CN112877295A - 一种urat1抑制剂体外活性筛选的细胞模型及其构建方法与筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型及其构建方法与筛选方法。该构建方法包括：将hURAT1基因连接在质粒上，将质粒转染至细胞中，经过药物筛选、DNA鉴定及蛋白质鉴定，得到URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型。该筛选方法，包括：将待测药物、荧光素加入培养基中，接种上述细胞模型，进行共培养，除去培养基，得到培养后的细胞，裂解，测试荧光分光光度值，根据荧光分光光度值来判断待测药物是否URAT1抑制剂。与现有的通过放射性标记14C‑尿酸的方法相比，本发明的方法具有高灵敏度、定量、高特异性，对设备与测试环境要求不高，可避免放射性污染等优点，且可用于高通量筛选URAT1抑制剂。
Description
技术领域
本发明涉及药理学及基因工程领域，具体涉及一种URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型及其构建方法与筛选方法。
背景技术
尿酸是人体嘌呤代谢的产物，在自然界中，通常只有人类、鸟类及某些灵长类以尿酸为嘌呤代谢的最终产物，由于缺乏将尿酸进一步分解成为可溶性尿囊素的酶，人类很容易发生高尿酸血症。人体尿酸在肝脏中形成，约1/3经肠道排泄，约2/3经肾脏排泄。研究发现肾脏尿酸盐转运的经典模式为：肾小球的滤过，肾小管的重吸收，肾小管的分泌，分泌后的重吸收。肾小球滤过的尿酸98％以上被近端肾小管重吸收然后再分泌，故肾小管是影响尿酸排泄量的重要因素。
URAT1也被称为尿酸盐转运体或尿酸盐阴离子交换器，主要表达于肾近端小管的顶膜，首次被发现于2002年。URAT1主要参与尿酸在肾小管近端的重吸收，在尿酸的重吸收过程中起到重要作用。抑制URAT1可减少肾脏对尿酸的重吸收，促进尿酸的排泄，使血浆尿酸浓度降低，从而达到治疗痛风和高尿酸血症的目的。近年来，URAT1抑制剂成为了目前降尿酸药物开发的热点，不断有新的小分子被发现可能具有URAT1的抑制活性。现已上市的URAT1抑制剂包括丙磺舒、磺吡酮、苯溴马隆、lesinurad等。
验证未知小分子化合物是否具有药理活性，即建立药物体外或者体内活性评价筛选模型是探索和发现新药的首要条件之一。为进行促尿酸排泄化合物的早期筛选和开发新型降尿酸药物，构建降尿酸药物药效评价细胞模型尤为重要。
细胞和分子水平模型是进行体外药物筛选的常用模型，它们具有快速检测、灵敏度高、假阳性低、经济的特点，尤其适合于药物的高通量筛选。目前，以URAT1为药物作用靶点的高尿酸血症治疗药物的体外筛选研究主要在细胞水平上进行。主要的细胞模型有肾小管细胞包括肾小管上皮细胞(HK-2)、狗肾细胞(MDCK)、小鼠肾细胞(RTECs)、HEK293细胞等，但不论哪种细胞模型，均是采用14C标记的尿酸为放射性底物，基于放射免疫原理，开展活性检测。此放射性同位素方法虽然具有灵敏度高的优点，但其使用成本高昂并且对环境有害，操作者在使用时还应采取特殊的安全预防措施，避免污染和处置废物。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型及其构建方法与筛选方法。
本发明的目的在于提供一种URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型，该细胞模型是一种非放射性、减少环境污染的、且更容易普及的体外活性评价模型，为研究URAT1抑制剂提供一种新的体外活性筛选方法，为新药的研发提供新途径。
本发明的另一目的在于提供基于上述URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型进行的URAT1体外活性评价的应用方法。
本发明提供的基于荧光分光光度法的体外活性筛选方法，用于检测尿酸盐转运蛋白1(URAT1)与小分子的相互作用，筛选出以URAT1为靶点的活性化合物。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明提供的URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型，该细胞模型是携带且能表达如SEQ ID NO.1所示的hURAT1基因的细胞系。所述hURAT1基因购自上海捷瑞生物工程有限公司(Catalog No.:EX-T4563-Lv105)。
进一步地，所述细胞系为HEK293T细胞。所述URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型是通过非脂质体转染试剂，并结合抗性药物筛选而获得的高稳定表达hURAT1基因的HEK293T细胞系。
本发明提供一种URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型的构建方法，报如下步骤：
(1)对质粒采用限制性内切酶(优选限制性内切酶AclI)进行酶切，并纯化酶切产物，然后将如SEQ ID NO.1所示的hURAT1基因连接在质粒上，得到包含hURAT1基因的质粒；
(2)将步骤(1)所述包含hURAT1基因的质粒转染至细胞系中，得到转染后的细胞系，经过药物筛选、DNA鉴定及蛋白质鉴定，得到能稳定表达hURAT1基因的细胞系，该细胞系即为所构建的URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型。
进一步地，步骤(1)所述质粒为pEGFP质粒；所述质粒包含嘌呤霉素的抗性基因；所述限制性内切酶为限制性内切酶AclI，所述限制性内切酶的酶切位点不在所述嘌呤霉素的抗性基因上。
进一步地，步骤(2)所述药物筛选包括：将所述转染后的细胞系置于含嘌呤霉素的完全培养基中进行筛选培养，筛选培养后，选出能在含嘌呤霉素的完全培养基中存活的细胞系；所述筛选培养的时间为6-8天；所述嘌呤霉素在完全培养基中的浓度为1-2μg/mL。
进一步地，步骤(2)所述DNA鉴定为：在DNA水平上证实hURAT1基因已经稳定整合到细胞中；所述DNA鉴定为PCR鉴定。
进一步地，步骤(2)所述蛋白质鉴定为：在蛋白质水平上证实转染后的细胞系能表达hURAT1基因；所述蛋白质鉴定方法为蛋白免疫印迹法。
步骤(2)中，通过稳定表达，抗性药物筛选，有限稀释法及克隆环法进行HEK细胞的转染和单克隆培养。需要对转染后的细胞系进行DNA和蛋白水平鉴定，DNA水平证实hURAT1基因已经被稳定整合到了HEK293T细胞上，蛋白表达水平筛选出HEK293T/hURAT1细胞。
优选地，在步骤(2)将所述包含hURAT1基因的质粒转染至细胞系的过程中，可采用GenJet TM试剂盒，按照易转染法使用说明书进行转染。
步骤(2)筛选出能稳定表达hURAT1基因的细胞系后，可以采用有限稀释法对hURAT1-HEK293T细胞进行单克隆化。
本发明提供的URAT1抑制剂体外活性筛选的方法，包括如下步骤：
(1)实验组：在容器内将待测药物、荧光底物加入培养基中，接种所述URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型，得到混合液，进行共培养处理，吸走培养基，得到实验组处理后的细胞；
(2)对照组：在容器内将荧光底物加入培养基中，接种所述URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型，得到混合液，进行共培养处理，吸走培养基，得到对照组处理后的细胞；
(3)分别裂解步骤(1)所述实验组处理后的细胞和步骤(2)所述对照组处理后的细胞，然后分别采用荧光分光光度法进行测试，得到实验组的荧光分光光度值、对照组的荧光分光光度值；
(4)当实验组的荧光分光光度值小于对照组的荧光分光光度值时，则判断步骤(1)所述待测药物为URAT1抑制剂，且差距越大，则抑制作用越强；当实验组的荧光分光光度值等于对照组的荧光分光光度值时，则判断步骤(1)所述待测药物不是URAT1抑制剂。
进一步地，步骤(1)和步骤(2)所述荧光素为5-羧基荧光素、6-羧基荧光素、Pyranine中的一种；在，步骤(1)和步骤(2)所述混合液中，荧光素的浓度为50-500μmol/L；步骤(1)和步骤(2)所述URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型的接种密度为4×104-10×104cells/well；步骤(1)和步骤(2)所述共培养处理的温度为25-37℃，共培养处理的时间为5-90min。
优选地，步骤(1)和步骤(2)所述荧光素为6-羧基荧光素。
优选地，步骤(1)和步骤(2)所述共培养处理的时间为15-90min。
进一步优选地，步骤(1)和步骤(2)所述共培养处理的时间为60min。
进一步地，步骤(1)所述待测药物为经过细胞毒性后的药物，所述待测药物对所述URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型无毒；在混合液中，所述待测药物的浓度为5μmol/L-5000μmol/L。
优选地，步骤(1)所述待测药物为经过细胞毒性后的药物，所述待测药物对所述URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型无毒；在混合液中，所述待测药物的浓度为50-500μmol/L。
进一步优选地，步骤(1)所述待测药物为经过细胞毒性后的药物，所述待测药物对所述URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型无毒；在混合液中，所述待测药物的浓度为240μmol/L。
本发明提供的URAT1抑制剂体外活性筛选的方法中，接种URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型后，可通过荧光强度值计算出荧光底物的浓度，从而计算出待测药物的IC50值，达到体外活性筛选的目的。
本发明提供的URAT1抑制剂体外活性筛选的方法可以通过如下方式进行方法学验证。先可以以荧光素类为荧光底物，设置一系列浓度梯度，通过荧光分光光度计检测不同浓度下的荧光强度，建立浓度-荧光强度的标准曲线，并确定最佳反应时间与最佳浓度，然后以已上市的URAT1抑制剂作为阳性化合物，取已繁殖2-5代的细胞(URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型)，分别进行细胞毒性实验和细胞摄取实验，通过酶标仪读数得到荧光强度值，从而计算生存率和抑制率。
生存率和抑制率的计算方法为：
本发明的方法是基于基因工程以及药理学的应用，采用非脂质体转染试剂构建高效稳定表达hURAT1的hURAT1-HEK293T细胞系，通过加入待测小分子化合物后，hURAT1-HEK293T细胞对荧光底物摄取能力的变化，即荧光强度的变化，来评价小分子化合物对URAT1的体外抑制活性。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
本发明提供的URAT1抑制剂体外活性筛选的方法是一种新的针对URAT1抑制剂的体外活性检测方法；与现有的通过放射性标记14C-尿酸的方法相比，本发明的方法具有高灵敏度、定量、高特异性，对设备与测试环境要求不高，可避免放射性污染等优点，且可用于高通量筛选URAT1抑制剂，为URAT1抑制剂的体外活性评价提供更多的选择。
附图说明
图1为hURAT1-HEK293T细胞的部分测序结果序列对比图；
图2为hURAT1-HEK293T细胞水平的hURAT1对荧光素类的转运实验结果图。
图3a为hURAT1摄取6-羧基荧光素的时效曲线。
图3b是以孵育时间为60min时，随6-羧基荧光素浓度增加，hURAT1特异性摄取6-羧基荧光素的饱和曲线；
图4a、图4b及图4c分别为已上市URAT1抑制剂丙磺舒、苯溴马隆和lesinurad对hURAT1-HEK293T细胞摄取6-羧基荧光素的抑制作用结果图。
图5a为化合物1抑制hURAT1-HEK293T细胞摄取6-羧基荧光素的抑制作用图。
图5b为化合物2抑制hURAT1-HEK293T细胞摄取6-羧基荧光素的抑制作用图。
图5c为化合物3抑制hURAT1-HEK293T细胞摄取6-羧基荧光素的抑制作用图。
图5d为化合物4抑制hURAT1-HEK293T细胞摄取6-羧基荧光素的抑制作用图。
图5e为化合物5抑制hURAT1-HEK293T细胞摄取6-羧基荧光素的抑制作用图。
图5f为化合物6抑制hURAT1-HEK293T细胞摄取6-羧基荧光素的抑制作用图。
图5g为化合物7抑制hURAT1-HEK293T细胞摄取6-羧基荧光素的抑制作用图。
图5h为化合物8抑制hURAT1-HEK293T细胞摄取6-羧基荧光素的抑制作用图。
图5i为化合物9抑制hURAT1-HEK293T细胞摄取6-羧基荧光素的抑制作用图。
图5j为化合物10抑制hURAT1-HEK293T细胞摄取6-羧基荧光素的抑制作用图。
图6为荧光分光光度法针对URAT1抑制剂的体外活性检测流程图。
图7为HEK293T单克隆细胞的蛋白表达水平分析结果图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
试剂来源：
DMEM高糖培养基、胎牛血清、非必需氨基酸(NEAA)、L-谷氨酰胺、青霉素购自于Gibco公司，GenJetTM体外转染试剂盒购自于SignaGen公司，15000DNA Marker购自于Takara公司，普通质粒小提试剂盒、去内毒素质粒小提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒购自于OMEGA公司，hURAT1抗体购自于ProteinTech公司。
菌株、细胞株及质粒来源：
HEK293T细胞贴壁生长于含10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的DMEM高糖培养基中；hURAT1质粒由上海捷瑞生物工程有限公司构建。
实施例1构建稳定高表达hURAT1基因的细胞系
1.相关溶液和试剂的配制：
(1)氨苄青霉素液储存液：用分析天平准确称取氨苄青霉素粉末0.5g置于15mL离心管中，加入3mL蒸馏水使其溶解，随后定容至5mL，即成终浓度为100mg/mL的氨苄青霉素储存液。在超净台内用0.22μm硝酸纤维素滤膜过滤除菌，小量分装保存于-20℃冰箱。使用时根据培养基的体积，将氨苄青霉素液储存液稀释至工作浓度100μg/mL。
(2)HEK293T细胞完全培养基：在DMEM高糖基础培养基中加入10wt％胎牛血清、1wt％青霉素/链霉素和1wt％L-谷氨酰胺，混匀后用0.22μm硝酸纤维素滤膜过滤除菌，放置于4℃冰箱保存备用。
(3)筛选培养基：在HEK293T完全培养基中加入适量的嘌呤霉素，使培养基终浓度为0.5μg/mL，放置于4℃冰箱保存备用。
(4)细胞冻存液：按胎牛血清与细胞培养级DMSO的体积比为9:1配制细胞冻存液，混匀后用0.22μm硝酸纤维素滤膜过滤，细胞冻存液需现配现用。
(5)蛋白电泳缓冲液：用电子天平准确称取Tris 30.2g、甘氨酸188g和SDS 10g置于洁净的玻璃烧杯中，加入900mL去离子水搅拌至完全溶解，随后定容至1L待用。
(6)5×蛋白质上样缓冲液：将12mL 1M Tris-HCl(pH 6.8)、4mL 10％SDS、10mL50％甘油、2mL1％溴酚蓝和1mLβ-巯基乙醇于洁净的烧杯中，加入超纯水溶解，随后定容至10mL待用。
(7)转膜缓冲液：用电子天平准确称取甘氨酸5.8g、Tris 11.6g于洁净的烧杯中，加入400mL蒸馏水溶解并定容至800mL，再加入200mL甲醇混匀备用。
(8)10×TBS缓冲液：用电子天平准确称取Tris 9g和NaCl 140g于洁净的烧杯中，加入300mL蒸馏水搅拌，随后定容至500mL，调节pH至7.6备用。
(9)封闭液：用电子天平准确称取脱脂奶粉3g，加入60mL TBST溶液搅拌直至完全混匀，放置于4℃冰箱中备用。
2.制备无内毒素重组质粒。从公司获得hURAT1质粒菌种后，将其菌液接种于10mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃恒温摇床振荡培养过夜(12小时)。按照OMEGA无内毒素小量质粒提取试剂盒使用说明书进行无内毒素重组质粒提取。
3.hURAT1过表达质粒线性化。获得大量的hURAT1质粒后，对其采用限制性内切酶AclI酶切，反应体系如表1所示：
表1 hURAT1质粒酶切反应体系
4.HEK293T细胞的转染：
(1)取汇合度达到80％的细胞，转染前更换新鲜的培养基放入37℃培养箱中。
(2)严格按照GenJetTM试剂盒易转染法使用说明书进行操作，先分别设置实验组和对照组，实验组将0.5μg线性化hURAT1质粒和1.5μLGen Jet TM Reagent转染试剂分别稀释于不含血清和双抗的25μL DMEM高糖培养基中，对照组将0.5μg pEGFP质粒和1.5μLGenJetTM Reagent转染试剂分别稀释于不含血清和双抗的25μL DMEM/HEK293T高糖培养基中，分别吹打混匀后将GenJetTMReagen稀释液移至质粒稀释液中，混匀，室温孵育15～30min，形成质粒-脂质体复合物。
(3)将质粒-脂质体转染复合物逐滴加至24孔培养板中，十字型轻轻晃动若干次，使其均匀分布于细胞表面，并放置于37℃，5％CO2培养箱内培养。
(4)12h后弃掉转染液，更换为新鲜的HEK293T细胞完全培养基。24h后观察荧光表达情况。
5.HEK293T细胞单克隆化
(1)细胞汇合度约为90％时，立即进行传代操作并传代至6孔板，然后继续放置于37℃，5％CO2培养箱内培养。
(2)转染第三日后将HEK293T完全培养基更换为含有浓度为1μg/mL的嘌呤霉素的HEK293T完全培养基进行细胞的抗性筛选。
(3)转染第7日后将筛选培养基的嘌呤霉素浓度更改为2μg/mL继续进行筛选，第八日则观察到细胞约80％死亡，换液，并将嘌呤霉素浓度更改为1μg/mL进行抗性筛选。
(4)细胞在含有浓度为1μg/mL嘌呤霉素的抗性培养基中进行抗性筛选2日后，吸走旧的培养基并用PBS洗一次，加入含有0.25％EDTA胰蛋白酶溶液进行消化，随后加入完全培养基终止消化。用移液枪转移至15mL离心管中离心，加入1mL培养基进行重悬和计数。采用梯度稀释法将细胞均匀铺板至10cm平皿进行单克隆化培养(接种密度：10-20个细胞/皿)，总共铺板5个平皿，随后放置于37℃，5％CO2培养箱内培养。
(5)铺完板48h后从培养箱中取出培养皿在显微镜下观察到细胞分裂可见，更换培养基，并将筛选培养基的嘌呤霉素浓度更改为0.5μg/mL，每3日需更换新鲜的含有0.5μg/mL嘌呤霉素的抗性培养基。
(6)连续筛选7日后形成单克隆，随后进行单克隆的挑取，挑取10cm平皿中分离较好的细胞单克隆至24孔板中进行扩大培养。
(7)待24孔板内的细胞汇合度达到80％左右，将24孔板中的单克隆细胞进行消化离心，取1/5继续在24孔板中培养，剩下的细胞获取细胞沉淀后提取基因组用于后续鉴定。
6.HEK293T单克隆细胞株的PCR鉴定
(1)鉴定基因组DNA的提取：采用TaKaRaMiniBEST Universal Genomic DNAExtraction Kit Ver.5.0试剂盒提取基因组DNA的方法，向获得的细胞沉淀中加入200μL的灭菌水或PBS溶液重悬细胞，离心，倒置晾干。分别加入180μL的Buffer GB、20μL的Proteinase K和10μL的RNaseA(10mg/mL)溶液，混匀，置于56℃的水浴中温浴10min。向裂解液中加入200μL100％乙醇，混匀，将裂解液转移至Spin Column中，置于Collection Tube上，10000g离心2min，弃掉滤液。分别将500μL的Buffer WA和700μL的Buffer WB加入至SpinColumn中，10000g离心1min，弃掉滤液。在Spin Column膜的中央处加入50～200μL的灭菌水或Elution Buffer溶液，室温静置5min后，10000g离心2min洗脱DNA。提取得到的基因组DNA吸光度测定其浓度。
(2)HEK293T-hURAT1单克隆细胞的鉴定：以HEK293T mix和HEK293T野生型基因组为模板，利用特异性引物对hURAT1基因进行梯度扩增。设计的特异性引物为：
HURAT1-F：5’-ATGGCCCAGTCCATCTACCT-3’，
HURAT1-R：5’-GAGATACAGGTCCGGAAGCG-3’，目的产物长度为620bp。
表2基因组DNA反应体系
反应程序为(如表3所示)：
表3
对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳验证，确定可以采用该对引物及扩增条件进行HEK293T单克隆的鉴定。
参照表4，实验组以单克隆基因组DNA为模板，特异性引物HURAT1-F/R对目的基因hURAT1进行扩增。
表4实验组反应体系
反应程序为(如表5所示)：
表5
扩增产物的测序结果显示，其序列和hURAT1基因序列完全匹配，说明目的基因已经整合到HEK293T细胞的基因组中(如图1所示)。
7.单克隆细胞的蛋白表达鉴定
(1)蛋白的提取：分别取稳定转染hURAT1的HEK293T和野生型的HEK293T，用胰酶将其消化下来，1000g离心3min，弃掉上清液。用预冷的PBS重悬细胞，以1000g离心3min，弃去上清液，重复两次得到细胞沉淀。取适量的RIPA裂解液于1.5mL离心管中并加入蛋白酶抑制剂，混匀并加入细胞沉淀中，置于冰上20min使细胞彻底裂解，4℃，14000g下离心15min，取上清液即为细胞总蛋白样品。
(2)蛋白含量的测定：将标准品按要求进行浓度梯度稀释，分别加入96孔板中，取50体积BCA试剂，加入1体积铜试剂，混匀，每孔200μL BCA工作液。在37℃避光放置30min后即可用于测蛋白，检测波段A560nm处的吸光度值。将样品稀释液的每个浓度作为横坐标，并将相应的吸光度值作为纵坐标绘制标准曲线，将样品孔中吸光度值带入标准曲线，以计算样品中的蛋白质浓度值。
(3)Western blot：计算含50ng蛋白的溶液体积即为上样量，加入适量5×SDS的上样缓冲液，使其终浓度为1×，将样品置于沸水中煮5min，待蛋白质变性后离心，取上清进行上样，进行SDS-PAGE电泳。将切好的硝酸纤维素膜置于水中浸泡2h，打开转移胶片用的夹子，使用玻璃棒前后滚动几次以去除内部的气泡，将三层滤纸放在海绵垫上，用玻璃棒擀去其中的气泡。将膜从底部到顶部都浸入TBS溶液中后，将其转移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。将PVDF膜放入塑料袋中并加入提前稀释好的一抗，用封膜机加以封口随后放入冰箱内，4℃孵育过夜进行一抗孵育(12小时)。同上述方法进行二抗孵育，孵育后在室温下脱色摇床上用TBST洗涤三次，每次洗涤时间10min。将A和B两种化学发光试剂按照体积1:10在保鲜膜上混合；混合1min后进暗室曝光，曝光完成后，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。
实验结果表明，编号为3、7、8的HEK293T单克隆细胞在60kDa均出现符合预期大小的URAT1蛋白特异性的条带。其中编号为3的HEK293T单克隆细胞对URAT1蛋白的表达量明显高于HEK293T-WT(图7)，故后续实验均选用该单克隆细胞株。
实施例2基于荧光法的URAT1抑制剂体外活性筛选模型的建立
1.溶液的配制
(1)HBSS(无Cl-)溶液的配制：分别称取固体葡萄糖酸钠(125mmol/L)，葡萄糖酸钾(4.8mmol/L)，葡萄糖酸钙(1.3mmol/L)，硫酸镁(1.2mmol/L)，磷酸二氢钾(1.2mmol/L)于烧杯中，用蒸馏水溶解，加入HEPES(25mmol/L)，D-葡萄糖(5.6mmol/L)至1000mL，再加入NaHCO3溶液使pH至7.3～7.4，0.22μm硝酸纤维素滤膜过滤除菌，放置于4℃冰箱备用。
(2)0.5％MTT溶液的配制：称取MTT 0.5g于100mL容量瓶中，用配制的HBSS(无Cl-)溶液溶解并定容，经0.22μm硝酸纤维素滤膜过滤除菌后，用15mL离心管分装并用锡箔纸包住，密封避光于-20℃冰箱保存。
(3)含2％胎牛血清HEK293T完全培养基的配制：DMEM高糖基础培养基中加入2％胎牛血清、1％青霉素/链霉素和1％L-谷氨酰胺，混匀后用0.22μm硝酸纤维素滤膜过滤除菌，放置于4℃冰箱保存备用。
(4)荧光物质溶液的配制：分别称取荧光素(1.66mg)，5-羧基荧光素(1.88mg)，6-羧基荧光素(1.88mg)，pyranine(2.62mg)于15mLEP管中，用配制的HBSS(无Cl-)溶液溶解至5mL，使其浓度为1mmol/L的溶液，经0.22μm硝酸纤维素滤膜过滤除菌，该溶液需现配现用。
(5)URAT1抑制剂溶液的配制：分别称取丙磺舒(285mg)，苯溴马隆(8.48mg)，lesinurad(202mg)于2mL EP管中，用1mL DMSO溶解配成分别为1mol/L，200mmol/L，500mmol/L的母液，经0.22μm硝酸纤维素滤膜过滤除菌，放置于4℃冰箱备用。
2.荧光底物的筛选
(1)用0.25％胰酶将汇合度大于80％左右的hURAT1-HEK293T细胞和HEK293T-WT细胞分别从6孔板中消化下来，制备成为4×104cells/well的细胞悬液，每孔200μL加入到96孔荧光板中，置于5％CO2、37℃细胞培养箱中孵育48h。其中实验组和加药组为HEK293T/hURAT1.3细胞，对照组为HEK293T-WT细胞，每组分别设5个复孔。
(2)48h后，去除96孔板里旧的培养基，HBSS(无Cl-)溶液每孔200μL清洗一次，洗完之后再加入每孔200μL的HBSS(无Cl-)溶液，放入培养箱进行孵育10min。
(3)孵育期间，将4种荧光物质：荧光素(CAS：2321-07-5)，5-羧基荧光素，6-羧基荧光素，pyranine的母液用配制的HBSS(无Cl-)溶液进行稀释，制备成浓度为100μmol/L的工作液备用。加药组的抑制剂选择丙磺舒，将配置好的丙磺舒母液用配制的HBSS(无Cl-)溶液进行稀释，制备成浓度为2mmol/L的工作液备用。每种荧光物质分别各取3个2mL的EP管，实验组：100μmol/L的荧光物质工作液稀释为50μmol/L，每孔100μL，总共600μL。对照组：每孔100μL配制的HBSS(无Cl-)溶液，总共600μL。加药组：100μmol/L的荧光物质工作液300μL+2mmol/L的丙磺舒工作液300μL，总共600μL。
(4)培养箱孵育10min后，吸走HBSS(无Cl-)溶液，分别加入对应的实验组，对照组，加药组的溶液，放置培养箱内孵育1h。
(5)1h后，吸走孵育液体，向实验组，对照组，加药组的每孔加入200μL HBSS(无Cl-)溶液洗涤，总共3次。最后每孔加入100μL0.5 N的NaOH溶液，室温裂解30min。在酶标仪中震荡10min，分别在荧光素(激发波长490nm，发射波长525nm)，5-羧基荧光素(激发波长490nm，发射波长525nm)，6-羧基荧光素(激发波长490nm，发射波长525nm)，pyranine(激发波长454nm，发射波长510nm)下进行读数。实验结果如图2所示，由图2可知，以6-羧基荧光素为底物的实验组，加入丙磺舒后荧光强度显著减弱，说明6-羧基荧光素可作为URAT1的特异性转运底物，因此确定6-羧基荧光素为优选荧光底物。图2的b部分中的荧光素指代CAS为2321-07-5的荧光素。
3.建立标准曲线
以6-羧基荧光素为荧光底物，设置一系列浓度梯度，通过仪器检测在0.5N的NaOH溶液中的荧光强度，以荧光物质的量为横坐标，荧光强度值为纵坐标作图，获得荧光强度与荧光底物浓度之间的线性关系，建立标准曲线。
4.最佳反应时间的选择
(1)用0.25％胰酶将汇合度大于80％的hURAT1-HEK293T细胞从6孔板中消化下来，制备成约为4×104cells/well的细胞悬液，每孔200μL加入到96孔荧光板中。
(2)用0.25％胰酶将汇合度大于80％左右的hURAT1-HEK293T细胞从6孔板中消化下来，制备成约为4×104cells/well的细胞悬液，每孔200μL加入到96孔荧光板中。
(3)培养48h后，吸走孔内旧的培养基，HBSS(无Cl-)溶液每孔200μL清洗一次，洗完之后每孔再加入200μL的HBSS(无Cl-)溶液，放入培养箱孵育10min。
(4)孵育期间，取优选的荧光物质的母液用HBSS(无Cl-)溶液配制成浓度分别为12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L的工作液。
(5)培养箱孵育10min后，吸走孔内的HBSS(无Cl-)溶液，分别加入配制好的各个浓度，每孔100μL，每个浓度设5个复孔，放置培养箱内孵育时间分别设置为5min、10min、15min、30min、45min、60min。
(6)结束孵育后，吸走孔内的孵育液体，每孔加入HBSS(无Cl-)溶液200μL洗涤，总共3次。最后每孔加入0.5N的NaOH溶液100μL，室温裂解30min，酶标仪中震荡10min，读数。
(7)根据标准曲线转换单位作图得时效曲线图(如图3a所示)，确定最佳反应时间为1h。图3a为hURAT1摄取6-羧基荧光素的时效曲线。由图3a的曲线可知，0min-15min，30min-60min这两个时间段内曲线的上升趋势明显。分别计算曲线斜率，确定60min为最佳孵育时间。
5.最佳底物浓度的选择
在最佳孵育时间下，通过设置浓度梯度得到浓度-吸收速率曲线图，具体操作如下：
用0.25％胰酶将汇合度大于80％的hURAT1-HEK293T细胞消化下来，制备成约为4×104cells/well的细胞悬液，每孔200μL加入到96孔荧光板中，培养48h后更换新的HBSS(无Cl-)溶液，放入培养箱孵育10min。吸走HBSS(无Cl-)溶液，分别加入12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L的荧光物质工作液，每孔100μL，每个浓度设5个复孔，放置培养箱内孵育时间为最佳时间60min。1h后，吸走孵育液体，每孔加入HBSS(无Cl-)溶液200μL洗涤，重复3次后每孔加入0.5N的NaOH溶液100μL，室温裂解30min，酶标仪中震荡10min，读数。以荧光物质浓度为横坐标，荧光物质吸收速率为纵坐标作量效曲线图(如图3b)，确定其动力学参数Km值为239.478μmol/L。图3b是以孵育时间为60min时，随6-羧基荧光素浓度增加，hURAT1特异性摄取6-羧基荧光素的饱和曲线；随着6-羧基荧光素浓度的增加，细胞对6-羧基荧光素的吸收速率逐渐下降并趋于饱和。
实施例3方法学验证
根据时效曲线和量效曲线获得优选的荧光物质的动力学参数，该参数可作为URAT1抑制剂体外活性测试的依据，用已上市的URAT1抑制剂丙磺舒，苯溴马隆，lesinurad，作为阳性化合物进行此方法模型的验证。
1.MTT实验：
(1)用0.25％胰酶将汇合度大于80％的hURAT1-HEK293T细胞消化下来，制备成细胞悬液，每孔200μL加入到96孔板中，分别设置实验组，对照组和调零组，其中实验组和对照组铺hURAT1-HEK293T细胞，调零组不加细胞。每组设5个复孔。
(2)48h后，吸走孔内旧的培养基，HBSS(无Cl-)溶液每孔200μL清洗一次，洗完之后再加入每孔200μL的HBSS(无Cl-)溶液，放入培养箱进行孵育10min。
(3)受试化合物工作液的配置。(1)实验组：将优选的荧光物质与丙磺舒等体积混合，使得丙磺舒的终浓度梯度为156.25μmol/L、312.5μmol/L、625μmol/L、1250μmol/L、2500μmol/L、5000μmol/L，混合均匀后，每孔加入混合溶液100μL；将优选的荧光物质与苯溴马隆等体积混合，使得苯溴马隆的终浓度梯度为7.8125μmol/L、15.625μmol/L、31.25μmol/L、62.5μmol/L、125μmol/L、250μmol/L，混合均匀后，每孔加入混合溶液100μL；将优选的荧光物质与lesinurad等体积混合，使得lesinurad的终浓度梯度为78.125μmol/L、156.25μmol/L、312.5μmol/L、625μmol/L、1250μmol/L、2500μmol/L，混合均匀后，每孔加入混合溶液100μL；将优选的荧光物质与febuxostat等体积混合，使得febuxostat的终浓度梯度为31.25μmol/L、62.5μmol/L、125μmol/L、250μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L，混合均匀后，每孔加入混合溶液100μL。(2)对照组：HBSS(无Cl-)溶液每孔100μL；(3)调零组：HBSS(无Cl-)溶液每孔100μL。
(4)培养箱孵育10min后，吸走孔内的HBSS(无Cl-)溶液，分别加入配好的对应的实验组，对照组，调零组的溶液，然后放置培养箱内孵育1h。
(5)1h后，吸走孵育液，每孔加入HBSS(无Cl-)溶液200μL洗涤，总共3次。使用含2％胎牛血清的DMEM完全培养基配制MTT溶液(5mg/mL稀释为0.5mg/mL)，每孔加入100μL。放置培养箱孵育4h。
(6)孵育4h后，小心吸走MTT溶液，用排枪往每孔加入200μL DMSO，在酶标仪中震荡10min，在紫外波长490nm处读数，获取各组的荧光强度值。将各组的荧光强度值代入公式1，按照公式1计算细胞的生存率。
利用上述体外活性评价方法分别测得丙磺舒、苯溴马隆、lesinurad的生存率。当丙磺舒的给药浓度增加至5000μmol/L时，hURAT1-HEK293T细胞的生存率仍可以保持在95％，说明丙磺舒为一种低毒、甚至无毒的抑制剂；当苯溴马隆的浓度增加到250μmol/L时，hURAT1-HEK293T细胞的生存率开始下降，当浓度为1000μmol/L时，细胞的生存率仅约为20％，表现为明确的细胞毒性；而lesinurad在浓度为2500μmol/L时，细胞生存率仍能达到约93％，说明该化合物对细胞无明显毒性。此实验结果均与文献报道基本一致。
2.荧光底物的摄取实验：
(1)用0.25％胰酶将覆盖率约80％的hURAT1-HEK293T细胞从6孔板中消化下来，制备成细胞悬液，每孔200μL加入到96孔板中，设置实验组，对照组和空白组，其中实验组和对照组铺hURAT1-HEK293T细胞，空白组不加细胞。每组分别设5个复孔。48h后，更换新的HBSS(无Cl-)溶液，放入培养箱孵育10min。
(2)孵育期间进行受试化合物工作液的配置。(1)实验组：将优选的荧光物质与丙磺舒等体积混合，使得丙磺舒的终浓度梯度为156.25μmol/L、312.5μmol/L、625μmol/L、1250μmol/L、2500μmol/L、5000μmol/L，混合均匀后，每孔加入混合溶液100μL；将6-羧基荧光素与苯溴马隆等体积混合，使得苯溴马隆的终浓度梯度为7.8125μmol/L、15.625μmol/L、31.25μmol/L、62.5μmol/L、125μmol/L、250μmol/L，混合均匀后，每孔加入混合溶液100μL；将6-羧基荧光素与lesinurad等体积混合，使得lesinurad的终浓度梯度为78.125μmol/L、156.25μmol/L、312.5μmol/L、625μmol/L、1250μmol/L、2500μmol/L，混合均匀后，每孔加入混合溶液100μL。(2)对照组：加入优选的荧光物质且不含抑制剂，每孔100μL。(3)空白组：HBSS(无Cl-)溶液每孔100mL。
(3)培养箱孵育10min后，吸走HBSS(无Cl-)溶液，分别加入配好的实验组，对照组，空白组的溶液，培养箱内孵育1h。
(4)1h后，吸走孵育液体，每孔加入200μLHBSS(无Cl-)溶液洗涤，总共3次。最后每孔加入100μL0.5 N的NaOH溶液，室温裂解30min，在酶标仪中震荡10min后，在紫外波长490nm处读数，获取各组的荧光强度值。将各组的荧光强度值代入公式2，按照公式2计算抑制率。
如图4a、图4b及图4c所示，以6-羧基荧光素为底物，分别测定三种化合物对URAT1摄取作用的抑制效果，并得到IC50值。与文献所报道的放射性标记14C-尿酸的测定方法相比(如表6)，荧光法测得的三个化合物对URAT1的抑制活性的强弱顺序一致，表明以6-羧基荧光素作为底物进行体外URAT1抑制剂的活性评价的方法具有可行性。图4a、图4b及图4c展示了在以6-羧基荧光素为底物时，三种化合物通过URAT1抑制其摄取的效果，并获得丙磺舒、苯溴马隆和lesinurad的IC50值分别为1518.67μmol/L，14.25μmol/L，273.5μmol/L。其抑制活性的大小为：苯溴马隆＞Lesinurad＞丙磺舒，与已有文献报道的顺序一致。
表6以6-羧基荧光素为底物的荧光法测得的IC50值以及文献报道IC50值
由以上实施例可见，本发明构建的基于荧光法的体外活性筛选模型可以有效的评价URAT1抑制剂的活性，可以用于筛选以URAT1为靶点的活性化合物。本发明的方法与常用的放射性方法相比，抑制的相对活性大小一致，且具有操作简单、成本低廉、无环境污染等优点。
实施例4基于荧光法的体外筛选模型的应用(可参照图6的流程图)
1.溶液的配制
(1)一般溶液的配制：HBSS(无Cl-)溶液、0.5％MTT溶液、含2％胎牛血清HEK293T完全培养基、荧光物质溶液以及URAT1抑制剂溶液的配制参见实施例2。
(2)待测化合物储存液的配制：取10个化合物，分别精确称取各待测化合物于1.5mL离心管中，加入1ml DMSO溶解，配制成200mM的储存液。
所述待测化合物共有10个，分别标记为化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8、化合物9、化合物10。其中，化合物1的结构式为：
化合物2的结构式为：
化合物3的结构式为:
化合物4的结构式为:
化合物5的结构式为:
化合物6的结构式为:
化合物7的结构式为:
化合物8的结构式为:
化合物9的结构式为:
化合物10的结构式为:
2.细胞培养
hURAT-HEK293T细胞于5％CO2、37℃细胞培养箱常规培养。待细胞长满时，用0.25％胰酶进行消化分离。在进行常规实验之前，维持细胞繁殖2～5代。开始实验时，取细胞铺于96孔板。维持细胞生长的培养基为含有血清、青霉素和链霉素的DMEM培养基。
3.细胞毒性实验
(1)用0.25％胰酶将汇合度大于80％的hURAT-HEK293T细胞消化下来，制备成细胞悬液，每孔200μL加入到96孔板中，分别设置实验组，对照组和调零组，其中实验组和对照组铺hURAT-HEK293T细胞，调零组不加细胞。每组设5个复孔。
(2)48h后，吸走孔内旧的培养基，HBSS(无Cl-)溶液每孔200μL清洗一次，洗完之后再加入每孔200μL的HBSS(无Cl-)溶液，放入培养箱进行孵育10min。
(3)受试化合物工作液的配置。(1)实验组：将6-羧基荧光素与待测化合物等体积混合，使得10个待测化合物的终浓度梯度为31.25μmol/L、62.5μmol/L、125μmol/L、250μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L，混合均匀后，每孔均加入混合后的体积100μL；(2)对照组：HBSS(无Cl-)溶液，每孔加入100μL；(3)调零组：HBSS(无Cl-)溶液，每孔加入100μL。
(4)培养箱孵育10min后，吸走孔内的HBSS(无Cl-)溶液，分别加入配好的对应的实验组，对照组，调零组的溶液，然后放置培养箱内孵育1h。
(5)1h后，吸走孵育液，每孔加入HBSS(无Cl-)溶液200μL洗涤，总共3次。使用含2％胎牛血清的DMEM完全培养基配制MTT溶液(5mg/mL稀释为0.5mg/mL)，每孔加入100μL。放置培养箱孵育4h。
(6)孵育4h后，小心吸走MTT溶液，用排枪往每孔加入200μL DMSO，在酶标仪中震荡10min，在紫外波长490nm处读数，获取各组的荧光强度值。将各组的荧光强度值代入公式1，按照公式1计算细胞的生存率。
细胞毒性实验的结果表明，所有待测化合物浓度在1000μmol/L以下时，细胞的生存率>75％；表明在此浓度下，细胞呈现低毒性，故在进行后续摄取实验时，可设置浓度范围在1000μmol/L以内。
4.荧光底物的摄取实验
(1)用0.25％胰酶将覆盖率约80％的hURAT1-HEK293T细胞从6孔板中消化下来，制备成细胞悬液，每孔200μL加入到96孔板中，设置实验组，对照组和空白组，其中实验组和对照组铺hURAT1-HEK293T细胞，空白组不加细胞。每组分别设5个复孔。48h后，更换新的HBSS(无Cl-)溶液，放入培养箱孵育10min。
(2)孵育期间配制各待测化合物的测试溶液。(1)实验组：将6-羧基荧光素与待测化合物等体积混合，使得待测化合物的终浓度梯度为31.25μmol/L、62.5μmol/L、125μmol/L、250μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L、混合均匀后，每孔加入混合后的体积100μL；(2)对照组：加入6-羧基荧光素且不含待测化合物，每孔加入100μL；(3)空白组：加入HBSS(无Cl-)溶液，每孔加入100μL。(3)培养箱孵育10min后，吸走HBSS(无Cl-)溶液，分别加入配好的实验组，对照组，空白组的溶液，培养箱内孵育1h。
(3)1h后，吸走孵育液体，每孔加入200μLHBSS(无Cl-)溶液洗涤，总共3次。最后每孔加入100μL0.5 N的NaOH溶液，室温裂解30min，在酶标仪中震荡10min后，在紫外波长490nm处读数，获取各组的荧光强度值。将各组的荧光强度值代入公式2，按照公式2计算抑制率。
实验结果如图5a、图5b、图5c、图5d、图5e、图5f、图5g、图5h、图5i及图5j所示，在本实验的浓度范围(31.25～1000μM)内，随着浓度增加：化合物的抑制作用逐渐增强，其中化合物4、化合物9的抑制活性IC50值与苯溴马隆在同一个数量级，化合物2、3、5、8的抑制活性较强于lesinurad，提示这几种化合物都有潜在的URAT1抑制活性。
其中，化合物1的IC50值为642.3μM；化合物2的IC50值为155.1μM；化合物3的IC50值为113μM；化合物4的IC50值为35.75μM；化合物5的IC50值为144.7μM；化合物6的IC50值为149.5μM；化合物7的IC50值为349μM；化合物8的IC50值为215μM；化合物9的IC50值为10.36μM；化合物10基本无抑制活性。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型及其构建方法与筛选方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1662
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 1
atggcatttt ctgaactcct ggacctcgtg ggtggcctgg gcaggttcca ggttctccag 60
acgatggctc tgatggtctc catcatgtgg ctgtgtaccc agagcatgct ggagaacttc 120
tcggccgccg tgcccagcca ccgctgctgg gcacccctcc tggacaacag cacggctcag 180
gccagcatcc tagggagctt gagtcctgag gccctcctgg ctatttccat cccgccgggc 240
cccaaccaga ggccccatca gtgccgccgc ttccgccagc cacagtggca gctcttggac 300
cccaatgcca cggccaccag ctggagcgag gccgacacgg agccgtgtgt ggatggctgg 360
gtctatgacc gcagcatctt cacctccaca atcgtggcca agtggaacct cgtgtgtgac 420
tctcacgctc tgaagcccat ggcccagtcc atctacctgg ctgggattct ggtgggagct 480
gctgcgtgcg gccctgcctc agacaggttt gggcgcaggc tggtgctaac ctggagctac 540
cttcagatgg ctgtgatggg tacggcagct gccttcgccc ctgccttccc cgtgtactgc 600
ctgttccgct tcctgttggc ctttgccgtg gcaggcgtca tgatgaacac gggcactctc 660
ctgatggagt ggacggcggc acgggcccga cccttggtga tgaccttgaa ctctctgggc 720
ttcagcttcg gccatggcct gacagctgca gtggcctacg gtgtgcggga ctggacactg 780
ctgcagctgg tggtctcggt ccccttcttc ctctgctttt tgtactcctg gtggctggca 840
gagtcggcac gatggctcct caccacaggc aggctggatt ggggcctgca ggagctgtgg 900
agggtggctg ccatcaacgg aaagggggca gtgcaggaca ccctgacccc tgaggtcttg 960
ctttcagcca tgcgggagga gctgagcatg ggccagcctc ctgccagcct gggcaccctg 1020
ctccgcatgc ccggactgcg cttccggacc tgtatctcca cgttgtgctg gttcgccttt 1080
ggcttcacct tcttcggcct ggccctggac ctgcaggccc tgggcagcaa catcttcctg 1140
ctccaaatgt tcattggtgt cgtggacatc ccagccaaga tgggcgccct gctgctgctg 1200
agccacctgg gccgccgccc cacgctggcc gcatccctgt tgctggcggg gctctgcatt 1260
ctggccaaca cgctggtgcc ccacgaaatg ggggctctgc gctcagcctt ggccgtgctg 1320
gggctgggcg gggtgggggc tgccttcacc tgcatcacca tctacagcag cgagctcttc 1380
cccactgtgc tcaggatgac ggcagtgggc ttgggccaga tggcagcccg tggaggagcc 1440
atcctggggc ctctggtccg gctgctgggt gtccatggcc cctggctgcc cttgctggtg 1500
tatgggacgg tgccagtgct gagtggcctg gccgcactgc ttctgcccga gacccagagc 1560
ttgccgctgc ccgacaccat ccaagatgtg cagaaccagg cagtaaagaa ggcaacacat 1620
ggcacgctgg ggaactctgt cctaaaatcc acacagtttt ag 1662
Claims (10)
1.一种URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型，其特征在于，该细胞模型是携带且能表达如SEQ ID NO.1所示的hURAT1基因的细胞系。
2.根据权利要求1所述的URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型，其特征在于，所述细胞系为HEK293T细胞。
3.一种如权利要求1-2任一项所述的URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型的构建方法，其特征在于，报如下步骤：
(1)对质粒采用限制性内切酶进行酶切，然后将如SEQ ID NO.1所示的hURAT1基因连接在质粒上，得到包含hURAT1基因的质粒；
(2)将步骤(1)所述包含hURAT1基因的质粒转染至细胞系中，得到转染后的细胞系，经过药物筛选、DNA鉴定及蛋白质鉴定，得到能稳定表达hURAT1基因的细胞系，该细胞系即为所构建的URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型。
4.根据权利要求3所述的URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述质粒为pEGFP质粒；所述质粒包含嘌呤霉素的抗性基因；所述限制性内切酶为限制性内切酶AclI，所述限制性内切酶的酶切位点不在所述嘌呤霉素的抗性基因上。
5.根据权利要求3所述的URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述药物筛选包括：将所述转染后的细胞系置于含嘌呤霉素的完全培养基中进行筛选培养，筛选培养后，选出能在含嘌呤霉素的完全培养基中存活的细胞系；所述筛选培养的时间为6-8天；所述嘌呤霉素在完全培养基中的浓度为1-2μg/mL。
6.根据权利要求3所述的URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述DNA鉴定为：在DNA水平上证实hURAT1基因已经稳定整合到细胞中；所述DNA鉴定为PCR鉴定。
7.根据权利要求3所述的URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述蛋白质鉴定为：在蛋白质水平上证实转染后的细胞系能表达hURAT1基因；所述蛋白质鉴定方法为蛋白免疫印迹法。
8.一种URAT1抑制剂体外活性筛选的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)实验组：在容器内将待测药物、荧光素加入培养基中，接种所述URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型，得到混合液，进行共培养处理，吸走培养基，得到实验组处理后的细胞；
(2)对照组：在容器内将荧光素加入培养基中，接种所述URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型，得到混合液，进行共培养处理，吸走培养基，得到对照组处理后的细胞；
(3)分别裂解步骤(1)所述实验组处理后的细胞和步骤(2)所述对照组处理后的细胞，然后分别采用荧光分光光度法进行测试，得到实验组的荧光分光光度值、对照组的荧光分光光度值；
(4)当实验组的荧光分光光度值小于对照组的荧光分光光度值时，则判断步骤(1)所述待测药物为URAT1抑制剂，且差距越大，则抑制作用越强；当实验组的荧光分光光度值等于对照组的荧光分光光度值时，则判断步骤(1)所述待测药物不是URAT1抑制剂。
9.根据权利要求8所述的URAT1抑制剂体外活性筛选的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)所述荧光素为5-羧基荧光素、6-羧基荧光素、Pyranine中的一种；在，步骤(1)和步骤(2)所述混合液中，荧光素的浓度为50-500μmol/L；步骤(1)和步骤(2)所述URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型的接种密度为4×104-10×104cells/well；步骤(1)和步骤(2)所述共培养处理的温度为25-37℃，共培养处理的时间为5-90min。
10.根据权利要求8所述的URAT1抑制剂体外活性筛选的方法，其特征在于，步骤(1)所述待测药物为经过细胞毒性后的药物，所述待测药物对所述URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型无毒；在混合液中，所述待测药物的浓度为5μmol/L-5000μmol/L。
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2021
- 2021-02-26 CN CN202110217540.5A patent/CN112877295A/zh active Pending
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