KR20170050240A - 생리적인 조절을 유도하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포내에서 특정 탐색물질이 디스플레이된 자성물질에 자기장을 인가하여 특이한 생리적인 조절을 유도하는 방법이다. 이러한 특이한 생리적인 조절 유도를 저해 또는 촉진하는 물질을 검출하는 방법 등으로의 활용에 관한 방법이다.
Description
본 발명은 세포내에서 특정 탐색물질이 디스플레이된 자성물질에 자기장을 인가하여 특이한 생리적인 조절을 유도하는 방법이다. 이러한 특이한 생리적인 조절 유도를 저해 또는 촉진하는 물질을 검출하는 방법 등으로의 활용에 관한 방법이다.
세포를 인위적으로 조절하기 위해서 흔히 이용하는 방법은 약물 등 생리조절물질을 세포에 처리하는 것이다. 이러한 생리조절물질은 세포에서 복잡한 생리체계(physiological network)를 특이하게 조절해서 생리적인 조절을 유도할 수 있다. 특히, 질병에 의해 교란된 생리체계 속에서 특정 질병인자(therapeutic target)을 약물 등을 이용해서 적절히 결합 및 조절해서 치료 효과를 얻을 수 있다.
그런데, 질병세포를 조절하기 위한 약물 등 생리조절물질을 새로이 개발하는 것은 매우 어렵다. 하나의 새로운 약물을 개발하기 위해선 15년 및 1조 이상의 엄청난 비용과 시간이 필요하다. 새로이 개발된 저분자화합물 등의 약물 등은 사람 몸에 독성 등 부작용(side effect)을 나타낼 수 있는 여러 가지 문제점을 내재적으로 가지고 있다. 따라서, 상당한 시행착오를 거치면서 신약이 개발된다.
항체 등을 이용해서 세포외 또는 세포막의 질병인자와의 결합과는 달리 세포내에서의 복잡한 생리체계 속에서 특정 질병인자를 특이하게 결합해서 조절하는 약물을 개발하는 것은 더욱 더 힘들다.
따라서, 세포의 생리적인 조절을 유도하는 새로운 방법이 필요하다.
나아가, 성공적인 신약 개발 및 방법 개발을 위해선 부작용과 관련해서 약물이 사람 몸 등 세포에서 어떤 질병인자 등과 특이하게 결합하는지 분석하는 것이 중요하다. 이 뿐만 아니라, 새로운 효능을 개발하기 위해서도 약효 등 생리적인 조절을 나타내는 사람세포에서 질병인자 등 생리조절물질의 상호작용을 탐색하는 것이 매우 중요하다.
사람세포내에서의 대표적인 생리조절물질의 상호작용 분석 방법으로 FRET(fluorescence resonance energy transfer)과 PCA(protein-fragment complementation assay)이 있다. 그런데, 이 방법들은 결합하는 물질들의 상대적인 간격과 위치가 적절하지 않으면 상호작용을 탐색할 수 없는 근본적인 문제점이 있다(Screen 8: 447, 2003). 나아가, 살아 있는 세포내에서 약효를 결정하는 약물 등의 저분자화합물과 질병인자들의 결합을 분석하기가 여러 가지 기술상의 한계들 때문에 힘들다.
이러한 문제점을 극복하기 위해서, 세포내에서 약물과 질병인자 등 생리조절물질의 상호작용을 탐색하는 방법으로 자성나노입자에 약물을 부착하여 그와 결합하는 질병인자를 자석을 이용해서 끌어서 분리하는 방법이 있다. 자석을 이용함으로서 세포를 깨지 않고 세포내에서 질병인자를 분리하는 방법으로 저명한 학술지(Won et al., Science 309: 121, 2005 이후에 취소)에 발표되는 등 여러 가지 분석의 장점이 있다.
그런데, 재현성 부족 등의 이유로 논문이 취소되는 등 상용화를 위한 기술의 완성도가 떨어진다. 가령, 자석에 의해 잘 끌리는 특성과 크기가 균일한 자성나노입자를 화학적으로 합성함으로서 세포내에 도입된 대부분의 자성나노입자가 효과적으로 끌려야 한다. 이렇게 자석에 의해 끌리는 현상을 눈으로 쉽게 확인할 수 있어야 하는데, 이러한 최적화된 자성나노입자를 합성하는 것이 미래 나노기술의 최첨단 분야로서 선정될 만큼 유익성에 비해서 매우 힘든 기술이다. 이렇게 최적화되지 않으면 일부의 자성나노입자가 자석에 의해 끌리게 되고, 끌리지 않는 상당한 자성나노입자들로 인한 높은 백그라운드 때문에 눈으로 쉽게 확인할 수가 없다. 나아가, 이 방법은 세포내에서 자석에 의해 끌리는 현상을 형광현미경 등을 이용해서 일일이 눈으로 확인해야 하기에 전문적인 분석에 이은 식별 능력과 시간 및 노력이 많이 든다.
따라서, 세포의 생리적인 조건하에서 약물 등 생리조절물질의 상호작용을 탐색하는 새로운 방법이 필요하다.
이러한 제반 문제점을 극복하기 위해서, 본 발명은 세포내에서 특정 탐색물질이 디스플레이된 자성물질에 자기장을 인가하여 특이한 세포의 생리적인 조절을 유도하는 방법을 발명하게 되었다. 나아가, 이러한 특이한 생리적인 조절 유도 또는 관련된 물질의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 물질을 검출하는 방법 등으로의 활용에 관한 방법이다. 따라서, 자기장에 의한 생리적인 조절을 토대로 기존의 조절 및 분석상의 문제점을 극복할 수 있는 본 발명을 완성하게 되었다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 기존의 방법과는 달리 자기장을 이용해서 세포의 생리적인 조절을 유도하는 것이다. 본 발명에서는 세포외 또는 세포막이 아닌 세포내에서 자기장을 이용하여 특정 탐색물질에 의해 특이한 세포의 생리적인 조절을 유도하는 새로운 방법에 관한 것이다.
나아가 상기 발명은 이러한 생리조절 또는 관련된 물질의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 물질을 탐색 및 검출하는 방법으로 활용될 수도 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 탐색물질을 이용한 세포의 생리적인 조절을 유도하는 방법을 제공한다:
(i) 세포내에서 탐색물질이 결합된 자성물질을 구성하는 단계; 및
(ii) 상기 세포에 자기장을 인가하여, 상기 탐색물질이 특정 생리적인 조절을 유도하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 세포의 생리적인 조절을 유도하는 물질을 탐색하는 방법을 제공한다:
(i) 세포내에서 표적후보물질이 결합된 자성물질을 구성하는 단계; 및
(ii) 상기 세포에 자기장을 인가하여, 특정 생리적인 조절이 유도되는지를 판단하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 탐색물질에 의해 유도된 세포의 생리적인 조절을 저해 또는 촉진하는 표적후보물질을 탐색하는 방법을 제공한다 :
(i) 세포내에서 탐색물질이 결합된 자성물질을 구성하는 단계; 및
(ii) 상기 세포에 표적후보물질을 도입한 이후에 자기장을 인가하여, 상기 탐색물질에 의해 유도된 특정 생리적인 조절이 저해 또는 촉진되는지를 판단하는 단계.
본 발명의 목적은 기존의 방법과는 달리 자기장을 이용해서 세포의 생리적인 조절을 유도하는 것이다. 본 발명에서는 세포외 또는 세포막이 아닌 세포내에서 자기장을 이용하여 세포의 생리적인 조절을 유도하는 새로운 방법에 관한 것이다.
자기장에 의하여 자성물질은 서로 클러스터를 형성하거나 특정 방향으로 끌린다. 따라서, 자성물질에 직접 또는 간접적으로 하나 또는 그 이상의 특정 생리조절물질을 디스플레이하고 자기장을 인가하면, 클러스터를 형성하는 현상을 이용해서 몸 또는 세포에서 특정 위치의 특정 생리조절물질(또는 생리조절물질과 상호작용하는 또 다른 생리조절물질들)의 국소농도(local concentration)를 변화시킬 수 있다. 나아가, 자기장의 방향으로 끌리는 현상을 이용해서 특정 생리조절물질 (또는 생리조절물질과 상호작용하는 또 다른 생리조절물질들)의 위치를 몸 또는 세포에서 변화시킬 수 있다. 이러한 특성을 토대로 세포내에서 특정 생리조절물질(또는 생리조절물질과 상호작용하는 또 다른 생리조절물질들)의 변화 및 조절을 통해서 인위적으로 특이한 세포의 생리적인 변화 및 조절을 유도할 수 있음을 본 발명을 통해서 밝혔다.
생리적인 조절을 위해서 자기장을 이용하는 방법은 약물을 개발해서 이용하는 방법에 비해 장점이 많다. 먼저, 약물과 비교해서 자기장은 사람에게 독성 등의 부작용이 거의 없다. 그리고, 자기장을 파괴적이지 않은(non-invasive) 자연 상태에서 사람에게 인가할 수 있다. 또한, 세포 또는 몸 특정 위치에 자기장을 임의적인 세기로 임의적인 시간 동안 편리하게 인가할 수 있다. 더불어, 자기장을 인가하고 제거함에 따라 가역적인 조절도 가능하다. 가령, 자기적인 트워저(magnetic tweezer)를 사용하면 세포 또는 몸에서 3차원적으로 특정 위치로 자성나노입자를 움직이게 하여 여러 가지 생리적인 조절을 임의적으로 정확하게 할 수 있다(Rev. Sci. Instrum. 76: 053711, 2005 ; Rev. Sci. Instrum. 74:4158, 2003 ; Ann. Rev. of Biophysics 41: 453, 2012). 나아가, 특이성을 가지는 항체를 자성나노입자에 디스플레이하면 세포내에서 특정 단백질 등의 셍리적인 기능을 특이하게 조절할 수도 있다. 따라서, 자기장을 이용해서 국부적으로 몸 또는 세포의 생리적인 조절을 바람직하게 효과적으로 유도할 수 있어 치료 효과 등 다양한 유익한 효과를 예상할 수 있다.
나아가 이러한 생리조절 또는 관련된 물질의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 물질을 탐색 및 검출하는 방법으로 활용될 수도 있다.
기존 방법들의 여러 가지 문제점을 해결하기 위해서 개발한 방법은 자석을 이용함으로서 세포를 깨지 않고 세포내에서 질병인자를 분리하는 방법으로 저명한 학술지(Won et al., Science 309: 121, 2005 이후에 취소)에 발표되는 등 여러 가지 분석의 장점이 있다. 그럼에도 불구하고, 상기 배경기술에서 자세히 설명한 바와 같이 재현성 부족 등의 이유로 논문이 취소되는 등 상용화를 위한 기술의 완성도가 떨어진다. 그런데, 본 발명을 이용하면 형광현미경을 이용하지 않고 세포의 죽음과 삶 및 성장 등을 토대로 간단하게 분석할 수 있고 초고속 스크리닝(ultra-high throughput screen)이 가능하다. 또한, 자성나노입자가 눈으로 확인할 정도가 아닌 극히 일부만 끌려도 세포의 죽음과 삶 및 성장 등 생리적인 조절이 비교적 쉽게 유도되기에 민감도(detection sensitivity)가 높고 백그라운드가 낮아 탐색이 용이하다. 나아가, 살아 있는 세포는 죽은 세포로부터 형광분리기(FACS) 등 여러 방법으로 쉽게 분리할 수 있어 그 세포들로부터의 여러 가지 생리조절 현상과 상호작용 등을 부가적으로 분석할 수 있는 장점도 있다.
세포를 깨지 않고 파괴적이지 않은(non-invasive) 자연 상태에서 자석을 이용해서 생리조절물질의 상호작용을 세포내에서 분석할 수 있다는 장점과 함께 이 기술은 분석용 토대 기술로서 여러 가지 장점이 있다. 몇 가지만을 간단히 예를 들면 다음과 같다. 첫 번째, 인위적인 조건이 아닌 생리적인 조건하에서 자연 상태에서 생리조절물질의 상호작용을 분석할 수 있다. 둘째, 형광 등 이미징이 아닌 세포의 죽음과 삶 등으로 명백한 신호(clear readout)로 분석하고 손쉽게 분리할 수 있다. 셋째, 단일 세포 수준에서의 체계적인 분석이 가능하다. 넷째, 토대 기술로서 다양한 생리조절물질들의 분석 및 스크리닝을 체계적으로 빠르게 대량으로 수행할 수 있다.
도 1은 대조군(YFP-FKBP)과 실험군(YFP-FKBP-Akt)에서 자기장의 인가에 의하여 죽음 방지 등 기능 변화가 유도된 세포의 비율을 나타내는 그래프이다. Akt가 발현된 경우에만 자기장의 인가에 의하여 세포의 죽음 방지 등 생리적인 조절 및 변화가 유도됨을 알 수 있다.
도 2는 자기장의 인가하여 YFP-FKBP-Akt에 의해서 죽음 방지 등 세포의 기능 변화가 유도된 상태에서, FKBP와 자성나노입자에 코팅된 FK506의 결합을 억제하는 라파마이신을 처리시에 죽음 방지이 유도되는 비율이 감소함을 알 수 있다.
도 3은 대조군(YFP-FKBP)과 실험군(YFP-FKBP-Fas)에서 자기장의 인가에 의하여 죽음 등 기능 변화가 유도된 세포의 비율을 나타내는 그래프이다. Fas가 발현된 경우에만 자기장의 인가에 의하여 세포의 죽음 등 생리적인 조절 및 변화가 유도됨을 알 수 있다.
도 4는 자기장의 인가하여 YFP-FKBP-Fas에 의해서 죽음 등 세포의 기능 변화가 유도된 상태에서, FKBP와 자성나노입자에 코팅된 FK506의 결합을 억제하는 라파마이신을 처리시에 죽음이 유도되는 비율이 감소함을 알 수 있다.
도 5는 대조군(YFP-FKBP)과 실험군(YFP-FKBP-Tiam1)에서 자기장의 인가에 의하여 생리적인 조절 및 변화가 유도된 세포의 비율을 나타내는 그래프이다. Tiam1이 발현된 경우에만 자기장의 인가에 의하여 세포막 주름짓기(membrane ruffling)과 접착용 세포족(lamellipodia)의 형성되는 현상이 유도됨을 알 수 있다. 자기장을 인가한 경우와 인가하지 않은 경우, 실험군(YFP-FKBP-Tiam1)에 의해 생리적인 조절 및 변화를 나타내는 현미경 사진이다.
도 2는 자기장의 인가하여 YFP-FKBP-Akt에 의해서 죽음 방지 등 세포의 기능 변화가 유도된 상태에서, FKBP와 자성나노입자에 코팅된 FK506의 결합을 억제하는 라파마이신을 처리시에 죽음 방지이 유도되는 비율이 감소함을 알 수 있다.
도 3은 대조군(YFP-FKBP)과 실험군(YFP-FKBP-Fas)에서 자기장의 인가에 의하여 죽음 등 기능 변화가 유도된 세포의 비율을 나타내는 그래프이다. Fas가 발현된 경우에만 자기장의 인가에 의하여 세포의 죽음 등 생리적인 조절 및 변화가 유도됨을 알 수 있다.
도 4는 자기장의 인가하여 YFP-FKBP-Fas에 의해서 죽음 등 세포의 기능 변화가 유도된 상태에서, FKBP와 자성나노입자에 코팅된 FK506의 결합을 억제하는 라파마이신을 처리시에 죽음이 유도되는 비율이 감소함을 알 수 있다.
도 5는 대조군(YFP-FKBP)과 실험군(YFP-FKBP-Tiam1)에서 자기장의 인가에 의하여 생리적인 조절 및 변화가 유도된 세포의 비율을 나타내는 그래프이다. Tiam1이 발현된 경우에만 자기장의 인가에 의하여 세포막 주름짓기(membrane ruffling)과 접착용 세포족(lamellipodia)의 형성되는 현상이 유도됨을 알 수 있다. 자기장을 인가한 경우와 인가하지 않은 경우, 실험군(YFP-FKBP-Tiam1)에 의해 생리적인 조절 및 변화를 나타내는 현미경 사진이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
본원에서 "생리조절물질"이란, 생리활성물질로서 세포 및 몸의 다양한 생리적인 조절 역할을 하는 활성물질이라 정의할 수 있다. 이러한 생리조절물질은 동식물과 같은 천연물로부터 얻거나 미생물 및 동식물 세포주의 대사산물로부터 추출 및 정제할 수도 있고 화학적인 합성에 의해서도 얻을 수 있다. 예를 들어, 핵산, 뉴클레오타이드, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 당, 지질, 비타민 또는 화합물(chemical compound) 등일 수 있다.
본원에서 "탐색물질"이란, 자기장에 의해서 생리적인 조절을 유도할 수 있는 다양한 생리조절물질이다.
본원에서 “자성물질”이란 화학적으로 합성한 자성나노입자 또는 페리틴 등 생물학적으로 합성되는 자성나노입자 등으로 자기장으로 끌리는 모든 물질을 총체적으로 지칭한다.
본원에서 "매개물질"이란, 물질의 상호작용 및 결합을 매개하는 역할을 가지는 동일한 또는 상이한 이중/다중 복합체를 이루는 물질이다. 이러한 복합체는 무조건적으로 항상 또는 조건적으로 형성될 수 있다. FK506 화합물-FKBP 단백질 등 화학적 또는 생물학적인 합성에 의한 물질 등을 총망라한다.
본원에서 "표적물질“이란, 분석하고자 하는 대상이 되는 특이한 생리적인 조절을 유도하거나 유도된 특이한 생리적인 조절 또는 매개물질, 탐색물질, 생리조절물질 등 관련된 물질의 상호작용을 촉진 또는 저해하는 물질이다. FKBP 화합물-FK506 단백질의 상호작용을 억제하는 라파마이신 화합물이 그 한 예다.
본원에서 "디스플레이"란, 자성물질 외부로 무조건적으로 항상 또는 조건적으로 특정 물질을 직접적으로 또는 간접적으로 노출하는 것을 의미하며 이에 따라 생리적인 조절 또는 물질의 상호작용을 야기할 수 있다.
본원에서 "생리적인 조절"이란, 탐색물질에 의해서 세포에서 유도되는 여러 가지 다양한 생리적인 변화 및 조절을 총망라한다.
이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 발명은, 탐색물질과 결합한 자성물질에 자기장을 인가하여, 탐색물질이 특정 생리적인 조절을 유도하는 방법에 관한 것이다.
우선, 본 발명의 구체적인 제1 태양은, 다음의 단계를 포함하는, 탐색물질을 이용한 세포의 생리적인 조절을 유도하는 방법에 관한 것이다:
(i) 세포내에서 탐색물질이 결합된 자성물질을 구성하는 단계; 및
(ii) 상기 세포에 자기장을 인가하여, 상기 탐색물질이 특정 생리적인 조절을 유도하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 세포의 생리적인 조절을 유도하는 물질을 탐색하는 방법에 관한 것이다:
(i) 세포내에서 표적후보물질이 결합된 자성물질을 구성하는 단계; 및
(ii) 상기 세포에 자기장을 인가하여, 특정 생리적인 조절이 유도되는지를 판단하는 단계.
즉, 본 발명에서는 탐색물질이 결합된 자성물질에 자기장을 인가하여, 탐색물질이 특정 생리적인 조절을 유도하는 것을 확인하거나, 표적후보물질이 결합된 자성물질에 자기장을 인가하여 표적후보물질 중에 특정 생리적인 조절이 유도되는 지를 확인 하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 탐색물질 및 상기 표적후보물질은 핵산, 뉴클레오타이드, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 당, 지질(lipid), 비타민 및 화합물(chemical compound)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질인 것을 특징으로 할 수 있고, Akt, Fas 및 Tiam 등으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 자성물질은 화학적 또는 생물학적으로 합성된 자성나노입자인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 태양의 각 (i)단계에서, 탐색물질과 자성물질 및/또는 표적후보물질과 자성물질 사이의 결합은 직접적으로 또는 동일/상이한 이중/다중 복합체를 이루는 매개물질을 통해서 간접적으로 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다. 한 가지 예로, 탐색물질(또는 표적후보물질)-매개물질과 매개물질-자성물질이 세포내에서 매개물질을 통해서 서로 결합하여 구성될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 매개물질은 핵산, 뉴클레오타이드, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 당, 지질(lipid), 비타민 및 화합물(chemical compound)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 탐색물질, 상기 표적후보물질, 상기 매개물질 및 상기 자성물질 사이의 결합은 정전기적, 물리적, 화학적 또는 생물학적 결합인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 탐색물질 및 상기 표적후보물질은 형광성 표지물질과 추가로 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 형광성 표지물질은 예를 들어, FITC, rhodamine 등 형광 염료들; CFP, GFP, YFP, CFP 및 RFP 등의 형광 단백질; 테트라시스테인 형광성 모티프(tetracystein motif); 또는 형광을 내는 나노입자일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생리적인 조절은 세포의 죽음과 삶, 성장, 분화, 발생 및 활성화(activation), 비활성화(inactivation) 등 다양한 생리적인 변화 및 조절 현상들로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 자성물질, 매개물질, 표적후보물질 및 탐색물질들은 각각 또는 적절히 결합및 융합해서 일반적으로 널리 알려진 방법에 의해 용이하게 상기 세포내로 도입할 수 있다. 예를 들어, 직접 도입(injection), 세포전달성 융합촉진 펩타이드(fusogenic peptide), 지질 전달체 또는 이들의 결합체를 이용한 도입; 전기(electroporation)을 이용한 도입; 자기장(magnetofection)을 이용한 도입 중 어느 하나로 구성된 군에서 선택되는 방법 등에 의해 수행될 수 있음은 자명하다.
본 발명에 있어서, 상기 매개물질은 동일한 또는 상이한 이중/다중 복합체를 이루는 물질로서 상호작용을 하는 다양한 물질 파트너를 이용할 수 있다. 구체적인 예로서, 화합물과 단백질 또는 단백질과 단백질 등의 다양한 형태로 상호작용한다고 알려진 또는 분석하고자 하는 파트너로서 FK506 화합물-FKBP 단백질, AP1510 화합물-FKBP 단백질, IkBα 단백질-RelA 단백질, TNFa 생리적인 신호에 따라 조절되는 IkBα 단백질-bTrCP 또는 IKKb 단백질, MTX 화합물-DHFR 단백질, 라파마이신 화합물-FKBP 단백질-FRB 단백질 등의 상호작용 등을 들 수 있다.
상기 특정 생리적인 조절을 저해 또는 촉진하는 상기 표적후보물질은 해당 생리적인 조절 및 관련된 물질의 상호작용을 변화시키는 물질이면 생리조절물질이든 어떠한 화합물이든 제한이 없다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 자기장을 이용한 Akt의 세포의 죽음 방지 유도
Akt 단백질을 디스플레이한 자성나노입자에 자기장을 인가하여 세포의 죽음 방지가 유도됨을 확인하였다. 디스플레이한 Akt 단백질은 PH 도메인이 삭제된 Akt 단백질 부위를 포함한다.
실시예 1-1: TATHA2-FK506-자성나노입자의 제조
표면에 스트렙타비딘이 코팅된 자성나노입자(Molday, et al., J. Immunol. Meth. 52: 353, 1982; March, et al., Anal. Biochem. 60: 149, 1974; Cuatrecasas, et al., J. Biol. Chem. 245: 3059, 1970; 미국특허 제5,665,582호; 미국특허공개 제2003/0092029A1호 등을 토대로 제조 또는 구입)에 비오틴-FK506과 비오틴-TATHA2를 융합하였다. TATHA2 펩타이드(Wadia et al., Nature Med. 10: 310, 2004 등을 토대로 제조)는 융합촉진 펩티드(fusogenic peptide)로서 자성나노입자가 세포내에 효율적으로 도입되는 것을 도와준다고 알려져 있다. FK506은 세포내에 도입된 자성나노입자가 세포내에 발현된 FKBP 융합단백질에 결합할 수 있도록 한다. 비오틴-FK506과 비오틴-TATHA2의 코팅을 위해 10ml의 자성나노입자(10pmol의 비오틴화 분자에 결합할 수 있는 양)에 100pmol의 비오틴-FK506을 혼합하고 100분 동안 반응시켜서, FK506이 결합된 자성나노입자(FK506-자성나노입자)를 수득하였으며, 상기 10ml의 FK506-자성나노입자에 다시 100pmol의 비오틴-TATHA2를 혼합하고 100분 동안 반응시켜서, 최종적으로는 FK506과 TATHA2가 함께 결합된 자성나노입자(TATHA2-FK506-자성나노입자)를 제조하였다.
실시예 1-2: YFP-FKBP 및 YFP-FKBP-Akt 발현세포주의 수득
Jurkat-TAg 세포주를 10% FCS를 포함하는 RPMI 1640 배지를 이용하여 배양하고, 대조군인 YFP-FKBP DNA 제작물 또는 실험군인 YFP-FKBP-Akt DNA 제작물을 전기도입법(electroporation)으로 도입하켰다.
실시예 1-3: 자기장의 인가 및 이에 따른 세포의 죽음 방지 변화
상기 실시예 1-2에서 수득한 YFP-FKBP 또는 YFP-FKBP-Akt를 발현시키는 각 세포주에 상기 실시예 1-1에서 제조한 TATHA2-FK506-자성나노입자를 가하여 12시간 동안 배양했다. 상기 세포에 2시간 동안 자기장을 미리 인가하고 9시간 동안 10uM wortmanin 또는 100uM LY294002을 함께 처리하였다. 세포의 죽음은 Propidim Iodide 동정법으로 측정한 결과, 자기장을 인가한 상황에서 Akt에 의해서 죽은 세포의 수가 감소하는 것을 확인하였다(도 1).
실시예 2: 자기장을 이용한 Fas의 세포의 죽음 유도
Fas 단백질을 디스플레이한 자성나노입자에 자기장을 인가하여 세포의 죽음이 유도됨을 확인하였다. 디스플레이한 Fas 단백질은 죽음(death) 도메인을 포함하는 Fas 수용체의 세포내 단백질 부위를 포함한다.
실시예 2-1: TATHA2-FK506-자성나노입자의 제조
실시예 1-1과 동일한 방법으로 제조하였다.
실시예 2-2: YFP-FKBP 및 YFP-FKBP-Fas 발현세포주의 수득
Jurkat-TAg 세포주를 10% FCS를 포함하는 RPMI 1640 배지를 이용하여 배양하고, 대조군인 YFP-FKBP DNA 제작물 또는 실험군인 YFP-FKBP-Fas DNA 제작물을 전기도입법(electroporation)으로 도입시켰다.
실시예 2-3: 자기장의 인가 및 이에 따른 세포의 죽음 변화
상기 실시예 2-2에서 수득한 YFP-FKBP 또는 YFP-FKBP-Fas를 발현시키는 각 세포주에 상기 실시예 2-1에서 제조한 TATHA2-FK506-자성나노입자를 가하여 12시간 동안 배양했다. 상기 세포에 12시간 동안 자기장을 인가한 이후에 세포의 죽음은 Propidim Iodide 동정법으로 측정한 결과, 자기장을 인가한 상황에서 Fas에 의해서 살아 있는 세포의 수가 감소하는 것을 확인하였다(도 3).
실시예 3: 자기장을 이용한 Tiam1의 세포의 형태 변화 유도
Tiam1 단백질을 디스플레이한 자성나노입자에 자기장을 인가하여 세포막 주름짓기(membrane ruffling)과 접착용 세포족(lamellipodia)의 형성이 유도됨을 확인하였다. 이러한 세포막 주름짓기(membrane ruffling)과 접착용 세포족(lamellipodia)이 형성되는 현상은 세포의 성장, 발생, 이동 및 암 질병 발생 등 여러 가지 세포의 생리적인 조절을 측정하는 중요한 척도임이 알려져 있다.
실시예 3-1: TATHA2-FK506-자성나노입자의 제조
실시예 1-1과 동일한 방법으로 제조하였다.
실시예 3-2: YFP-FKBP 및 YFP-FKBP-Tiam1 발현세포주의 수득
NIH3T3 세포주를 10% CS을 포함하는 DMEM 배지를 이용하여 배양하고, 대조군인 YFP-FKBP DNA 제작물 또는 실험군인 YFP-FKBP-Tiam1 DNA 제작물을 전기도입법(electroporation)으로 도입시켰다.
실시예 3-3: 자기장의 인가 및 이에 따른 세포의 형태 변화
상기 실시예 1-2에서 수득한 YFP-FKBP 또는 YFP-FKBP-Tiam1를 발현시키는 각 세포주에 상기 실시예 1-1에서 제조한 TATHA2-FK506-자성나노입자를 가하여 12시간 동안 배양하고, 상기 세포에 2시간 동안 자기장을 인가한 다음, 세포의 형태 변화를 형광현미경(Olympus IX51)와 렌즈(LUC Plan FL N objective lens (40x/0.6NA))를 사용해서 관찰한 결과, 자기장을 인가한 상황에서 Tiam1에 의해서 세포막 주름짓기 및 접착용 세포족 형성이 촉진되는 것을 확인하였다(도 5).
실시예 4: Akt의 세포 죽음 방지를 유도하는 상태에서 물질의 상호작용 스크리닝
상기 실시예 1의 결과로부터, 자기장을 이용하여 세포의 변화 및 조절을 유도할 수 있음을 확인하였는 바, 관련된 물질의 상호작용을 조절할 수 있는 물질을 스크리닝하고자 하였다.
구체적으로, 실시예 1에서 자기장을 인가하기 1시간 이전부터 10uM wortmanin을 처리하는 시간동안 FK506와 FKBP의 결합을 억제하는 라파마이신을 처리하고 세포의 죽음 변화를 관찰한 결과, 라파마이신을 처리함에 따라 자기장에 따라 유도되는 죽는 세포의 비율이 증가하는 것을 확인하였다(도 2)
실시예 5: Fas의 세포 죽음을 유도하는 상태에서 물질의 상호작용 스크리닝
상기 실시예 2의 결과로부터, 자기장을 이용하여 세포의 변화를 유도할 수 있음을 확인하였는 바, 관련된 물질의 상호작용을 조절할 수 있는 물질을 스크리닝하고자 하였다.
구체적으로, 실시예 2에서 자기장을 인가하기 1시간 이전부터 FK506와 FKBP의 결합을 억제하는 라파마이신을 처리하고 세포의 죽음 변화를 관찰한 결과, 라파마이신을 처리함에 따라 자기장에 따라 유도되는 죽는 세포의 비율이 감소한 것을 확인하였다(도 4).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (12)
- 다음의 단계를 포함하는, 탐색물질을 이용한 세포의 생리적인 조절을 유도하는 방법:
(i) 세포내에서 탐색물질이 결합된 자성물질을 구성하는 단계; 및
(ii) 상기 세포에 자기장을 인가하여, 상기 탐색물질이 특정 생리적인 조절을 유도하는 단계.
- 다음의 단계를 포함하는, 세포의 생리적인 조절을 유도하는 물질을 탐색하는 방법:
(i) 세포내에서 표적후보물질이 결합된 자성물질을 구성하는 단계; 및
(ii) 상기 세포에 자기장을 인가하여, 특정 생리적인 조절이 유도되는지를 판단하는 단계.
- 제1항 내지 제2항에 있어서, 상기 탐색물질 및 상기 표적후보물질은 핵산, 뉴클레오타이드, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 당, 지질(lipid), 비타민 및 화합물(chemical compound)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 자성물질은 화학적 또는 생물학적으로 합성된 자성나노입자인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제2항에 있어서, 상기 탐색물질 및 상기 표적후보물질은 상기 자성물질과 직접 또는 매개물질을 통해서 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 매개물질은 핵산, 뉴클레오타이드, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 당, 지질(lipid), 비타민 및 화합물(chemical compound)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제6항에 있어서, 상기 탐색물질, 상기 표적후보물질, 상기 매개물질 및 상기 자성물질 사이의 결합은 정전기적, 물리적, 화학적 또는 생물학적 결합인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제2항에 있어서, 상기 탐색물질 및 상기 표적후보물질은 형광성 표지물질과 추가로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 형광성 표지물질은 형광 염료, 형광 단백질 또는 형광 나노입자인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 특정 생리적인 조절은 세포의 죽음과 삶, 성장, 활성화 및 비활성화로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 탐색물질은 Akt, Fas 및 Tiam으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 다음의 단계를 포함하는, 탐색물질에 의해 유도된 세포의 생리적인 조절을 저해 또는 촉진하는 표적후보물질을 분석하는 방법 :
(i) 세포내에서 탐색물질이 결합된 자성물질을 구성하는 단계; 및
(ii) 상기 세포에 표적후보물질을 도입한 이후에 자기장을 인가하여, 상기 탐색물질에 의해 유도된 특정 생리적인 조절이 저해 또는 촉진되는지를 판단하는 단계.
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