KR20210056280A - 조절 t 세포 표면 항원의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 조절 T 세포의 표면에 존재하는 항원인 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 에피토프와 이에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이다.

Description

조절 T 세포 표면 항원의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 항체{Epitope of regulatory T cell surface antigen and an antibody specifically binding to the epitope thereof}
본 발명은 조절 T 세포의 표면에 존재하는 항원인 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 에피토프와 이에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이다.
모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성은, 자기(self)를 구성하고 있는 항원 물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 비-자기(non-self) 항원에 대해서는 이를 인식하고 제거할 수 있는 능력을 갖는 것이다. 이처럼 자기 항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라 한다. 자기 관용은 자기 항원의 특이적인 수용체를 가지고 있을지 모르는 림프구를 제거함으로써, 또는 자기 항원에 접한 후 스스로 반응하는 기능이 불활성화됨으로써 발생한다. 자기 관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기 항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 초래되는 질환을 자가면역질환(autoimmune disease)이라 한다.
상기 자가면역질환의 치료를 위하여, 1970년 대 초 Gershon에 의해 고식적 T 세포(conventional T cells)의 효과 기능(effector function)을 제어 및 억제할 수 있는 T 세포의 존재 가능성이 있는 억제 T 세포라는 개념을 도입하여, 처음으로 제시된 이래(R. K. Gershon and K. Kondo, Immunology, 1970, 18: 723-37), 면역학의 많은 분야에서 조절 T 세포의 생물학적 특성 및 기능을 규명하기 위한 연구가 이루어져 왔다.
이에, 상기 조절 T 세포(Treg)는 과다한 염증과 면역반응의 발생을 자연적으로 방지하는 중요한 역할을 하지만, 자가면역질환과 만성염증질환이 발생하는 경우 조절 T 세포의 기능과 숫자가 현저하게 줄어드는 것이 보고되었다. 따라서, 면역 질환과 염증 질환이 있는 환자의 경우, 조절 T 세포가 정상적인 수준으로 생성되는 것이 중요하며, 이는 상기 질환의 치료법 중 하나가 될 수 있다.
현재까지 조절 T 세포에 특이적으로 존재하는 유전자 및 단백질에 대한 연구가 진행되어, CD25, CTLA4, CD62L, CD38, CD103, GITR 및 CD45RB 등의 물질이 표지 물질에 해당할 수 있음이 제시되어 왔지만, 아직 조절 T 세포만을 단독으로 표적화 할 수 있는 유전자 및 단백질은 존재하지 않는다.
한편, 상보성 결정 영역(complementarity determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리는 3개의 다변 가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 항원 결정기(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 지칭하고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
본 발명의 일 목적은 조절 T 세포(regulatory T cell, Treg cell)의 표면에 존재하는 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 에피토프를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체와 약물, 예를 들면 항암제가 결합된 항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항체-약물 결합체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편; 및 항체-약물 결합체를 이용하여 암의 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 에피토프 또는 상기 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 "Lrig-1 단백질"은 조절 T 세포의 표면에 존재하는 막관통 단백질로서, 세포 외 혹은 루멘 쪽의 루신 반복 서열(leucine-rich repeat(LRR))과 세개의 면역 체 유사 도메인(immunoglobulin-like domains), 세포막 관통 서열 및 세포질 꼬리부분으로 구성되어 있다. LRIG 유전자 패밀리는 LRIG1, LRIG2와 LRIG3이 존재하며, 각각의 패밀리를 구성하는 아미노산들은 매우 보전적으로 구성되어 있다. 상기 LRIG1 유전자는 정상 피부에서 높게 발현하고 있으며, 기저와 모낭 세포에 발현하여 상피 줄기세포의 증식을 조절할 수 있다. 따라서, 표피의 항상성 유지에 중요한 역할을 하며, 부존재 시 건선이나 피부암으로 발전할 수 있다. LRIG1이 위치한 염색체 3p14.3 부분이 잘리는 경우에는 암세포로 발전할 가능성이 있는 것으로 보고된 바 있으며, 실제로 신장암(renal cell carcinoma)과 편평상피암(cutaneous squamous cell carcinoma)에서는 LRIG1의 발현이 매우 감소되어 있는 것으로 확인되었다. 그런데 최근에는 상기 Lrig-1 단백질을 발현하는 암은 20~30% 정도에 불과하다고 밝혀지기도 하였다. 한편, 본 발명의 목적상 상기 Lrig-1 단백질은 인간 또는 마우스에 존재하는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시에서 상기 Lrig-1 단백질은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류, 등을 포함하는 포유류로부터 유래된 Lrig-1 단백질일 수 있다.
본 발명의 일 예시에서 상기 Lrig-1 단백질은 서열번호 1로 표시되는 인간 유래 Lrig-1 단백질일 수 있고, 이는 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 예시에서 상기 Lrig-1 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 마우스 유래 Lrig-1 단백질일 수 있고, 이는 서열번호 4로 표시되는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 예시에서 상기 Lrig-1 단백질은 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 Lrig-1 세포 외 도메인은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류, 등을 포함하는 포유류로부터 유래된 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인일 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 Lrig-1 단백질의 세포 외 단백질은 인간 또는 마우스로부터 유래된 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시에서 상기 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인은 인간 유래 Lrig-1 단백질의 35번째 내지 794번째 아미노산 서열에 해당하는 서열번호 5로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 예시에서 상기 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인은 마우스 유래 Lrig-1 단백질의 35번째 내지 794번째 아미노산 서열에 해당하는 서열번호 6으로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명에 대해 보다 자세히 설명한다.
1. Lrig-1 단백질의 에피토프
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 상기 Lrig-1 단백질의 에피토프로서, 상기 서열번호 1, 3, 5 및 5로 표시되는 Lrig-1 단백질의 일부 아미노산, 예를 들면 2개 내지 50개; 6개 내지 45개; 또는 10개 내지 44개 등의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 상기 Lrig-1 단백질의 에피토프로서, 서열번호 7 내지 70으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는 에피토프를 제공한다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 Lirg-1 단백질의 에피토프는 서열번호 71 또는 서열번호 72로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 에피토프일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 에피토프는 입체구조 에피토프(conformational epitope)일 수 있다.
본 발명의 상기 "입체구조 에피토프"는 연속적인 서열로 이루어지는 1차원적인 선형 에피토프와는 달리, 불연속적인 아미노산 배열로 구성된다. 이러한 입체구조 에피토프는 항체 항원결합부위의 3차원적인 구조와 반응한다.
2. Lrig-1 단백질의 에피토프를 코딩하는 핵산 분자
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 상기 에피토프를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 핵산 분자는 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 당업자에게 알려진 바와 같이 폴리뉴클레오티드 서열로 번역된 핵산 분자 모두를 포함한다. 그러므로 ORF(open reading frame)에 의한 다양한 폴리뉴클레오티드 서열이 제조될 수 있으며 이 또한 모두 본 발명의 핵산 분자에 포함된다.
3. Lrig-1 단백질의 에피토프를 코딩하는 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 상기 단리된 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에서 상기 "벡터"는 어떤 핵산 분자가 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 상기 핵산 분자이다. 벡터의 한 가지 유형은, 추가적인 DNA 세그멘트가 결찰될 수 있는 원형 이중가닥 DNA를 가리키는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스성 벡터로, 추가적인 DNA 세그멘트가 바이러스 게놈에 결찰될 수 있다. 어떤 벡터들은 그들이 유입된 숙주세포에서 자율적인 복제를 할 수 있다(예컨대, 박테리아성 벡터는 박테리아성 복제 기원을 갖는 에피솜 포유류 벡터). 기타 벡터(예컨대, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주세포에 유입되면서 숙주세포의 게놈에 통합될 수 있고, 이를 통해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 뿐만 아니라, 어떤 벡터는 이들이 작동차원에서 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이와 같은 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" 또는 단순히 "발현 벡터"라 명명된다. 일반적으로 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, "플라스미드"와 "벡터"는 벡터 중에서 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 형태이기 때문에, 상호 교환하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 발현 벡터의 구체적인 예시로는 상업적으로 널리 사용되는 pCDNA 벡터, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti 벡터; 코스미드; 람다, 람도이드(lambdoid), M13, Mu, p1 P22, Qμμ, T-even, T2, T3, T7 등의 파아지; 식물 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에게 발현 벡터로 알려진 모든 발현 벡터는 본 발명에 사용 가능하고, 발현 벡터를 선택할 때에는 목적으로 하는 숙주 세포의 성질에 따른다. 숙주세포로의 벡터 도입 시 인산칼슘 트랜스펙션, 바이러스 감염, DEAE-덱스트란 조절 트랜스펙션, 리포펙타민 트랜스펙션 또는 전기천공법에 의해 수행될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자는 사용하는 발현 벡터 및 숙주 세포에 알맞은 도입 방법을 선택하여 이용할 수 있다. 바람직하게 벡터는 하나 이상의 선별 마커를 함유하나 이에 한정되지 않으며, 선별 마커를 포함하지 않은 벡터를 이용하여 생산물 생산 여부에 따라 선별이 가능하다. 선별 마커의 선택은 목적하는 숙주 세포에 의해 선별되며, 이는 이미 당업자에게 알려진 방법을 이용하므로 본 발명은 이에 제한을 두지 않는다.
본 발명의 핵산 분자가 코딩하는 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여 태그(Tag) 서열을 상기 발현 벡터 상에 삽입하여 융합시킬 수 있다. 상기 태그로는 헥사-히스티딘 태그, 헤마글루티닌 태그, myc 태그 또는 flag 태그를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자에게 알려진 정제를 용이하게 하는 태그는 모두 본 발명에서 이용 가능하다.
4. Lrig-1 단백질의 에피토프를 코딩하는 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터가 형질전환된 숙주 세포주
본 발명의 또 다른 구현 예에 다르면, 본 발명에서 제공하는 상기 발현 벡터가 형질전환된 숙주 세포주를 제공한다.
본 발명에서 상기 "숙주 세포"에는 폴리펩티드 삽입물의 편입을 위한 벡터(들)의 수령자(recipient)일 수 있거나 또는 수령자였던 개별적인 세포 또는 세포배양물이 포함된다. 숙주 세포에는 단일 숙주 세포의 자손이 포함되고, 상기 자손은 자연적인, 우발적인 또는 고의의 돌연변이 때문에 반드시 원래 모세포와 완전히 동일(형태학상 또는 게놈 DNA 보완체에서)하지 않을 수 있다. 숙주 세포에는 본원의 폴리펩티드(들)로 체내에서 형질 전환된 세포가 포함된다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주 세포로는 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있고, 예를 들면 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포, 피치아 파스 토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, Chinese hamster ovary cells), SP2/0(생쥐 골수종), 인간 림프아구(Human lymphoblastoid), COS, NSO(생쥐 골 수종), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, Baby Hamster Kidney cells), HEK(인간 배아신장 세포, Human Embryonic Kidney cells) 또는 PERC.6(인간 망막 세포)의 동물 세포; 또는 식물 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 숙주 세포주로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.
본 발명의 상기 형질 전환 방법은 상기 숙주 세포에 목적하는 벡터를 주입시키는 임의의 방법으로서, 숙주 세포에 벡터를 주입시킬 수 있는 공지의 방법이라면 모두 포함될 수 있고, 예를 들면, CaCl2를 이용한 방법, 전기천공법, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 유전자 밤바드먼트 및 바이러스를 이용한 형질 전환 방법 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
5. 항체 또는 항원 결합 단편
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명에서 상기 항체는 전장 항체(full-length antibody) 또는 항체의 일부분으로써 Lrig-1 단백질에 결합할 능력을 가지며 본 발명의 결합 분자와 경쟁적으로 Lrig-1 항원 결정 부위에 결합하는 항체 단편 모두를 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로블린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 항원은 조절 T 세포(regulatory T cell)의 표면에 존재하는 Lrig-1 단백질일 수 있다. 바람직하게는 상기 Lrig-1 단백질의 류신 리치 구역(Leucine Rich Region) 또는 면역글로블린 유사 도메인을 특이적으로 인식하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.
본 발명에서 상기 "면역글로불린"은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변 가능한 영역 및 4개의 구조 영역(Framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 항원 결정기(Epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 지칭하고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
본 발명에서 상기 "전장 항체"는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드(Disulfide) 결합으로 연결되어 있으며, IgA, IgD, IgE, IgM, 및 IgG를 포함한다. 상기 IgG는 그 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.
또한, 본 발명에서 상기 "항원 결합 단편"은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, 항원 결합 단편의 예는 (i) 경쇄의 가변역역(VL) 및 중쇄의 가변영역(VH)과 경쇄의 불변역역(CL) 및 중쇄의 첫번째 불변 영역 (CH1)으로 이루어진 Fab 단편; (ⅱ) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (ⅲ) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편; (v) 분리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 항원 결합 부위를 형성하도록 결합시키는 펩타이드 링커에 의해 결합된 단일쇄 Fv 분자(scFv); (viii) 이특이적인 단일쇄 Fv 이량체 및 (ix) 유전자 융합에 의해 제작된 다가 또는 다특이적인 단편인 디아바디(diabody) 등을 포함한다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소, 예를 들면 파파인 또는 펩신을 이용하는 경우 Fab 또는 F(ab')2의 단편을 얻을 수 있으며, 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 항체는 단일클론항체(monoclonal antibody), 다클론항체(polyclonal antibody), 키메라 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody), 인간 항체(human antibody), 이가(bivalent), 양특이성 분자, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 이중특이적 항체(bispecific antibody), 항체 모방체, 유니바디(unibody), 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody) 또는 이의 단편일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 "단일클론항체"는, 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 일컫는 말로, 특정 항원 결정기(Epitope)에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
본 발명에서 상기 "키메라 항체"는, 생쥐 항체의 가변 영역 및 인간 항체의 불변 영역을 재조합 시킨 항체로서, 생쥐 항체에 비하여 면역 반응이 크게 개선된 항체이다.
또한, 본 발명에서 상기 "인간화 항체"는 인간이 아닌 종에서 유래한 항체의 단백질 서열을 인간에서 자연적으로 생산된 항체 변이체와 유사하도록 변형시킨 항체를 의미한다. 그 예로 상기 인간화 항체는 생쥐 유래의 CDR을 인간 항체 유래의 FR과 재조합시켜 인간화 가변 영역을 제조하고, 이를 바람직한 인간 항체의 불변 영역과 재조합시켜 인간화 항체를 제조할 수 있다.
본 발명에서 상기 "결합" 또는 "특이적 결합"은 본원 항체 또는 항체 조성물의 항원에 대한 친화도를 나타내는 것이다. 항원 항체 결합에서 "특이적 결합"은 전형적으로 해리상수(dissociation constant, Kd)가 1x10-5M 미만 또는 1x10-6M 미만 또는 1x10-7M 미만인 경우 비특이적인 배경 결합과 구분될 수 있다. 특이적 결합은 당업계의 공지된 방법, 예를 들면 ELISA, SPR(Surface plasmon resonance), 면역침전(immunoprecipitation), 공침전(coprecipitation) 등의 방법으로 검출될 수 있으며, 비특이적 결합과 특이적 결합을 구분할 수 있는 적절한 대조군을 포함한다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 단량체의 항원 결합능의 적어도 일부를 포함하는 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체 등의 다량체로 존재할 수 있다. 이러한 다량체는 또한 동종다량체, 또는 이종다량체를 포함하는 것이다. 항체 다량체는 다수의 항원 결합 부위를 포함하기 때문에 단량체와 비교하여 항원에 대한 결합능이 우수하다. 항체의 다량체는 또한 다기능성(bifunctional, trifunctional, tetrafunctional) 항체 제작에도 용이하다.
본 발명에서 상기 "다기능성"이란, 두 가지 이상의 활성 또는 기능 (예를 들면 항원결합능, 효소 활성, 리간드 또는 수용체 결합능)을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편을 일컫는 것으로, 예를 들면 본 발명의 항체는 효소 활성을 갖는 폴리펩티드 예를 들면 루시퍼라제, 아세틸트랜스퍼라제, 갈락토시다제 등과 결합될 수 있다. 다기능성 항체는 또한 다가성(multivalent) 또는 다특이성(bispecific, trispecific, 등) 형태의 항체를 포함한다.
6. 항체 또는 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물
또한, 본 발명에 따른 항체는 조절 T 세포 상에 존재하는 서열번호 7 내지 72 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하여 상기 조절 T 세포의 기능을 활성화 또는 유지시키거나; 또는 억제하여, 이펙터 T 세포의 활성을 조절함으로써 암을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 상기 "암"은 포유류에서 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장으로 특징 지어진 생리적 상태를 나타내거나 가리킨다. 본 발명에서 예방, 개선 또는 치료의 대상이 되는 암은 고형 장기(solid organ)에서 비정상적으로 세포가 성장하여 발생한 덩어리로 이루어진 고형암(solid tumor)일 수 있고, 고형 장기의 부위에 따라 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 흑색종 또는 폐암 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
7. 항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 항체 또는 항원 결합 단편; 및 약물을 포함하는 항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)를 제공한다.
본 발명에서 상기 "항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)"란, 항체와 약물의 생물학적 활성을 저하시키지 않으면서 약물과 항체를 화학적으로 연결한 형태를 지칭한다. 본 발명에서 상기 항체-약물 결합체는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 N-말단의 아미노산 잔기에 약물이 결합된 형태, 구체적으로는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 N-말단, α-아민기에 약물이 결합된 형태를 말한다.
본 발명에서 상기 "약물"은 세포에 특정 생물학적 활성을 가지는 임의의 물질을 의미할 수 있으며, 이는 DNA, RNA 또는 펩타이드(Peptide)를 포함하는 개념이다. 상기 약물은 α-아민기와 반응하여 가교할 수 있는 반응기를 포함하는 형태일 수 있으며, α-아민기와 반응하여 가교할 수 있는 반응기를 포함하는 링커가 연결되어 있는 형태 역시 포함한다.
본 발명에서 상기 α-아민기와 반응하여 가교할 수 있는 반응기의 예로는, 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 α-아민기와 반응하여 가교할 수 있다면 그 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 공지된 아민기와 반응하는 종류를 모두 포함한다. 그 예로 아이소티오시아네이트(Isothiocyanate), 아이소시아네이트(Isocyanates), 아실 아자이드(Acyl azide), NHS 에스터(NHS ester), 설포닐 클로라이드(Sulfonyl chloride), 알데하이드(Aldehyde), 글리옥살(Glyoxal), 에폭사이드(Epoxide), 옥시레인(Oxirane), 칼보네이트(Carbonate), 아릴 할라이드(Aryl halide), 이미도에스터(Imidoester), 카보이미드(Carbodiimide), 안하이드라이드(Anhydride) 및 플루오로페닐 에스터(Fluorophenyl ester) 중 어느 하나 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 항체-약물 결합체는 상기 항체 또는 항원 결합 단편으로 본 발명의 에피토프, 즉 Lrig-1 단백질; 또는 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인의 일부 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하는 에피토프; 상기 식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하는 에피토프; 또는 서열번호 48 내지 113 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하고, 이때 상기 약물은 Lrig-1 항체가 표적으로 하는 질환을 치료할 수 있는 약물이라면 모두 포함될 수 있고, 예를 들면 암을 치료할 수 있는 항암제를 치료할 수 있는 약물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 항암제는 암의 예방, 개선 또는 치료를 위해 사용되는 약물이라면 제한없이 포함될 수 있으나, 예를 들면, 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 소라페닙, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다라빈, 에노시타빈, 플루타미드, 카페시타빈, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈블라스틴, 이다루비신, 미토마이신, 블레오마이신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 올라파립, 나벨빈, 파드로졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴, 5FU, 보리노스텟, 엔티노스텟 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
8. 항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 항체 또는 항원 결합 단편; 또는 항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)를 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 약학 조성물에서 유효 성분으로 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편; 또는 이에 약물이 결합된 항체-약물 결합체는 서열번호 7 내지 72 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하여 상기 조절 T 세포의 기능을 억제하고, 이펙터 T 세포의 활성은 유지 혹은 상승시켜 암을 매우 효과적으로 치료할 수 있다.
본 발명에서 상기 암은 고형 장기(solid organ)에서 비정상적으로 세포가 성장하여 발생한 덩어리로 이루어진 고형암(solid tumor)일 수 있고, 구체적인 예시로 고형 장기의 부위에 따라 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 흑색종 또는 폐암 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
9. 기타
한편, 본 발명에서, "예방"은 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 질환의 증상을 차단하거나, 그 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서, "치료"는 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 질환의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사 용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항 응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 상기 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.
본 발명에서 상기 "비경구"란, 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.
10. 치료 방법
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에 따른 항체 또는 항원 결합 단편; 또는 항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)를 약학적 유효량으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상기 "암"은 포유류에서 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장으로 특징 지어진 생리적 상태를 나타내거나 가리킨다. 본 발명에서 예방, 개선 또는 치료의 대상이 되는 암은 고형 장기(solid organ)에서 비정상적으로 세포가 성장하여 발생한 덩어리로 이루어진 고형암(solid tumor)일 수 있고, 고형 장기의 부위에 따라 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 흑색종 또는 폐암 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편; 및 항체-약물 결합체는 서열번호 7 내지 72 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하여 상기 조절 T 세포의 기능을 억제하고, 이펙터 T 세포의 활성은 유지 혹은 상승시켜 암을 매우 효과적으로 치료할 수 있다.
본 발명에서 상기 "개체"는 암의 발병이 의심되는 개체로서, 상기 암 발병의 의심 개체는 해당 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 가축 등을 포함하는 포유동물을 의미하나, 본 발명의 항체 또는 항체-약물 결합체로 치료 가능한 개체는 제한 없이 포함된다.
본 발명의 방법은 항체 또는 항체-약물 결합체를 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
한편, 이에 제한되지 않으나, 상기 암의 예방 또는 치료 방법은 하나 이상의 암 질환에 대한 치료적 활성을 가지는 화합물 또는 물질을 투여하는 것을 더 포함하는 병용 요법일 수 있다.
본 발명에서 상기 "병용"은 동시, 개별 또는 순차 투여를 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 상기 투여가 순차 또는 개별적인 경우, 2차 성분 투여의 간격은 상기 병용의 이로운 효과를 잃지 않도록 하는 것이어야 한다.
본 발명에서 상기 항체 또는 항체-약물 결합체의 투여 용량은 환자 체중 1 kg당 약 0.0001 μg 내지 500 mg일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 Lrig-1 단백질의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 조절 T 세포 상에 존재하는 본 발명의 에피토프에 특이적으로 결합하여 상기 조절 T 세포의 기능을 억제하고, 이펙터 T 세포의 활성은 유지 혹은 상승시켜 암의 예방, 개선 또는 치료에 매우 효율적으로 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1, Lrig-2 및 Lrig-3 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 조절 T 세포와 비 조절 T 세포 내 Lrig-1 단백질의 발현량 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 조절 T 세포의 표면에 Lrig-1 단백질의 발현을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에서 항체(GTC210-01, GTC210-02, GTC210-03, GTC210-04, GTC110-01, GTC110-02, GTC110-03 및 GTC110-04)와 Lrig-1 단백질에 대한 결합력을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에서 Lrig-1 단백질에 특이적인 단일클론항체(GTC210-01, GTC210-02, GTC210-03, GTC210-04, GTC110-01, GTC110-02, GTC110-03 및 GTC110-04)와 조절 T 세포 내에서 Lrig-1 단백질 유도 Stat3 인산화 조절 기작을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에서 Lrig-1 단백질에 특이적인 단일클론항체를 이용한 암 치료 실험 설계도를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에서 Lrig-1 단백질에 특이적인 단일클론항체(GTC110-01, GTC110-02, GTC110-03 및 GTC110-04)를 이용한 암 치료 효과를 나타낸 것이다.
도 13 내지 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 질량 분석의 조건을 나타낸 것이다.
도 16 및 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lirg-1 단백질의 세포 외 도메인에서 키모트립신을 이용한 공유결합 레이블링 MS 결과를 나타낸 것이다.
도 18 및 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lirg-1 단백질의 세포 외 도메인에서 트립신을 이용한 공유결합 레이블링 MS 결과를 나타낸 것이다.
도 20 및 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lirg-1 단백질의 세포 외 도메인에서 Asp-N+Lys-C를 이용한 공유결합 레이블링 MS 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lirg-1 단백질의 세포 외 도메인에서 키모트립신을 이용한 크로스 결합 MS 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lirg-1 단백질의 세포 외 도메인에서 트립신을 이용한 크로스 결합 MS 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lirg-1 단백질의 세포 외 도메인에서 Asp-N+Lys-C를 이용한 크로스 결합 MS 결과를 나타낸 것이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인 중에서 GTC110-04 항체가 특이적으로 결합하는 에피토프 부위를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
[준비예 1] T 세포 아형 세포 배양
조절 T 세포(Treg)에서만 Lrig-1 단백질이 발현되는지 확인하기 위하여, T 세포의 아형(subset)인 Th0, Th1, Th2, Th17 및 iTreg을 준비하였다. 상기 iTreg은 자연적으로 분리한 nTreg과는 달리 하기 조성을 포함하는 배지에서 분화를 인공적으로 유도한 세포를 의미한다.
T 세포의 아형은 우선, 쥐의 비장으로부터 얻은 나이브(naive) T 세포를 분리한 뒤, 우태아혈청(FBS; hyclone, logan, UT) 10%를 포함하는 RPMI1640(Invitrogen Gibco, Grand Island, NY) 영양배지에 하기 표 1의 성분을 각각 더 포함하도록 하여, 37℃, 5 % CO2 배양기 내에서 72시간 배양을 통해 각각의 세포로 분화 유도하였다.
분화 세포 조성
Th0 anti-CD3, anti-CD28
Th1 IL-12, anti-IL-4 항체
Th2 IL-4, anti-IFNβ
Th17 IL-6, TGFβ, anti-IFNβ, anti-IL-4
iTreg IL-2, TGFβ
[실시예 1] Lrig-1 구조 분석
조절 T 세포의 표면 단백질인 Lrig-1 단백질에 특이적인 항체를 제작하기 위하여 Lrig-1 단백질의 세포외 도메인의 3차원 입체 구조를 예측하였다.
우선, 항원 결정기(Epitope) 염기서열 예측을 위해 Lrig-1 단백질의 세포외 도메인(Extracellular domain; ECD)의 구조를 확인하기 위하여 Uniprot(http://www.uniprot.org)과 RCSB Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb) 툴을 이용하여 3차원 입체 구조를 예측한 뒤, 그 결과를 도 1 및 2에 나타내었다.
도 1에서 보는 바와 같이, Lrig-1 단백질의 세포외 도메인 중 Lrig-LRR 도메인(아미노산 서열 41 ~ 494번) 내에는 LRR1 내지 LRR15의 총 15개의 류신 리치 부위(Leucine rich region)가 존재하였다. 상기 LRR 도메인 각각은 23 내지 27개의 아미노산으로 구성되고, 류신은 3 내지 5개가 존재하였다.
또한, 도 2에서 보는 바와 같이, Lrig-1 단백질의 세포외 도메인 중 Lrig-1 단백질의 아미노산 서열 494 내지 781번에는 면역글로블린 유사 도메인(Immunoglobulin-like domain)이 3개 존재하였다.
[실시예 2] Lrig-1 mRNA의 조절 T 세포에서의 특이적 발현 확인
Lrig-1 단백질이 조절 T 세포에 특이적인 바이오마커(biomarker)로 작용할 수 있는지 검증하였다.
상기 검증을 위하여, 쥐의 비장으로부터 CD4 비드를 통해 자석 활성 세포 분류기(magnet-activated cell sorting; MACS)를 이용하여 CD4+ T 세포를 분리하였다. 이후, CD25 항체를 이용하여 형광 활성 세포 분류기(FACS)를 이용해 조절 T (CD4+CD25+ T) 세포 및 비 조절 T (CD4+CD25- T) 세포를 분리하였다. 각각의 세포 및 상기 준비예 1에서 분화된 세포는 트리졸(Trizol)을 이용하여 mRNA를 추출한 뒤, 게노믹 RNA는 gDNA 추출 키트(Qiagen)를 이용하여 업체에서 제공한 프로토콜에 의해 gDNA를 제거하였다. gDNA가 제거된 mRNA는 BDsprint cDNA 합성 키트 (Clonetech)를 통해 cDNA로 합성하였다.
상기 cDNA에서 Lrig-1 mRNA의 발현량을 정량적으로 확인하기 위하여 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)을 수행하였다.
상기 실시간 중합효소연쇄반응은 SYBR Green (Molecular Probes)을 이용하여 업체에서 제공한 프로토콜에 의해 95℃에서 3분, 61℃에서 15초, 72℃에서 30초씩 40 사이클의 조건으로, 하기 표 2의 프라이머를 이용하여 수행하였고, 상대적인 유전자 발현량은 △CT 방법을 이용하여 계산하였으며, HPRT를 이용하여 일반화(normalization) 하여, 그 결과를 도 3 내지 6에 나타내었다.
프라이머 서열
쥐 Lrig-1 Forward 5' - GAC GGA ATT CAG TGA GGA GAA CCT - 3'
Reverse 5' - CAA CTG GTA GTG GCA GCT TGT AGG - 3'
쥐 Lrig-2 forward 5' - TCA CAA GGA ACA TTG TCT GAA CCA- 3'
reverse 5' - GCC TGA TCT AAC ACA TCC TCC TCA- 3'
쥐 Lrig-3 forward 5' - CAG CAC CTT GAG CTG AAC AGA AAC - 3'
reverse 5' - CCA GCC TTT GGT AAT CTC GGT TAG - 3'
쥐 FOXP3 forward 5' - CTT TCA CCT ATC CCA CCC TTA TCC - 3'
reverse 5' - ATT CAT CTA CGG TCC ACA CTG CTC - 3'
ACTG1 forward 5' - GGC GTC ATG GTG GGC ATG GG - 3'
reverse 5' - ATG GCG TGG GGA AGG GCG TA - 3'
도 3에서 보는 바와 같이, 비 조절 T (CD4+CD25- T) 세포에 비하여 조절 T (CD4+CD25+ T) 세포에서 Lrig-1의 발현이 18.1배 높은 것을 알 수 있다. 이는, 기존에 알려져 있는 조절 T 세포의 마커인 Lag3 및 Ikzf4와 비교하였을 때 약 10배 정도 발현양이 높은 수준이었다.
또한, 도 4 및 5에서 보는 바와 같이, 다른 종류의 면역세포에 비하여 조절 T 세포, 특히 유도된 조절 T 세포(iTreg)에 비해 자연적으로 분리한 조절 T 세포(nTreg)에서 Lrig-1 mRNA의 발현이 현저하게 높았다.
또한, 도 6에서 보는 바와 같이, Lrig 패밀리에 해당하는 Lrig-1, Lrig-2 및 Lrig-3 중에서 Lrig-1의 발현이 가장 높았다.
상기 결과를 통해 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질은 조절 T 세포, 특히 자연적으로 존재하는 조절 T 세포에서 특이적으로 발현하는 것을 알 수 있다.
[실시예 3] Lrig-1 단백질의 조절 T 세포에서의 특이적 발현 확인
Lrig-1 mRNA로부터 발현된 Lrig-1 단백질이 조절 T 세포에서만 특이적으로 발현되는지 확인하였다.
조절 T 세포 특이적인 전사 인자인 FOXP3 프로모터에 RFP(Red fluorescence protein)이 결합된 FOXP3-RFP 주입(Knock-in) 쥐를 이용하여, 상기 쥐의 비장으로부터 CD4 비드로 자석 활성 세포 분류기(magnet-activated cell sorting; MACS)를 이용하여 CD4+ T 세포를 분리하였다. 이후, RFP 단백질을 이용하여, 형광 활성 세포 분류기(FACS)를 통해 조절 T (CD4+RFP+ T) 세포 및 비 조절 T(CD4+RFP- T) 세포를 분리하여 얻었다. 각각의 상기 세포는 구입한 Lrig-1 항체 및 음성 대조군은 아이소타입(isotype)을 통해 염색하여 형광 활성 세포 분류기로 Lrig-1의 발현량을 측정하여, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에서 보는 바와 같이, 점선으로 표시되는 비 조절 T 세포의 경우 음성 대조군과 거의 동일한 Lrig-1의 발현 수준을 보였지만, 조절 T 세포의 경우 Lrig-1의 발현 수준이 높은 세포가 다수 존재하였다.
상기 결과를 통해 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질은 조절 T 세포에서 특이적으로 발현하는 것을 알 수 있다.
[실시예 4] 조절 T 세포 표면에서의 Lrig-1 단백질 특이적 발현 확인
Lrig-1 단백질이 세포 치료의 타겟이 되기 위해서는 조절 T 세포의 표면에 발현되어야 더욱 효과적으로 타겟 치료를 할 수 있으므로, Lrig-1 단백질이 표면에서의 발현 여부를 확인하였다.
상기 준비예 1의 각각의 분화된 T 세포 아형을 항-CD4-APC 및 항 Lrig-1-PE 항체로 염색하고, 형광 이용 세포 분류기(Fluorescence-Activated Cell Sorter; FACS)를 이용하여 각각의 세포 표면에서 Lrig-1의 발현량을 측정하여, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에서 보는 바와 같이, 활성화된 T 세포(activated T cell), Th1 세포, Th2 세포, Th17 세포 및 나이브(Naive) T 세포에서는 Lrig-1의 발현이 0.77 내지 15.3의 양으로 발현되는 반면, 분화가 유도된 T 세포(iTreg)에서는 83.9로 높게 발현되었다.
상기 결과를 통해 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질은 조절 T 세포(Treg) 세포에서 특이적으로 발현될 뿐만 아니라, 특히 조절 T 세포의 표면에서 더욱 높게 발현되는 것을 알 수 있다.
[제조예 1 내지 8] Lrig-1 단백질에 특이적인 단일클론항체의 제작
본 발명에 따른 Lrig-1 단백질에 특이적인 항체를 제작하였다. 본 항체는 특정 항원 결정기를 정하여 생산하지 않고, Lrig-1 단백질에 어느 부위든지 결합할 수 있는 항체를 생산하였다.
상기 항체를 제작하기 위하여 Lrig-1 단백질이 발현되는 세포를 제작하였다. 보다 상세하게는, 서열번호 2에 해당하는 DNA 단편 및 pcDNA(hygro)를 절단 효소로 절단한 뒤, 37℃에서 배양하여 라이게이션(Lrigation) 하여, Lrig-1 단백질의 DNA 서열이 삽입(insert) 되어 있는 pcDNA를 제작하였다. 상기 제작된 서열번호 2가 삽입된 pcDNA는 L세포에 형질주입(transfection)을 통해 도입되어 L 세포의 표면에 Lrig-1 단백질이 발현될 수 있도록 하였다.
상기 세포 표면에 발현되는 Lrig-1에 결합할 수 있는 경쇄(Lright chain) 및 중쇄(heavy chain) 아미노산의 서열을 Human scFv library에서 선별하여, 총 8개의 중쇄 및 경쇄를 선별하였다.
상기 선별된 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 mlgG2a Fc 영역 또는 인간 IgG1 Fc 영역과 융합하여 단일클론항체(monoclonal antibody)를 제작하였다. 상기 단일클론항체의 서열은 하기 표 3과 같다.
구분 클론 위치 아미노산 서열 서열정보
제조예 1 GTC210-01 clone 중쇄 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS GYDMSWVRQA PGKGLEWVSL IYPDSGNKYY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDA GLSWAGAFDY WGQGTLVTVS 120
SASTTAPSVY PLAPVCGDTT GSSVTLGCLV KGYFPEPVTL TWNSGSLSSG VHTFPAVLQS 180
DLYTLSSSVT VTSSTWPSQS ITCNVAHPAS STKVDKKIEP RGPTIKPCPP CKCPAPNLLG 240
GPSVFIFPPK IKDVLMISLS PIVTCVVVDV SEDDPDVQIS WFVNNVEVHT AQTQTHREDY 300
NSTLRVVSAL PIQHQDWMSG KEFKCKVNNK DLPAPIERTI SKPKGSVRAP QVYVLPPPEE 360
EMTKKQVTLT CMVTDFMPED IYVEWTNNGK TELNYKNTEP VLDSDGSYFM YSKLRVEKKN 420
WVERNSYSCS VVHEGLHNHH TTKSFSRTPG K		 서열번호 147
경쇄 QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCSGSSSNIG SNYVTWYQQL PGTAPKLLIY SDSHRPSGVP 60
DRFSGSKSGT SASLAISGLQ SEDEADYYCG SWDYSLSAYV FGGGTKLTVL RTVAAPTVSI 120
FPPSSEQLTS GGASVVCFLN NFYPKDINVK WKIDGSERQN GVLNSWTDQD SKDSTYSMSS 180
TLTLTKDEYE RHNSYTCEAT HKTSTSPIVK SFNRNEC		 서열번호 148
제조예 2 GTC210-02 clone 중쇄 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYYMSWVRQA PGKGLEWVSG ISPGDSSTYY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKGL YSNPNEPFDY WGQGTLVTVS 120
SASTTAPSVY PLAPVCGDTT GSSVTLGCLV KGYFPEPVTL TWNSGSLSSG VHTFPAVLQS 180
DLYTLSSSVT VTSSTWPSQS ITCNVAHPAS STKVDKKIEP RGPTIKPCPP CKCPAPNLLG 240
GPSVFIFPPK IKDVLMISLS PIVTCVVVDV SEDDPDVQIS WFVNNVEVHT AQTQTHREDY 300
NSTLRVVSAL PIQHQDWMSG KEFKCKVNNK DLPAPIERTI SKPKGSVRAP QVYVLPPPEE 360
EMTKKQVTLT CMVTDFMPED IYVEWTNNGK TELNYKNTEP VLDSDGSYFM YSKLRVEKKN 420
WVERNSYSCS VVHEGLHNHH TTKSFSRTPG K		 서열번호 149
경쇄 QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCTGSSSNIG SNYVSWYQQL PGTAPKLLIY DDSQRPSGVP 60
DRFSGSKSGT SASLAISGLR SEDEADYYCG TWDYSLNGYV FGGGTKLTVL RTVAAPTVSI 120
FPPSSEQLTS GGASVVCFLN NFYPKDINVK WKIDGSERQN GVLNSWTDQD SKDSTYSMSS 180
TLTLTKDEYE RHNSYTCEAT HKTSTSPIVK SFNRNEC		 서열번호 150
제조예 3 GTC210-03 clone 중쇄 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYDMSWVRQA PGKGLEWVSG ISPDGSNIYY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKVG LRCRYEACSY AYGMDVWGQG 120
TLVTVSSAST TAPSVYPLAP VCGDTTGSSV TLGCLVKGYF PEPVTLTWNS GSLSSGVHTF 180
PAVLQSDLYT LSSSVTVTSS TWPSQSITCN VAHPASSTKV DKKIEPRGPT IKPCPPCKCP 240
APNLLGGPSV FIFPPKIKDV LMISLSPIVT CVVVDVSEDD PDVQISWFVN NVEVHTAQTQ 300
THREDYNSTL RVVSALPIQH QDWMSGKEFK CKVNNKDLPA PIERTISKPK GSVRAPQVYV 360
LPPPEEEMTK KQVTLTCMVT DFMPEDIYVE WTNNGKTELN YKNTEPVLDS DGSYFMYSKL 420
RVEKKNWVER NSYSCSVVHE GLHNHHTTKS FSRTPGK		 서열번호 151
경쇄 QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCSGSSSNIG SNYVSWYQQL PGTAPKLLIY SDSHRPSGVP 60
DRFSGSKSGT SASLAISGLR SEDEADYYCA TWDSSLNGYV FGGGTKLTVL RTVAAPTVSI 120
FPPSSEQLTS GGASVVCFLN NFYPKDINVK WKIDGSERQN GVLNSWTDQD SKDSTYSMSS 180
TLTLTKDEYE RHNSYTCEAT HKTSTSPIVK SFNRNEC		 서열번호 152
제조예 4 GTC 210-04 clone 중쇄 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYDMSWVRQA PGKGLEWVSS ISPSSGSIYY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKDL DAFWRPSFDY WGQGTLVTVS 120
STTAPSVYPL APVCGDTTGS SVTLGCLVKG YFPEPVTLTW NSGSLSSGVH TFPAVLQSDL 180
YTLSSSVTVT SSTWPSQSIT CNVAHPASST KVDKKIEPRG PTIKPCPPCK CPAPNLLGGP 240
SVFIFPPKIK DVLMISLSPI VTCVVVDVSE DDPDVQISWF VNNVEVHTAQ TQTHREDYNS 300
TLRVVSALPI QHQDWMSGKE FKCKVNNKDL PAPIERTISK PKGSVRAPQV YVLPPPEEEM 360
TKKQVTLTCM VTDFMPEDIY VEWTNNGKTE LNYKNTEPVL DSDGSYFMYS KLRVEKKNWV 420
ERNSYSCSVV HEGLHNHHTT KSFSRTPGK		 서열번호 153
경쇄 QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCTGSSSNIG NNNVNWYQQL PGTAPKLLIY SDSHRPSGVP 60
DRFSGSKSGT SASLAISGLR SEDEADYYCG SWDDSLSAYV FGGGTKLTVL RTVAAPTVSI 120
FPPSSEQLTS GGASVVCFLN NFYPKDINVK WKIDGSERQN GVLNSWTDQD SKDSTYSMSS 180
TLTLTKDEYE RHNSYTCEAT HKTSTSPIVK SFNRNEC		 서열번호 154
제조예 5 GTC110-01 clone 중쇄 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYDMSWVRQA PGKGLEWVSS ISPSSGSIYY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKDL DAFWRPSFDY WGQGTLVTVS 120
SASTTAPSVY PLAPVCGDTT GSSVTLGCLV KGYFPEPVTL TWNSGSLSSG VHTFPAVLQS 180
DLYTLSSSVT VTSSTWPSQS ITCNVAHPAS STKVDKKIEP RGPTIKPCPP CKCPAPNLLG 240
GPSVFIFPPK IKDVLMISLS PIVTCVVVDV SEDDPDVQIS WFVNNVEVHT AQTQTHREDY 300
NSTLRVVSAL PIQHQDWMSG KEFKCKVNNK DLPAPIERTI SKPKGSVRAP QVYVLPPPEE 360
EMTKKQVTLT CMVTDFMPED IYVEWTNNGK TELNYKNTEP VLDSDGSYFM YSKLRVEKKN 420
WVERNSYSCS VVHEGLHNHH TTKSFSRTPG K		 서열번호 155
경쇄 QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCTGSSSNIG NNSVTWYQQL PGTAPKLLIY ADNNRPSGVP 60
DRFSGSKSGT SASLAISGLR SEDEADYYCA AWDSSLSAYV FGGGTKLTVL RTVAAPTVSI 120
FPPSSEQLTS GGASVVCFLN NFYPKDINVK WKIDGSERQN GVLNSWTDQD SKDSTYSMSS 180
TLTLTKDEYE RHNSYTCEAT HKTSTSPIVK SFNRNEC		 서열번호 156
제조예 6 GTC110-02 clone 중쇄 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYYMSWVRQA PGKGLEWVSG ISHDSGSKYY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARHW TTFDYWGQGT LVTVSSASTT 120
APSVYPLAPV CGDTTGSSVT LGCLVKGYFP EPVTLTWNSG SLSSGVHTFP AVLQSDLYTL 180
SSSVTVTSST WPSQSITCNV AHPASSTKVD KKIEPRGPTI KPCPPCKCPA PNLLGGPSVF 240
IFPPKIKDVL MISLSPIVTC VVVDVSEDDP DVQISWFVNN VEVHTAQTQT HREDYNSTLR 300
VVSALPIQHQ DWMSGKEFKC KVNNKDLPAP IERTISKPKG SVRAPQVYVL PPPEEEMTKK 360
QVTLTCMVTD FMPEDIYVEW TNNGKTELNY KNTEPVLDSD GSYFMYSKLR VEKKNWVERN 420
SYSCSVVHEG LHNHHTTKSF SRTPGK		 서열번호 157
경쇄 QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCSGSSSNIG SNNVTWYQQL PGTAPKLLIY ANSNRPSGVP 60
DRFSGSKSGT SASLAISGLR SEDEADYYCG AWDYSLSAYV FGGGTKLTVL RTVAAPTVSI 120
FPPSSEQLTS GGASVVCFLN NFYPKDINVK WKIDGSERQN GVLNSWTDQD SKDSTYSMSS 180
TLTLTKDEYE RHNSYTCEAT HKTSTSPIVK SFNRNEC		 서열번호 158
제조예 7 GTC110-03 clone 중쇄 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYAMSWVRQA PGKGLEWVSA IYPGGGSIYY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDI LPCPWGRCYY DYAMDVWGQG 120
TLVTVSSAST TAPSVYPLAP VCGDTTGSSV TLGCLVKGYF PEPVTLTWNS GSLSSGVHTF 180
PAVLQSDLYT LSSSVTVTSS TWPSQSITCN VAHPASSTKV DKKIEPRGPT IKPCPPCKCP 240
APNLLGGPSV FIFPPKIKDV LMISLSPIVT CVVVDVSEDD PDVQISWFVN NVEVHTAQTQ 300
THREDYNSTL RVVSALPIQH QDWMSGKEFK CKVNNKDLPA PIERTISKPK GSVRAPQVYV 360
LPPPEEEMTK KQVTLTCMVT DFMPEDIYVE WTNNGKTELN YKNTEPVLDS DGSYFMYSKL 420
RVEKKNWVER NSYSCSVVHE GLHNHHTTKS FSRTPGK		 서열번호 159
경쇄 QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCSDSSSNIG SNTVSWYQQL PGTAPKLLIY ADNNRPSGVP 60
DRFSGSKSGT SASLAISGLR SEDEADYYCG TWDYSLSGYV FGGGTKLTVL RTVAAPTVSI 120
FPPSSEQLTS GGASVVCFLN NFYPKDINVK WKIDGSERQN GVLNSWTDQD SKDSTYSMSS 180
TLTLTKDEYE RHNSYTCEAT HKTSTSPIVK SFNRNEC		 서열번호 160
제조예 8 GTC110-04 clone 중쇄 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYAMSWVRQA PGKGLEWVSV ISHGGGSTYY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVI SNCHLGVCYY SNGMDVWGQG 120
TLVTVSSAST TAPSVYPLAP VCGDTTGSSV TLGCLVKGYF PEPVTLTWNS GSLSSGVHTF 180
PAVLQSDLYT LSSSVTVTSS TWPSQSITCN VAHPASSTKV DKKIEPRGPT IKPCPPCKCP 240
APNLLGGPSV FIFPPKIKDV LMISLSPIVT CVVVDVSEDD PDVQISWFVN NVEVHTAQTQ 300
THREDYNSTL RVVSALPIQH QDWMSGKEFK CKVNNKDLPA PIERTISKPK GSVRAPQVYV 360
LPPPEEEMTK KQVTLTCMVT DFMPEDIYVE WTNNGKTELN YKNTEPVLDS DGSYFMYSKL 420
RVEKKNWVER NSYSCSVVHE GLHNHHTTKS FSRTPGK		 서열번호 161
경쇄 QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCSGSSSNIG NNDVYWYQQL PGTAPKLLIY SDSQRPSGVP 60
DRFSGSKSGT SASLAISGLR SEDEADYYCG TWDYSLSGYV FGGGTKLTVL RTVAAPTVSI 120
FPPSSEQLTS GGASVVCFLN NFYPKDINVK WKIDGSERQN GVLNSWTDQD SKDSTYSMSS 180
TLTLTKDEYE RHNSYTCEAT HKTSTSPIVK SFNRNEC		 서열번호 162
제조예 9 GTC110-04
인간화 항체		 중쇄 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYAMSWVRQA PGKGLEWVSV ISHGGGSTYY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVI SNCHLGVCYY SNGMDVWGQG 120
TLVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF 180
PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKKVEPKSC DKTHTCPPCP 240
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK 300
PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT 360
LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL 420
TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGKY		 서열번호 163
경쇄 QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCSGSSSNIG NNDVYWYQQL PGTAPKLLIY SDSQRPSGVP 60
DRFSGSKSGT SASLAISGLR SEDEADYYCG TWDYSLSGYV FGGGTKLTVL RTVAAPSVFI 120
FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS 180
TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC		 서열번호 164
[실시예 5] 본 발명에 따른 항체의 Lrig-1 단백질에 대한 결합능 평가
상기 제조예 1 내지 8에서 제작된 본 발명에 따른 단일클론항체가 Lrig-1을 잘 인식하는 지를 확인하기 위하여, Lrig-1을 안정하게 발현하는 L 세포에 상기 제조예 1 내지 8의 항체 각각을 결합시킨 뒤 마우스 항체를 인식할 수 있으면서 eFlour 670이 컨쥬게이션(conjugation)된 2차 항체(secondary antibody)를 넣은 후 FACS를 이용하여 상기 단일클론항체의 Lrig-1 단백질에 대한 결합력을 분석하여 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체 모두 L 세포의 표면에 존재하는 Lrig-1 단백질을 효과적으로 인식하여 결합한 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 6] 본 발명에 따른 항체의 조절 T 세포 내 신호전달경로의 조절
상기 제조예 1 내지 8에서 제작된 본 발명에 따른 단일클론항체가 Lrig-1 단백질을 통하여 조절 T 세포 내의 신호전달경로에 어떠한 영향을 미치는 지를 분석하기 위하여, 상기 제조예 1 내지 8의 항체를 조절 T 세포에 처리하여 상기 조절 T 세포의 표면에 존재하는 Lrig-1를 자극한 뒤, 포스포티로신 면역 블롯(phosphotyrosine immunoblot)을 통하여 자극받은 조절 T 세포 내에 존재하는 Stat3 단백질의 티로신 인산화(tyrosine phosphorylation) 정도를 분석하고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체(GTC210-01, GTC210-02, GTC210-03 및 GTC210-04)는 Stat3의 인산화(phosphorylation)를 Th17 세포와 같은 수준으로 증가를 시키는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체(GTC110-01, GTC110-02, GTC110-03 및 GTC110-04)는 Stat3의 인산화(phosphorylation)를 iTreg 세포와 같은 수준으로 계속하여 유지 및 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 7] (GTC110-01, GTC110-02, GTC110-03 및 GTC110-04 항체의 암 치료 효과
상기 제조예 5 내지 8에서 제작된 본 발명에 따른 단일클론항체(GTC110-01, GTC110-02, GTC110-03 및 GTC110-04)의 고형암에 대한 치료 효과를 확인하기 위하여, 도 11에서 보는 바와 같이, B16F10 흑색종 세포(melanoma cell)를 마우스 등에 3X105 세포의 양으로 피하 주사(subcutaneous injection)한 뒤, 4일, 8일, 12일 째에 상기 제조예 5 내지 8의 항체를 200 ug의 양으로 복강 내 주사하였다. 상기 멜라노마 세포 이식 후 시간의 경과에 따른 종양의 부피 변화를 측정하여 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체(GTC110-01, GTC110-02, GTC110-03 및 GTC110-04)를 처리한 경우 항체를 처리하지 않은 음성 대조군에 비하여 종양의 크기가 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다.
이를 통하여, 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체는 다양한 고형암 세포의 성장을 억제하여, 이를 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 것을 알 수 있다.
[실시예 8] 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질의 에피토프 확인
Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인에서 상기 제조예 8의 GTC110-04 항체가 결합할 수 있는 부위인 구조 에피토프를 발굴하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.
[8-1] 공유결합 레이블링 MS(Covalent Labeling MS; CL-MS)
[8-1-1] 키모트립신을 통한 에피토프 확인
상기 제조예 8의 GTTC110-04 항체와 서열번호 4로 표시되는 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인(항원)을 2:1의 비율로 혼합하여 충분히 반응시킨 항원-항체 결합체와, 항체가 결합되지 않은 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인(항원)을 각각 준비하였다. 그런 다음, 상기 각각의 샘플에 1%가 넘지 않도록 DEPC(Diethyl pyrocarbonate)를 첨가한 뒤, 37℃에서 1분 동안 충분히 반응시키고, 이미다졸을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 반응이 종결된 상기 각각의 샘플에 메탄올을 첨가하고, 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 이후, 8 M의 우레아 및 0.1 M의 NaCl이 포함된 용액을 추가하여, 재현탁 시킨 뒤에 키모트립신을 넣고 펩타이드 결합이 끊어질 수 있도록 하였다.
이렇게 펩타이드 결합이 끊어진 상기 각각의 샘플을 이용하여 하이퍼실(Hypersil) GOLDTM(1.9 ㎛, 1 × 100 ㎜) 컬럼을 이용하여, 30 ℃의 조건에서 하기 표 4에 기재된 바와 같이 유체 크로마토그래피(VanquishTM Flex Quaternary UHPLC (Thermo SCIENTIFIC))를 수행하였다.
단계 전체 시간(min) 유속 (㎕/min) 이동상 A* (%) 이동상 B** (%)
0 0.00 100.00 95.0 5.0
1 5.00 100.00 95.0 5.0
2 7.00 100.00 90.0 10.0
3 48.00 100.00 70.0 30.0
4 55.00 100.00 5.0 95.0
5 65.00 100.00 5.0 95.0
6 66.00 100.00 95.00 5.0
7 71.00 100.00 95.00 5.0
*이동상 A(증류수/0.2% 포름산)
** 이동상 B(아세토니트릴/0.2% 포름산)
이후, 도 13 내지 도 15에 기재된 조건에 따라 질량 분석(Q ExactiveTM Plus Mass Spectrometer (Thermo SCIENTIFIC))을 수행하고, 측정된 항원-항체 결합체와 항원의 질량 분석 값을 비교하여 그 결과를 도 16와, 표 5에 나타내었다. 나아가, 측정된 질량 분석 값을 항원-항체 결합체/항원으로 계산하여 도 17에 나타내었다.
아미노산 번호 항원 항원-항체 결합체 차이 비율 p value
mean S.D mean S.D
26-64 59.56 4.11 51.51 5.56 8.05 1.16 **
36-64 51.37 7.00 40.77 4.25 10.60 1.26 **
44-64 30.46 1.29 31.87 0.66 -1.41 0.96 *
65-87 47.90 0.74 43.09 4.36 4.81 1.11 *
105-134 48.26 2.60 35.54 8.20 12.72 1.36 **
207-216 77.52 1.61 75.76 0.72 1.77 1.02 *
209-216 73.44 1.19 69.09 0.63 4.34 1.06 ***
252-254 53.84 5.08 43.75 5.22 10.09 1.23 **
303-317 64.17 1.22 59.52 4.26 4.65 1.08 *
303-320 53.78 0.94 48.69 0.82 5.10 1.10 ***
308-317 44.52 2.44 38.84 1.67 5.68 1.15 ***
321-344 62.11 4.53 81.23 1.84 -19.12 0.76 ***
324-344 35.87 2.41 32.23 4.19 3.64 1.11 *
329-347 40.96 2.95 24.52 10.14 16.44 1.67 **
354-368 94.66 0.98 92.95 1.02 1.71 1.02 **
357-368 87.35 0.80 86.48 0.59 0.88 1.01 *
390-395 51.34 2.27 46.62 1.05 4.72 1.10 ***
396-401 76.00 1.59 73.84 0.93 2.15 1.03 **
427-440 69.31 4.49 61.15 4.78 8.16 1.13 **
430-446 58.32 1.57 53.15 4.67 5.17 1.10 *
447-471 27.21 1.42 28.88 1.33 -1.67 0.94 *
472-480 42.21 2.48 47.49 0.82 -5.28 0.89 ***
474-480 42.02 3.00 45.34 0.87 -3.32 0.93 *
529-535 22.96 2.26 7.52 2.03 15.44 3.05 ***
568-579 51.68 2.04 46.19 4.75 5.49 1.12 **
585-598 44.89 4.28 38.20 7.01 6.69 1.18 *
599-624 22.09 2.48 16.84 4.15 5.25 1.31 **
599-615 12.33 1.08 9.13 1.40 3.20 1.35 ***
599-614 13.25 1.26 10.06 2.00 3.19 1.32 **
599-610 8.54 1.11 7.16 0.49 1.38 1.19 **
599-612 12.89 0.77 9.49 1.18 3.39 1.36 ***
599-613 11.49 1.32 9.85 0.94 1.65 1.17 **
624-636 3.40 0.20 2.58 0.21 0.82 1.32 ***
637-692 53.44 2.57 49.35 2.29 4.09 1.08 **
679-692 15.77 0.70 13.62 0.74 2.15 1.16 ***
694-699 59.44 1.75 56.79 2.66 2.65 1.05 *
700-705 67.98 5.79 60.47 5.42 7.51 1.12 *
700-713 21.98 1.53 18.80 2.73 3.18 1.17 *
700-735 9.04 1.23 5.87 1.02 3.17 1.54 ***
702-714 24.37 2.05 20.49 3.86 3.88 1.19 *
705-714 28.28 1.17 25.69 2.46 2.59 1.10 *
715-727 0.66 0.26 0.35 0.11 0.31 1.88 **
728-735 10.05 1.56 5.58 0.81 4.47 1.80 ***
도 16 및 17과 표 5에서 보는 바와 같이, 서열번호 4로 표시되는 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인에서, 36-64번째; 105-134번째; 252-254번째; 329-347번째; 529-535번째; 599-612번째; 599-614번째; 599-615번째; 599-624번째; 624-636번째; 700-735번째; 715-727번째; 및 728-735번째 아미노산으로 이루어진 폴리펩티트는 항원과 비교하여 항원-항체 결합체 간의 비율이 1.2 이상 나타나므로, Lrig-1 단백질의 에피토프로 선정될 가능성이 있는 것으로 확인되었다. 나아가, 서열번호 7 내지 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드는 그 실제 차이 값이 더욱 유의미하게 나타나 에피토프로 선정될 가능성이 더욱 높은 것으로 확인되었다.
[8-1-2] 트립신을 통한 에피토프 확인
상기 [8-1-1]에 기재된 방법과 동일하게 에피토프 확인을 위한 실험을 수행하면서, 다만 효소를 키모트립신을 대신하여 트립신을 사용하여, 그 결과를 도 18 및 19와, 하기 표 6에 나타내었다.
아미노산 번호 항원 항원-항체 결합체 차이 비율 p value
mean S.D mean S.D
24-37 1.67 0.34 1.11 0.19 0.56 1.51 **
38-45 5.70 0.33 4.15 0.15 1.55 1.37 ***
46-92 76.64 1.30 73.22 3.67 3.42 1.05 *
46-94 91.22 3.99 74.75 2.92 16.47 1.22 ***
103-132 40.74 1.01 34.52 2.64 6.23 1.18 ***
122-132 39.75 0.85 35.32 2.70 4.43 1.13 **
141-154 1.99 0.42 1.38 0.35 0.61 1.44 **
161-178 48.76 0.58 48.00 0.75 0.75 1.02 *
173-178 68.68 0.96 69.78 0.72 -1.10 0.98 *
179-186 0.45 0.09 0.31 0.08 0.14 1.46 **
179-188 3.91 0.71 4.87 0.97 -0.96 0.80 *
216-226 8.82 1.60 6.80 0.93 2.03 1.30 **
264-266 75.97 3.22 71.79 3.45 4.18 1.06 *
268-274 36.31 0.82 34.17 1.44 2.14 1.06 **
304-318 76.26 2.16 71.49 4.45 4.77 1.07 *
304-321 94.20 0.90 91.94 1.35 2.26 1.02 **
367-385 37.10 0.76 34.89 2.04 2.22 1.06 *
499-531 72.06 5.48 76.85 2.75 -4.79 0.94 *
532-540 7.00 0.24 4.85 0.56 2.16 1.44 ***
559-569 5.17 1.00 3.93 0.77 1.24 1.31 *
570-577 28.67 0.69 26.69 2.20 1.98 1.07 *
578-600 20.13 0.54 17.24 2.84 2.89 1.17 *
584-600 51.23 0.73 46.30 3.49 4.93 1.11 **
584-610 87.90 2.41 83.13 4.53 4.77 1.06 *
614-629 16.83 0.83 13.41 1.55 3.42 1.25 ***
669-689 99.84 0.01 99.88 0.01 -0.03 1.00 ***
682-704 18.83 1.57 16.22 0.47 2.61 1.16 **
690-694 0.47 0.11 0.37 0.09 0.11 1.29 *
694-704 59.11 2.39 63.48 1.79 -4.37 0.93 **
705-726 26.02 1.55 23.05 2.64 2.97 1.13 *
705-739 35.21 1.46 31.44 3.05 3.77 1.12 **
727-739 12.04 1.75 9.20 1.58 2.85 1.31 **
740-754 16.35 0.37 12.98 2.51 3.37 1.26 **
740-753 44.06 1.69 38.00 3.84 6.07 1.16 **
755-769 97.94 0.77 97.13 0.58 0.81 1.01 *
도 18 및 19와, 표 6에서 보는 바와 같이, 서열번호 4로 표시되는 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인에서, 24-37번째; 38-45번째; 46-94번째; 141-154번째; 179-186번째; 216-226번째; 532-540번째; 559-569번째; 614-629번째; 690-694번째; 727-739번째; 및 740-754번째 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드는 항원과 비교하여 항원-항체 결합체 간의 비율이 1.2 이상 나타나므로, Lrig-1 단백질의 에피토프로 선정될 가능성이 있는 것으로 확인되었다. 나아가, 서열번호 14 내지 22로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드는 그 실제 차이 값이 더욱 유의미하게 나타나 에피토프로 선정될 가능성이 더욱 높은 것으로 확인되었다.
[8-1-3] Asp- N + Lys- C 를 통한 에피토프 확인
상기 [8-1-1]에 기재된 방법과 동일하게 에피토프 확인을 위한 실험을 수행하면서, 다만 효소를 키모트립신을 대신하여 Asp-N + Lys-C를 사용하여, 그 결과를 도 20 및 21과, 하기 표 7에 나타내었다.
아미노산 번호 항원 항원-항체 결합체 차이 비율 p value
mean S.D mean S.D
1-15 14.43 2.40 10.99 3.78 3.44 1.31 *
16-18 0.84 0.11 0.46 0.05 0.37 1.81 **
31-45 5.01 0.20 3.83 0.08 1.18 1.31 ***
31-49 99.66 0.12 95.79 1.18 3.87 1.04 ***
31-55 98.23 0.17 74.26 5.16 23.98 1.32 ***
46-49 0.45 0.03 0.41 0.01 0.04 1.10 **
93-102 5.74 0.41 5.35 0.12 0.38 1.07 *
111-132 33.35 0.92 28.93 0.61 4.42 1.15 ***
164-182 55.69 2.33 62.83 2.27 -7.14 0.89 ***
289-318 81.31 3.28 40.46 2.89 40.86 2.01 ***
319-326 1.66 0.08 1.86 0.03 -0.20 0.89 ***
327-338 57.92 2.43 65.19 1.55 -7.27 0.89 ***
329-338 25.18 1.80 22.95 1.06 2.22 1.10 **
348-352 22.88 2.16 26.19 1.63 -3.32 0.87 **
353-361 25.13 1.63 33.14 1.62 -8.00 0.76 ***
360-361 82.60 2.14 66.35 6.14 16.24 1.24 ***
366-389 27.95 1.36 24.58 0.83 3.36 1.14 ***
395-396 61.42 4.84 55.89 4.32 5.52 1.10 *
397-399 76.77 0.99 73.96 0.83 2.82 1.04 ***
397-405 77.87 1.09 81.73 2.21 -3.87 0.95 **
400-405 22.98 1.52 20.48 0.55 2.50 1.12 **
456-476 23.65 0.77 30.16 0.50 -6.51 0.78 ***
477-498 100.00 0.00 98.88 0.04 1.12 1.01 ***
498-506 11.99 0.91 7.16 0.46 4.82 1.67 ***
507-517 48.71 2.15 37.83 1.31 10.87 1.29 ***
557-572 63.44 0.59 66.15 0.74 -2.71 0.96 ***
573-600 15.68 0.87 11.78 0.98 3.90 1.33 ***
585-600 44.58 0.66 33.48 0.52 11.10 1.33 ***
601-620 10.27 2.06 6.88 0.83 3.39 1.49 **
601-626 7.82 0.71 5.97 0.52 1.85 1.31 ***
605-620 12.99 2.31 8.95 0.88 4.03 1.45 **
611-620 19.72 2.71 14.61 1.30 5.11 1.35 ***
611-618 19.38 2.98 15.17 1.53 4.22 1.28 **
627-631 91.56 5.88 80.51 6.05 11.05 1.14 **
627-630 7.59 0.53 6.42 0.20 1.17 1.18 ***
632-666 0.34 0.15 1.88 0.32 -1.54 0.18 ***
667-681 4.25 0.29 3.04 0.11 1.21 1.40 ***
682-695 8.62 0.34 8.28 0.15 0.34 1.04 *
682-694 0.01 0.01 1.52 0.33 -1.51 0.01 ***
695-722 7.06 1.46 4.61 0.28 2.45 1.53 **
696-722 24.25 1.22 19.92 0.59 4.33 1.22 ***
696-709 28.84 2.10 23.96 0.97 4.88 1.20 ***
723-754 56.36 0.47 50.13 0.43 6.23 1.12 ***
755-769 61.79 1.18 54.57 1.37 7.22 1.13 ***
도 20 및 21과, 표 7에서 보는 바와 같이, 서열번호 4로 표시되는 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인에서, 1-15번째; 16-18번째; 31-45번째; 31-55번째; 289-318번째; 360-361번째; 498-506번째; 507-517번째; 573-600번째; 585-600번째; 601-620번째; 601-626번째; 605-620번째; 611-618번째; 611-620번째; 667-681번째; 695-722번째; 696-709번째; 및 696-722번째 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드는 항원과 비교하여 항원-항체 결합체 간의 비율이 1.2 이상 나타나므로, Lrig-1 단백질의 에피토프로 선정될 가능성이 있는 것으로 확인되었다. 나아가, 서열번호 23 내지 28로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드는 그 실제 차이 값이 더욱 유의미하게 나타나 에피토프로 선정될 가능성이 더욱 높은 것으로 확인되었다.
상기 [8-1-1] 내지 [8-1-3]에서 확인된 에피토프의 결과를 오버랩시키는 방식의 추가 분석을 수행한 결과, 상기 결과에서 열거된 폴리펩티드가 에피토프의 가능성이 있으며, 특히 서열번호 29 내지 32으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드가 더욱 Lrig-1 단백질의 GTC110-04 항체에 대한 에피토프일 가능성이 있음을 알 수 있다.
[8-2] 크로스-결합 MS(Cross-linking MS; XL)
[8-2-1] 키모트립신을 통한 에피토프 확인
상기 제조예 8의 GTC110-04 항체와 서열번호 4로 표시되는 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인(항원)을 2:1의 비율로 혼합하여 충분히 반응시킨 항원-항체 결합체 샘플을 2개 준비하였다. 이후, DMSO(dimethyl sulfoxide)에 충분히 녹인 DSG(disuccinimidyl glutarate, 20593, Thermo)를 상기 하나의 샘플에 1:50(샘플:DSG)의 비율로 첨가하고(T%), 다른 하나의 샘플에는 DMSO만을 첨가(C%)한 뒤에 25℃에서 1시간 동안 충분히 반응시켰다. 그런 다음, 상기 [8-1-1]과 동일한 방법으로 키모트립신을 처리하고 LC-MS 분석을 수행하여, 질량 분석 값을 도출하였다.
이후, DSG가 첨가된 샘플(T%)와 DMSO만이 첨가된 샘플(C%) 간의 질량 분석 값 간의 차이를 확인하고, 차이가 나는 에피토프 중에서 에피토프가 아닌 결합 보조 사이트(모도 타입 및 루프 타입)을 제외하고, 최종적으로 그 값이 10% 이하인 부위를 도출하는 분석을 수행하여, 그 결과를 도 22와, 하기 표 8에 나타내었다.
아미노산 번호 C % T % 링커 사이트 C % T % + M/L
26-46 88.9 11.1 T36 50.8 49.2
66-86 79.6 20.4 　 　 　
89-110 92.0 8.0 K102 69.2 30.8
126-136 90.1 9.9 　 　 　
137-144 70.5 29.5 　 　 　
158-174 96.8 3.2 K163 65.1 34.9
175-179 97.1 2.9 K175 52.5 47.5
198-208 40.2 59.8 　 　 　
207-224 96.4 3.6 K207 82.3 17.7
222-237 72.2 27.8 　 　 　
238-246 62.0 38.0 　 　 　
252-269 65.4 34.6 K267 47.2 52.8
270-280 92.2 7.8 K274 87.3 12.7
279-282 83.6 16.4 　 　 　
283-293 94.0 6.0 T286 50.2 49.8
305-344 98.0 2.0 K318 55.2 44.8
348-356 94.7 5.3 K352 64.5 35.5
357-368 96.7 3.3 K359, 365 88.7 11.3
390-401 94.7 5.3 K394 85.7 14.3
417-420 80.3 19.7 　 　 　
422-429 81.7 18.3 　 　 　
441-453 86.7 13.3 K441 74.7 25.3
472-494 99.1 0.9 K476 97.1 2.9
495-511 98.5 1.5 K497 98.2 1.8
525-530 92.9 7.1 T525 92.7 7.3
531-541 91.7 8.3 Y541 78.9 21.1
554-559 97.7 2.3 K556 83.1 16.9
560-567 94.7 5.3 T560 92.7 7.3
568-579 97.1 2.9 T568, K569 94.9 5.1
585-598 80.2 19.8 　 　 　
624-636 80.8 19.2 T626 80.7 19.3
680-693 93.3 6.7 　 93.3 6.7
694-701 43.5 56.5 　 　 　
715-727 82.6 17.4 　 　 　
736-744 75.8 24.2 　 　 　
745-762 97.5 2.5 K754 91.8 8.2
도 22와, 표 8에서 보는 바와 같이, 서열번호 4로 표시되는 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인에서, 472-494번째(서열번호 32); 서열번호 495-511번째(서열번호 33); 525-530번째(서열번호 34); 560-567번째(서열번호 35); 568-579번째(서열번호 36); 680-693번째(서열번호 37); 및 745-762번째(서열번호 38) 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드는 크로스 결합 비율이 5% 또는 10% 이하에 해당하는 매우 낮은 수준으로 확인되는 바, Lrig-1 단백질의 에피토프로 선정될 가능성이 있는 것으로 확인되었다.
[8-2-2] 트립신을 통한 에피토프 확인
상기 [8-2-1]에 기재된 방법과 동일하게 에피토프 확인을 위한 실험을 수행하면서, 다만 효소를 키모트립신을 대신하여 트립신를 사용하여, 그 결과를 도 23과, 하기 표 9에 나타내었다.
아미노산 번호 C % T % 링커 사이트 C % T % + M/L
1-4 94.6 5.4 　 94.6 5.4
46-92 91.4 8.6 　 91.4 8.6
93-102 86.8 13.2 　 　 　
164-172 98.6 1.4 　 98.6 1.4
173-178 91.9 8.1 K175 73.8 26.2
179-186 58.1 41.9 　 　 　
191-207 91.0 9.0 K207 77.0 23.0
216-226 95.0 5.0 K215 88.6 11.4
264-274 94.6 5.4 　 94.6 5.4
267-274 98.7 1.3 K267 92.9 7.1
268-274 98.9 1.1 　 98.9 1.1
275-287 94.8 5.2 　 94.8 5.2
275-303 91.6 8.4 　 91.6 8.4
325-359 92.1 7.9 K352 89.9 10.1
360-366 96.7 3.3 K361, 365 58.0 42.0
366-385 87.8 12.2 　 　 　
386-394 91.3 8.7 　 91.3 8.7
395-424 94.2 5.8 K396, 415 93.6 6.4
425-441 93.3 6.7 　 93.3 6.7
442-479 99.0 1.0 　 99.0 1.0
480-498 98.4 1.6 　 98.4 1.6
498-531 90.9 9.1 　 90.9 9.1
532-540 91.4 8.6 　 91.4 8.6
541-556 97.5 2.5 K556 96.3 3.7
557-577 90.8 9.2 K569 87.9 12.1
615-629 95.3 4.7 　 95.3 4.7
669-681 85.8 14.2 　 　 　
754-765 93.6 6.4 K754 53.0 47.0
도 23과, 표 9에서 보는 바와 같이, 서열번호 4로 표시되는 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인에서, 1-4번째(서열번호 80); 46-92번째(서열번호 40); 164-172번째(서열번호 41); 264-274번째(서열번호 42); 267-274번째(서열번호 43); 268-274번째(서열번호 44); 275-287번째(서열번호 45); 275-303번째(서열번호 46); 386-394번째(서열번호 47); 395-424번째(서열번호 48); 425-441번째(서열번호 49); 442-479번째(서열번호 50); 480-498번째(서열번호 51); 498-531번째(서열번호 52); 532-540번째(서열번호 53); 541-556번째(서열번호 54); 및 615-629번째(서열번호 55) 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드는 크로스 결합 비율이 5% 또는 10% 이하에 해당하는 매우 낮은 수준으로 확인되는 바, Lrig-1 단백질의 에피토프로 선정될 가능성이 있는 것으로 확인되었다.
[8-2-3] Asp- N + Lys- C 를 통한 에피토프 확인
상기 [8-2-1]에 기재된 방법과 동일하게 에피토프 확인을 위한 실험을 수행하면서, 다만 효소를 키모트립신을 대신하여 Asp-N + Lys-C를 사용하여, 그 결과를 도 24와, 하기 표 10에 나타내었다.
아미노산 번호 C % T % 링커 사이트 C % T % + M/L
46-102 93.7 6.3 　 93.7 6.3
93-102 91.6 8.4 　 91.6 8.4
150-163 94.5 5.5 　 94.5 5.5
164-182 98.0 2.0 　 98.0 2.0
183-207 73.7 26.3 　 　 　
208-215 94.3 5.7 K215 85.1 14.9
216-226 91.4 8.6 　 91.4 8.6
227-267 91.8 8.2 　 91.8 8.2
268-274 97.0 3.0 　 97.0 3.0
275-318 85.6 14.4 　 　 　
319-361 96.0 4.0 K352, 361 91.6 8.4
366-399 90.1 9.9 K394, 396 89.9 10.1
411-415 91.1 8.9 　 91.1 8.9
442-455 72.2 27.8 　 　 　
456-476 93.3 6.7 　 93.3 6.7
477-498 93.4 6.6 　 93.4 6.6
498-506 95.5 4.5 　 95.5 4.5
538-556 96.4 3.6 　 96.4 3.6
557-572 99.3 0.7 T560 98.5 1.5
557-600 93.6 6.4 　 93.6 6.4
601-626 89.7 10.3 　 　 　
627-630 66.0 34.0 K629 64.7 35.3
682-695 97.1 2.9 K694 79.4 20.6
723-754 91.4 8.6 K754 84.1 15.9
도 24와, 표 10에서 보는 바와 같이, 서열번호 4로 표시되는 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인에서, 46-102번째(서열번호 56); 93-102번째(서열번호 57); 150-163번째(서열번호 58); 164-182번째(서열번호 59); 216-226번째(서열번호 60); 227-267번째(서열번호 61); 268-274번째(서열번호 62); 319-361번째(서열번호 63); 411-415번째(서열번호 64); 456-476번째(서열번호 65); 477-498번째(서열번호 66); 498-506번째(서열번호 67); 538-556번째(서열번호 68); 557-572번째(서열번호 69); 및 557-600번째(서열번호 70) 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드는 크로스 결합 비율이 5% 또는 10% 이하에 해당하는 매우 낮은 수준으로 확인되는 바, Lrig-1 단백질의 에피토프로 선정될 가능성이 있는 것으로 확인되었다.
상기 [8-2-1] 내지 [8-2-3]에서 확인된 에피토프의 결과를 오버랩하는 통해 추가 분석을 수행한 결과, 상기 결과에서 열거된 폴리펩티드가 에피토프의 가능성이 있으며, 특히 서열번호 32 내지 36, 서열번호 40 내지 42, 64 및 68 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드가 더욱 Lrig-1 단백질의 GTC110-04 항체에 대한 에피토프일 가능성이 있음을 알 수 있다.
[8-3] 에피토프 예측
상기 [8-1] 및 [8-2]에서 도출된 에피토프의 결과를 오버랩하는 과정을 통해 얻어진 특정 에피토프의 서열에 기초하여, 상기 [8-1]과 동일한 방법으로 에피트포 확인을 위한 실험을 수행하여, 그 결과를 하기 표 11 및 12에 나타내었다.
효소 아미노산 번호 항원 항원-항체 결합체 차이 비율
Asp-N Lys-C 31-45 5.01 3.83 1.18 1.31
Asp-N Lys-C 31-55 98.23 74.26 23.98 1.32
키모트립신 36-64 51.37 40.77 10.60 1.26
트립신 38-45 5.70 4.15 1.55 1.37
트립신 46-94 91.22 74.75 16.47 1.22
효소 아미노산 번호 항원 항원-항체 결합체 차이 비율
트립신 24-37 1.67 1.11 0.56 1.51
키모트립신 26-64 59.56 51.51 8.05 1.16
Asp-N Lys-C 31-49 99.66 95.79 3.87 1.04
키모트립신 38-64 53.47 46.30 7.16 1.15
Asp-N Lys-C 62-92 65.30 65.51 -0.22 1.00
키모트립신 65-87 47.90 43.09 4.81 1.11
키모트립신 88-94 89.93 89.48 0.44 1.00
상기 표 11 및 12에서 보는 바와 같이, 서열번호 4로 표시되는 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인에서, 46-87번째; 또는 46-64번째 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드가 다양한 효소를 이용하여 측정한 결과에서 높은 비율로 차이나는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해 GTC110-04 항체는 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인 중에서, 46-87번째; 또는 46-64번째 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 알 수 있다(도 25의 빨간 동그라미 표시 부분).
이상에서 본 발명에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
<110> Good T Cells, Inc. <120> Epitope of regulatory T cell surface antigen and an antibody specifically binding to the epitope thereof <130> PDPB194105SEk01 <150> KR 10-2019-0142251 <151> 2019-11-08 <160> 164 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1093 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Arg Pro Val Arg Gly Gly Leu Gly Ala Pro Arg Arg Ser Pro 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Leu Trp Leu Val Leu Val Arg Leu Glu Pro Val Thr 20 25 30 Ala Ala Ala Gly Pro Arg Ala Pro Cys Ala Ala Ala Cys Thr Cys Ala 35 40 45 Gly Asp Ser Leu Asp Cys Gly Gly Arg Gly Leu Ala Ala Leu Pro Gly 50 55 60 Asp Leu Pro Ser Trp Thr Arg Ser Leu Asn Leu Ser Tyr Asn Lys Leu 65 70 75 80 Ser Glu Ile Asp Pro Ala Gly Phe Glu Asp Leu Pro Asn Leu Gln Glu 85 90 95 Val Asn Leu Ser Tyr Asn Lys Leu Ser Glu Ile Asp Pro Ala Gly Phe 100 105 110 Glu Asp Leu Pro Asn Leu Gln Glu Val Tyr Leu Asn Asn Asn Glu Leu 115 120 125 Thr Ala Val Pro Ser Leu Gly Ala Ala Ser Ser His Val Val Ser Leu 130 135 140 Phe Leu Gln His Asn Lys Ile Arg Ser Val Glu Gly Ser Gln Leu Lys 145 150 155 160 Ala Tyr Leu Ser Leu Glu Val Leu Asp Leu Ser Leu Asn Asn Ile Thr 165 170 175 Glu Val Arg Asn Thr Cys Phe Pro His Gly Pro Pro Ile Lys Glu Leu 180 185 190 Asn Leu Ala Gly Asn Arg Ile Gly Thr Leu Glu Leu Gly Ala Phe Asp 195 200 205 Gly Leu Ser Arg Ser Leu Leu Thr Leu Arg Leu Ser Lys Asn Arg Ile 210 215 220 Thr Gln Leu Pro Val Arg Ala Phe Lys Leu Pro Arg Leu Thr Gln Leu 225 230 235 240 Asp Leu Asn Arg Asn Arg Ile Arg Leu Ile Glu Gly Leu Thr Phe Gln 245 250 255 Gly Leu Asn Ser Leu Glu Val Leu Lys Leu Gln Arg Asn Asn Ile Ser 260 265 270 Lys Leu Thr Asp Gly Ala Phe Trp Gly Leu Ser Lys Met His Val Leu 275 280 285 His Leu Glu Tyr Asn Ser Leu Val Glu Val Asn Ser Gly Ser Leu Tyr 290 295 300 Gly Leu Thr Ala Leu His Gln Leu His Leu Ser Asn Asn Ser Ile Ala 305 310 315 320 Arg Ile His Arg Lys Gly Trp Ser Phe Cys Gln Lys Leu His Glu Leu 325 330 335 Val Leu Ser Phe Asn Asn Leu Thr Arg Leu Asp Glu Glu Ser Leu Ala 340 345 350 Glu Leu Ser Ser Leu Ser Val Leu Arg Leu Ser His Asn Ser Ile Ser 355 360 365 His Ile Ala Glu Gly Ala Phe Lys Gly Leu Arg Ser Leu Arg Val Leu 370 375 380 Asp Leu Asp His Asn Glu Ile Ser Gly Thr Ile Glu Asp Thr Ser Gly 385 390 395 400 Ala Phe Ser Gly Leu Asp Ser Leu Ser Lys Leu Asn Leu Gly Gly Asn 405 410 415 Ala Ile Arg Ser Val Gln Phe Asp Ala Phe Val Lys Met Lys Asn Leu 420 425 430 Lys Glu Leu His Ile Ser Ser Asp Ser Phe Leu Cys Asp Cys Gln Leu 435 440 445 Lys Trp Leu Pro Pro Trp Leu Ile Gly Arg Met Leu Gln Ala Phe Val 450 455 460 Thr Ala Thr Cys Ala His Pro Glu Ser Leu Lys Gly Gln Ser Ile Phe 465 470 475 480 Ser Val Pro Pro Glu Ser Phe Val Cys Asp Asp Phe Leu Lys Pro Gln 485 490 495 Ile Ile Thr Gln Pro Glu Thr Thr Met Ala Met Val Gly Lys Asp Ile 500 505 510 Arg Phe Thr Cys Ser Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser Pro Met Thr Phe 515 520 525 Ala Trp Lys Lys Asp Asn Glu Val Leu Thr Asn Ala Asp Met Glu Asn 530 535 540 Phe Val His Val His Ala Gln Asp Gly Glu Val Met Glu Tyr Thr Thr 545 550 555 560 Ile Leu His Leu Arg Gln Val Thr Phe Gly His Glu Gly Arg Tyr Gln 565 570 575 Cys Val Ile Thr Asn His Phe Gly Ser Thr Tyr Ser His Lys Ala Arg 580 585 590 Leu Thr Val Asn Val Leu Pro Ser Phe Thr Lys Thr Pro His Asp Ile 595 600 605 Thr Ile Arg Thr Thr Thr Val Ala Arg Leu Glu Cys Ala Ala Thr Gly 610 615 620 His Pro Asn Pro Gln Ile Ala Trp Gln Lys Asp Gly Gly Thr Asp Phe 625 630 635 640 Pro Ala Ala Arg Glu Arg Arg Met His Val Met Pro Asp Asp Asp Val 645 650 655 Phe Phe Ile Thr Asp Val Lys Ile Asp Asp Ala Gly Val Tyr Ser Cys 660 665 670 Thr Ala Gln Asn Ser Ala Gly Ser Ile Ser Ala Asn Ala Thr Leu Thr 675 680 685 Val Leu Glu Thr Pro Ser Leu Val Val Pro Leu Glu Asp Arg Val Val 690 695 700 Ser Val Gly Glu Thr Val Ala Leu Gln Cys Lys Ala Thr Gly Asn Pro 705 710 715 720 Pro Pro Arg Ile Thr Trp Phe Lys Gly Asp Arg Pro Leu Ser Leu Thr 725 730 735 Glu Arg His His Leu Thr Pro Asp Asn Gln Leu Leu Val Val Gln Asn 740 745 750 Val Val Ala Glu Asp Ala Gly Arg Tyr Thr Cys Glu Met Ser Asn Thr 755 760 765 Leu Gly Thr Glu Arg Ala His Ser Gln Leu Ser Val Leu Pro Ala Ala 770 775 780 Gly Cys Arg Lys Asp Gly Thr Thr Val Gly Ile Phe Thr Ile Ala Val 785 790 795 800 Val Ser Ser Ile Val Leu Thr Ser Leu Val Trp Val Cys Ile Ile Tyr 805 810 815 Gln Thr Arg Lys Lys Ser Glu Glu Tyr Ser Val Thr Asn Thr Asp Glu 820 825 830 Thr Val Val Pro Pro Asp Val Pro Ser Tyr Leu Ser Ser Gln Gly Thr 835 840 845 Leu Ser Asp Arg Gln Glu Thr Val Val Arg Thr Glu Gly Gly Pro Gln 850 855 860 Ala Asn Gly His Ile Glu Ser Asn Gly Val Cys Pro Arg Asp Ala Ser 865 870 875 880 His Phe Pro Glu Pro Asp Thr His Ser Val Ala Cys Arg Gln Pro Lys 885 890 895 Leu Cys Ala Gly Ser Ala Tyr His Lys Glu Pro Trp Lys Ala Met Glu 900 905 910 Lys Ala Glu Gly Thr Pro Gly Pro His Lys Met Glu His Gly Gly Arg 915 920 925 Val Val Cys Ser Asp Cys Asn Thr Glu Val Asp Cys Tyr Ser Arg Gly 930 935 940 Gln Ala Phe His Pro Gln Pro Val Ser Arg Asp Ser Ala Gln Pro Ser 945 950 955 960 Ala Pro Asn Gly Pro Glu Pro Gly Gly Ser Asp Gln Glu His Ser Pro 965 970 975 His His Gln Cys Ser Arg Thr Ala Ala Gly Ser Cys Pro Glu Cys Gln 980 985 990 Gly Ser Leu Tyr Pro Ser Asn His Asp Arg Met Leu Thr Ala Val Lys 995 1000 1005 Lys Lys Pro Met Ala Ser Leu Asp Gly Lys Gly Asp Ser Ser Trp Thr 1010 1015 1020 Leu Ala Arg Leu Tyr His Pro Asp Ser Thr Glu Leu Gln Pro Ala Ser 1025 1030 1035 1040 Ser Leu Thr Ser Gly Ser Pro Glu Arg Ala Glu Ala Gln Tyr Leu Leu 1045 1050 1055 Val Ser Asn Gly His Leu Pro Lys Ala Cys Asp Ala Ser Pro Glu Ser 1060 1065 1070 Thr Pro Leu Thr Gly Gln Leu Pro Gly Lys Gln Arg Val Pro Leu Leu 1075 1080 1085 Leu Ala Pro Lys Ser 1090 <210> 2 <211> 3282 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atggcgcggc cggtccgggg agggctcggg gccccgcgcc gctcgccttg ccttctcctt 60 ctctggctgc ttttgcttcg gctggagccg gtgaccgccg cggccggccc gcgggcgccc 120 tgcgcggccg cctgcacttg cgctggggac tcgctggact gcggtgggcg cgggctggct 180 gcgttgcccg gggacctgcc ctcctggacg cggagcctaa acctgagtta caacaaactc 240 tctgagattg accctgctgg ttttgaggac ttgccgaacc tacaggaagt gtacctcaat 300 aataatgagt tgacagcggt accatccctg ggcgctgctt catcacatgt cgtctctctc 360 tttctgcagc acaacaagat tcgcagcgtg gaggggagcc agctgaaggc ctacctttcc 420 ttagaagtgt tagatctgag tttgaacaac atcacggaag tgcggaacac ctgctttcca 480 cacggaccgc ctataaagga gctcaacctg gcaggcaatc ggattggcac cctggagttg 540 ggagcatttg atggtctgtc acggtcgctg ctaactcttc gcctgagcaa aaacaggatc 600 acccagcttc ctgtaagagc attcaagcta cccaggctga cacaactgga cctcaatcgg 660 aacaggattc ggctgataga gggcctcacc ttccaggggc tcaacagctt ggaggtgctg 720 aagcttcagc gaaacaacat cagcaaactg acagatgggg ccttctgggg actgtccaag 780 atgcatgtgc tgcacctgga gtacaacagc ctggtagaag tgaacagcgg ctcgctctac 840 ggcctcacgg ccctgcatca gctccacctc agcaacaatt ccatcgctcg cattcaccgc 900 aagggctgga gcttctgcca gaagctgcat gagttggtcc tgtccttcaa caacctgaca 960 cggctggacg aggagagcct ggccgagctg agcagcctga gtgtcctgcg tctcagccac 1020 aattccatca gccacattgc ggagggtgcc ttcaagggac tcaggagcct gcgagtcttg 1080 gatctggacc ataacgagat ttcgggcaca atagaggaca cgagcggcgc cttctcaggg 1140 ctcgacagcc tcagcaagct gactctgttt ggaaacaaga tcaagtctgt ggctaagaga 1200 gcattctcgg ggctggaagg cctggagcac ctgaaccttg gagggaatgc gatcagatct 1260 gtccagtttg atgcctttgt gaagatgaag aatcttaaag agctccatat cagcagcgac 1320 agcttcctgt gtgactgcca gctgaagtgg ctgcccccgt ggctaattgg caggatgctg 1380 caggcctttg tgacagccac ctgtgcccac ccagaatcac tgaagggtca gagcattttc 1440 tctgtgccac cagagagttt cgtgtgcgat gacttcctga agccacagat catcacccag 1500 ccagaaacca ccatggctat ggtgggcaag gacatccggt ttacatgctc agcagccagc 1560 agcagcagct cccccatgac ctttgcctgg aagaaagaca atgaagtcct gaccaatgca 1620 gacatggaga actttgtcca cgtccacgcg caggacgggg aagtgatgga gtacaccacc 1680 atcctgcacc tccgtcaggt cactttcggg cacgagggcc gctaccaatg tgtcatcacc 1740 aaccactttg gctccaccta ttcacataag gccaggctca ccgtgaatgt gttgccatca 1800 ttcaccaaaa cgccccacga cataaccatc cggaccacca ccatggcccg cctcgaatgt 1860 gctgccacag gtcacccaaa ccctcagatt gcctggcaga aggatggagg cacggatttc 1920 cccgctgccc gtgagcgacg catgcatgtc atgccggatg acgacgtgtt tttcatcact 1980 gatgtgaaaa tagatgacgc aggggtttac agctgtactg ctcagaactc agccggttct 2040 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Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 225 230 235 240 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 245 250 255 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 260 265 270 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 275 280 285 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 290 295 300 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 305 310 315 320 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 325 330 335 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 340 345 350 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 355 360 365 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 370 375 380 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 385 390 395 400 Tyr 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Claims (10)

  1. Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 에피토프로서,
    서열번호 7 내지 서열번호 70으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 에피토프.
  2. Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 에피토프로서,
    서열번호 71 또는 서열번호 72로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하는 에피토프.
  3. 서열번호 7 내지 서열번호 70으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  4. 서열번호 71 또는 서열번호 72로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  5. 제1항 또는 제2항의 에피토프를 코딩하는 핵산 분자.
  6. 제5항의 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터.
  7. 제6항의 발현 벡터가 형질 감염된 숙주 세포주.
  8. 제3항 또는 제4항의 항체 또는 항원 결합 단편을 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 암은 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 흑색종 또는 폐암인, 약학 조성물.
  10. 제3항 또는 제4항의 항체 또는 항원 결합 단편; 및 약물을 포함하는 항체-약물 결합체.
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