGE로 확인한 도이며, 도 1 C는 본 발명의 항체 스크리닝 과정을 순서도(flow chart)로 나타낸 것이다.
도 2는, HBX 라이브러리로부터 패닝된 96개의 클론에 대하여 ELISA를 진행한 파아지 ELISA 결과를 나타낸 것으로, 이 중 20개의 클론이 TM4SF5 EC2에 양성반응을 보인다.
도 3은, 선별된 클론들의 염기서열 및 항체 가변부의 인간 생식세포 계열 면역글로불린 사용유형을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는, 서로 다른 서열을 가지는 #1, #16, #27, #28, #45, #46, #73, #79, #85, #88 및 #92 클론의 ELISA 결과를 나타낸 것이다.
도 5는, 본 발명의 항-TM4SF5 항체의 결합력을 분석한 결과를 나타내는 도이다. 도 5a 및 b는 대조군 세포주(Cp)에 대한 FACS 분석 결과를 나타내며, 도 5c 및 d는 TM4SF5-발현 세포주(Tp)에 대한 FACS 분석 결과를 나타낸다. 또한, 도 5e는 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은, 본 발명의 5종의 항체(#1, 27, 79, 88, 92)를 친화도 크로마토그래피를 이용하여 정제한 결과를 나타내는 것으로, #79, 88 및 92를 크로마토그래피 용출(elution)하여 얻은 결과 및 상기 5종의 항체를 정량한 다음 겔(gel)에서 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은, 대조군 세포주(Cp)와 TM4SF5 과발현 세포주인 Tp, T3, T7 및 T16에 대한 본 발명의 항-TM4SF5 항체(#1, #27 및 #79)의 결합력을 FACS로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은, 본 발명의 항-TM4SF5 항체 및 음성 대조군 항체 1종(HAV)를 이용한 면역세포화학 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 8a는 음성 대조군 항체(HAV)의 면역세포화학 분석 결과를, 도 8b는 항-TM4SF5 항체 #1의 면역세포화학 분석 결과를, 도 8c는 #27의 면역세포화학 분석 결과를, 도 8d는 #79의 면역세포화학 분석 결과를, 도 8e는 #88의 면역세포화학 분석 결과를, 도 8f는 #92의 면역세포화학 분석 결과를 나타낸 것이다. 여기서 Tp, T7 및 T16은 TM4SF5 과발현 세포를, Cp는 대조군 세포를 나타내는 것이다.
도 9는, 상업적으로 판매되는 항-인간 TM4SF5 다클론항체(Proteintech group 18239-1-AP)를 이용한 면역세포화학 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10a 내지 c는, Flag가 태그된 TM4SF5(Flag-TM4SF5) 과발현 세포주에서 본 발명의 항-TM4SF5 항체 및 대조군 항체인 항-Flag 항체를 사용한 공동-면역세포화학 실험(co-immunocytochemistry) 결과를 나타낸 것이다.
도 11a 및 b는, 본 발명의 항-TM4SF5 항체가 TM4SF5 과발현 세포주(Tp)의 침윤에 미치는 영향을 확인한 것이다.
도 12는, 본 발명의 대표적인 항-TM4SF5 항체인 #1에 의한 Huh7 간암세포의 이동성 변화를 확인한 도이다.
도 13a 및 b는, 본 발명의 항-TM4SF5 항체가 세포 이동성에 미치는 영향을 Wound healing assay로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 14a 및 b는, 본 발명의 항-TM4SF5 항체가 세포 성장에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는, 본 발명의 대표적인 항-TM4SF5 항체인 #27을 이용하여, CCl4-매개 간 섬유증(liver fibrosis) 동물모델의 간 조직 염색을 수행한 결과(A) 및 인간 Chang 간세포에서 발현된 TM4SF5 단백질의 인지 여부를 FACS로 확인한 결과(B)를 나타낸 도이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 TM4SF5(transmembrane 4 L six family member 5) 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공한다.
본 발명에서 용어, "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론항체, 단일클론항체, 전체(whole) 항체 및 항체 단편을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody) 및 이가(bivalent) 또는 양특이성 분자(예를 들어, 양특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 상기 항체 단편은 항원결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv(variable fragment)는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미한다. 이중쇄Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명에서 용어, "단일클론항체"는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일클론항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 전형적으로, 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역(상기 부위는 도메인으로 또한 알려져 있음)을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity-determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region, FR)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
한편, 상기 단일클론항체는 상기에서 설명한 바와 같이 인체에 적용하기 위해 면역원성을 감소시킨 키메라성 항체 또는 인간화 항체의 형태일 수 있다.
본 발명에서 용어, "키메라성 항체(chimeric antibody)"는 DNA 재조합 기술에 의하여 생쥐 항체의 가변영역과 인간 항체의 불변영역을 재조합시킨 형태의 항체이며, 상기 키메라성 항체의 면역반응은 생쥐 항체에 비하여 크게 개선되므로, 임상적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "인간화 항체(humanized antibody)"는 생쥐 단일클론항체의 CDR 서열의 전부 또는 일부를 인간 항체에 이식시킨 형태의 항체를 의미하며, 그 예로 생쥐 단일클론항체의 CDRs를 인간 항체 유래의 FR과 재조합시켜 인간화 가변영역을 제조하고 이를 바람직한 인간 항체의 불변영역과 재조합시켜 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 생쥐 유래의 CDRs만을 이식하는 경우 인간화 항체의 친화도가 떨어지므로 CDR의 3차원 구조에 영향을 줄 것으로 생각될 수 있는 FR 아미노산 잔기를 생쥐 항체의 아미노산으로 치환시켜 친화도를 증진시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "TM4SF5(transmembrane 4 L six family member 5) 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체"는 TM4SF5 단백질에 결합하여 TM4SF5 단백질의 생물학적 활성을 억제할 수 있는 항체를 의미하며, 본 발명에서 항-TM4SF5 항체와 혼용되어 사용될 수 있다. 상기 TM4SF5 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 TM4SF5에 결합하여 TM4SF5의 생물학적 활성을 저해하는 단일클론항체라면 제한없이 포함한다. 또한, 상기 단일클론항체의 형태는 상기에서 설명한 바와 같이, 전체 항체 및 항체 단편을 모두 포함할 수 있으며, 키메라성 항체 또는 인간화 항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 단일클론항체는 TM4SF5의 EC2(extracellular loop 2 or extracellular domain 2)에 특이적으로 결합하여, TM4SF5에 의한 신호전달을 억제하여, TM4SF5에 의한 EMT 유도와 같은 생물학적 활성을 저해시키므로, TM4SF5가 관여하는 암과 같은 질병의 예방 또는 치료에 있어 유용하게 사용할 수 있다. 또한 TM4SF5의 과발현은 암에 있어 특이적인 현상으로 보고되고 있으므로, TM4SF5에 특이적으로 결합할 수 있는 본 발명의 항체는 암의 진단에 있어 높은 민감도 및 특이도를 갖는 진단 능력을 가지므로, 암의 진단에 있어 유용하게 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 TM4SF5 EC2 부위, 즉 TM4SF5 아미노산 113번 내지 157번 부위를 포함하는 융합 단백질을 항원 단백질로 이용하여 본 발명의 TM4SF5에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제작하였다(도 1).
상기 TM4SF5 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 바람직하게는 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 4로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 7로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 8로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 단일클론항체일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1로 기재된 중쇄 가변영역 및 서열번호 5로 기재된 경쇄 가변영역을 포함하는 단일클론항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 1로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 5로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 단일클론항체를 #1로 명명하였다. 상기 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9로 기재된 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 10으로 기재된 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 TM4SF5 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 바람직하게는 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 12로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 14로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 15로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 16으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 단일클론항체일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 11로 기재된 중쇄 가변영역 및 서열번호 13으로 기재된 경쇄 가변영역을 포함하는 단일클론항체이나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 11로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 13으로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 단일클론항체를 #27로 명명하였다. 상기 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 17로 기재된 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 18로 기재된 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 TM4SF5 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 바람직하게는 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 20으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 14로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 15로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 22로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 단일클론항체일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 19로 기재된 중쇄 가변영역 및 서열번호 21로 기재된 경쇄 가변영역을 포함하는 단일클론항체이나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 19로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 21로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 단일클론항체를 #79로 명명하였다. 상기 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 23으로 기재된 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 24로 기재된 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 TM4SF5 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 바람직하게는 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 26으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 14로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 15로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 28로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 단일클론항체일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 25로 기재된 중쇄 가변영역 및 서열번호 27로 기재된 경쇄 가변영역을 포함하는 단일클론항체이나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 25로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 27로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 단일클론항체를 #88로 명명하였다. 상기 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 29로 기재된 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 30으로 기재된 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 TM4SF5 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 바람직하게는 서열번호 32로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 33으로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 34로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 36으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 15로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 37로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 단일클론항체일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 31로 기재된 중쇄 가변영역 및 서열번호 35로 기재된 경쇄 가변영역을 포함하는 단일클론항체이나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 31로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 35로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하는 단일클론항체를 #92로 명명하였다. 상기 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 38로 기재된 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 39로 기재된 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 단일클론항체가 불변 영역을 포함하는 경우, IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 불변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 불변 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 그 예로, IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 불변 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 불변 영역으로부터 이량체 또는 다량체를 형성할 수 있다.
본 발명에서 용어, "하이브리드(hybrid)"란 단쇄 면역 글로불린 중쇄 불변 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 해당하는 서열이 존재함을 의미하며, 그 예로 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하다.
한편, IgG의 아형인 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 중쇄 불변영역의 조합 또는 혼성화도 가능하다. 상기 조합 및 혼성화에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
또한, 본 발명의 상기 TM4SF5에 특이적인 단일클론항체가 경쇄 불변영역을 포함하는 경우, 상기 경쇄 불변영역은 람다(λ) 또는 카파(κ) 경쇄 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "TM4SF5(transmembrane 4 L six family member 5) 단백질"은 세포막을 4번 통과하는 막수용체 그룹인 TM4SF(transmembrane 4 superfamily)에 속하는 한 종류로서, 세포 발달, 활성화, 성장 및 이동성 조절에 관여하는 신호전달경로를 매개하는 단백질을 의미한다. 상기 TM4SF5 단백질은 세포막을 통과하는 4개의 영역과 세포밖에 존재하는 2개의 고리구조와 세포질 내에 존재하는 하나의 고리구조 및 2개의 말단 구조를 가지며, 세포밖에 존재하는 2개의 고리구조 중 EC1(first external loop, extracellular loop 1)에 비하여 EC2(second external loop, extracellular loop 2)의 길이가 길며, 다른 분자들과의 상호작용에 관여하는 주요 아미노산 잔기가 EC2에 존재한다. 상기 TM4SF5 단백질은 그 종류가 특별히 제한되지는 않으나, 바람직하게는 인간 TM4SF5 단백질일 수 있다. 또한, 상기 TM4SF5 단백질은 천연형 또는 변이체 TM4SF5 단백질을 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 천연형 TM4SF5 단백질이란 천연형 TM4SF5 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 일반적으로 지칭하며, 상기 천연형 TM4SF5 단백질의 아미노산 서열이란 천연 발생 TM4SF5 단백질에서 발견되는 아미노산 서열을 일반적으로 지칭한다. 상기 TM4SF5에 대한 정보는 미국국립보건원의 GenBank 등 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 그 예로 Accession Number가 NP_003954(Gene ID: 9032)인 TM4SF5 단백질의 정보일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 TM4SF5 단백질은 대장암, 간암 또는 췌장암 등에 과발현되어 있는 것으로 알려져 있으며, 암에 있어서 TM4SF5 단백질은 암의 발생, 침습 또는 전이에 관여하는 EMT(epithelial-mesenchymal transition)를 유도하며, 결국 세포의 접촉성장억제(contact inhibition)을 상실하게 하여 다층증식을 초래하는 결과를 가져오는 것으로 알려져 있다(Lee SA et al., J Clin Invest 2008, 118(4):1354-66). 또한, 암세포에 발현하는 TM4SF5가 인테그린 알파 5(integrin α 5)와 세포 내부적으로 상호작용을 함으로써, FAK/c-Src/STAT3의 신호전달 과정을 활성화시켜, 혈관신생(angiogenesis)에 있어 중요한 인자인 VEGF(vascular endothelial growth factor)가 발현 및 분비되도록 하여, 혈관내피세포의 혈관형성을 야기할 수 있다(Choi S et al., Blood 2009 113(8):1845-55). 따라서, TM4SF5의 기능을 저해하는 물질은 항암 효과를 보일 수 있다(대한민국 등록특허 제10-0934706호). 이에, 본 발명의 TM4SF5 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 암의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, TM4SF5에 특이적으로 결합하는 단일클론항체인 #1, #27, #79, #88 및 #92를 제작하였고, 상기 5가지 항체는 TM4SF5에 특이적으로 결합할 뿐만 아니라, 상업적으로 판매되는 TM4SF5 다클론항체에 비하여 현저히 강한 결합력을 가짐을 확인하였다(도 5, 도 7 내지 10). 또한, 본 발명의 항체는 TM4SF5 과발현 간암세포주에서 세포 침윤 및 세포 이동을 현저히 감소시키며, 본 발명의 대표적인 항체인 #1은, TM4SF5를 내재적으로 발현하는 Huh7 세포의 이동성을 45% 가량 감소시키는 결과를 나타내었다(도 11 내지 13). 또한, 본 발명의 항체들은 세럼이 없는 상태에서 세포 성장을 30 내지 50% 감소시킴을 확인하였다(도 14). 나악, 본 발명의 대표적인 항체인 #27은 간 섬유증이 유발되어 TM4SF5를 발현하는 생쥐 간 조직을 효과적으로 염색시키는 결과를 나타내어, TM4SF5 단백질을 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하였다. 또한, 인간 Chang 간세포에 TGF-베타를 처리하여 TM4SF5 단백질의 발현을 유도하였을 때, TM4SF5 단백질을 효과적으로 검출하는 결과를 나타내었다(도 15).
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 단일클론항체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 단일클론항체는 공지의 단일클론항체 제조기술로 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 단일클론항체를 제조하는 방법은 면역된 동물로부터 얻은 B 림프구를 사용하여 하이브리도마를 제조함으로써 수행될 수 있거나(Koeher and Milstein, 1976, Nature, 256:495), 파아지 디스플레이(phage display) 기술을 이용함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
파아지 디스플레이 기술을 이용한 항체 라이브러리는 하이브리도마를 제작하지 않고 바로 B 림프구로부터 항체 유전자를 얻어 파아지(phage) 표면에 항체를 발현시키는 방법이다. 파아지 디스플레이 기술을 이용하면 B-세포 불멸화(immortalization)에 의해 단일클론항체를 생성하는데 관련된 기존의 많은 어려움이 극복될 수 있다. 일반적으로 파아지 디스플레이 기술은 1) 파아지의 외피 단백질(coat protein) pⅢ(또는 pⅣ) N-말단에 해당하는 유전자 부위에 무작위 서열의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 삽입하는 단계; 2) 천연형의 외피 단백질 일부와 상기 무작위 서열의 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 융합 단백질을 발현시키는 단계; 3) 상기 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드와 결합할 수 있는 수용체 물질을 처리하는 단계; 4) 수용체에 결합된 펩티드-파아지 입자들을 낮은 pH나 결합 경쟁력 있는 분자를 이용하여 용출시키는 단계; 5) 패닝(panning)에 의하여 용출된 파아지를 숙주 세포 내에서 증폭시키는 단계; 6) 원하는 양을 얻기 위해 상기 방법을 반복하는 단계; 및 7) 패닝에 의해 선별된 파지 클론들의 DNA 서열로부터 활성이 있는 펩티드의 서열을 결정하는 단계로구성된다.
바람직하게 본 발명의 단일클론항체의 제조방법은 파아지 디스플레이 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 당업자는 공지의 파아지 디스플레이 기술, 예를 들어 Barbas 등(METHODS : A Companion to Methods in Enzymology 2:119, 1991 및 J. Virol. 2001 Jul;75(14):6692-9) 및 Winter 등(Ann. Rev.Immunol. 12:433, 1994) 의 논문 등에 공지된 방법을 참고하여 상기 본 발명의 제조방법의 각 단계를 용이하게 수행할 수 있다. 항체 라이브러리를 구축하기 위해 사용될 수 있는 파아지는, 예를 들어 필라멘트성 파아지(filamentous phage)로 fd, M13, f1, If1, Ike, Zj/Z, Ff, Xf, Pf1 또는 Pf3 파아지가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 필라멘트성 파아지의 표면상에 이종 유전자의 발현을 위해 사용될 수 있는 벡터에는 예를 들어, fUSE5, fAFF1, fd-CAT1 또는 fdtetDOG 등의 파아지 벡터 또는 pHEN1, pComb3, pComb8 또는 pSEX 등의 파아지미드 벡터가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 증폭을 위한 재조합 파아지의 성공적인 재감염을 위해 요구되는 야생형 외피 단백질을 제공하기 위해 사용될 수 있는 헬퍼 파아지에는, 예를 들어 M13K07 또는 VSCM13 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 하이브리도마 유래의 단일클론항체 또는 파아지 디스플레이 클론을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 통상적인 절차를 사용하여 쉽게 단리되고 서열분석될 수 있다. 그 예로, 하이브리도마 또는 파아지 주형 DNA로부터 당해 중쇄 및 경쇄 코딩 영역을 특이적으로 증폭시키도록 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용할 수 있다. 일단 상기 폴리뉴클레오티드가 단리되면, 이를 발현 벡터 내로 넣을 수 있고, 그 후 상기 발현 벡터를 적당한 숙주세포에 도입하여, 형질전환된 숙주세포(즉, 형질전환체)로부터 원하는 단일클론항체을 생산할 수 있다. 따라서 본 발명의 상기 단일클론항체의 제조 방법은 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 증폭시키는 단계를 포함하는, 단일클론항체의 제조방법일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
상기 단일클론항체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 제공하는 상기 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 생쥐 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 바람직하게는 숙주세포에서 상기 뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터가 될 수 있다. 그 예로 파아지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체, 바이러스 또는 레트로바이러스벡터 등에 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 형태가 될 수 있다.
상기 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 상기 단일클론항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 발현벡터 또는 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 모두 포함하는 발현벡터일 수 있다.
본 발명에서 제공하는 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현벡터가 도입되어 형질전환된 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, chinese hamster ovary cells), SP2/0(생쥐 골수종), 인간 림프아구(human lymphoblastoid), COS, NSO(생쥐 골수종), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, baby hamster kidney cells), HEK(인간 배아신장 세포, human embryonic kidney cells), PERC.6(인간망막세포) 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.
본 발명에서 용어, "도입"은 상기 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 전달하는 방법을 의미한다. 이와 같은 도입은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당 분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 입자를 사용하여 목적물을 세포 내로 전달시키는 것을 의미한다. 아울러, 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 본 발명에서 도입은 형질전환과 혼용되어 사용될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 단일클론항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 약학적 조성물 또는 진단용 조성물 형태일 수 있다.
상기 조성물은 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물일 수 있다.
본 발명의 단일클론항체는 TM4SF5에 특이적으로 결합하여 TM4SF5에 의해 매개되는 신호전달들을 효과적으로 차단시킴으로써, EMT와 같은 암의 발생 또는 전이 등에 관여하는 생물학적 활성을 저해시켜 암의 예방 또는 치료에 관여할 수 있다. 상기 TM4SF5 및 단일클론항체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "암"은 TM4SF5 단백질을 발현하는 암이라면 종류에 제한없이 포함하나, 그 예로 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 연부조직육종(soft tissue sarcoma), 림프종 또는 다발성 골수종 혈액암일 수 있다.
본 발명에서 용어, "예방"이란 상기 조성물의 투여에 의해 암의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다. 또한, 본 발명에서 용어, "치료"란 상기 조성물의 투여에 의해 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 암의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또한, 상기 조성물은 간암 전이 억제용 약학적 조성물일 수 있다.
본 발명에서 용어, "전이"는 암세포의 이동으로, 다른 장소에 정착하여 증식하는 것을 의미한다. 본 발명의 항-TM4SF5 단일클론항체는 간암 세포의 이동을 효과적으로 억제하므로, 상기 단일클론항체를 포함하는 조성물은 간암 전이 억제를 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 항-TM4SF5 항체인 #1, #27, #79, #88 및 #92가 TM4SF5에 특이적으로 결합할 뿐만 아니라(도 5, 7, 8 및 10), TM4SF5 과발현 간암세포의 침윤 및 세포 이동성을 현저히 감소시키고(도 11 내지 13), 세럼이 없는 상태에서 간암세포의 증식을 감소시킴을 확인하여(도 14), 본 발명의 항체를 포함하는 약학적 조성물을 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.
또한, 상기 조성물은 암 진단용 조성물일 수 있다.
TM4SF5에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는 조성물을 이용하여 TM4SF5를 검출함으로써 TM4SF5의 발현 여부나 발현 정도와 관련된 질환 또는 TM4SF5에 의해 매개되는 질환을 진단할 수 있으며, 특히 TM4SF5는 대장암, 간암 또는 췌장암 등 다양한 암에 과발현되어 있기 대문에, 암을 진단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 항원-항체 반응을 이용하여 본 발명의 항-TM4SF5 항체가 TM4SF5를 특이적으로 인지함을 확인하였으며, 이때 상업적으로 판매되는 TM4SF5 다클론항체에 비하여 뛰어난 검출 능력이 있음을 확인함으로써(도 5, 도 7 내지 10), 본 발명의 항체는 간암과 같은 다양한 암의 진단에 유용하게 사용할 수 있음을 나타내었다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
상기 조성물 및 암에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 또한, 상기 암 진단용 키트는 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분을 가진 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 단일클론항체를 이용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 단일클론항체 및 암에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 암을 치료하는 방법은 본 발명의 단일클론항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 약학적 조성물을 암이 발병되거나 발명 의심이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법일 수 있으며, 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 상기에서 설명한 바와 동일하다. 상기 암을 치료하는 방법은 바람직하게는 본 발명의 단일클론항체를 포함하는 조성물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법일 수 있다.
상기 개체는 소, 돼지, 양, 닭, 개, 인간 등을 포함하는 포유 동물, 조류 등을 포함하며, 본 발명의 상기 조성물의 투여에 의해 암이 치료되는 개체는 제한없이 포함된다.
이때, 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 이때, 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 캡슐제, 장용피 정제 또는 캡슐제 또는 좌제의 형태로 투여할 수 있다. 투여 경로는 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 내 투여, 내피 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 TM4SF5에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하므로, 상기 단일클론항체를 포함하는 약학적 조성물을 인체 내에 투여하는 경우, 암의 발생, 증식 또는 전이를 억제시키거나 진행을 막아 암을 치료할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 단일클론항체를 간암 의심 개체에 투여하여 간암 전이를 억제하는 방법을 제공한다.
상기 단일클론항체, TM4SF5 단백질 및 투여 등에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 단일클론항체를 이용하여 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료의 TM4SF5 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암 진단방법을 제공한다.
상기 단일클론항체, 암, 개체 및 TM4SF5 단백질에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 상기 암의 진단방법은 본 발명의 TM4SF5에 특이적인 단일클론항체를 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료와 반응시키고 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 TM4SF5 단백질을 검출할 수 있으며, 이를 통해 암의 진단을 할 수 있다. 상기 TM4SF5는 간암, 대장암 또는 췌장암과 다양한 암세포에서 과발현되어 있으므로, 정상 세포 또는 조직과 같은 대조군과 발현량을 비교하여 암을 진단할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "생물학적 시료"란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 항체와 반응시켜 TM4SF5 단백질의 존재 또는 암의 유무를 확인할 수 있다.
본 발명에서 용어, "항원-항체 복합체"란 시료 중의 TM4SF5 단백질 항원과 이를 인지하는 본 발명에 따른 단일클론항체의 결합물을 의미하며, 이러한 항원-항체 복합체의 형성은 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.
본 발명에서는 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러 가지 표지체를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 한정되는 것은 아니다.
검출 표지체로서 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-라타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu3+, Eu3+ 킬레이트 또는 크립테이트 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 57Co, 3H, 125I, 125I-볼톤(Bonton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함한다.
바람직하게는, 항원-항체 복합체를 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있다. 효소면역흡착법(ELISA)에는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA,고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.
상기 단일클론항체는 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출표지를 가지지 않을 경우는 이들 단일클론 항체를 포획할 수 있고 검출 표지를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에서 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 항-TM4SF5 항체의 제조 및 선별
실시예 1-1: 파아지 디스플레이(Phage display)를 통한 패닝(Panning)
TM4SF5 세포외 도메인 2(TM4SF5 EC2)의 113번 내지 157번 아미노산을 포함하는 TM4SF5 항원 단백질을 제작하였다. 상기 TM4SF5 EC2 단백질의 C 말단에는 Myc 단백질과 인간 Fc 단백질을 융합시켜, TM4SF5 EC2-hFc-Myc 형태의 융합 단백질 작제물(Fusion protein construct)를 제작하였다. 본 발명자가 보유한 고속/고효율 동물세포 발현벡터(대한민국 등록특허 제10-110365호)를 활용하여, 상기 TM4SF5 세포외 도메인 항원 단백질(TM4SF5 Extracellular domain 2, AA 113-157)을 포함하는 융합 단백질을 HEK293E 세포에서 발현 및 정제하였다. 본 발명에서 사용한 상기 항원 단백질 및 항체 스크리닝 전반적인 과정에 대하여 도 1에 나타내었다. 상기 항원 단백질에 대하여 패닝(Panning) 과정을 통한 항체 라이브러리를 스크리닝 과정을 하기와 같이 수행하였다.
생쥐 scFv 라이브러리 세포를 100㎖ 2xYT에 O.D 600nm에서 0.1 정도로 접종하고, 37℃, 250rpm에서 O.D값 0.5-0.7이 될 때까지 키웠다. 그 다음, 보조파지 VCSM13(Stratagene)은 라이브러리의 세포수 10배로 37℃에서 30분간 중복 감염(superinfection)시키고, 30분간 250rpm으로 배양하였다. 감염된 세포는 3500rpm 10분간 원심 분리한 후, 새로 준비된 200㎖ 2xYTAK배지(0.1% 앰피실린, 0.1% 70㎎/㎖ 카나마이신)에서 26℃, 250rpm으로 하룻밤 동안 증폭하였다. 6000rpm에서 20분간 원심분리하고 파아지가 녹아 있는 상등액에 4%(w/v) PEG(polyethylene glycol)와 3% NaCl을 넣고 얼음에서 1시간 동안 침전시켰다. 4℃, 8000rpm에서 1시간 동안 원심 분리한 후, 1㎖ PBS(phosphate-buffer saline)에 파지를 녹이고, 4℃, 13,000rpm에서 10분간 원심 분리하여 사용하였다.
항원 TM4SF5 EC2-hFc-Myc과 대조군 hFc 절편을 5㎍/㎖의 농도로 탄산 나트륨 완충액(sodium carbonate buffer, pH 9.6)에 희석하여 4℃에서 면역-96-마이크로웰 플레이트(Immuno-96 MicroWell plates, Nunc, Denmark)에서 표면 고정하였다. 다음날, 고정된 항원을 200㎕ PBS(Phosphate buffered saline)로 2회 세척한 다음, 200㎕ 블로킹 완충액(Blocking buffer, 4% skim milk in PBS, MPBS)으로 실온에서 2시간 동안 블로킹하였다. 상기에서 준비한 라이브러리 파지를 블로킹 완충액(blocking buffer)과 1:1로 혼합하고, hFc 절편이 고정화된 웰에서 30분간 반응하여 hFc와 결합하는 파아지를 제거하였다. 추출(Subtraction) 과정을 거친 파지를 항원 TM4SF5 EC2-hFc-Myc이 고정화된 웰에서 2시간 동안 반응시킨 후, 200㎕ PBST (0.05% tween 20)로 2분간 5회, 200㎕ PBS로 2회 세척하여 비특이적으로 결합하는 파아지를 제거하였다. 상기 항원에 결합된 파아지는 100㎕ 0.2M 글리신(glycine)-HCl(0.1% BSA, pH 2.5)로 10분간 용리(elution)시키고, 즉시 6㎕ 2M Tris-HCl(pH 8.0)로 중화시켰다. 용리된 파지는 당일 배양된 5㎖ ER2738(O.D 600nm,0.7)로 옮겨 37℃에서 30분간 감염시키고 30분간 200rpm으로 배양하였다. 파지에 감염된 세포는 3500rpm에서 10분간 원심 분리하여 600㎕배지에 녹이고 300㎕씩 분주하여 SOB배지에서 30℃에서 하룻밤 동안 배양하여, 다음날 2㎖ 15% 글리세롤로 회수하였다. 회수된 세포를 다시 보조 파아지를 감염시켜 파아지를 얻은 후, 상기의 방법대로 또 한번의 패닝을 수행하였다.
실시예 1-2: 파아지-ELISA 스크리닝(Phage-ELISA Screening)
2차 패닝 후 96개의 콜로니를 무작위로 선택하여 200㎕ 2xYTA배지가 담긴 딥 웰 플레이트(deep well plates, Bioneer, korea)에서 하룻밤 동안 배양하였다. 다음날, 배양액 10㎕를 90㎕배지가 첨가된 새 딥 웰 플레이트에 옮겨 37℃, 250rpm에서 6시간 배양하였다. VCSM13 보조 파아지 10㎕를 첨가하여 37℃, 30분간 중복감염시킨 후, 250rpm에서 30분간 배양하였다. 이후 추가로 100㎕ 2xYTAK 배지(0.1% 앰피실린, 0.2% 카나마이신)를 첨가하여 26℃에서 250rpm로 하룻밤 동안 배양하였다. 다음날 파아지를 2000rpm, 10분간 원심 분리하여 얻었다. 한편, 4℃의 온도에서 면역-96 마이크로 웰 플레이트(Immuno-96 microwell plate)에 하룻밤 동안 100㎕ 탄산나트륨 완충액에서 1㎍/㎖ 농도로 표면 고정된 대조군 hFc과 항원 TM4SF5-EC2를, 200㎕ PBS로 2회 세척하고 4% MPBST(skim milk in 0.05% PBST)로 37℃에서 1시간 동안 반응하였다. 파아지는 4% MPBST와 1:1 비율로 30분간 혼합한 후 블로킹된 웰에 100㎕씩 분주하여 1시간 동안 반응시켰다. 비특이적으로 결합하는 파아지를 제거하기 위해서 200㎕ PBST로 4회 세척한 후, 100㎕ 0.4% MPBST에 1:2000 비율로 희석한 IgG-anti-M13-HRP(Pharmacia)를 1시간 반응시켰다. 200㎕ PBST로 5회 세척하고, 기질 A와 B를 1:1로 혼합한 TMB 기질 반응 세트(TMB substrate reagent set, BD bioscience, USA) 100㎕를 첨가하여 발색시켰다. 이후 발색 정도를 확인하고, 50㎕ 2.5M H2SO4을 넣어 반응을 중단시켰다. 발색은 마이크로 플레이트 리더(microplate reader)로 흡광도 450nm에서 측정하였다. 그 결과를 바탕으로, 96개의 콜로니로부터 양성 반응을 보이는 #1, #6, #13, #14, #16, #26, #27, #28, #45, #46, #51, #53, #55, #58, #68, #73, #79, #85, #88 및 #92의 20개 콜로니를 선별하였다(도 2).
실시예 1-3: 스크리닝된 클론의 서열 분석(sequencing)
상기 실시예 1-2의 파아지-ELISA 스크리닝으로 선별된 20개 콜로니를 서열 분석 및 IMGT/V-quest로 CDR3 부위의 서열을 분석한 결과, #1과 #6이 동일한 서열을 가지고 있었고, #13, #14, #26, #51, #53, #55, #58, #68, 및 #73 콜로니가 동일한 서열을 가지고 있음을 확인하였다. 이를 통하여 11개의 서로 다른 서열을 분리할 수 있었다(도 3). 동일한 서열을 가지는 콜로니 중 #1과 #73을 대표로 하고 나머지 서로 다른 아미노산 서열을 가지는 11개 콜로니에 대해서 인간-His-Fc-Myc이 결합된 scFv에 대해서 ELISA를 진행한 결과(도 4), #16 콜로니가 대조군에 양성 반응을 보였으며, 이를 제외하고 #1, #27, #28, #45, #46, #73, #79, #85, #88 및 #92를 선별하였다.
그 중 선별된 단일클론항체 #1은 서열번호 1로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 5로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하였으며, 서열번호 9로 기재된 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 10으로 기재된 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하였다.
또한, #27은, 서열번호 11로 기재된 중쇄 가변영역 및 서열번호 13으로 기재된 경쇄 가변영역을 포함하였으며, 서열번호 17로 기재된 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 18로 기재된 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하였다.
또한, #79는 서열번호 19로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 21로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하였으며, 서열번호 23으로 기재된 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 24로 기재된 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하였다.
또한, #88은 서열번호 25로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 27로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하였으며, 서열번호 29로 기재된 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 30으로 기재된 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하였다.
마지막으로, #92는 서열번호 31로 기재된 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 서열번호 35로 기재된 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 포함하였으며, 서열번호 38로 기재된 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열번호 39로 기재된 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하였다.
실시예 1-4: 항-TM4SF5 항체의 TM4SF5에 대한 결합력 확인 및 선별
상기 실시예 1-3에서 얻은 10종의 항체를 scFv-파아지 상태로 박테리아로부터 얻은 후, 간암 세포의 용해물(lysates)에 대하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였고 이에 대한 결과를 도 5 C에 나타내었다. 그 결과, #1, #28, #45, #46, #79, #85 및 #92, 총 7 가지가 TM4SF5에 대하여 결합력을 지님을 확인하였다.
또한, 10종의 항체를 scFv-Fc 형태로 전환한 다음, 동물세포에서 발현하였다. 이때, 세포 밖으로 분비되는 항체를 상청액(supernatant) 상태로 모은 후, 간암 세포주 수준에서 항체의 결합력을 확인하기 위하여 FACS 분석을 수행하였다.
FACS 분석 결과, #1, #27, #79, #88 및 #92가 대조군 세포주(Cp)에 비하여 TM4SF5 발현 세포주(Tp)에 상대적으로 높은 결합력을 나타내었다(도 5 A 및 B).
상기 FACS 분석 및 웨스턴 블롯 실험 결과를 바탕으로, #1, #27, #79, #88 및 #92를 다시 선별하였다.
실시예 1-5: 선별된 항-TM4SF5 항체의 생산 및 정제
상기 실시예 1-4에서 선별된 #1, #27, #79, #88 및 #92 5가지 항체를 HEK293E 세포에서 대량으로 발현시켜, 정제하였다. 구체적으로, HEK293E 2X10e7 세포(100mm 디쉬, 10장)에 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터로 형질감염(transfection)한 후, 세럼이 없는 배지(serum-free medium)로 교체하고, 3일 간격으로 5회 상청액(supernatant)을 얻었다. 그 다음, 모은 상청액은 단백질 A 엑셀로스 비드(protein A excellose bead)로 정제하였다. 그 결과, 상기 항체당 평균 2 mg을 확보하였다(도 6).
실시예 2: 항-TM4SF5 항체의 결합력 분석
TM4SF5-과발현 SNU-449 간암 세포주(Tp, T3, T7, T16) 및 대조군 세포주(Cp)에 대해 FACS 실험을 수행하였다. 그 결과, 본 발명의 항체 #1, #27 및 #79가 대조군 세포주에 비하여 TM4SF5-과발현 세포주에 뚜렷하게 결합함을 확인하였다(도 7).
또한, 면역세포화학 실험 결과, #1, 27, 79, 88 및 92, 5가지 항체를 처리한 군 모두에서 대조군 세포에 비하여 TM4SF5-과발현 간암세포를 뚜렷하게 염색함을 나타내었다(도 8). 이때, #92를 처리한 군에서는 핵막이 염색되는 상기 4가지 항체와는 다른 특이한 패턴이 나타나, TM4SF5의 핵막으로의 이동가능성이 시사되었다.
반면, 상업적으로 구입가능한 항-TM4SF5 토끼 다클론항체(Proteintech group, cat no. 18239-1-AP)는 본 발명의 항체와 동일한 실험 조건에서 TM4SF5를 인식하지 못하는 결과를 보여, 본 발명의 항체가 TM4SF5에 대하여 우수한 결합력을 가짐을 나타내었다(도 9).
또한, Flag가 태그된 TM4SF5-과발현 SNU-761 간암 세포주를, 본 발명의 항-TM4SF5 항체 및 항-플래그 항체로 함께 염색(Co-staining)한 결과, Co-localization되는 결과를 나타내었다(도 10).
상기와 같은 결과는 본 발명의 TM4SF5 항체가 TM4SF5에 결합하는 우수한 활성을 가짐을 시사하는 것이다. 또한, 이와 같은 강한 결합력은 TM4SF5를 과발현하는 암세포의 진단에 있어, 본 발명의 항체가 높은 민감도 및 특이도를 나타내며 결합할 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 3: 항-TM4SF5 항체의 표적 저해능 분석
TM4SF5에 의하여 간암 세포의 성장이 촉진되고 세포이동성이 증가함이 보고되어있으므로(J. Clin. Invest. (2008) 118:1354-1366; Carcinogenesis (2009) 30:1872-1879; J. Cell. Biochem. (2010) 111:59-66), 본 발명의 항-TM4SF5 항체 #1, #27 및 #79의 표적 저해능, 즉, TM4SF5 결합을 통한 TM4SF5의 기능 저해를 세포성장 실험, 세포 침윤(transwell assay)실험 및 세포 이동성(wound healing assay) 실험을 통해 분석하였다.
(1) 세포 침윤 실험(Transwell assay)
TM4SF5-과발현 간암세포주인 Tp 세포에서 본 발명의 항체를 처리하였을 때 침윤(세포이동성)에 미치는 영향을 분석하였다. TM4SF5-과발현 간암세포를 본 발명의 항체(20㎍/㎖)와 전배양(pre-incubation)한 후, 트랜스웰(Transwell)에 깔고, 48시간 동안 세포이동을 유도하였다. 그 다음, 이동한 세포를 고정시키고 크리스털 바이올렛(crystal violet)으로 염색한 후, 이동한 세포를 200배 배율에서 세어 평균값을 구하였다. 그 결과, 본 발명의 항-TM4SF5 항체를 처리하였을 때, TM4SF5-과발현 간암세포주의 침윤(세포이동성)이 억제됨이 관찰되었다. 구체적으로, 본 발명의 항체 #1, 27 및 79가 간암세포주의 침윤을 각각 83%, 56% 및 49% 억제시켰으며(도 11a), 본 발명의 항체 #88 및 92의 경우, 침윤을 각각 73% 및 46% 억제시키는 결과를 나타내었다(도 11b).
또한, Huh7 간암세포를 이용하여 본 발명의 대표적인 항체 #1에 의하여 이동성 저하 여부를 조사하였다.
구체적으로, 1X10e4 세포를 항체(30㎍/ml)와 전 배양(37℃, 20min)한 후, 인써트에 분주하였다. 아래 챔버에는 5% FBS를 넣어주고, 48시간 배양한 후 이동한 세포를 고정한 다음, 염색하였다. 200배 배율(HPF)에서 보이는 필드(view) 당 세포를 계수하고 평균값을 얻었고, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 대표적인 항-TM4SF5 항체인 #1에 의하여 TM4SF5 단백질을 내재적으로 발현하는 Huh7 세포의 이동성이 45% 가량 감소하는 결과를 나타내었다.
(2) 세포 이동성 실험(wound healing assay)
세포 이동성(wound healing) 실험을 수행하여, 항-TM4SF5 항체의 간암세포이동성에 미치는 효능을 분석하였다. TM4SF5-과발현 간암세포인 T16을 96 웰 플레이트에 confluent한 상태로 깔고, 스크래치를 낸 후 항체(20㎍/㎖)를 처리하였다. 그 다음, 48시간까지 암세포의 이동(wound healing) 정도를 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 항체 #1, #27, #79, #88 및 #92에 의하여 세포 이동 감소 효과를 나타내었다(도 13a 및 b).
(3) 세포 성장에 대한 효과 실험
또한, 본 발명의 항체의 세포 성장에 대한 효과를 확인하였다. TM4SF5-과발현 간암 세포주인 Tp 및 T16을 96 웰 플레이트에 깐 후, 항체를 20㎍/㎖의 농도로 48시간, 72시간 처리한 후, 비색 결정(colorimetric determination)으로 세포성장 정도를 측정하였다. 그 결과, 세럼이 존재하는 조건 하에서는 본 발명의 항체들은 간암세포주 성장을 뚜렷하게 저해하지 못하였으나, 세럼이 없는 조건에서 본 발명의 항체 #1 및 #79에 의해 세포성장이 30 내지 50% 정도 저해되었고(도 14a), 항체 #88 및 92에 의해 세포성장이 50% 정도 저해되는 결과를 나타내었다(도 14b). 이러한 결과로부터 본 발명의 항체가 간암 세포의 성장을 저해시킬 수 있는 효능을 지님을 확인하였다.
상기와 같은 결과들은 본 발명의 항체가 TM4SF5에 특이적으로 결합하여, EMT와 같은 TM4SF5의 생물학적 활성을 효과적으로 저해시켜, 암의 증식, 이동 및 전이를 효과적으로 차단함으로써 암의 예방 또는 치료에 효과적으로 이용될 수 있는 항체임을 시사하는 결과이다.
실시예 4: 항-TM4SF5 항체를 이용한 조직 염색
CCl4를 투여한 생쥐(CCl4-treated mouse는 간섬유화(liver fibrosis) 유도 동물모델로서, CCl4-투여에 의해 심각한 간 손상 및 섬유증이 유도됨)의 간 조직을 본 발명의 대표적인 항체인 #27로 염색하였다.
구체적으로, 생쥐 조직(CCl4를 통해 간섬유화 유도 시킨 조직)을 파라핀 표본으로 만든 후, 4 내지 5㎛ 두께로 섹션하여 슬라이드에 고정시킨 다음, 자일렌을 이용한 탈파라핀 과정후 , 에탄올(100% > 90% > 80% > 70%) 탈수 과정을 수행하였다. 그 다음, 1mM 시트르산 완충액(pH 6.0)에 조직을 담근 후, 10간 보일링(boiling) 하였고, 상온에서 식힌 조직 슬라이드를 3% H2O2에 10분간 반응시켰다( hydrogen peroxidase in methanol). 그 다음, 6% 정상 말 혈청(normal horse serum)으로 30분간 블로킹하였고, #27를 1차 항체로, 3㎍/mL(in 1% normal horse serum)로 4℃에서 밤새 반응시켰다. 그 다음, PBS로 세척하고, 1:100의 비율로 이차 항체를 상온에서 1시간 반응시켰으며(이차항체: Rabbit Anti-Human IgF(Fc), Fluorescein Conjugated (pierce #31535, 1.5mg/ml), PBS로 세척한 다음, DAPI 염색하고, 마운팅하여 결과를 관찰하였다.
그 결과, CCl4를 투여하지 않은 대조군 생쥐 간은 항체 #27에 의해 염색되지 않는 반면, CCl4-투여한 생쥐의 간(간 손상 유도)의 섬유증 영역이 항체 #27에 의해 염색되는 결과를 나타내었다(도 15A). 즉, #27은 간 손상으로 발현된 TM4SF5를 인식하는 결과를 나타내었다.
또한, 인간 Chang 간세포에서 TGF 베타를 처리하여 TM4SF5가 유도된 경우, #27에 의해 인식되는 결과를 FACS 분석을 통해 확인하였고, 그 결과를 도 15B에 나타내었다.
그 결과, 도 15B에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항-TM4SF5 항체는 내재적 TM4SF5 단백질을 효과적으로 인지하는 결과를 나타내었다.
종합하면, 이러한 결과는 본 발명의 항-TM4SF5 항체, 특히 항체 #27은 동물모델 조직 및 임상조직염색(IHC)에 활용될 수 있음을 시사하는 결과이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그 리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범 위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (22)

  1. 인간 TM4SF5(transmembrane 4 L six family member 5) 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단일클론항체는 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 4로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 7로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 8로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 단일클론항체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 단일클론항체는 서열번호 1로 기재된 중쇄 가변영역 및 서열번호 5로 기재된 경쇄 가변영역을 포함하는 단일클론항체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단일클론항체는 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 12로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 14로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 15로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 16으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 단일클론항체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 단일클론항체는 서열번호 11로 기재된 중쇄 가변영역 및 서열번호 13으로 기재된 경쇄 가변영역을 포함하는 단일클론항체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단일클론항체는 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 20으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 14로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 15로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 22로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 단일클론항체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 단일클론항체는 서열번호 19로 기재된 중쇄 가변영역 및 서열번호 21로 기재된 경쇄 가변영역을 포함하는 단일클론항체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 단일클론항체는 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 26으로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 14로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 15로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 28로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 단일클론항체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 단일클론항체는 서열번호 25로 기재된 중쇄 가변영역 및 서열번호 27로 기재된 경쇄 가변영역을 포함하는 단일클론항체.
  10. 제1항에 있어서, 상기 단일클론항체는 서열번호 32로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 33으로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 34로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 36으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 15로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 37로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 단일클론항체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 단일클론항체는 서열번호 31로 기재된 중쇄 가변영역 및 서열번호 35로 기재된 경쇄 가변영역을 포함하는 단일클론항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  13. 제12항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  14. 제13항의 발현 벡터가 도입된 형질전환체.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 단일클론항체를 포함하는, 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 조성물은 암의 예방 또는 치료를 위한 것인 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 상기 조성물은 간암 전이 억제를 위한 것인 조성물.
  18. 제15항에 있어서, 상기 조성물은 암 진단을 위한 것인 조성물.
  19. 제16항 또는 제18항에 있어서, 상기 암은 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 연부조직육종(soft tissue sarcoma), 림프종 및 다발성 골수종 혈액암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  20. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 단일클론항체를 포함하는, 암 진단용 키트.
  21. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 단일클론항체를 이용하여 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료의 TM4SF5(transmembrane 4 L six family member 5) 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암 진단방법.
  22. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 단일클론항체를 암이 의심되는 개체에 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018034434A1 (ko) * 2016-08-17 2018-02-22 한림대학교 산학협력단 사이클릭 펩타이드를 포함하는 백신 조성물, 사이클릭 펩타이드에 대한 항체 또는 이를 포함하는 항암 조성물
CN110734494A (zh) * 2019-10-30 2020-01-31 上海市第一人民医院 抗tspan8单克隆抗体及其用途

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019015696A2 (zh) * 2017-07-17 2019-01-24 同济大学苏州研究院 用于治疗癌症的新靶标

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100934706B1 (ko) 2006-12-07 2009-12-31 재단법인서울대학교산학협력재단 Ｔｍ４ｓｆ５의 기능을 저해하는 항암물질의 스크리닝 방법및 칼콘계 화합물을 함유하는 항암조성물
KR101103650B1 (ko) 2007-10-10 2012-01-11 한국생명공학연구원 동물세포에서의 단백질 고발현 벡터 시스템

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101040652B1 (ko) * 2008-08-11 2011-06-10 재단법인서울대학교산학협력재단 Ｔｍ４ｓｆ5의 암전이 기능을 저해하는 물질의 스크리닝 방법
KR20120022504A (ko) * 2010-07-30 2012-03-12 서울대학교산학협력단 간 질환의 진단, 치료 및 예방용 조성물

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100934706B1 (ko) 2006-12-07 2009-12-31 재단법인서울대학교산학협력재단 Ｔｍ４ｓｆ５의 기능을 저해하는 항암물질의 스크리닝 방법및 칼콘계 화합물을 함유하는 항암조성물
KR101103650B1 (ko) 2007-10-10 2012-01-11 한국생명공학연구원 동물세포에서의 단백질 고발현 벡터 시스템

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BARBAS ET AL., METHODS: A COMPANION TO METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 2, 1991, pages 119
CARCINOGENESIS, vol. 30, 2009, pages 1872 - 1879
CHOI S ET AL., BLOOD, vol. 113, no. 8, 2009, pages 1845 - 55
J. CELL. BIOCHEM., vol. 111, 2010, pages 59 - 66
J. CLIN. INVEST., vol. 118, 2008, pages 1354 - 1366
J. VIROL., vol. 75, no. 14, July 2001 (2001-07-01), pages 6692 - 9
KANG M ET AL., BIOCHEM J, vol. 443, no. 3, 2012, pages 691 - 700
KIM H ET AL., BIOCHIM BIOPHYS ACTA, vol. 1803, no. 8, 2010, pages 975 - 82
KOEHER; MILSTEIN, NATURE, vol. 256, 1976, pages 495
LEE SA ET AL., J CLIN INVEST, vol. 118, no. 4, 2008, pages 1354 - 66
See also references of EP2886556A4
WINTER ET AL., ANN. REV. IMMUNOL., vol. 12, 1994, pages 433

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018034434A1 (ko) * 2016-08-17 2018-02-22 한림대학교 산학협력단 사이클릭 펩타이드를 포함하는 백신 조성물, 사이클릭 펩타이드에 대한 항체 또는 이를 포함하는 항암 조성물
CN110734494A (zh) * 2019-10-30 2020-01-31 上海市第一人民医院 抗tspan8单克隆抗体及其用途

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