KR20190011092A

KR20190011092A - 단분자 단백질의 다중 번역 후 변형을 검출하는 방법

Info

Publication number: KR20190011092A
Application number: KR1020170093624A
Authority: KR
Inventors: 김기문; 김경록; 류성호; 박경민
Original assignee: 기초과학연구원; 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2017-07-24
Filing date: 2017-07-24
Publication date: 2019-02-01
Also published as: KR102317672B1

Abstract

본 발명은 표적 단백질을 기판 위에 고정시키고, 상기 단백질의 부위 특이적 번역 후 변형을 검출할 수 있는 프로브와 반응시켜 번역 후 변형 정보를 수득한 후 프로브를 제거하고, 단백질의 다른 부위 특이적 번역 후 변형을 검출할 수 있는 프로브와 반응시켜 다른 번역 후 변형 정보를 추가적으로 수득하는 일련의 과정을 반복함으로써 단분자 단백질의 다중 번역 후 변형을 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 종래 단백질의 번역 후 변형을 분석하는 반응에서 사용되는 항체의 숙주종 및 형광색의 제약, 짧은 서열 구간에서의 다양한 형광색 표지로 인해 발생하는 입체 장애를 해소함으로써 조합적인 번역 후 변형 코드의 단일 분자 프로파일을 정량적으로 분석할 수 있는 직접적이고 강력한 방법을 제공하는 효과가 있다.

Description

단분자 단백질의 다중 번역 후 변형을 검출하는 방법 {A method for detecting multiple post-translational modification in a single molecule protein}

본 발명은 단분자 단백질의 다중 번역 후 변형을 검출하는 방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 기판 위에 단분자 단백질을 고정시키고, 상기 단백질의 부위 특이적 번역 후 변형을 검출할 수 있는 프로브와 반응시켜 번역 후 변형 정보를 수득한 후 프로브를 제거하고, 다른 부위 특이적 번역 후 변형을 검출할 수 있는 프로브와 반응시켜 다른 번역 후 변형 정보를 추가적으로 수득하는 일련의 과정을 반복함으로써 단분자 단백질의 다중 번역 후 변형을 검출하는 방법에 관한 것이다.

하나의 단백질이 다양한 기능을 발휘하기 위하여 어떻게 조절되는지 연구하는 것은 포스트-게놈 시대 이래로 매우 중요한 연구 주제로 각광받고 있다. 단백질의 기능은 mRNA의 전사, 선택적 RNA 스플라이싱, 성숙 mRNA가 단백질로 번역되는 과정을 포함하는 다층적이고 상호 밀접하게 연관된 복잡한 메커니즘을 통해 조직적으로 조절되고 있으며, 이처럼 다양한 조절 메커니즘 중에서도 번역 후 변형(post-translational modifications, PTMs)은 단백질을 색인할 수 있는 막대한 잠재력과 더불어 단백질의 레퍼토리를 지수적으로 확장할 수 있는 수단을 제공하고 있으며, 매우 역동적이면서도 가역적인 반응이라는 이점도 함께 가지고 있다.

자극에 신속하게 반응하기 위하여 게놈, 전사, 번역 단계에서의 조절 없이 번역 후 변형을 통해 단백질의 기능을 미세 조절한다는 다양한 연구 결과들이 보고되고 있다. 개별 단백질은 다중 부위에서 환경적 신호에 대한 통합적 반응을 조율하기 위한 광범위한 공유결합적 변형이 일어날 수 있으며, 예를 들어 히스톤 코드와 같은 조합적인 번역 후 변형(combinatorial PTMs, e.g., 'PTM code')은 단백질의 분자적 형태의 다양성을 기하급수적으로 확장시킬 뿐만 아니라 이로 인해 야기되는 다양한 분자적 형태만큼이나 다양한 생물학적 효과를 발휘할 수 있도록 해준다. 최근까지 번역 후 변형을 연구하기 위한 가장 기본이 되는 방법으로 웨스턴 블라팅이나 질량 분석법 같은 방법이 널리 사용되었다. 그러나 조합적인 번역 후 변형 정보는 동일 단백질 상의 다른 다수의 부위가 동시에 변형된 경우 등에 있어서 종래 사용되던 상기한 앙상블-평균 측정 방법에 의해서는 정확히 분석하기 어려운 한계가 존재한다. 따라서, 조합적인 번역 후 변형의 다양성을 기존 방법에 비해 보다 정확하게 분석하기 위한 새로운 방법이 요구되는 실정이다.

이에 본 발명자들은 개별 단일 단백질 분자의 조합적인 번역 후 변형 코드를 정확히 분석할 수 있는 간단하고 신속하며 직접적인 신규한 방법을 고안해 내고자 예의 노력한 결과, 기판 표면에 표적 단백질을 안정적으로 고정시키고, 단일분자 형광 현미경과 함께 부위 특이적 항-번역 후 변형 항체들을 사용하여 이미징과 소거반응을 순환 반복함으로써 개별 단백질의 조합적인 번역 후 변형 코드의 프로파일링이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

Jaqaman, K. et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature methods 5, 695-702, doi:10.1038/nmeth.1237 (2008). Kim, K. L. et al. Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting. Nat Commun 7, 11107, doi:10.1038/ncomms11107 (2016). Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M. & Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature reviews. Molecular cell biology 7, 473-483, doi:10.1038/nrm1960 (2006). Lemmon, M. A. & Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell 141, 1117-1134, doi:10.1016/j.cell.2010.06.011 (2010). Birtwistle, M. R. et al. Ligand-dependent responses of the ErbB signaling network: experimental and modeling analyses. Molecular systems biology 3, 144, doi:10.1038/msb4100188 (2007).

본 발명의 목적은 단분자 단백질의 다중 번역 후 변형을 검출하는 신규한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 표적 단백질에 대한 프로브의 검출율을 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 표적 단백질의 다중 번역 후 변형 분석용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 단분자 단백질의 다중 번역 후 변형 조합 코드 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 단분자 단백질의 다중 번역 후 변형에 기초한 시료 판별 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, (a) 기판 표면에 표적 단백질을 고정하는 단계; (b) 고정된 표적 단백질을 표적 단백질의 특정 번역 후 변형(post-translational modification) 부위에 특이적으로 결합하는 프로브와 반응시키는 단계; (c) 프로브와의 반응 정보를 수득하는 단계; (d) 표적 단백질과 결합한 프로브를 표적 단백질로부터 제거하는 단계;를 포함하고, 상기 (b) 내지 (d) 단계를 순환적으로 반복하되, 표적 단백질의 서로 상이한 N개의 번역 후 변형을 검출하기 위하여 상기 번역 후 변형을 특이적으로 검출하는 N개의 프로브와 반응시키는 것을 특징으로 하는 표적 단백질의 다중 번역 후 변형을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 기판 표면에 표적 단백질을 고정하는 단계; (b) 고정된 표적 단백질을 표적 단백질의 특정 번역 후 변형(post-translational modification) 부위에 특이적으로 결합하는 프로브와 반응시키는 단계; (c) 프로브와의 반응 정보를 수득하는 단계; (d) 표적 단백질과 결합한 프로브를 표적 단백질로부터 제거하는 단계; (e) 고정된 표적 단백질을 상기 프로브와 다시 반응시키는 단계; (f) (e) 단계의 프로브와의 반응 정보를 수득하는 단계; 및 (g) 상기 수득된 반응 정보들을 통합하는 단계를 포함하되, 상기 (b) 내지 (d) 단계는 1 내지 10회 반복되는 것을 특징으로 하는, 표적 단백질에 대한 프로브의 검출율을 향상시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 표적 단백질이 공유결합으로 고정된 기판, 표적 단백질의 번역 후 변형에 특이적으로 결합하는 프로브 및 소거 완충액을 포함하는 표적 단백질의 다중 번역 후 변형 분석용 키트을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 방법으로 세포 내 단분자 단백질의 다중 번역 후 변형을 검출하는 단계; 및 (b) 다중 번역 후 변형을 부위별로 코드화 하여 조합 코드 정보를 제공하는 단계;를 포함하는 단분자 단백질의 다중 번역 후 변형 조합 코드 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 (a) 상기 방법으로 시료 내 단분자 단백질의 다중 번역 후 변형을 검출하는 단계; (b) (a) 단계에서 검출된 정보를 상기 조합 코드 정보와 비교하는 단계; 및 (c) (a) 단계의 정보와 동일한 조합 코드 정보를 기초로 시료가 채취된 조직 또는 시료에 가해진 자극을 판별하는 단계;를 포함하는 단분자 단백질의 다중 번역 후 변형에 기초한 시료 판별 방법을 제공한다.

본 발명은 다양한 세포 단백질에 적용할 수 있는 조합적인 번역 후 변형 코드를 분석하기 위한 단백질학적 접근을 기반으로 한 플랫폼 기술을 제공함으로써, 적은 양의 시료로 신속하고 민감하게 단일 단백질 내의 다중 번역 후 변형을 검출할 수 있도록 한다. 또한, 본 발명에 의하면 항체 숙주종이나 형광색의 제한없이 단분자 수준에서 다중 부위에서의 번역 후 변형 상태에 관한 정교한 정량 데이터를 쉽고 빠르게 확보할 수 있다.

이와 더불어, 본 발명에 프로브를 제거하는 소거 단계를 도입함으로써 단일 폴리펩타이드 상에서 다색성 면역 형광 표지에 의해 빈번하게 발생하는 입체 장애를 완전히 제거할 뿐만 아니라, 반복적인 프로빙 사이클로부터의 이미지 중첩을 허용함으로써 1차 항체의 이종 감수성과 관련된 문제점도 해결하는 효과가 있다.

또한, 표적 단백질에 대한 적절한 부위 특이적 변형 항체를 이용하는 경우, 본 발명은 종래 사용되던 앙상블-평균 측정 방법에서는 확인할 수 없었던 조합적인 번역 후 변형 코드에 대한 전례없는 수준의 정보를 제공할 수 있다. 이처럼 다양한 번역 후 변형 코드 상태에 대한 정보는 조직 특이적 또는 외부 자극에 대한 세포 내 신호 전달의 조절에 대한 새로운 시각을 제시하며 임상 생물학 자료 및 정밀 의학의 분자 진단에 도움이 될 수 있다.

또한, 단일 세포 연구용 마이크로 유체 플랫폼과 함께, 본 발명은 조합 번역 후 변형 코드에서 세포 대 세포 변이의 측정으로 확장될 수 있으며, 자동화된 영상 시스템을 결합하면 복잡한 세포 내 단백질의 번역 후 변형 정보를 손쉽고 간편하게 확보할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 기본 단계를 도식화한 것으로, (a) 본 발명은 프로빙/이미징/소거의 기본 단계가 반복되어 이루어지며, (b) 각각 N개의 번역 후 변형 부위에 대한 항체를 이용한 N번의 사이클을 통해 N개의 이미지를 확보하고, (c) N개의 이미지를 중첩하여 기판에 고정된 단분자 단백질의 번역 후 변형에 대한 조합 코드를 분석한다.
도 2는 소거 완충액의 활성을 확인하기 위한 것으로, (a) 기판에 in vitro 자가인산화된 EGFR을 Bt-NA 결합으로 고정하고, 항-pTyr 1차 항체와 Alexa Fluor 488 표지된 2차 항체로 프로빙한 뒤 소거 완충액과 반응시켰을 때 나타나는 프로브의 제거 효과를 형광 이미지로 확인하거나, (b) 이미징 영역(N _f ) 당 형광 분자의 평균 수로 그래프화하였다. Scale bar, 5um. *P < 0.05, Student's t-test.
도 3은 소거 완충액 반복 노출에 따른 형광 신호 감소 양상을 나타낸 것으로, (a) 기판에 in vitro 자가인산화된 EGFR을 Bt-NA 결합으로 고정하고, 항-pTyr 1차 항체와 Alexa Fluor 488 표지된 2차 항체를 이용하여 프로빙/이미징/소거 사이클을 6회 반복하였을 때 사이클이 반복될수록 형광 이미지 상 형광 신호가 감소되고, (b) 이미징 영역(N _f ) 당 형광 분자의 평균 수도 감소되며, (c) 이미징 영역(N _f ) 당 초기 형광 분자 대비 소거 반응 후 형광 분자의 비율도 감소되는 것으로 나타났다. Scale bar, 5um.
도 4는 소거 반응에 따른 NeutrAvidin의 Biotin 표면에 대한 결합 안정성을 나타낸 것으로, (a) Cy3 표지된 SA를 Bt-NA 표면에 고정하고 소거 완충액에 10분 또는 1시간 노출한 결과 형광 이미지 상 형광 신호의 감소가 관찰되지 않으며, (b) 이미징 영역(N _f ) 당 형광 분자의 평균 수도 감소되지 않는다. Scale bar, 5um. *, ** P < 0.05, Student's t-test.
도 5는 소거 반응에 따른 바이오티닐화한 단백질의 Bt-NA 표면에 대한 결합 안정성을 나타낸 것으로, (a, c) NeutrAvidin 코팅된 기판에 Biotin-결합된 염소 IgG를 형광 표지된 당나귀 항-염소 IgG 2차 항체로 프로빙 하였을 때에는 선명한 형광 신호가 검출되나, (b, d) 소거 완충액에 노출되면 형광 신호가 사라진다. Scale bar, 5um.
도 6은 Alexa Fluor 488-표지된 염소 IgG에 DBCO를 결합한 후 면역 블라팅으로 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명에서 단백질을 기판에 안정적으로 고정시키기 위한 방법을 도식화하고 결합의 안정성을 확인한 것으로, (a, b) 기판은 Az-PEG-COOH와 반응시키고, 기판에 결합시키고자 하는 단백질은 DBCO 결합시켜, 클릭 화학법에 의해 단백질을 기판에 안정적으로 공유결합시키며, (c) DBCO-표지된 토기 IgG 단백질을 클릭 화학법으로 기판에 고정시킨 후 Alexa Fluor 488-표지된 항-토끼 IgG 항체로 소거/재프로빙을 1, 5, 10회 반복한 결과 형광 이미지의 형광 신호가 감소되지 않았고, (d) 소거/재프로빙을 10회 반복하는 동안 이미징 영역(N _f ) 당 형광 분자의 평균 수도 거의 감소하지 않았다. Scale bar, 10 um. (n > 8). *P < 0.005, Student's t-test.
도 8은 Alexa Fluor 488- 및 DBCO-표지된 염소 항-토끼 IgG를 클릭 화학법으로 기판에 고정시킨 후 소거 완충액에 반복적으로 노출하며 형광 신호의 변화를 관찰한 것으로, (a) 소거 완충액에 반복적으로 노출하여도 형광 이미지 상 형광 신호의 감소가 관찰되지 않으며, (b) 이미징 영역(N _f ) 당 형광 분자의 평균 수도 거의 감소하지 않았다. Scale bar, 5 um. Error bars denote standard deviation (n > 8).
도 9는 토끼 IgG를 DBCO 결합시킨 후 이를 면역 블라팅으로 확인한 결과이다.
도 10은 단일 항원 펩타이드 분자의 반복적인 면역표지와 형광 이미지를 확인한 결과로, (a) 단일 항원 펩타이드인 HA 펩타이드의 N-말단에 DBCO 결합시키고, (b) DBCO-표지된 HA 펩타이드와 기준 마커 단백질을 기판에 클릭 화학법으로 고정시킨 후, 항-HA 1차 항체와 Alexa-Fluor 555-표지된 2차 항체로 프로빙/이미징/소거 사이클을 반복하며 형광 이미지를 관찰하고, (c) 이를 이미징 영역(N _f ) 당 형광 분자의 평균 수로 나타내었으며, (d) 기준 마커로 보정하거나 보정하지 않은 두 개의 상이한 사이클 이미지의 형광 신호의 평균 중첩률을 통해 항원 HA 펩타이드에 대한 항-HA 항체의 검출률을 분석하고, (e) 항 HA 항체와 Alexa Fluor 555-표지된 2차 항체를 사용하여 사이클을 반복 누적에 따른 항체의 항원 검출률 상승 효과를 이론값과 실험값으로 표시하였다. Error bars denote standard deviation (n > 8).
도 11은 기준 마커로 Alexa Fluor 488-표지된 염소 IgG 단백질을 기판에 고정하고 중첩율을 통하여 단백질의 위치를 보정하는 과정을 나타낸다.
도 12는 단분자 단백질의 다중 번역 후 변형을 검출하는 과정을 보여주는 것으로 (a) γEGFR 단백질을 정제하여 기판 위에 클릭 화학법으로 고정하고 (b) 각각 pY845, pY992, pY998, pY1068, pY1086, pY1173에 결합하는 항체를 이용하여 프로빙/이미징/소거 사이클을 진행하여 형광 이미지로 관찰하였으며, (c) 이를 이미징 영역(N _f ) 당 형광 분자의 평균 수로 나타내고, (d) 6개의 인산화 부위에 의한 번역 후 변형 조합 코드(63개) 별로 이미징 영역(N _f ) 당 형광 분자의 평균 수를 표시하고, 이에 대응하는 컴퓨터에 의해 생성된 이진법 코드를 관련 그래프 아래 기재하였으며, (e) 각 인산화 코드 조합에 따른 인산화-화학량적 분포를 표시하였다. Scale bar, 5 um. Error bars denote standard deviation (n > 8).
도 13은 γEGFR의 in vitro 자가인산화에 따른 각 티로신 잔기의 인산화 여부를 면역 블라팅으로 확인한 결과이다.
도 14는 benzylguanine-PEG₁₃-DBCO의 합성방법을 나타낸다.
도 15는 리간드 처리에 따른 γEGFR의 인산화 코드 프로파일링 과정을 보여주는 것으로, (a) 리간드 처리한 세포에서 γEGFR을 분리하여 기판 위에 클릭 화학법으로 고정하고, (b) 항-pTyr 1차 항체와 Alexa Fluor 555-표지된 2차 항체로 프로빙한 후, pY/γEGFR 비율과 상기 비율의 변화를 관찰하였으며, (c) 각각 pT669, pY845, pY992, pY998, pY1068, pY1086, pY1173에 결합하는 항체를 이용하여 프로빙/이미징/소거 사이클을 진행하여 γEGFR 상에서 각 부위 특이적 인산화의 비율 변화를 관찰하였고, (d) 인산화 코드 조합에 따른 인산화-화학론적 분포를 표시하고, (e) γEGFR의 각 부위 특이적 인산화의 다중 인산화로의 비율 변화를 측정하였다. Error bars denote standard deviation (n > 12). *P < 0.05, Student's t-test.
도 16은 리간드 처리에 따른 γEGFR의 부위 특이적 인산화를 면역블라팅으로 확인한 결과이다.
도 17은 EGF 및/또는 pervanadate 처리에 따른 γEGFR의 7개의 인산화 위치(pYT669, pY845, pY992, pY998, pY1068, pY1086, pY1173)에서의 인산화 코드 조합의 변화를 확인한 것으로, (a) 모든 인산화 코드 조합, (b) 모노 인산화 코드 조합, (c) 디-인산화 코드 조합, (d) 트리-인산화 코드 조합, (e) 테트라-인산화 코드 조합, (f) 헥사- 및 헵타- 인산화 코드 조합의 변화를, 이에 대응하는 컴퓨터에 의해 생성된 이진법 코드와 함께 표시하였다.
도 18은 EGF 및/또는 pervanadate 처리에 따른 γEGFR의 각 인산화 부위에서의 다중 인산화 비율을 나타낸다.
도 19는 리간드에 의해 유도되는 EGFR이 인산화되는 모델을 도식화한 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

SiMBlot 분석법은 세포막 비투과성 비오틴(Biotin) 표지 화합물(Sulfo-NHS-Biotin)을 이용해 세포막 수용체에 특이적으로 비오틴(Biotin) 표지하고, 표지된 세포에 상피성장인자와 같은 외부 자극을 부여한 후 세포를 분쇄하여 세포 현탁액을 만들고, 세포 현탁액을 적절히 희석하여 뉴트라비딘(NeutrAvidin)으로 표면 처리된 기판에 비오틴(Biotin) 표지된 세포막 수용체를 고정시킨 후, 고정된 세포막 수용체의 각 분자에 대한 변형 부위에 특이적인 항체를 이용해 형광 표지하고, 단분자 영상 기술을 이용하여 각 수용체의 분자 변형 상태를 분석하는 기술이다.

본 발명에서는 단분자 단백질의 다중적인 번역 후 변형을 분석하기 위하여 상기한 SiMBlot 분석법을 개량하고자 하였으며, 구체적으로는 종래 SiMBlot 반응에서 사용되는 항체의 숙주종 및 형광색의 제약, 짧은 서열 구간에서의 다양한 형광색 표지로 인해 발생하는 입체 장애를 해소함으로써 조합적인 번역 후 변형 코드의 단일 분자 프로파일을 정량적으로 분석할 수 있는 직접적이고 강력한 방법을 제공하고자 하였다.

이를 위하여 본 발명에서는 SiMBlot 분석에서와 같이 표적 단백질을 이미징 기판 표면에 고정하고 부위 특이적 번역 후 변형에 특이적으로 결합하는 1차 항체로 프로빙한 후 형광 표지된 2차 항체로 표지하는 단계(도 1a 좌측), 부위 특이적 번역 후 변형 항체로 면역 형광에 의해 프로빙 된 기준 마커와 부위 특이적 번역 후 변형 단백질들에 대한 정보를 분리된 채널에서 수집하는 단계(도 1a 중간), 이미징 기판 표면에 고정된 단백질(항원)에는 영향 없이 소거 완충액을 이용하여 면역 형광 항체만을 완전히 제거하여 이미징 기판 표면에 고정된 단백질이 다른 부위 특이적 번역 후 변형 항체로 프로빙 및 형광 표지되도록 초기화하는 단계(도 1a 우측)를 포함하는 신규한 단분자 단백질의 번역 후 변형을 검출하는 방법을 고안하였다.

본 발명에서는 N 번의 순차적 사이클을 통하여 각 부위 특이적 번역 후 변형이 존재하는지 여부를 확인할 수 있고, 기판 상의 동일 위치에 기반한 단분자 표본에 대하여 N 개의 하위 이미지 데이터 집단을 도출하여(도 1b), 이들 데이터로부터 N 개의 부위 특이적 변형으로 구성된 단백질 단분자의 조합적인 번역 후 변형 프로파일을 생성할 수 있다(도 1c). 예를 들어, 프로빙/이미징 사이클이 10번 반복되면 개별 단백질 분자 내에서 10개 부위에서의 번역 후 변형의 유무를 확인할 수 있으며, 인산화의 경우 이는 2¹⁰(1,204)개의 이원화된 인산화 코드의 분석이 가능하다.

그러나 본 발명에 의해 단분자 단백질의 다중 번역 후 변형을 정확하게 분석하기 위해서는 다음과 같은 기술적 난제를 해결하여야 하는데, (i) 사이클을 반복하면서 이전 사이클의 정보가 다음 사이클로 넘어가는 것을 방지하여야 하고, (ii) 프로빙/이미징/소거 단계를 반복하면서 표적 단백질이 기판에 안정적으로 고정될 수 있어야 하며, (iii) 위음성의 결과를 피할 수 있을 만큼 모든 항체가 항원을 검출할 수 있는 능력이 신뢰할 수 있는 수준 이상이어야 한다.

본 발명에서는 상기와 같은 기술적 난제를 하기와 같은 방법으로 극복하였다. 우선 사이클을 반복하면서 이전 사이클의 정보가 다음 사이클로 넘어가는 것을 방지하기 위하여 최적의 소거 완충액 조성을 개발하였고, 프로빙/이미징/소거 단계를 반복하면서 표적 단백질이 기판에 안정적으로 고정될 수 있도록 하기 위하여 클릭 화학법을 도입하였으며, 항원에 대한 검출률이 낮은 항체의 경우 프로빙/이미징/소거 사이클을 반복하며 이미지를 누적하고 통합하여 검출률을 신뢰 가능한 수준으로 향상시켰다.

본 발명에 있어서, 소거 완충액은 50~200 mM Glycine, 1~3% SDS, pH 1~5로 구성될 수 있는데, 상기 조성의 소거 완충액은 항체가 결합된 단백질에 단순 노출시키는 것으로도 항체를 단백질에서 효과적으로 분리할 수 있다. 이는 기판에 고정된 단백질이 접힘이 펼쳐진 선형의 형태로 변성되어 있어 항체와 결합하여도 큰 침전물을 형성하지 않기 때문이며, 따라서 본 발명에서 사용한 조성의 소거 완충액에 의해 항원-항체 복합체를 포함한 단백질-단백질 복합체는 쉽게 분리될 수 있다.

본 발명에 있어서 표적 단백질은 기판에 안정적으로 고정되어야 하며, 이를 위하여 본 발명에서는 클릭 화학법에 의해 표적 단백질을 기판에 고정하도록 하였다. 기판에 생체 분자를 고정하기 위하여 가장 널리 사용되는 방법은 Bt-NA 결합 이지만, Bt-NA 결합은 리간드-단백질 결합이기 때문에 본 발명에 적용하는 경우 사이클을 반복하면서 단백질이 기판에서 분리되어 소실되는 문제점이 발생하였다. 이에 본 발명에서는 코퍼-프리 클릭 화학법의 일종인 SPAAC(strain-promoted azide-alkyne cycloaddition) 반응을 도입하였다. SPAAC 반응에 의해 형성된 안정한 공유 결합인 트리아졸 결합(triazole linkage)은 기판에 표적 단백질을 고도로 선택적이고도 영구적으로 고정시킬 수 있었으며, 이후 반복적인 소거 반응에서도 충분히 표적 단백질이 기판 표면에 안정적으로 고정되는 것으로 나타났다.

한편, 일부 항원에 대한 항체의 낮은 검출율은 본 발명의 신뢰도를 심각하게 훼손할 수 있어, 낮은 항원 검출률을 나타내는 항체의 신뢰도를 일정 수준 이상으로 상향 조절할 수 있는 방법을 고안하고자 하였다. 항-HA 항체는 항원 HA에 대해 낮은 검출율을 나타내는데, HA 항원에 대해 항-HA 항체를 이용하여 프로빙/이미징/소거 사이클의 반복적이고 가역적인 표지를 통하여 이미지 데이터 세트를 누적 탐지하는 실험적 전략을 수립하였다. 이 접근법은 누적 감지율 (Tn = 1- (1-Rd) n, n은 누적 사이클 수, 그림 9e)에 대한 이론적 시뮬레이션에 의해 추정된 바와 같이 항원 검출률을 현저히 향상시킬 수 있었으며, 실제로, 6회의 프로빙/이미징/소거 사이클을 통한 항-HA 항체의 항원 검출율은 실험값와 이론값 사이의 상관계수가 1에 매우 근접한 상관 계수(r = 0.999)를 나타내며 74.63 % ± 3.71 %에 이르렀고, 이는 다중 사이클 이미지를 통한 누적적 검출이 항체들 사이의 불완전한 검출률을 보상할 수 있었다.

이처럼, 본 발명에서는 소거 완충액을 사용하여 표적 단백질의 프로빙에 사용된 프로브들을 깨끗하게 제거하면서도 표적 단백질이 반복적인 사이클을 진행하는 과정에서 기판 표면에 안정적으로 고정될 수 있도록 하였고, 이와 더불어 검출률이 낮은 일부 항체의 검출률을 일정 수준 이상으로 향상시킬 수 있는 방법을 제공함으로써 본 발명의 신뢰도를 향상시킬 수 있었다.

본 발명은 단분자 단백질의 다중 부위 번역 후 변형을 검출하고, 더 나아가 개별 단백질 분자의 다중 부위 번역 후 변형에 대한 조합 코드를 제공하는 것을 목적으로 한다. 이와 관련하여 본 발명에서는 in vitro 자가인산화에 의한 EGFR의 다중 부위 인산화 조합 코드를 생성하였다. γEGFR을 기판에 클릭 화학법으로 고정한 후, 2,500개 이상의 자가인산화된 γEGFR 분자에 대해 6개의 부위 특이적 인산화-항체(pTyr845, pTyr992, pTyr998, pTyr1068, pTyr1082, pTyr1173)를 이용하여 63(2⁶-1)개의 조합적인 인산화 코드를 분석한 결과, 6개의 인산화 부위가 모두 인산화된 γEGFR가 가장 많은 인산화 형태인 것으로 확인되었다. 이는 면역 블라팅을 통해 확인한 결과와 일치하는 결과였으며, 본 발명에서는 인산화-화학량적 분포를 분석하여 in vitro 자가인산화 과정에서 모노 인산화된 형태의 비율을 99.00 % ± 0.96 %에서 22.46 % ± 2.00 %로 현저히 감소되고, 다중 인산화된 형태의 비율은 1.00 % ± 0.96 % 에서 77.54 % ± 2.00 %로 현저히 증가되는 것까지 확인할 수 있어, 본 발명이 종래 방법에 비해 종래에는 명확히 확인할 수 없었던 개별 단백질 분자의 다중 부위에서의 번역 후 변형 코드를 직접적이고 정량적으로 분석할 수 있어 종래 기술을 효과적으로 대체할 수 있는 기술임을 확인하게 되었다.

In vivo 상에서 단백질의 번역 후 변형은 다양한 외부 환경 자극에 대응하여 신속하게 반응할 수 있는 역할을 하며, 따라서 in vivo 에서 단백질의 번역 후 변형을 정확히 파악하는 것은 조직 특이적 또는 외부 자극에 대한 세포 내 신호 전달의 조절에 대한 이해와 함께 임상 생물학 자료 및 정밀 의학의 분자 진단에 도움이 될 수 있다. 또한, in vivo에서 단백질의 번역 후 변형을 조합 코드로 제공하는 경우 세포 대 세포 변이의 측정의 도구로까지 확장될 수 있다. 이에 본 발명에서는 in vivo 상에서 외부 환경 자극에 따른 반응으로 발생하는 단백질의 조합적인 번역 후 변형 코드의 변화를 분석해 보았다.

앞서 살펴본 바와 같이, in vitro 자가인산화 γEGFR에 있어서는 모든 인산화 부위가 인산화된 γEGFR이 γEGFR의 인산화 형태 중 대다수를 차지하는 것으로 나타났는데, 이는 in vitro에서는 포스파타아제에 의한 탈인산화 반응이 일어나지 않아 자가인산화에 의한 티로신 인산화가 축적됨으로써 EGFR은 완전히 인산화된 형태로 존재하는 것이다. 한편, 세포 내에서 리간드에 대한 반응에 따른 EGFR의 인산화는 세포 내의 포스파타아제(phosphatase)의 강력한 활성으로 매우 짧은 반감기를 갖는 것으로 알려져 있다. 세포 내에서 EGFR 인산화의 축적을 방지하기 위한 포스파타아제(phosphatase)의 활성에 따라 모노 인산화된 EGFR이 존재하는지 실험적으로 확인하기 위하여, 살아있는 세포에 EGF 및/또는 pervanadate를 처리하고 EGFR의 조합적인 인산화 코드를 분석하기 위하여 본 발명에서 제시하는 방법에 따라 분석을 진행하였다. 다중 부위 특이적 항-인산화 항체로는 EGFR의 pThr669, pTyr845, pTyr992, pTyr998, pTyr1068, pTyr1082 및 pTyr1173 부위 특이적으로 결합하는 항체를 사용하였는데, 전체 티로신 인산화 수준과 각 부위 특이적 인산화 수준은 EGF 및/또는 pervanadate 처리에 따라 유의미하게 증가하였으며, 이는 면역 블라팅 분석 결과와 일치하는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 본 발명이 기존의 앙상블-평균 측정 방법인 면역 블라팅 방법을 대체할 수 있는 방법임을 시사한다.

종래 생화학적 분석 방법에 따르면 티로신 키나아제 수용체는 리간드에 반응하여 다중적인 인산화가 일어나는 것으로 알려져 있었으나, 최근에는 이와 다른 연구 결과가 발표되고 있다. 이와 관련하여, 본 발명에서는 기준 마커의 데이터 세트를 가이드로 하여 부위 특이적 면역 형광 표지를 갖는 7개의 이미지 데이터 세트를 등록하고, 10,000개 이상의 γEGFR 분자를 분석하여 개별 인산화된 γEGFR 단백질에서 가능한 조합적인 인산화에 상응하는 127(2⁷-1)개의 이진법 코드의 분자 비율을 정량화하였다. 그 결과, γEGFR 단백질 분자의 조합적인 번역 후 변형 분포가 주로 모노 인산화된 코드로 강하게 편향되어 있는 것으로 확인되었으며(NT : 94.41 % ± 0.86 %, EGF : 94.45 % ± 0.92 %, 도 15d), 이러한 결과로부터 EGF에 의해 EGFR이 세포막에서 다중 인산화되지는 않는다는 최근 결과를 검증할 수 있었다. 또한, EGF 단독 처리에 의해 다중 인산화된 EGFR 형태의 비율은 5.59% ± 0.86%이었으나, pervanadate 처리에 따라 EGF를 처리하지 않는 경우 및 처리한 경우 각각 8.26 % ± 0.95 % 또는 13.92 % ± 0.96 % 로 증가하는 것으로 나타났다(도 15d). 이와 더불어 EGF 처리 유무에 관계없이 pervanadate 처리에 따라 EGFR의 부위 특이적 인산화 중 모든 다중 인산화 비율이 증가하는 것으로 나타났다(도 18, 및 도 15e). 특히, EGF와 pervanadate를 함께 처리한 경우, EGFR 탈인산화를 위한 SHP1 포스파타아제를 불러오는 위치인 EGFR의 pY1173의 다중 인산화 비율이 pervanadate를 단독 처리한 것에 비해 2배까지 현저히 증가하였다. 그러나 비록 각각의 부위 특이적 인산화 레벨은 증가하였을지라도(도 15c), 대부분의 비율은 EGF 단독 처리에 의해 다소 감소하였다(도 15e). 이와 같은 결과는 in vitro 에서와 같이 탈인산화를 억제하는 것에 의해 개별 EGFR 분자의 인산화 축적을 가능하게 하는 세포 내 포스파타아제 활성이 억제되는 효과에 기인하는 결과로 보인다.

이처럼 본 발명은 EGFR의 조합적인 인산화 코드의 분석에 따라 종래의 분석법으로는 확인할 수 없었던 살아있는 세포 내에서 키나아제와 포스파타아제 사이의 균형에 따라 EGFR의 리간드에 의한 조합적인 인산화 패턴이 조절되는 양상을 정확히 분석할 수 있는 효과가 있다(도 19).

본 발명에서는 생리학적으로 발생하는 조합적인 번역 후 변형 중 리간드에 의해 유도되는 EGFR의 인산화 코드만을 분석하였으나, 본 발명에서는 친화성 정제, in vitro SNAP-태그 표지 등과 같은 실험과정 전반에 걸쳐 활용할 수 있는 생화학적 공정을 확실하게 수립하여, 인산화 이외의 다른 조합적인 번역 후 변형 코드의 분석에 적합하고, 기존에 없던 개별 신호 분자 내의 조합적인 부위 특이적 번역 후 변형을 직접적으로 시각화하여 확인할 수 있는 방법을 제공하는 효과가 있다.

본 발명은 일 관점에서 표적 단백질의 다중 번역 후 변형을 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 상기 방법은, (a) 기판 표면에 표적 단백질을 고정하는 단계; (b) 고정된 표적 단백질을 표적 단백질의 특정 번역 후 변형(post-translational modification) 부위에 특이적으로 결합하는 프로브와 반응시키는 단계; (c) 프로브와의 반응 정보를 수득하는 단계; (d) 표적 단백질과 결합한 프로브를 표적 단백질로부터 제거하는 단계;를 포함하고, 상기 (b) 내지 (d) 단계를 순환적으로 반복하되, 표적 단백질의 서로 상이한 N개의 번역 후 변형을 검출하기 위하여 상기 번역 후 변형을 특이적으로 검출하는 N개의 프로브와 반응시키는 것을 특징으로 한다. 여기서 N은 표적 단백질에서 검출하고자 하는 번역 후 변형 부위의 개수로, 일반적으로 N은 2 내지 20의 자연수이나, 이에 한정되지는 않으며, 검출하고자 하는 번역 후 변형 부위의 개수가 증가함에 따라 함께 증가할 수 있다. 한편, 상기 (b) 내지 (d) 단계는 서로 상이한 N개의 번역 후 변형을 검출하기 위하여 N회 순환적으로 반복하되 N번째 순환 사이클에서는 (d) 단계가 생략될 수 있을 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 표적 단백질은 기판 표면에 공유결합으로 고정할 수 있다. 상기 표적 단백질은 클릭 화학법(click chemistry)에 의해 기판 표면에 공유결합 할 수 있으며, 상기 클릭 화학법(click chemistry)은 코퍼-프리 클릭 화학법(copper-free click chemistry)일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 표적 단백질은 SPAAC(strain-promoted azide-alkyne cycloaddition) 반응, SPANC (streain-promoted zlkyne-nitrone cycloaddition) 반응 및 알켄(alkene)-테트라아진(tetrazine) 클릭 반응으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 반응에 의해 기판 표면에 공유결합 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 공유결합은 트리아졸 결합(triazole linkage)일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 표적 단백질은 단분자 단백질이 서로 동일하거나 상이한 번역 후 변형된 형태로 기판 위에 다수개 고정될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프로브는 형광 표지된 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 반응 정보는 형광 이미지 정보인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계는 소거 완충액을 이용하여 프로브를 제거하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 프로브는 항체 또는 프로브일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프로브가 항체인 경우, 상기 소거 완충액은 50~200 mM Glycine 및 1~3% SDS를 포함하고, pH가 1~5인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프로브가 압타머인 경우, 상기 소거 완충액은 10~500 unit/μL 의 뉴클레아제를 포함하는 PBS인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 표적 단백질은 EGFR, 인슐린 수용체, Erk, STAT, RNA 중합효소, 히스톤 및 p53로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지는 않으며, SNAP과 같은 통상적인 유전공학적 방법을 통해 선별 분리가 가능한 모든 단백질에 적용이 가능할 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 번역 후 변형은 인산화, 메틸화, 아세틸화, 글라이코실화, 유비퀴틴화, 술포닐화 및 미리스톨화로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

한편, 본 발명은 (a) 기판 표면에 표적 단백질을 고정하는 단계; (b) 고정된 표적 단백질을 표적 단백질의 특정 번역 후 변형(post-translational modification) 부위에 특이적으로 결합하는 프로브와 반응시키는 단계; (c) 프로브와의 반응 정보를 수득하는 단계; (d) 표적 단백질과 결합한 프로브를 표적 단백질로부터 제거하는 단계;를 포함하는 방법으로 제공할 수 있으며, 이와 같은 방법은 표적 단백질의 단일 번역 후 변형을 검출하는 목적으로 활용될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명은 다른 관점에서 표적 단백질에 대한 프로브의 검출율을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 방법은 (a) 기판 표면에 표적 단백질을 고정하는 단계; (b) 고정된 표적 단백질을 표적 단백질의 특정 번역 후 변형(post-translational modification) 부위에 특이적으로 결합하는 프로브와 반응시키는 단계; (c) 프로브와의 반응 정보를 수득하는 단계; (d) 표적 단백질과 결합한 프로브를 표적 단백질로부터 제거하는 단계; (e) 고정된 표적 단백질을 상기 프로브와 다시 반응시키는 단계; (f) (e) 단계의 프로브와의 반응 정보를 수득하는 단계; 및 (g) 상기 수득된 반응 정보들을 통합하는 단계를 포함하되, 상기 (b) 내지 (d) 단계는 1 내지 10회 반복되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 표적 단백질이 공유결합으로 고정된 기판, 표적 단백질의 번역 후 변형에 특이적으로 결합하는 프로브 및 소거 완충액을 포함하는 표적 단백질의 다중 번역 후 변형 분석용 키트에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 표적 단백질은 EGFR이고, 상기 프로브는 EGFR의 인산화된 Tyr845, Tyr992, Tyr998, Tyr1068, Tyr1086 및 Tyr1173에 특이적으로 결합하는 프로브 중 선택되는 2 이상의 프로브일 수 있다.

본 발명에 있어서, 표적 단백질은 EGFR에 한정되지 않으며, 인산화, 메틸화, 아세틸화, 글라이코실화, 유비퀴틴화, 술포닐화 및 미리스톨화 등 번역 후 변형 부위가 있는 모든 표적 단백질의 다중 번역 후 변형 분석용 키트의 제조가 가능할 것이다. 본 발명에 있어서, 상기 표적 단백질은 인슐린 수용체, Erk, STAT, RNA 중합효소, 히스톤 및 p53로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 상술한 바와 같이 번역 후 변형 부위가 있는 모든 표적 단백질에 적용이 가능하여, 상기 단백질에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 키트의 기술적 특징은 표적 단백질의 인산화, 메틸화, 아세틸화, 글라이코실화, 유비퀴틴화, 술포닐화 및 미리스톨화 등과 같은 번역 후 변형 부위에 특이적으로 결합하는 프로브를 2종 이상 포함하고 있으며, 따라서 표적 단백질의 다중 번역 후 변형을 검출할 수 있는 키트를 제공함에 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프로브는 항체 또는 압타머일 수 있으며, 상기 프로브가 항체인 경우, 상기 소거 완충액은 50~200 mM Glycine 및 1~3% SDS를 포함하고, pH가 1~5인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 프로브가 압타머인 경우, 상기 소거 완충액은 10 ~ 500 unit/μL의 뉴클레아제를 포함하는 PBS인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 표적 단백질의 다중 번역 후 변형을 검출하는 방법을 이용하여 세포 내 단분자 단백질의 다중 번역 후 변형을 검출하는 단계; 및 (b) 다중 번역 후 변형을 부위별로 코드화 하여 조합 코드 정보를 제공하는 단계;를 포함하는 단분자 단백질의 다중 번역 후 변형 조합 코드 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 정보는 조직 또는 자극에 따라 차별화된 조합 코드 정보인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 표적 단백질의 다중 번역 후 변형을 검출하는 방법을 이용하여 시료 내 단분자 단백질의 다중 번역 후 변형을 검출하는 단계; (b) (a) 단계에서 검출된 정보를 단분자 단백질의 다중 번역 후 변형 조합 코드 정보와 비교하는 단계; 및 (c) (a) 단계의 정보와 동일한 단분자 단백질의 다중 번역 후 변형 조합 코드 정보를 기초로 시료가 채취된 조직 또는 시료에 가해진 자극을 판별하는 단계;를 포함하는 단분자 단백질의 다중 번역 후 변형에 기초한 시료 판별 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서 "프로브"란 표적 단백질에 특이적 결합을 이루는 물질로, 대표적으로는 항체 또는 압타머의 형태로 제작될 수 있다. 상기 프로브는 고체 지지체(기판)에 고정될 수 있는데, 여기서, "기판"은 물질, 구조, 표면 또는 재료, 비생물학적이고, 합성되고, 무생물, 평면, 구형 또는 특이적 결합, 평편한 표면의 물질을 포함하는 혼합물 수단으로, 혼성화 또는 효소 인식 부위 또는 대다수의 다른 인식 부위 또는 표면, 구조 또는 재료로 구성된 수많은 다른 분자 종을 넘어서는 수많은 다른 인식 부위를 포함할 수 있다. 상기 기질은 예를 들면, 반도체, (유기)합성 메 탈, 합성 반도체, 인슐레이터 및 도판트; 금속, 합금, 원소, 화합물 및 미네랄; 합성되고, 분해되며, 에칭되고, 리소그라프되며, 프린트되고 마이크로패브리케이트된 슬라이드, 장치, 구조 및 표면; 산업적, 폴리머, 플라스틱, 멤브레인, 실리콘, 실리케이트, 유리, 금속 및 세라믹; 나무, 종이, 카드보드, 면, 울, 천, 직조 및 비직조 섬유, 재료 및 패브릭일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 항체란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명에 사용되는 항체는 단클론 또는 다클론 항체, 면역학적으로 활성인 단편(예를 들어, Fab 또는 (Fab)2 단편), 항체 중쇄, 인간화 항체, 항체 경쇄, 유전자 조작된 단일쇄 Fν 분자, 키메릭 항체 등일 수 있다.

본 발명에 있어서, 압타머란 높은 친화성으로 표적 단백질을 특이적으로 인지할 수 있는 작은 단일가닥 올리고 핵산을 말한다.

상기에서 프로브는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있도록 표지할 수 있으며, 이를 통해 항원-항체 복합체의 형성 또는 표적 단백질과 압타머의 결합을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하는데, 이의 예로는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 등이 있다. 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글루코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있다. 형광물로는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있다. 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있고 레독스 분자로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 다이이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있다. 방사성 동위원소로는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있는 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 재료 준비 및 실험 방법

1-1. 항체 및 시약

EGFR, phospho-EGFR (pThr669, pTyr1068 및 pTyr1173) 및 phospho-Erk에 대한 항체는 Cell Signaling Technology (Cat # 2239, # 3056, # 2236, # 4407 및 # 9101), 단일클론 항-pTyr845 EGFR 항체 및 원심 분리 필터 유닛은 Millipore (Cat. # 04-283, # UFC503024), 단일클론 항-β-액틴 항체는 MP Biomedicals (Cat. # 08691001), 형광 표지된 2차 항체와 Lipofectamine은 Invitrogen Life Technology (카탈로그 # A21110, # A11001, # A11034, # A21424, # A21429 및 # 18324), 재조합 인간 EGF는 R & D Systems (Cat. # 236-EG)에서, Sulfo-NHS-DBCO와 NHS-PEG13-DBCO는 Click Chemistry Tools (Cat. # A124, # 1015), 항-FLAG M2 친화성 겔, 3XFLAG 펩타이드, HA 펩타이드 및 Phosphatase Inhibitor Cocktails 2 & 3는 Sigma-Aldrich (카탈로그 # A2220, # F4799, # I2149, # 5726 및 # P0044)에서 구입하여 사용하였다.

1-2. 세포 배양 및 트랜스펙션

COS7 세포는 10%(v/v) FBS가 첨가된 DMEM (Dulbecco Modified Eagle 's Medium)을 이용하여 CO₂(5 %) 제어 배양기로 37℃에서 배양하였다. 재조합 단백질의 트랜스펙션 및 일시적인 발현을 위해, 상기 세포를 Lipofectamine을 사용하여 γEGFR을 코딩하는 플라스미드로 트랜스펙션 하였고, 추가 48 시간 동안 배양하여 γEGFR의 이소성 발현을 유도하였다.

1-3. 플라스미드

eGFP의 상응하는 cDNA 서열을 pcDNA 3.1 myc / his 벡터 (Invitrogen)의 XbaI / AgeI 부위에 삽입하여 C- 말단에 Flag- 표지된 eGFP를 코딩하는 플라스미드를 제작하였다. C- 말단에 FLAG- 표지된 eGFP를 코딩하는 삽입된 DNA 단편은 벡터 pEGFP-C1 (Clontech Laboratory Inc.)을 주형으로 하기 프라이머 세트를 이용하여 PCR에 의해 제작하였다.

순방향 프라이머: 5'-GCTCTAGAGGAGGGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3 '(서열번호 1)

역방향 프라이머: 5'-CACCGGTTCACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCCTTGTACAGCTCGTC-3'(서열번호 2)

WT 구조체는 pcDNA3.1 eGFP-FLAG의 NotI / XbaI 부위에 정지 코돈이 없는 전장 EGFR의 cDNA 서열(NCBI Gene ID: 1956, NP_005219.2) 을 N- 말단을 삽입함으로써 클로닝되었다. EGFR의 신호 펩타이드(Signal Peptide)와 막 단백질 서열(Membrane Protein Sequence) 사이에 2개의 제한 효소 부위 (AscI 및 SacII)를 삽입하기 위해, 2개의 제한효소 부위를 갖는 N-말단 신호 펩타이드 또는 C-말단 막 단백질 서열을 인코딩하는 2개의 DNA 단편을 pcDNA3.1 EGFR WT-eGFP-FLAG를 주형으로 하기 프라이머 세트를 이용하여 PCR에 의해 제작하였다.

N- 말단 신호 펩타이드 서열

순방향 프라이머: 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'(서열번호 3)

역방향 프라이머(SacII/AscI): 5'-CCGCGGTTGGCGCGCCAGCCCGACTCGCCGGGCAGAG-3'(서열번호 4)

C- 말단 막 단백질 서열

순방향 프라이머(AscI/SacII): 5'-GGCGCGCCAACCGCGGCTGGAGGAAAAGAAAGTTTGC-3 '(서열번호 5)

역방향 프라이머(XbaI): 5'-GCTCTAGATGCTCCAATAAATTCACTGC-3'(서열번호 6)

EGFR WT (AscI/SacII)를 코딩하는 DNA 단편은 상기 두 개의 DNA 단편을 주형으로 하기 프라이머를 이용하여 오버랩핑 PCR로 제작하였다.

순방향 프라이머: 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'(서열번호 7)

역방향 프라이머: 5'-GC TCTAGA TGCTCCAATAAATTCACTGCT-3'(서열번호 8)

EGFR WT-eGFP-FLAG (AscI / SacII) 구조체는 상기 통합된 DNA 단편을 pcDNA3.1 eGFP-FLAG의 NotI / XbaI 부위에 삽입하여 클로닝하였다.

N-말단 SNAP-태그 EGFR WT-eGFP-FLAG 구조체는 변형된 EGFR WT-eGFP-Flag 구조체의 AscI / SacII 부위에 SNAP- 태그를 코딩하는 cDNA 서열을 삽입하여 제작하였다. SNAP- 태그 DNA 단편은 pSNAPf (NEB) 벡터를 주형으로 하기 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 준비되었다.

순방향 프라이머: 5'-GGCGCGCCACATCATCACCATCACCATATGGACAAAGACTGCGAAATG-3 '(서열번호 9)

역방향 프라이머: 5'-TCCCCGCGGCCCTCCACTCCCACTACCCAGCCCAGGCTTGCCCAG-3 '(서열번호 10)

1-4. BG- PEG ₁₃ - DBCO의 합성

아르곤 분위기하에, 건조 DMF 0.7 ml에 O⁶- [4- (아미노메틸) 벤질] 구아닌 (Matrix Scientific, 2.7 mg, 0.01 mmol)을 현탁시킨 후, 건조 DMF 0.3ml에 트리메틸아민 (10 ㎕) 및 DBCO-PEG13-NHS(Click Chemistry Tools, 10 ㎎, 0.01 mmol)를 현탁시켜 첨가하였다. 실온에서 24시간 동안 교반한 후, 생성물을 HPLC로 정제하였다. 정제된 화합물을 감압하에 건조시켜 BG-PEG₁₃-DBCO (5.5 mg, 47 %)를 수득하였다. MS(ESI): [M+H⁺]에 대한 m/z, 계산값: 1201.6027; 측정값:1201.76

1-5. DBCO -접합 HA 펩타이드의 합성

인플루엔자 헤마글루티닌 (HA) 펩타이드 (Sigma-Aldrich, 0.1 ㎎, 0.09 ㎛ol)를 아르곤 분위기하에 건조 DMF 0.2 ㎖에 현탁시키고, 건조 DMF 0.1 ㎖에 트리메틸아민 (2 ㎕) 및 DBCO-PEG₄-NHS (Click Chemistry Tools, 1 mg, 1.54 μmol)를 현탁시켜 첨가하였다. 실온에서 24시간 동안 교반한 후, 생성물을 HPLC로 정제하였다. 정제된 화합물을 감압하에 건조시켜 DBCO-PEG-HA 펩타이드 (0.05 ㎎, 47 %)를 수득 하였다. MS(ESI):[M+H⁺]에 대한 m/z, 계산값: 1636.7094; 측정값: 1636.35.

1-6. DBCO - 및 염료- 결합된 단백질의 제조

Alexa Fluor 488- 표지된 항 - 햄스터 염소 IgG (Invitrogen, 0.2mg) 또는 소 혈청 알부민 (Invitrogen, # A13100, 0.2mg)을 0.3ml PBS에 현탁시켰다. DBCO-PEG₄-NHS (Click Chemistry Tools, 0.1mg)를 0.2ml PBS에 현탁시켰다. 실온에서 1 시간 동안 교반한 후, 생성물을 원심분리 필터(Millipore, 30 kDa cut off)를 사용하여 다이아필트레이션(diafiltration)으로 정제하여 형광 이미징을 촬영하거나 면역 블라팅을 진행하였다.

1-7. In vitro 자가 인산화 EGFR의 제조

γEGFR을 이소성 발현하는 COS7 세포를 12시간 동안 혈청없는 배지에서 배양하였다. Sulfo-NHS-DBCO로 세포 표면 단백질을 표지하고 10 μM AG1478을 함유하는 용해 완충액(lysis buffer)을 사용하여 세포를 용해 시킨 후, γEGFR을 항-FLAG M2- 결합된 아가로오스를 사용하여 친화성-정제하였다. 용해 완충액 (AG1478-free)으로 3회 세척하고, 키나아제 완충액(25 mM HEPES, pH 7.4, 20 mM MgCl₂, 5 mM β- 글리세로포스페이트, 0.5 mM 디티오트레이톨 및 0.1 mM 나트륨 오르토바나데이트)으로 2 회 세척하였다. 면역침강물은 4℃에서 30분 동안 0.1 mg/ml 3X FLAG 펩타이드를 이용하여 비드에서 용출시켰다. 정제된 γEGFR은 30℃에서 1시간 동안 쉐이킹하였다. EGFR은 키나아제 완충액에서 제조된 100ng/ml EGF와 0.1mM ATP를 첨가하여 활성화하였다. 제조된 샘플로 형광 이미징을 촬영하거나 면역 블라팅을 진행하였다.

1-8. 세포로부터 EGFR 단백질의 제조

γEGFR을 이소성 발현하는 COS7 세포를 12시간 동안 혈청 없는 배지에서 배양하였다. 세포를 EGF와 같은 리간드로 37℃에서 10분간 처리하고, 차가운 PBS로 세척하였다. 세포를 용해 완충액(50mM HEPES, pH 7.4, 150mM NaCl, 5mM MgCl₂, 1mM EDTA, 5% 글리세롤, 1% NP-40, 10μM AG1478 및 포스파타제 억제제 칵테일)을 이용하여 음파파쇄(sonication)하고, 세포 용해물을 4℃에서 13,500 rpm으로 10분간 원심분리 하였다. 상청액으로부터 γEGFR을 항-FLAG M2- 결합된 아가로오스를 사용하여 친화성-정제하고, 이어서 용해 완충액 (AG1478-free)으로 3회 세척하고 PBS로 1 회 세척하였다. 면역침강물은 30℃에서 30분간 BG 유도체 (BG-PEG13-DBCO)로 표지하고, 차가운 PBS로 4회 세척하였다. 면역침강물은 실온에서 30분 동안 0.1 mg/ml 3X FLAG 펩타이드를 이용하여 비드로부터 용출시켰다. 제조된 샘플로 형광 이미징을 촬영하거나 면역 블라팅을 진행하였다.

1-9. 플로우 챔버 및 단분자 고정화

커버 글라스를 H₂O 및 1M KOH로 2시간 이상 세척하여 세정한 후, 3-(2-아미노에틸아미노)-프로필트리메톡시실란 (Tokyo Chemical Industry Co., Cat. # A0774)으로 처리하고 azide-PEG (Laysan Bio, Inc., azide-PEG-COOH-5000) 또는 mPEG와 biotin-PEG (Laysan Bio, Inc., mPEG-SVA-5000, Biotin-PEG-SVA-5000)를 25:1(mPEG:biotin-PEG)의 질량비로 혼합한 혼합물을 처리하였다. 바이오틴 표면의 경우, 플로우 챔버를 NeutrAvidin (Thermo Scientific, Cat. # 31000)으로 코팅 하였다. 10분간 반응시킨 후, 이미징 기판 표면에 고정화하기 전, 시료를 연속 희석하여 이미징 기판 표면 상에 제대로 분리된 스팟을 얻을 수 있도록 하였다. 모든 희석은 PBS (0.1 mg/ml bovine serum albumin)를 이용하여 실험 직전 이루어졌다. 결합하지 않은 항체와 시료는 SB18 버퍼 (40mM HEPES, 105mM NaCl, 5mM KCl, 5 mM MgCl₂, 0.05% [vol/vol] Tween-20, 0.1 mg/ml bovine serum albumin, pH 8.0)를 이용하여 2번 세척함으로써 채널로부터 제거하였다. 각 채널은 1.0 mg/ml BSA(bovine serum albumin)가 첨가된 SB18로 블라킹하였다. 면역 형광 검출을 위하여, 고정화된 단백질 분자를 항원 단백질에 대한 1차 항체(13.3nM)로 10분간 반응시키고, 이미징 직전에 형광 염색-표지된 2차 항체(2.66nM)로 10분간 반응시켰다. 이미지를 수득한 후, 소거 버퍼(IgG elution buffer added with 2% SDS and adjusted pH 1.85)로 2회 세척하고 5분간 반응시켜 항체들을 채널로부터 제거시켰다. 재프로빙를 위하여 각 채널은 PBS로 3회 세척하여 중화시키고, 10mg/ml BSA를 첨가한 SB 18으로 블라킹하였다.

1-10. 단분자 이미징 분석

Objective-type TIRF 현미경 (Nikon Ti-E, Hamamatsu EM-CCD)을 사용하여 단분자 데이터를 수득하였다. eGFP 및 Alexa Fluor 488은 488 nm에서 여기되었고 Alexa Fluor 555는 532 nm에서 여기되었다. 채널 간의 크로스토크(crosstalk)을 피하기 위해 협대역통과 필터(Chroma)를 사용하였다. 모든 실험은 특별히 명시하지 않는 한 실온에서 수행되었다. 단일분자 분석은 Jaqaman, K. et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature methods 5, 695-702, doi:10.1038/nmeth.1237 (2008)에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 이미지(이미징 영역 3000 μm²) 당 평균 스팟 수와 표준 편차는 5개 이상의 다른 지역의 이미지로부터 계산되었다. 재표지된 다른 사이클에서 얻어진 이미지 간의 통합(colocalization)은 Jain, A. et al. Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down. Nature 473, 484-488, doi:10.1038/nature10016 (2011)을 참고하여 진행하였다. 이를 간단히 기술하면, Alexa Fluor 488을 기준 마커로 사용하고 Alexa Fluor 555를 사용하여 단일 폴리펩티드 분자에서 부위 특이 적 변이를 검출하기 위해 동일한 지역의 2개의 분리된 영상을 촬영하였다. 두 이미지에서 형광 스팟은 반 픽셀 정확도로 분자의 중심 위치를 결정하기 위하여 가우시안 프로파일로 조응하였다. 다음으로, 재프로빙을 통한 이미지들과의 X-Y 스테이지 상에 일치하지 형광 스팟들의 위치는 기준 마커의 위치를 이용하여 보정되었다. 중심이 3개의 픽셀(~300nm)의 거리 내에 있는 재프로빙된 이미지 사이의 형광 스팟은 중첩(colocalization) 스팟으로 결정되었다. 조합적인 PTM 코드의 비율은 중첩된 분자의 수를 형광 신호의 전체 수로 나누어 계산하였다.

1-11. 통계 분석

모든 데이터는 최소한 3 번의 독립적인 실험을 진행한 후, 이에 대한 평균 ± 표준 편차 또는 이를 대표하는 이미지로 제공하였다. 필요에 따라 Student 's t-test를 사용하여 통계적으로 데이터를 분석하였다.

실시예 2. 소거 완충액을 이용한 표적 단백질로부터의 항체 제거

본 발명은 기판 위에 표적 단백질을 고정시키고 프로빙/이미징/소거 사이클을 반복함으로써 표적 단백질의 다중 번역 후 변형을 검출하는 것을 목적으로 하는바, 이전 사이클의 이미지가 다음 사이클의 이미지에 재현되지 않아야 하고, 따라서 이전 사이클에서 표적 단백질에 결합한 프로브는 소거 단계에서 완전히 제거되어야 한다.

이에 본 발명에서는 표적 단백질에서 항체를 제거하는데 적합하다고 판단되는 소거 완충액 조성을 100mM Glycine, 2% SDS, pH1.85로 하여, 상기 소거 완충액을 사용하였을 때 표적 단백질에 결합한 항체가 깨끗하게 제거되는지 확인해 보았다. 이를 위하여, 기판에 in vitro에서 자가 인신화시킨 EGFR을 Bt-NA 결합시키고 이를 항-pTyr 1차 항체와 Alexa Fluor 555로 표지된 2차 항체를 사용하여 프로빙한 뒤, 소거 완충액을 5분간 상온에서 처리하였다. 그 결과, 도 2에서 볼 수 있듯이, 소거 완충액에 대한 짧은 노출만으로도 항체가 효과적으로 제거되는 것으로 나타났다.

실시예 3. 표적 단백질의 기판 고정 방법의 개선

기판에 생체 분자를 고정하기 위하여 Bt-NA 결합을 이용하는 것이 일반적이다. 그러나, 본 발명은 반복적인 프로빙/이미징/소거 사이클 과정에서도 표적 단백질이 안정되게 기판에 고정되어 있어야 하는바, 상기와 같은 고정 방법에 본 발명에 적합한지 확인해 보고자 하였다.

Bt-NA 결합에 의해 기판에 고정된 in vitro 자가인산화 된 γEGFR을 항 p-Tyr 1차 항체와 Alexa 555 항-마우스 2차 항체를 이용하여 6회의 프로빙/이미징/소거 사이클을 반복하며 형광 이미지를 관찰해 보았다. 그 결과, 프로빙/이미징/소거 사이클을 반복함에 따라 형광 신호가 점차적으로 약해지는 것으로 나타났다(도 3).

형광 신호가 약해지는 원인이 NeutrAvidin이 기판의 Biotin 표면에서 분리되기 때문인지, 단백질이 기판에서 분리되기 때문인지 추가로 확인해 보았다. Cy3-표지된 SA를 Bt-NA 표면에 고정시킨 경우 소거 완충액을 처리하여도 형광 신호가 감소하지 않았으나(도 4), NeutrAvidin 코팅된 기판에 Biotin-결합된 염소 IgG 단백질을 결합시킨 후, 형광 표지된 당나귀 항-염소 IgG 2차 항체로 프로빙하여 검출된 형광 신호가 소거 완충액을 처리하면 급격히 사라지는 것으로 나타난바(도 5), 이는 Bt-NA 결합된 단백질 분자가 기판에서 소실되는 결과로 판단되었다.

이에 본 발명에서는 반복적인 프로빙/이미징/소거 사이클에서도 단백질이 기판에 안정적으로 결합할 수 있는 새로운 결합 방법을 모색하고자 하였다. 반복적인 소거 과정에서 기판 표면에 단백질을 안정적으로 고정시키기 위하여, 코퍼-프리 클릭 화학법(copper-free click chemistry)의 일종인 SPAAC(strain-promoted azide-alkyne cycloaddition) 반응을 이용해 보았다. 이는 SPAAC 반응에 의해 형성된 안정된 공유결합인 트리아졸 결합(triazol linkage)이 기판 표면에 표적 단백질을 고도로 선택적이고 영구적으로 고정할 수 있다고 예상되었기 때문이다. 상기 반응을 유도하기 위하여 기판을 azide-terminal polyethylene glycol로 코팅하고 형광 표지된 IgG에 DBCO(dibenzocyclooctyl)를 결합시킨 후, 생체 직교 반응(bio-orthogonal reaction)을 진행하였다(도 6, 도 7). 그 결과, 형광 표지된 DBCO-결합 IgG는 SPAAC 반응에 의해 기판에 안정적으로 고정되었으며(도 7b), 소거 완충액에 10회 노출되는 동안 형광 신호(N _f = 1,310.67 ± 135.15)가 일정하게 유지되어, 상기 단백질이 기판에 안정적으로 고정되어 있음을 확인할 수 있었다(도 8).

한편, 항체에 의한 반복적인 프로빙/이미징/소거 반응에 의해서도 단백질이 기판 표면에 안정적으로 고정되어 있는지 확인해 보고자, DBCO가 결합된 토끼 IgG 단백질을 기판에 클릭 화학법으로 고정하고, 형광 표지된 항-토끼 IgG 2차 항체로 프로빙/이미징/소거 사이클을 진행하였다(도 9, 도 7c). 그 결과, Bt-NA 결합으로 고정된 단백질이 사이클이 반복됨에 따라 기판에서 소실되는 것과는 대조적으로, 클릭 화학법에 의해 고정된 단백질은 사이클이 반복되어도 기판에 안정적으로 고정되어 있음을 확인할 수 있었다(N _f =330.39 ± 28.06, 도 7d, 7e). 이와 같은 결과는 클릭 화학법에 의한 공유결합이 본 발명에서 기판에 표적 단백질을 고정하는 적합한 방법임을 나타낸다.

실시예 4. 항원 단백질에 대한 프로빙 / 이미징 /소거 사이클의 적용

앞서, 반복적인 소거 반응에서도 단백질을 기판에 안정적으로 고정시키는 방법을 모색해낸바, 이하에서는 본 발명을 다양한 분석 키트에 적용할 수 있도록 항원 단백질을 기판에 안정적으로 고정시킨 후, 1차 항체와 2차 항체를 이용하여 프로빙/이미징/소거 사이클을 반복해 보았다.

단일 항원 단백질로는 DBCO가 결합된 HA 펩타이드를 사용하였다. 기판에 HA를 결합시키기 위하여 NHS-PEG₄-DBCO를 HA 펩타이드의 N-말단 아민에 NHS 반응을 이용하여 결합시키고(도 10a), DBCO가 결합된 HA 펩타이드를 클릭 화학법을 이용하여 기판에 고정시켰다. 이후 항-HA 1차 항체와 Alexa Flour 555-표지된 2차 항체로 프로빙하고 이에 대한 형광 이미지를 수득한 뒤, 항체를 제거하는 소거 반응을 반복하여 진행하였다(도 10b). 그 결과, 각 사이클이 반복되어도 Alexa Fluor 555 신호는 일정하게 유지되었다(N _f = 422.19 ± 32.18, 도 10c). 또한 각 사이클을 반복하면서 1차 또는 2차 항체가 소거 반응에 의해 확실히 제거되는지 확인하기 위하여 최종(7회) 사이클에서 2차 항체만으로 형광 표지를 진행해 본 결과, 형광 신호가 매우 미미하게 나타났으며, 이를 통해 소거 반응에 의해 항체가 깨끗하게 제거되는 것을 확인할 수 있었다(도 10c). 이와 같은 결과는 본 발명이 지속적인 항체 또는 다색성 면역 형광 표지에 의한 입체 장애 가능성을 제거하였음을 나타낸다.

실시예 5. 검출률이 낮은 항체의 검출 신뢰도 개선

본 발명은 프로빙/이미징/소거의 단계로 이루어진 각 사이클에서 부위 특이적 번역 후 변형에 특이적으로 결합하는 서로 다른 항체를 이용하여 표적 단백질의 다중 부위 번역 후 변형을 검출하는 것을 하나의 목적으로 한다. 이와 같은 목적을 달성하기 위해서는 사용하는 모든 항체가 일정 수준 이상의 항원에 대한 검출률을 나타내어야 하나, 일부 항체의 경우 항원에 대한 검출률이 낮은 문제점이 있다. 예를 들어 본 발명에서 사용한 HA 항원 펩타이드에 대한 항-HA 항체는 검출률이 상대적으로 낮은 것으로 나타났는데, Alexa Fluor 488- 표지된 염소 IgG 단백질을 기판에 클릭 화학법으로 고정하고(도 6, 도 11) 이를 기준 마커로 하여 데이터 세트를 확보한 후, 실시예 4에서 기판에 고정한 HA 펩타이드에 대한 다중 사이클 형광 이미지 데이터 세트와 중첩시켜, 동일한 이미징 평면에서 멀티 사이클 데이터 세트 간 두 이미지의 동시 분석을 진행해 본 결과, 두 이미지 간의 쌍 중첩(pairwise colocalization) 비율(Rd = P (x | y), x, y는 서로 다른 사이클)은 27.08 % ± 3.15 %로 나타났으며, 이로부터 기준 마커에 비해 항-HA 항체가 상당히 낮은 검출률을 나타내는 것을 알 수 있었다(도 10d).

일부 항체에 대한 이와 같은 낮은 검출률은 본 발명의 신뢰도를 심각하게 손상시킬 수 있으므로, 검출률이 낮은 항체의 검출 신뢰도를 향상시킬 수 있는 방법을 모색하였다. 이를 위하여 동일 항원을 동일 항체로 반복적으로 가역 표지하고 이에 따라 발생한 이미지 데이터 세트를 누적 탐지하는 전략을 수립하였다. 이 방법에 의한 이론적 시뮬레이션에 의하면 누적 검출률 (Tn = 1- (1-Rd) n, n은 누적 사이클 수, 그림 10e)은 매우 높은 것으로 나타났는데, 실제로도 항-HA 항체를 사용하여 6회의 프로빙/이미징/소거 사이클을 반복하여 이를 누적해 본 결과, 실험적 검출률이 이론적 검출률에 매우 근접한 값을 나타내었으며(상관계수 (r = 0.999)) 검출률은 74.63 % ± 3.71 %에 이르러, 동일 항체로 프로빙/이미징/소거 사이클을 반복함으로써 항체의 낮은 항원 검출률을 보상할 수 있음을 확인하였다.

실시예 6. In vitro 자가인산화에 의한 EGFR 다중 부위 인산화의 판별

본 발명은 단분자 단백질의 다중 부위 번역 후 변형을 검출하고, 더 나아가 개별 단백질 분자의 다중 부위 번역 후 변형에 대한 조합 코드를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그 하나의 예로 본 발명에서는 in vitro 자가인산화에 의한 EGFR의 다중 부위 인산화 조합 코드를 생성해 보았다.

eGFP, SNAP, FLAG 표지한 in vitro 자가인산화된 재조합 EGFR을 항-FLAG 비드를 이용하여 친화성 정제하였다(도 12a). 정제된 γEGFR을 면역 블라팅해 본 결과, 모든 티로신 잔기는 완전히 인산화된 것으로 확인되었다(도 13).

본 발명의 방법에 의해 γEGFR의 인산화 정도를 확인해 보고자, 정제된 γEGFR의 SNAP-태그의 기질로 BG-PEG₁₃-DBCO를 합성하고, DBCO와 SANP-태그와의 비가역적 공유결합을 유도하였다(도 14). γEGFR을 기판 표면에 클릭 화학법으로 고정한 후, 6개의 부위 특이적 pTyr 항체(pTyr845, pTyr992, pTyr998, pTyr1068, pTyr1082, pTyr1173, 도 12b)를 이용하여, 2,500개 이상의 자가인산화된 γEGFR 분자를 분석하고(N _f = 526.8 ± 22.05), 각각의 가능한 조합적인 인산화 코드별로(합계: 2⁶-1 = 63, 이진법 코드) 정량화하였다(도 12c). 그 결과, 가능한 이진법의 인산화코드(도 12d)중 가장 많은 조합 코드는 6개의 인산화 부위가 모두 인산화된 γEGFR인 것으로 나타나(N _f = 92.60 ± 13.88, 17.58%) 면역 블라팅을 통해 확인한 결과와 일치하는 결과가 나타났으며, 각각 다른 이진법 코드의 평균 분자 수는 현저히 낮은 것으로 나타났다(N _f = 7.00 ± 6.90, 1.33 %). 또한, 인산화-화학량적 분포를 통해 in vitro 자가인산화 반응은 모노 인산화된 형태의 비율을 99.00 % ± 0.96 %에서 22.46 % ± 2.00 %로 현저히 감소시키고, 다중 인산화된 형태의 비율은 1.00 % ± 0.96 % 에서 77.54 % ± 2.00 %로 현저히 증가시키는 것을 알 수 있었다(도 12e). 이와 같은 결과를 통하여, 본 발명은 단백질의 다중 부위 번역 후 변형을 확인하던 종래 방법을 대체할 수 있으며, 정확한 정량적 분석까지 가능함을 알 수 있었다.

실시예 7. 외부 자극에 의한 in vivo EGFR 다중 부위 인산화의 판별

In vivo 상에서 단백질의 번역 후 변형은 다양한 외부 환경 자극에 대응하여 신속하게 반응할 수 있는 역할을 하며, 따라서 in vivo에서 단백질의 번역 후 변형을 정확히 파악하는 것은 조직 특이적 또는 외부 자극에 대한 세포 내 신호 전달의 조절에 대한 이해와 함께 임상 생물학 자료 및 정밀 의학의 분자 진단에 도움이 될 수 있다. 또한, 본 발명은 in vivo에서 단백질의 번역 후 변형의 조합 코드를 통하여 세포 대 세포 변이의 측정의 도구로 확장될 수 있다. 이에 본 발명의 분석 방법을 이용하여 in vivo 상에서 외부 환경 자극에 따른 반응으로 발생하는 단백질의 조합적인 번역 후 변형 코드의 변화를 분석해 보았다.

이를 간략히 설명하면, γEGFR을 이소성 발현시킨 COS7 세포를 12시간 동안 혈청 없는 배지에서 배양한 후, EGF(100ng/ml) 및/또는 pervanadate(1mM)를 10분 동안 처리하고, 친화성 정제 방법에 의해 세포 파쇄물에서 γEGFR를 정제하였다. γEGFR의 SNAP-태그에 BG 유도체(BG-PEG₁₃-DBCO)로 표지하고(도 15a), 클릭 화학법에 의해 기판에 고정시킨 뒤 항-pTyr 1차 항체 및 Alexa Fluor 555-표지된 2차 항체로 프로빙하였다(도 15b). 또한, 다중 부위 특이적 항-인산화 항체 세트(EGFR의 pThr669, pTyr845, pTyr992, pTyr998, pTyr1068, pTyr1082 및 pTyr1173, 도 15c)를 이용하여 각 항체별로 프로빙/이미징/소거 사이클을 진행하였다. 그 결과, 전체 티로신 인산화 수준과 각 부위 특이적 인산화 수준은 EGF 및/또는 pervanadate 처리에 따라 유의미하게 증가하여 면역 블라팅 분석 결과와 일치하는 것으로 나타났다(도 16). 따라서, 본 발명은 기존의 앙상블-평균 측정 방법인 면역 블라팅 방법을 대체할 수 있는 방법임을 확인할 수 있었다.

기준 마커의 데이터 세트를 가이드로 하여, 부위 특이적 면역 형광 표지를 갖는 7개의 이미지 데이터 세트를 등록하였다. 기판에 고정된 10,000개 이상의 γEGFR 분자를 분석하여 γEGFR 단백질에서 가능한 조합적인 인산화에 상응하는 127(2⁷-1)개의 이진법 코드를 도출하고, 각 코드에 해당하는 γEGFR 분자의 비율을 정량화하였다(도 17). 그 결과, γEGFR 단백질 분자의 조합적인 번역 후 변형 분포가 주로 모노 인산화된 코드로 강하게 편향되어 있는 것으로 확인되었으며(NT : 94.41 % ± 0.86 %, EGF : 94.45 % ± 0.92 %, 그림 15d). 또한, EGF 단독 처리에 의해 다중 인산화된 EGFR 형태의 비율은 5.59% ± 0.86%이었으나, pervanadate 처리에 따라 EGF를 처리하지 않는 경우 및 처리한 경우 각각 8.26 % ± 0.95 % 또는 13.92 % ± 0.96 % 로 증가하는 것으로 나타났다(도 15d). 이와 더불어 EGF 처리 유무에 관계없이 pervanadate 처리에 따라 EGFR의 부위 특이적 인산화 중 모든 다중 인산화 비율이 증가하는 것으로 나타났다(도 18, 및 도 15e). 특히, EGF와 pervanadate를 함께 처리한 경우, EGFR 탈인산화를 위한 SHP1 포스파타아제를 불러오는 위치인 EGFR의 pY1173의 다중 인산화 비율이 pervanadate를 단독 처리한 것에 비해 2배까지 현저히 증가하였다. 한편, 비록 각각의 부위 특이적 인산화 레벨은 증가하였을지라도(도 15c), 대부분의 비율은 EGF 단독 처리에 의해 다소 감소하는 것으로 확인되었다(도 15e).

상기 결과를 종합할 때, 본 발명의 조합적인 코드 분석법을 사용하면 종래 EGFR의 단순한 번역 후 변형 여부만을 확인할 있었던 면역 블라팅 등의 방법에 비해 살아있는 세포 내에서 키나아제와 포스파타아제의 균형에 따라 EGFR이 리간드에 의해 어떻게 조절되는지, EGFR의 조합적인 인산화 패턴이 생체 내에서 조절되는 양상을 더욱 정확하고 면밀하게 분석할 수 있는 효과가 있다(도 19).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 통상의 기술자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> INSTITUTE FOR BASIC SCIENCE POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> A method for detecting multiple post-translational modification in a single molecule protein <130> P17-B112 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for eGFP cloning <400> 1 gctctagagg agggatggtg agcaagggcg aggag 35 <210> 2 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for eGFP cloning <400> 2 caccggttca cttgtcgtca tcgtctttgt agtccttgta cagctcgtc 49 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for N-terminal Signal Peptide amplification <400> 3 cgcaaatggg cggtaggcgt g 21 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for N-terminal Signal Peptide amplification <400> 4 ccgcggttgg cgcgccagcc cgactcgccg ggcagag 37 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for C-terminal membrane protein amplification <400> 5 ggcgcgccaa ccgcggctgg aggaaaagaa agtttgc 37 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for C-terminal membrane protein amplification <400> 6 gctctagatg ctccaataaa ttcactgc 28 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for EGFR WT cloning <400> 7 cgcaaatggg cggtaggcgt g 21 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for EGFR WT cloning <400> 8 gctctagatg ctccaataaa ttcactgct 29 <210> 9 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for SANP-tag DNA fragment amplification <400> 9 ggcgcgccac atcatcacca tcaccatatg gacaaagact gcgaaatg 48 <210> 10 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for SANP-tag DNA fragment amplification <400> 10 tccccgcggc cctccactcc cactacccag cccaggcttg cccag 45

Claims

(a) 기판 표면에 표적 단백질을 고정하는 단계;
(b) 고정된 표적 단백질을 표적 단백질의 특정 번역 후 변형(post-translational modification) 부위에 특이적으로 결합하는 프로브와 반응시키는 단계;
(c) 프로브와의 반응 정보를 수득하는 단계;
(d) 표적 단백질과 결합한 프로브를 표적 단백질로부터 제거하는 단계;를 포함하고,
상기 (b) 내지 (d) 단계를 순환적으로 반복하되, 표적 단백질의 서로 상이한 N개의 번역 후 변형을 검출하기 위하여 상기 번역 후 변형을 특이적으로 검출하는 N개의 프로브와 반응시키는 것을 특징으로 하는 표적 단백질의 다중 번역 후 변형을 검출하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 표적 단백질은 기판 표면에 공유결합으로 고정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 표적 단백질은 기판 표면에 공유결합으로 고정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 클릭 화학법(click chemistry)은 코퍼-프리 클릭 화학법(copper-free click chemistry)에 의해 기판 표면에 공유결합 하는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 표적 단백질은 SPAAC(strain-promoted azide-alkyne cycloaddition) 반응, SPANC (streain-promoted zlkyne-nitrone cycloaddition) 반응 및 알켄(alkene)-테트라아진(tetrazine) 클릭 반응으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 반응에 의해 기판 표면에 공유결합 하는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 공유결합은 트리아졸 결합(triazole linkage)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 표적 단백질은 단분자 단백질이 서로 동일하거나 상이한 번역 후 변형된 형태로 기판 위에 다수개 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 프로브는 형광 표지된 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 반응 정보는 형광 이미지 정보인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (d) 단계는 소거 완충액을 이용하여 프로브를 제거하는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서,
상기 프로브는 항체이며,
상기 소거 완충액은 50~200 mM Glycine 및 1~3% SDS를 포함하고, pH가 1~5인 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서,
상기 프로브는 압타머이며,
상기 소거 완충액은 10 ~ 500 unit/μL의 뉴클레아제를 포함하는 PBS인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 표적 단백질은 EGFR, 인슐린 수용체, Erk, STAT, RNA 중합효소, 히스톤 및 p53로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 번역 후 변형은 인산화, 메틸화, 아세틸화, 글라이코실화, 유비퀴틴화, 술포닐화 및 미리스톨화로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, N은 2 내지 20의 자연수이고, 상기 (b) 내지 (d) 단계는 N회 순환적으로 반복하되 N번째 순환 사이클에서는 (d) 단계가 생략될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 기판 표면에 표적 단백질을 고정하는 단계;
(b) 고정된 표적 단백질을 표적 단백질의 특정 번역 후 변형(post-translational modification) 부위에 특이적으로 결합하는 프로브와 반응시키는 단계;
(c) 프로브와의 반응 정보를 수득하는 단계;
(d) 표적 단백질과 결합한 프로브를 표적 단백질로부터 제거하는 단계;
(e) 고정된 표적 단백질을 상기 프로브와 다시 반응시키는 단계
(f) (e) 단계의 프로브와의 반응 정보를 수득하는 단계; 및
(g) 상기 수득된 반응 정보들을 통합하는 단계를 포함하되, 상기 (b) 내지 (d) 단계는 1 내지 10회 반복되는 것을 특징으로 하는, 표적 단백질에 대한 프로브의 검출율을 향상시키는 방법.
표적 단백질이 공유결합으로 고정된 기판, 표적 단백질의 번역 후 변형에 특이적으로 결합하는 프로브 및 소거 완충액을 포함하는 표적 단백질의 다중 번역 후 변형 분석용 키트.
제17항에 있어서, 상기 표적 단백질은 EGFR이고, 상기 프로브는 EGFR의 인산화된 Tyr845, Tyr992, Tyr998, Tyr1068, Tyr1086 및 Tyr1173에 특이적으로 결합하는 프로브 중 선택되는 2 이상의 프로브인 것을 특징으로 하는 키트.
제17항에 있어서, 상기 프로브는 항체 또는 압타머인 것을 특징으로 하는 키트.
제19항에 있어서,
상기 프로브는 항체이며,
상기 소거 완충액은 50~200 mM Glycine 및 1~3% SDS를 포함하고, pH가 1~5인 것을 특징으로 하는 키트.
제19항에 있어서,
상기 프로브는 압타머이며,
상기 소거 완충액은 10 ~ 500 units/μL의 뉴클레아제를 포함하는 PBS인 것을 특징으로 하는 키트.
(a) 제1항의 방법으로 세포 내 단분자 단백질의 다중 번역 후 변형을 검출하는 단계; 및
(b) 다중 번역 후 변형을 부위별로 코드화 하여 조합 코드 정보를 제공하는 단계;를 포함하는 단분자 단백질의 다중 번역 후 변형 조합 코드 정보를 제공하는 방법.
제22항에 있어서, 상기 정보는 조직 또는 자극에 따라 차별화된 조합 코드 정보인 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 제1항의 방법으로 시료 내 단분자 단백질의 다중 번역 후 변형을 검출하는 단계;
(b) (a) 단계에서 검출된 정보를 제22항의 조합 코드 정보와 비교하는 단계; 및
(c) (a) 단계의 정보와 동일한 제22항의 조합 코드 정보를 기초로 시료가 채취된 조직 또는 시료에 가해진 자극을 판별하는 단계;를 포함하는 단분자 단백질의 다중 번역 후 변형에 기초한 시료 판별 방법.