JP2017530332A - ホスファチジルイノシトールリン酸結合物質の細胞死滅検出用途 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の他の目的は、前記細胞死滅検出用組成物を含む、細胞死滅検出用キットを提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、抗がん剤のスクリーニング用組成物と候補物質を、癌細胞を含む試料に処理する第1段階;及び前記試料から標識物質を感知する第2段階を含む、抗がん剤のスクリーニング方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記食作用抑制用組成物を、細胞、組織、または臓器に処理する段階を含む、食作用抑制方法を提供することにある。
細胞死滅検出用組成物、キット、及び検出方法
前記目的を達成するための一つの様態として、本発明は、ホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質を含む、細胞死滅検出用組成物を提供する。
前記細胞死滅検出用組成物は、細胞死滅信号であるホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質を可視化する標識物質を含むため、リアルタイムで細胞死滅の有無及びその程度を容易に検出することができる。
他の態様として、本発明は、前記細胞死滅検出用組成物を含む、抗がん剤のスクリーニング用組成物を提供する。前記細胞死滅検出用組成物は、前記の通りである。
前記スクリーニング用組成物は、細胞死滅時に外在化されるホスファチジルイノシトールリン酸を検出する標識物質を含むため、リアルタイムで抗がん剤による細胞死滅の有無及びその程度を容易に検出することができる。したがって、標識物質によりホスファチジルイノシトールリン酸が感知された場合、前記候補物質を抗がん剤として決定することができる。
他の態様として、本発明は、前記細胞死滅検出用組成物を含む、細胞死滅阻害物質のスクリーニング用組成物を提供する。前記細胞死滅検出用組成物は、前記の通りである。
他の態様として、本発明は、ホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質を含む、食作用抑制用組成物を提供する。
以下、本発明を下記例により詳しく説明する。ただし、下記例は本発明を例示するためのものであり、下記例により、本発明の範囲が制限されるものではない。
1−1.細胞死滅誘導
具体的には、HeLa細胞、Jarkat T細胞、またはCHO(Chinese hamster ovary)K1細胞を、それぞれ10%のFBSと1%のペニシリン/ストレプトマイシン抗生剤を含むDMEM培地、RPMI培地、またはF12培地で培養した。その後、それぞれの細胞を6−ウェルプレートのカバーグラス上で1x105cells/mlの密度で24時間培養した後、細胞死滅誘導キット(ab102480; Abcam、Cambridge、MA、USA)を6時間、37℃で処理した。具体的には、カンプトテシン(camptothecin)4μM、シクロヘキシミド(cycloheximide)200μM、デキサメタゾン(dexamethasone)20μM、エトポシド(etoposide)100μMを処理した。
死滅が誘導された細胞の表面にホスファチジルイノシトールリン酸が露出されるかを確認するために、まず、前記実施例1−1で死滅を誘導した細胞を10%の中性に緩衝されたホルマリンで5分間固定した後、PBSで2回洗浄した。その後、前記細胞を無血清タンパク質ブロック溶液(DAKO)で処理し、モノクローナルマウスIgM抗−PtdIns(4,5)P2または抗−PtdIns(3,4,5)P3抗体(1:100、Echelon Biosciences、Salt Lake City、UT、USA)と共に30分間処理して、FITC−標識されたロバ抗−マウスIgM2次抗体で30分間処理した。
実施例2.ホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質の探索
2−1.PtdIns(3,4,5)P3の分離
ホスファチジルイノシトールリン酸を検出する物質を探索するために、まず、下記のように死滅が誘導された細胞からPtdIns(3,4,5)P3を分離した。
組換えCD14タンパク質は、下記方法で製造した:まず、下記プライマー(Genemed Synthesis、Inc.)を使用してCD14(1−365の残基)全長をコードするヒト野生型CD14 cDNAをPCRで増幅した。
5’−TTGGTGCCAACAGATGAGGTTCAC−3’−配列番号1
逆プライマー
5’−TTCTTTCCTACACAGCGGCACCC−3’−配列番号2
その後、QuikChange Site−Directed Mutagenesis Kit(Invitrogen)を用いてpcDNA6 V5 HisA(Invitrogen)のHindIIIandXbaI切断位置に複製し、C末端にV5とHis6タグを有するタンパク質を生産して、配列分析によりその配列を検証した。その後、メーカーのマニュアルに従ってリポフェクタミンプラス試薬(Lipofectamine Plus reagent)を用いて前記線状ベクター10ugをCHO K1細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの2日経過後、CHO K1細胞に2日ごとにブラストサイジン(blasticidin)5μg/mlで処理してブラストサイジン(blasticidin)−抵抗性のある安定した細胞株を得た。抗−CD14抗体で免疫ブローティングを行い、CHO K1−CD14細胞をブラストサイジン1μg/mlを含むF12培地に培養した。安定した各細胞株を3日間、20個の150cm3のプレートの中で培養して収集した。その後、収集された細胞を溶解バッファー(50mM Tris pH7.6、500mM NaCl、20mM imidazole、EDTA-free protease inhibitor cocktail(Roche、Germany))に懸濁し、超音波分解した。各組換えタンパク質をNi−NTAアガロースレジン(Qiagen)上で精製して、50mM Tris pH7.6、250mM NaCl、及び300mMのイミダゾールで溶かして分離した。その後、精製された組換えタンパク質を50mM Tris pH7.6、20mM NaClで透析し、ゲル濾過(Superdex-200 FPLC)クロマトグラフィーで追加精製して組換えCD14受容体タンパク質を得た。
2−3.CD14タンパク質とホスファチジルイノシトールリン酸の結合確認:タンパク質−脂質オーバーレイアッセイ及び免疫ブローティング
多様なホスファチジルイノシトールリン酸のイノシトールリン酸グループが大食細胞CD14受容体と直接結合するかを確認するために、前記実施例2−2で製造した全長の組換えヒトCD14タンパク質及び変異CD14タンパク質を利用してタンパク質−脂質オーバーレイアッセイを行った。PIPストリップまたはPIPアレイは、Echelon Biosciencesから購入した。
3−1.IC−InsP6の製造
PtdInsPsはIns(1,4,5)P3、Ins(1,3,4,5)P4のようなmyo−イノシトールリン酸及びジアシルグリセロールで構成されるため、InsP6はPtdInsPsを模倣して行動する。したがって、InsP6を利用して下記実験を行った。
動物実験は、動物管理使用委員会で承認を受け、あらゆる使用される動物は、嘉泉大学のイ・ギルヨ癌、糖尿病研員の動物実験のための倫理ガイドライン及び遺伝子操作実験のための安全ガイドラインにより行われた。
CD14受容体と結合するInsP6の残基を確認するために、下記のように分子モデリングを行った。
死滅細胞に漏出されたPtdIns(3,4,5)P3をCD14タンパク質が直接認識するかを確認するために、下記実験を行った。
(1)肝臓クッパー細胞(Kupffer cell)の食作用の評価
Jackson laboratory USAから購入したCD14が欠損した(CD14−/−)C57BL/6マウスにIC−InsP6を動脈注射し、そこから肝臓を分離した後、IC−InsP6に対する食作用を免疫組織化学法(Immunohistochemistry)及びプルシアンブルー染色により下記のようなことを確認した。
CD14媒介食作用においてPdtIns(3,4,5)P3の外在化が必要であることを確認するために、野生型またはCD14欠損マウスから分離されたものとして、LPSにより刺激された大食細胞により、PHrodoで標識された死滅Jurkat T細胞に対するイン・ビトロ食作用アッセイを行った。この時、抗−PdtIns(3,4,5)P3抗体処理の有無を異にした。
その後、PHrodo標識された前記Jurkat T細胞に、LPSで刺激されたThio−pMacsを2.5時間処理した。培養後、前記プレートをPBSで洗浄してPHrodoで標識したJurkat T細胞を除去し、10%中性に緩衝されたホルマリンで5分間固定した後、核を可視化するためにDAPIで対比染色した。食作用の程度は、前記実施例で記載したように、共焦点顕微鏡を使用して観察した。
Aktタンパク質のPHドメインは、細胞内PtdIns(3,4,5)P3に結合するバイオセンサーである(図11a、非特許文献7)。したがって、これを利用してPHドメインを含有するタンパク質が細胞死滅を検出することができるかどうかを確認する実験を行った。
5−1.組換えPHドメインの製造
図12aで示されたように、ヒトAkt PHドメイン(1−144番目アミノ酸)をpET28aにクローニングした。これを大腸菌で発現させた後、Ni−NTAカラム及びゲル浸透クロマトグラフィー(Gel permeation chromatography)を使用して分離し、組換えPHドメインを製造した。
同様な方法で、ヒトアネキシンV(Annexin V、1−319アミノ酸)をpET28aにクローニングし、大腸菌で発現させた後、分離して組換えアネキシンVを製造した。図12cのように製造されたタンパク質のサイズが37kDaで確認され、アネキシンVであることを確認した。
まず、CHO細胞に4μMのカンプトテシンを6時間処理して死滅を誘導した後、10%中性に緩衝されたホルマリンで5分間固定した後、PBSで2回洗浄した。その後、前記細胞を無血清タンパク質ブロック溶液(DAKO)で処理し、前記5−1で製造した組換えPHドメインと30分間培養した。その後、前記細胞をモノクローナルマウス抗−Akt1抗体のPHドメイン(05-591、1:100、Millipore)で30分間処理し、FITC−標識された2次抗体で30分間処理した。その後、PBSで細胞を洗浄し、10%中性に緩衝されたホルマリンで5分間固定した後、染色を行った。ヨウ化プロピジウムで対比染色し、死滅細胞を見分けることができるようにした。
その後、前記細胞を顕微鏡に載せた後、適切な励起及び放出フィルターセットを用いてZeiss LSM 710レーザー−スキャン共焦点顕微鏡(Carl Zeiss)で撮影した。画像は40x油浸対物レンズで撮影した。操作されていないオリジナル画像の蛍光強度の定量のためにZEN 2010ソフトウェア(Carl Zeiss)を使用した。
PKCβ1C2ドメイン−Mycタンパク質と多様なホスファチジルイノシトールリン酸のイノシトールリン酸グループが直接的に結合するかどうかを確認するために、前記実施例2−3と同様の方法でタンパク質−脂質オーバーレイアッセイ及び免疫ブローティングを行った。PIPストリップまたはPIPアレイは、Echelon Biosciencesから購入した。
ホスファチジルセリンと特異的に結合することが知られているアネキシンVに、前記実施例2−3と同様の方法でタンパク質−脂質オーバーレイアッセイ及び免疫ブローティングを行った。
しかし、図16の右側で示されたように、アネキシンVを5μM CaCl2と混合して実験した場合は、アネキシンVの濃度が100ρmolであっても多様な種類のホスファチジルイノシトールリン酸に結合することが示された。具体的には、PI(3,5)P2、PI(4,5)P2、PI(3,4,5)P3に最も強い結合を示し、PI(3,4)P2以外にも、PI(5)P、PI(3)P、PI(4)Pとも結合することが示された。しかし、ホスファチジルセリンとは結合してなかった。
1−1.細胞死滅誘導
具体的には、HeLa細胞、Jurkat T細胞、またはCHO(Chinese hamster ovary)K1細胞を、それぞれ10%のFBSと1%のペニシリン/ストレプトマイシン抗生剤を含むDMEM培地、RPMI培地、またはF12培地で培養した。その後、それぞれの細胞を6−ウェルプレートのカバーグラス上で1x105cells/mlの密度で24時間培養した後、細胞死滅誘導キット(ab102480; Abcam、Cambridge、MA、USA)を6時間、37℃で処理した。具体的には、カンプトテシン(camptothecin)4μM、シクロヘキシミド(cycloheximide)200μM、デキサメタゾン(dexamethasone)20μM、エトポシド(etoposide)100μMを処理した。
5’−TTGGTGCCAACAGATGAGGTTCAC−3’−配列番号1
逆プライマー
5’−TTCTTTCCTACACAGCGGCACCC−3’−配列番号2
その後、QuikChange Site−Directed Mutagenesis Kit(Invitrogen)を用いてpcDNA6 V5 HisA(Invitrogen)のHindIII及びXbaI切断位置に複製し、C末端にV5とHis6タグを有するタンパク質を生産して、配列分析によりその配列を検証した。その後、メーカーのマニュアルに従ってリポフェクタミンプラス試薬(Lipofectamine Plus reagent)を用いて前記線状ベクター10ugをCHO K1細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの2日経過後、CHO K1細胞に2日ごとにブラストサイジン(blasticidin)5μg/mlで処理してブラストサイジン(blasticidin)−抵抗性のある安定した細胞株を得た。抗−CD14抗体で免疫ブローティングを行い、CHO K1−CD14細胞をブラストサイジン1μg/mlを含むF12培地に培養した。安定した各細胞株を3日間、20個の150cm3のプレートの中で培養して収集した。その後、収集された細胞を溶解バッファー(50mM Tris pH7.6、500mM NaCl、20mM imidazole、EDTA-free protease inhibitor cocktail(Roche、Germany))に懸濁し、超音波分解した。各組換えタンパク質をNi−NTAアガロースレジン(Qiagen)上で精製して、50mM Tris pH7.6、250mM NaCl、及び300mMのイミダゾールで溶かして分離した。その後、精製された組換えタンパク質を50mM Tris pH7.6、20mM NaClで透析し、ゲル濾過(Superdex-200 FPLC)クロマトグラフィーで追加精製して組換えCD14受容体タンパク質を得た。
CD14媒介食作用においてPdtIns(3,4,5)P3の外在化が必要であることを確認するために、野生型またはCD14欠損マウスから分離されたものとして、LPSにより刺激された大食細胞により、PHrodoで標識された死滅Jurkat T細胞に対するイン・ビトロ食作用アッセイを行った。この時、抗−PdtIns(3,4,5)P3抗体処理の有無を異にした。
Claims (23)
- ホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質を含む、細胞死滅検出用組成物。
- 前記ホスファチジルイノシトールリン酸が、ホスファチジルイノシトール−3,4,5−三リン酸(PtdIns(3,4,5)P3)またはホスファチジルイノシトール−4,5−二リン酸(PtdIns(4,5)P2)である、請求項1に記載の組成物。
- 前記ホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質が、CD14タンパク質またはその変異体、PH(Pleckstrin Homology)ドメイン含有タンパク質、PKC(Protein kinase C)のC2ドメイン含有タンパク質、またはその混合物を含むものである、請求項1に記載の組成物。
- 前記PHドメイン含有タンパク質が、Akt(タンパク質キナーゼB)、Btk(Bruton’s tyrosine kinase)、PDK1(pyruvate dehydrogenase kinase 1)、及びGRP1(general receptor of phosphoinositides 1)からなる群から選択されるものである、請求項3に記載の組成物。
- 前記C2ドメイン含有タンパク質が、Mycが結合されたPKCβ1C2ドメインタンパク質である、請求項3に記載の組成物。
- 前記ホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質が、抗−PtdIns(3,4,5)P3抗体または抗−PtdIns(4,5)P2抗体である、請求項1に記載の組成物。
- 前記組成物が、カルシウム;及びホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質としてアネキシンV(Annexin V)を含むものである、請求項1に記載の組成物。
- 前記細胞死滅検出がイン・ビトロで行われる、請求項1に記載の組成物。
- 前記ホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質が、標識物質で標識されたものであり、前記標識物質が、蛍光物質、発色酵素、放射性同位元素、クロモフォア、常磁性粒子、及び超常磁性粒子からなる群から選択されるいずれか一つである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の組成物。
- 請求項9に記載の組成物を含む、細胞死滅検出用キット。
- 請求項9に記載の組成物を、細胞を含む試料に処理する第1段階;
前記試料から標識物質を感知する第2段階を含む、細胞死滅検出方法。 - 請求項9に記載の組成物を含む、抗がん剤のスクリーニング用組成物。
- 請求項12に記載の組成物と候補物質を、癌細胞を含む試料に処理する第1段階;及び
前記試料から標識物質を感知する第2段階を含む、抗がん剤のスクリーニング方法。 - 前記方法において、第2段階で標識物質が感知された場合には、前記候補物質を抗がん剤で決定する第3段階をさらに含むものである、請求項13に記載の抗がん剤のスクリーニング方法。
- 請求項9に記載の組成物と候補物質を、細胞を含む試料に処理する第1段階;
前記第1段階の細胞の死滅を誘導する第2段階;及び
前記試料から標識物質を定量する第3段階を含む、細胞死滅阻害物質のスクリーニング方法。 - 前記第2段階は、細胞に死滅誘導剤を処理して細胞死滅を誘導するものである、請求項15に記載の方法。
- ホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質を含む、食作用抑制用組成物。
- 前記ホスファチジルイノシトールリン酸が、ホスファチジルイノシトール−3,4,5−三リン酸(PtdIns(3,4,5)P3)またはホスファチジルイノシトール−4,5−二リン酸(PtdIns(4,5)P2)である、請求項17に記載の組成物。
- 前記ホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質が、CD14タンパク質またはその変異体、PH(Pleckstrin Homology)ドメイン含有タンパク質、PKC(Protein kinase C)のC2ドメイン含有タンパク質、抗−PtdIns(3,4,5)P3抗体、抗−PtdIns(4,5)P2抗体、またはその混合物を含むものである、請求項17に記載の組成物。
- 前記組成物が、カルシウム;及びホスファチジルイノシトールリン酸と結合する物質としてアネキシンV(Annexin V)を含むものである、請求項17に記載の組成物。
- 前記食作用抑制用組成物が、移植用細胞、組織、または臓器に処理されるものである、請求項17に記載の組成物。
- 前記移植用細胞が、膵島(pancreatic islet)細胞である、請求項21に記載の組成物。
- 請求項17〜22のいずれか1項に記載の食作用抑制用組成物を、細胞、組織、または臓器に処理する段階を含む、食作用の抑制方法。
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