JP6490669B2 - 単離腎細胞を含有するオルガノイド及びその使用 - Google Patents
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Description
他で定義されない限り、本明細書において使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者により普遍的に理解されているものと同じ意味を有する。Principles of Tissue Engineering,3rd Ed.(Edited by R Lanza,R Langer,& J Vacanti),2007において、本明細書に用いられている用語のうちの多くに関する全体的なガイドラインが当業者に開示されている。当業者であれば、本明細書に開示されているものと類似した、または均等な多くの方法及び物質を認識し、及び、本発明の実施に用いることができることを認識するであろう。本発明は、決して開示される方法及び物質を限定しない。
本発明により、急性または慢性の腎疾患の処置における使用のための、特定の生物活性のある成分または細胞型が富化され、ならびに/または、不活性もしくは望ましくない成分または細胞型及びさらには生物活性のある細胞群(限定されないが、内皮細胞、内皮前駆細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来前駆細胞が挙げられる)が枯渇した、単離異種腎細胞群を含有する細胞群が開示される。特定の生物活性のある成分または細胞型が富化され、及び/または、特定の不活性もしくは望ましくない成分または細胞型が枯渇された単離異種腎細胞群は、本明細書に開示される任意の細胞群を含有しても良い。1つの実施形態において、当該さらなる生物活性のある成分(たとえば、内皮細胞、内皮前駆細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来前駆細胞)は、特定の生物活性のある成分もしくは細胞型が富化され、及び/または、特定の不活性もしくは望ましくない成分または細胞型が枯渇した単離異種腎細胞群と混合される。本発明の他の態様において、本明細書に開示されるSRC+細胞群の製造方法が開示される。当該細胞群を含有する当該さらなる生物活性のある成分(たとえば、内皮細胞、内皮前駆細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来前駆細胞)は、細胞または組織の欠如を改善するために十分な任意の割合で存在しても良い。
本発明によりさらに、本明細書に開示される生物活性のある成分(たとえば、B2、B4及びB3であり、不活性または望ましくない成分(たとえば、B1及びB5)を枯渇しており、急性及び/または慢性腎疾患の処置における使用のために、単独、または混合される)を含有する、及び/または、から形成されるオルガノイドが開示される。1つの態様において、本発明により、1以上の細胞型(たとえば、血管、内分泌または内皮)が枯渇または欠如している、特定の亜分画(B4)(すなわち、B4´であり、単独で、または他の生物活性のある亜分画(たとえば、B2及び/またはB3)と混合された際に、治療特性(たとえば腎機能の安定化及び/または改善及び/または再生)を保持している)を含有する、及び/または、から形成されるオルガノイドが開示される。好ましい実施形態において、生物活性のある細胞群は、B2である。ある実施形態において、B2細胞群は、B4またはB4´と混合される。他の実施形態において、B2細胞群は、B3と混合される。他の実施形態において、B2細胞群は、B3及びB4の両方、または、B3及び/またはB4の特定の細胞性成分と混合される。全ての実施形態において、本発明のオルガノイドは、ex vivoで形成及び培養される。全ての実施形態において、オルガノイドはさらに、さらなる生物活性のある細胞群(限定されないが、内皮細胞、内皮前駆細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来前駆細胞が挙げられる)を含有し、及び/または、から形成されても良い。1つの実施形態において、さらなる生物活性のある細胞群(限定されないが、内皮細胞、内皮前駆細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来前駆細胞が挙げられる)は、特定の生物活性成分または細胞型が富化された、及び/または、不活性もしくは望ましくない成分または細胞型が枯渇した、単離異種腎細胞群と混合される。
本発明のSRC+細胞群及び/またはオルガノイドは、腎疾患の処置における使用のため(すなわち、腎機能の安定化及び/または改善及び/または再生をもたらすために)に、特定の生物活性のある成分または細胞型を富化した、及び/または、特定の不活性な、もしくは望ましくない成分または細胞型を枯渇させた、単離異種腎細胞群、及びその混合物を含有し、及び/または、から形成されても良い(PresnellらのUS2011−0117162及びIlaganらのPCT/US2011/036347に既に開示されている。参照により、その全内容が本明細書に援用される)。オルガノイドは、健常な個人と比較して細胞成分を欠いているが、治療特性を保持している(すなわち、腎機能の安定化及び/または改善及び/または再生をもたらす)単離腎細胞分画を含有しても良い。本明細書に開示される細胞群、細胞分画及び/または混合物は、健常な個人、腎疾患を有する個人、または、本明細書に開示される対象から誘導されても良い。
本発明から、必要のある対象の標的器官または組織へと投与される、生物活性のある細胞群を含有する、治療用オルガノイド及びSRC+細胞群が予期される。通常、生物活性のある細胞群は、対象への投与に対する治療特性を潜在的に有する細胞群を指す。たとえば、必要のある対象への投与で、生物活性のある腎細胞群を含有するオルガノイドは、対象の腎機能の安定化及び/または改善及び/または再生をもたらすことができる。治療特性に、再生効果が含まれても良い。
本明細書において、本発明は、生物活性のある成分を富化し、不活性な、または望ましくない成分を枯渇させた異種腎細胞群のある亜分画を含有するオルガノイド、及び/または、から形成されたオルガノイドによって、開始群よりも優れた治療転帰及び再生結果がもたらされるという驚きの発見に部分的に基づいている。好ましい実施形態において、本発明に開示されるオルガノイドは、B1及び/またはB5細胞群を枯渇された細胞群を含有している。たとえば、以下はB1及び/またはB5を枯渇しても良い:B2、B3及びB4(またはB4´)のうち2以上の混合物;B2、B3及びB4(またはB4´)を富化した細胞群。
1つの態様において、本発明のSRC+細胞群及び/またはオルガノイドは、腎組織から単離、及び/または、培養された細胞群を含有、及び/または、から形成される。本明細書において、腎疾患、貧血、EPO欠乏症、尿細管輸送障害、及び糸球体濾過障害の処置を含む、治療用途のためのオルガノイド中に含有される富化細胞群等の腎細胞成分を分離及び単離する方法が開示される。1つの実施形態において、細胞群は、消化されたばかりの、すなわち、機械的または酵素的に消化されたばかりの腎組織から単離され、または、哺乳類腎細胞のin vitro異種培養物から単離される。本発明のSRC+細胞群を含有する、さらなる生物活性のある細胞群を単離する方法を、実施例に詳述する。
Bertramらの米国特許公開20070276507に開示されるように、ポリマーマトリクスまたはスキャホールドを、任意の数の全体的なシステム制限、形状制限、または空間的制限を満たすために所望される任意の数の構造へと成形しても良い。1つの実施形態において、本発明のマトリクスまたはスキャホールドは、3次元構造であってもよく、及び、器官構造または組織構造の大きさ及び形状に合わせるために成形されても良い。たとえば、腎疾患、貧血、EPO欠乏、尿細管輸送障害、または糸球体濾過障害の処置に対するポリマースキャホールドの使用において、3次元(3−D)マトリクスを用いても良い。様々な異なる形状の3−Dスキャホールドを用いても良い。当然ながら、ポリマーマトリクスは、異なるサイズの患者に合わせるために、異なるサイズ及び形状に成形されても良い。また、ポリマーマトリクスは、患者の特別のニーズに対応するために他の方法で成形されても良い。他の実施形態において、ポリマーマトリクスまたはスキャホールドは、生体適合性の多孔性ポリマースキャホールドであっても良い。当該スキャホールドは、様々な合成物質または天然物質(限定されないが、オープンセルポリ乳酸(OPLA(登録商標))、セルロースエーテル、セルロース、セルロースエステル、フッ素化ポリエチレン、フェノール、ポリ−4−メチルペンテン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリアミドイミド、ポリアクリレート、ポリベンゾキサゾール、ポリカルボネート、ポリシアノアリールエーテル、ポリエステル、ポリエステルカルボネート、ポリエーテル、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルイミド、ポリエーテルケトン、ポリエーテルスルホン、ポリエチレン、ポリフルオロオレフィン、ポリイミド、ポリオレフィン、ポリオキサジアゾール、ポリフェニレンオキシド、ポリフェニレンスルフィド、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルフィド、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリチオエーテル、ポリトリアゾール、ポリウレタン、ポリビニル、ポリビニリデンフッ化物、再生セルロース、シリコーン、尿素−ホルムアルデヒド、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、グリコサミノグリカン、絹、エラスチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、アガロース、またはそれらのコポリマーもしくは物理的混合物が挙げられる)から形成されても良い。スキャホールドの構造は、液体ハイドロゲル懸濁液から、柔らかい多孔性スキャホールド、硬い形状維持多孔性スキャホールドに及んでも良い。
1つの態様において、本発明により、必要のある対象における腎疾患、貧血またはEPO欠乏症を処置するための、本明細書に開示される細胞群の1つ以上を有する移植可能な構築物を含有するオルガノイドが開示される。1つの実施形態において、当該構築物は、生体適合性のある物質またはバイオマテリアルである、1以上の合成生体適合性物質または天然生体適合性物質及び、本明細書に開示される1以上の細胞群または細胞の混合物(付着及び/またはトラップされることにより、当該スキャホールドの表面に置かれ、または、埋め込まれている)から構成されるスキャホールドまたはマトリクスから作製される。ある実施形態において、当該構築物は、バイオマテリアル及び、当該バイオマテリアルの構成要素(複数含む)を用いてコートされ、上に置かれ、中に置かれ、付着され、中にトラップされ、中に埋め込まれ、播種され、または組み合わされた、本明細書に開示される1以上の細胞群または細胞の混合物から作製される。本明細書に開示される任意の細胞群(富化細胞群またはその混合物を含む)は、構築物を形成するためのマトリクスと組み合わせて用いられても良い。
1つの態様において、本発明により、本明細書に開示される腎細胞群及び腎細胞の混合物を含有する、及び/もしくは、から形成される、SRC+細胞群ならびに/またはオルガノイドを用いた、必要のある対象における腎疾患、貧血、またはEPO欠乏症の処置のための方法が開示される。1つの実施形態において、当該方法には、EPO産生細胞が富化された第一の腎細胞群を含有する、及び/または、から形成されたオルガノイド(複数含む)を対象に投与することを含む。他の実施形態において、第一の細胞群は、EPO産生細胞、糸球体細胞及び血管細胞が富化されている。他の実施形態において、オルガノイド(複数含む)はさらに、1以上の追加の腎細胞群を含有しても良く、及び/または、から形成されても良い。1つの実施形態において、追加の細胞群は、EPO産生細胞が富化されていない第二の細胞群である。他の実施形態において、追加の細胞群は、EPO産生細胞、糸球体細胞、または血管細胞が富化されていない第二の細胞群である。他の実施形態において、オルガノイド(複数含む)はまた、本明細書に開示される疾患または障害の処置のための、本明細書に開示される移植可能な構築物を形成するためのバイオマテリアル中に配置され、バイオマテリアル上に配置され、バイオマテリアル中に埋め込まれ、バイオマテリアルでコートされ、またはバイオマテリアル中にトラップされる腎細胞群または腎細胞混合物を含有する、及び/または、から形成される。1つの実施形態において、オルガノイドは、単独で、または、他の細胞もしくはバイオマテリアル(たとえば、ハイドロゲル、多孔性スキャホールド、または天然ペプチドもしくはタンパク質、または合成ペプチドもしくはタンパク質)と組み合わせて用いられ、急性疾患状態または慢性疾患状態の再生を刺激する。
本発明のSRC+細胞群及び/または生物活性のある細胞オルガノイドは、単独で、または他の生物活性のある成分と組み合わせて投与されても良い。SRC+細胞群及び/またはオルガノイドは、組織を再生するための、固形器官内部への組込み型再生医療用成分の注入または移植に適している。
本発明にはさらに、本発明のポリマーマトリクス及びスキャホールドを含有するキット、及び関連物質、ならびに/または、培養培地及び使用説明書を含有するキットが含まれる。使用説明書には、たとえば、本発明のSRC+細胞群またはオルガノイドの形成における細胞培養、及び/または、SRC+細胞群またはオルガノイドの投与に関する説明が含まれても良い。1つの実施形態において、本発明により、本明細書に開示されるスキャホールド及び説明書を含有するキットが開示される。さらに他の実施形態において、当該キットは、マーカー発現の検出のための剤、当該剤の使用のための試薬、及び使用説明書を含有する。このキットは、本明細書に開示されるオルガノイド(複数含む)の移植または投与後の、対象における自然腎の再生予後決定の目的のために使用されても良い。当該キットはまた、本明細書に開示されるオルガノイド(複数含む)の生体治療有効性の測定のために用いられても良い。
以下の方法において、従前に適合されたコラゲナーゼ/ディスパーゼ消化プロトコール2、3、5を用いた、酵素消化後の内皮細胞の単離例を提示する。この方法を、罹患ZSF1ラット腎臓及び、透析を受けている高血圧症のヒトESRD患者から得た腎生検に適用する。
下記に開示されるように、腎細胞単離のための標準的な操作手順を用いて消化された腎臓(複数含む)を、100μmのSteriflipフィルター(Millipore)を通して濾過する。残った細胞懸濁液を、5%FBSを含有するDMEMを用いて中性化し、次いで、5分間、300xgで遠心することにより洗浄する。100μmフィルターを通して回収された細胞ペレットを、十分に補充されたEMG−2増殖培地(Lonza)中に再懸濁し、25K/cm2の細胞密度で、フィブロネクチンをコートしたディッシュ上に播種する。培養を3日毎に行う。EC培養が80〜90%コンフルエントに達したとき、トリプシン処理を行い、計数する。トリプシン処理された細胞を、CD31(PECAM)一次抗体を用いて標識し、Miltenyi抗CD31マイクロビーズを用いて陽性選択を行った。CD31+ソートされた細胞を洗浄、計数し、十分に補充されたEGM−2培地中に10K/cm2の密度で播種する。内皮細胞の形態は、24時間後に明白となり、これら細胞は、複数回の継代を介して増殖させることができる。脈管系及び/またはリンパ系の組成を、系統特異的抗体(たとえば、VEGF−3は毛細血管;LYVE1はリンパ系)を用いて分析しても良く;Miltenyiマイクロビーズ選択法を用いた、同じ細胞表面表現型マーカーにより、特定の内皮細胞亜群をさらに選択/ソートすることもできる。
EGM2培地中、フィブロネクチンコートされたフラスコから回収された細胞を、EMG2培地w/oサプリメント中、0.4μg/100万個の細胞/100μlの濃度で、マウス抗ヒトCD31の一次抗体を用いて、4℃で20分間、染色する。20分後、細胞を洗浄し、12mlのEGM2培地w/oサプリメントと200μlのヤギ抗マウスIgG1中に再懸濁する。Miltenyiマイクロビーズを添加し、さらに20分間、4℃で遮光しながらインキュベートする。20分後、細胞を、遠心(5分、300xg)を介して2回洗浄し、12ml(1000万個の細胞/ml)中に再懸濁し、Miltenyi自動MACS機器(センシティブモードプログラムで、二重陽性選択)を用いて精製する。
ヒト腎細胞の培養:
ヒト腎細胞(ドナーに関する情報は、表1の下を参照)は、下記に開示されるように、ヒト腎初代細胞の酵素的単離及び培養に関する標準的な操作手順を用いて単離した。簡潔に述べると、細胞を単離し、標準的なKGMのT/C処置フラスコ、または、EGM2を十分に補充した培地のフィブロネクチンコートフラスコのいずれかで、25K/cm2で培養した。細胞を、21%酸素環境下で3日間増殖させ、次いで、培地を交換し、O/N曝露のために培養物を2%酸素環境下へと移した。4日後、細胞を画像撮影し、培養形態を分析した(図2A)。次いで、それらを回収し、標準的な方法を用いて計数した(HK027バッチレコードを参照)。サンプルを採取し、染色して、CD31+内皮細胞の割合を測定した(図2)。内皮細胞を、マウス抗ヒトCD31の一次抗体(BD bioscience)と磁性マイクロビーズ(Miltenyi)を用いてソートした。次いで、CD31+細胞を10K/cm2の密度で再度フィブロネクチンコートフラスコ上に播種し、さらに4日間培養した(図2、細胞培養形態)。次いで、細胞を計数し、サンプルを採取して、マウス抗ヒトCD31 一次抗体とFACS分析を用いて陽性内皮細胞の割合を測定した(図3)。
A.腎上皮:
浮遊密度勾配を介して単離された分画における様々な上皮細胞コンパートメント(壁細胞、近位尿細管細胞、ヘンレ係蹄細胞、遠位尿細管細胞)の発現評価が進行中である。より具体的には、系統追跡実験により、Six2+上皮細胞単離の直接及び選択的な立証がなされ;ネフロン上皮コンパートメントに特異的なマーカーでSix2を共標識すること(表2〜3を参照)により、細胞特異的な検出が確認される(表4を参照)。表4において、p0 ZSF1培養(混合分画B2−B3−B4)を近位、遠位、及び集合尿細管の細胞型の混合物として特徴解析する上皮マーカーの限定パネルを提示する。表2〜4に列記されるものと同じ細胞表面検出抗体を用いた、上述の培養選択(磁性ソーティングと併せた培養条件)を介したこれら特異的上皮細胞コンパートメントの富化が予期される。
骨盤の解剖学的除外により、糸球体分画の単離が改善される。下記に記述される、腎消化のための標準的な操作手順を用いて、細胞を単離し、100μmのSteri−flipフィルター(Millopore)を介して濾過し、100μmを超える大きさの細胞粒子/塊(糸球体分画を含有する)を、さらに20分間、再消化する。消化された分画を、10%FBSを含有するDMEM培地で中和し、遠心により洗浄する(300xg、5分)。再懸濁された細胞ペレットを、VRADD培地6(DMEM/F12、1uM All Trans Retinoic Acid(Genzyme、Cambridge、MA)、0.1umのデキサメタゾン(Sigma−Aldrich)、10〜100nMのビタミンD(有足細胞培養を促進するための1,25(OH)2D3)、または、たとえば、(50:50 DMEM/KSFM)等のFBS無しで十分に補充された、壁上皮細胞に適した血清フリー培地中で、1型コラーゲンでコートされたT/Cプレート上で培養する。細胞を、25K/cm2の密度で播種し、細胞増殖が現れるまでサブ培養する。増殖細胞を、増殖させ、及び、1継代目で、Miltenyiマイクロビーズに結合した一次抗体(PEC特異的マーカー(たとえば、限定されないが、Claudin−1)または前駆体特異的マーカー(たとえば、CD146、CD117、SOX2、Oct 4A、CD24、CD133)、またはメサンギウム特異的マーカー(たとえば、限定されないが、平滑筋アクチン、ビメンチン、ミオカルジン、カルビンジン)または糸球体毛細管内皮細胞(たとえば、VEFG3またはCD31またはLIVE1)のいずれかを用いる)を用いてソートする。最適な細胞産生量で採取し、及び、通常の頻度よりも高い割合でB2成分と混合すると、高割合の糸球体由来細胞を、糸球体疾患に罹患している患者に適用することができる。
腎臓の皮質領域と髄質領域を解剖学的に切除することにより、骨盤内、または骨盤近くに位置する細胞の単離が改善される。下記に記述されるように、げっ歯類、イヌ科、及びヒトの初代腎細胞を単離、増殖及び採取するための標準的な操作手順は、集合尿細管上皮細胞の単離及び増殖に従うものである。初代培養腎細胞の亜群を分画化するための標準的な操作手順は、細胞分画B1の集合尿細管の細胞を富化するものであり、以下に記述される。これら細胞は、最も高い割合で集合尿細管上皮細胞を含有している(たとえば、アクアポリン2及びDolichos Biflorus Agglutinin(DBA)等のマーカーに基づく)。あるいは、Dr.Ben Humphreysから得た乳頭/髄質間集合尿細管(IMCD)培養プロトコールを適用した(EGFを補充したREGM培地;未公開データ)。これら方法のいずれにおいても、集合尿細管上皮を富化された細胞分画を、通常よりも高い頻度でB2成分と組み合わせて用いることができ、または、標準的なKGMまたは均等物を用いて増殖させ、尿濃縮と関連した疾患原因を標的とするために用いることができ、及び、腎盂の異常、及び/または、腎盂の疾患(たとえば、水腎症、血管−尿管閉塞)に適用しうる活性のある生物成分をより良く具体化しうる。
自己形成オルガノイド/スフェロイド形成
オルガノイドは、初代腎培養、増殖、及びSRCを単離するための浮遊密度勾配遠心の後に生成された(以下に記述される、NKA生成のための標準的な操作手順)。簡潔に述べると、SRCを、100mlの腎細胞増殖培地に、[1x106細胞/ml]の濃度で、スピナーフラスコ(Corning)中、磁気攪拌機(80rpmに設定)上で24〜48時間、再懸濁した(図4)。細胞オルガノイド/スフェロイドは、50〜125μMのサイズ範囲の細胞塊からなる。オルガノイド当たりの細胞数は、細胞型、及びスピナーフラスコ培養前のサイズによって変化しうる。オルガノイド/スフェロイドは、ラット及びヒトSRCの両方から生成され、尿細管上皮の表現型を表した(図5)。
管を形成するSRCの能力を適用して、NKAの潜在能力を評価しても良い。このアッセイを、3Dの1型コラーゲン/4型コラーゲンゼラチンの50:50混合物中で培養したSRCオルガノイドに行った。培養オルガノイドに免疫蛍光染色を行うと、得られた管は、上皮表現型を発現し続ける(図6)。
他の細胞型の組み合わせを適用する際の自己形成スフェロイドを形成するSRC活性の優位性が明らかとなる。管形成は、血管成分または幹細胞成分を添加することで増強されうる。オルガノイド形成期間中に、SRC群を有する培養液中に選択細胞群を添加することにより、再生転帰の間に活性化される重要な細胞シグナル伝達経路を繰り返しながら、機能性ユニットが形成されうる。そのような細胞−細胞相互作用としては、限定されないが、器官形成中に軸となることが知られている、上皮−間葉系シグナル伝達事象が挙げられる(Basu & Ludlow 2012,Developmental engineering the kidney−leveraging morphogenic principles for renal regeneration.Birth Defects Research Part C 96:30−38を参照のこと)。標準的な手順を用いてSRCが生成される一方で、内皮細胞株(HuVEC)は、オルガノイド(+)の組み合わせの例として用いられた。8000万個のSRCを、膜色素(Invitrogen、DiL赤色標識)を用いて標識し、そして、100mlのRCGM培地中、125mlのスピナーフラスコ中の、異なる膜色素(Invitrogen DiO緑色標識)で標識された2000万個のHuVECに、48時間、80rpmにて、添加した(図7)。SRCオルガノイド群単独もまた、対照として開始させた。オルガノイドが形成された時点で、管形成アッセイを、in vitro、ColI/IV 3Dゲル内で設定し、潜在的な同時血管新生を伴う、または伴わない管形成活性を確認した(図8)。
48時間にわたる、SPIO標識オルガノイドの細胞保持及び生体分布を評価するZSF1急性実験。6匹の40+週齢のZSF1ラットに、2.5x106 SPIOローダミン標識細胞(およそ25000の自己形成オルガノイド(PBSに溶解)を表す)を、50x106/mlの濃度で、左尾極において、実質へと注射した(図9)。3匹の動物を、移植後、24〜48時間の間隔で回収した。腎臓を、細胞保持及び生体分布に関して、MRIにより評価し、プルシアンブルー染色及びH&E染色法を用いて組織学的に評価した(図10と11)。
オルガノイドは、容易に標識及び標的化送達を追跡することができた。尿細管または糸球体コンパートメントにおいて、形態学的変化は観察されず、オルガノイド処置は耐容性良好であった。上皮細胞(プルシアンブルーにより陽性染色)の多焦点塊が、注入後24時間で、左腎の腎皮質(尿細管内/尿細管間)にしばしば観察され、48時間後には少なくなった。
ヒト由来SRC+SRC/SRC+オルガノイドを、免疫不全げっ歯類(NIHRNU(ヌード)ラット;無胸腺ラット)の、5/6腎摘出の慢性腎疾患モデルを用いて治療有効性に関して評価した。疾患状態の確率、治療介入モダリティ、及び治療応答の臨床評価は、従前に開示されている(Genheimer et al.,2012.Molecular characterization of the regenerative response induced by intrarenal transplantation of selected renal cells in rodent model of chronic kidney disease.Cells Tissues Organs 196:374−84)。
ヒト腎細胞を単離し、Presnell(2011)に開示されるように生検から増殖させた。細胞をサブ培養し、2回継代した後、凍結保存緩衝液(80%HTS/10%DMSO/10%FBS)において、20x106細胞/ml/バイアルの濃度で、−1℃/分の凍結速度で−80℃まで温度を下げて凍結保存し、次いで、長期保管のための液体窒素フリーザーに移した。凍結保存の後、細胞を急速に37℃まで溶解させ、回復と活性について、標準的なトリパンブルー排除法を用いて評価した。次いで、細胞を3000細胞/cm2で組織培養管に播種し、酸素正常状態(21%O2/5%CO2/37℃)で4日間、腎細胞増殖培地中で培養した。4日後、培養培地を交換し、培養物を、低酸素環境下(2%O2/5%CO2/37℃)で一晩インキュベートし、次いで、細胞を回収して、密度勾配分離によりSRCを選別した。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)培養物(Lonza 2389、CAT# CC2517)を、凍結保存後の早期継代から、EGM2が十分に補充された培地で3回継代するまで増殖させた。細胞を回収し、活性を、標準的なトリパンブルー排除法を用いて評価した。
オルガノイド培養は、1)ヒトSRC及びHUVECを、それぞれの培地中に2x106細胞/mlの濃度で再懸濁し、2)各細胞調製物25ml(50x106細胞/ml)の等量を125mlのスピナーフラスコ(Corning)へと混合させることにより確立させた。混合培養に対し、各培地25mlをフラスコに添加し、100ml中、最終細胞濃度は1x106細胞/mlとした。フラスコをインキュベーター内の磁気攪拌機に置き、80RPMの早さ、24時間培養した。
オルガノイドの投与量は、ラット腎臓当たり、およそ(2〜5x106細胞/50μl)が投与されるように調整された。オルガノイドの数は、輸送の間に生じる損失のために、より多い量のDPBS 0.5ml中で、上述の濃度に調整された。余剰管を補充分として送付した。FEDEXを介し、4〜8℃でCREDO cube shipperを用いて、2本の0.5mlマイクロ遠心管中で、投与物を移植施設へと送付した。
残った左腎は、左わき腹の切開により得た。送付する前に、穏やかに管底をタッピングまたはフリッキングすることによりオルガノイドを再懸濁した(ボルテックスは行わない)。オルガノイドを、18Gの丸い先端の針を用いてシリンジ内に吸引した。次いで、送付のために針を23Gの切断針に変えた。標的化送達は、50μLを腎臓の皮髄境界領域に注入することにより行われた。未処置対照動物には処置せず、何も手順を行わなかった。
オスのNIHRNUラット(8〜12週齢、体重は平均でおよそ200g)に、以下のように2工程の腎摘出術を行った。各個々の動物に対し、右腎を摘出し、重量を計測し、1週間回復させた後、左腎の頭頂及び尾極から組織を切除し、重量を計測した。実験を開始する前に、2〜3週間の回復と馴化を行った。馴化期間の後、血液と尿を連続して2週間、採取し、分析した。次のサンプリングは、その後の2週間毎に行われた。全てのラットに、市販の餌を与え、水は不断で与えた。
測定項目:体重(g)は、隔週ベースで記録された。血清生化学的評価、血液学的評価は、隔週ベースで、実験期間の間行われた。尿検査は隔週で行われた。予定通りの剖検の場合には、実験動物に対し肉眼的病理所見を作成し、残った腎臓を切除及び固定し、残りの動物身体をホルマリン固定した。全ての動物及び組織を必要に応じて採取し、重さを計測し、測定し、組織学的処理のために調製した。腎臓の組織学的評価に用いられる方法を行った。KMRは、腎質量の減少である。
ヒトNKOの有効性が、無胸腺ラットの腎不全モデルで示された。
無胸腺KMRモデルでの疾患進行は、従前に報告されている腎摘出モデルと一致しており、CKD関連後遺症(腎タンパク質処置、高窒素血症、高コレステロール血症、貧血及び尿毒症の発現を含む)があった。得られた疾患状態に関するNIHRNU腎摘出モデルの転帰は、質量減少の間は、摘出された腎組織の量に影響を受けており、本明細書において使用された動物は、臨床病理モニタリングと末端組織学的評価に基づき、ゆっくりとした早期ステージの疾患状態の進行を示した。
腎機能に関連した臨床病理学的測定結果を処置前に検証し、対の形式として、実験終了前に記録された測定結果と比較した。以下の表に要約されるように、この比較から、未処置の対照動物において、4か月にわたる実験中に、疾患が進行するにつれ変化が認められた。有意の差は、BUN、Hct、Hgb、RBC、WBC、sChol、sProt、sAlb、uPro、UPC、及びspGravの対比較で記録された。これらマーカーにおける変化は、早期ステージのCKDの典型であり、急性高窒素血症、終末期の尿細管濾過/濃縮の消失及びリン酸塩血症にはまだ至っていない腎機能低下の指標である。NKOで処置された動物においては、未処置対照動物の転帰を基に予測されるように、BUN、Hct、Hgb、RBC、WBC、及びspGravの変化は有意ではなかった(以下の表6を参照)。
組織学的検査により、対照動物は、中程度にまで進行し、最終的に殺処分されるまでに、腎症を発症したことが示された。
全ての動物(59%KMR)が、実験終了時(Tx後119日、及び腎摘出後204日)まで生存したため、NKO処置による明らかな生存率に関する利益は検出されなかった。
このモデルにはヒト産物の異種移植が可能であるため、ヒト細胞を識別する抗体の使用を介した、ラット腎臓内でのヒト細胞の追跡が可能であった。RKMラット腎臓のバックグラウンド内のヒトHLA1染色により、処置の4か月後に細胞を識別した(図12参照)。ヒト細胞の生着と一致しているとみなされた染色の同定は、二人の独立した検閲者によって確認された。各動物に対して染色された4つの切片のうちの1つにおいて、通常1または2の細胞が識別され、尿細管へと組み込まれていたが、1つの塊は間質内にあると識別された。
オルガノイド(NKO)送達により緩和された重要な変化は、対照動物において腎疾患の進行に関連したものであり、及び、疾患モデルへの同系/自己NKA送達により影響を受けた測定項目を含有していた。
影響を受けた測定項目は、疾患モデルへの同系/自己NKA送達で観察されたもの(貧血(Hct、Hgb、RBC)、炎症(WBC)、尿濃縮(spGrav)及び、場合によって、高窒素血症(BUN)の測定項目)と一致していた。
非常に小数のヒト細胞が、NKOプロタイプで処置を行ったおよそ4か月後に検出された。
ヌードラットの腎摘出(平均で59%KMR)により、早期ステージ及び慢性進行状態の腎不全の状態がもたらされた(貧血、蛋白尿、脂質異常症、及び場合によって早期ステージの高窒素血症の指標により特徴付けられる)。
全ての動物が、実験終了まで生存した。
ヒトオルガノイドをRKMモデルへと送達させるために用いられた手順は、耐容性良好であった。
成獣のオスブタ(Sus scrofa)における、貧血を伴う特発性進行性慢性腎疾患(CKD)の症例により、年齢を適合させた正常ブタ腎組織との直接比較を用いた細胞組成の評価及び特徴解析のための、新鮮な罹患腎組織がもたらされた。採取時点での腎組織の組織学的評価により、重篤なびまん性慢性間質性線維化及び多発性線維化を伴う半月体形成性糸球体腎炎により特徴付けられる腎疾患が確認された。臨床化学的検査により、高窒素血症(血中尿素窒素及び血清クレアチニンの上昇)及び、中程度の貧血(ヘマトクリットの中程度の低下及びヘモグロビンレベルの低下)が確認された。細胞を罹患腎組織及び正常腎組織の両方から単離、増殖及び特徴解析を行った。PresnellらのWO/2010/056328の図1に示されるように、Gomori's Trichrome染色により、正常腎組織と比較し、罹患腎組織において線維化が顕著に認められる(矢印により示されている青色染色)。キュビリン(cubulin):メガリン(megalin)を発現し、受容体介在性アルブミン移送を行うことができる機能性尿細管細胞は、正常及び罹患腎組織の両方から増殖していた。エリスロポエチン(EPO)発現細胞もまた、培養中に存在しており、複数回の継代及び凍結/融解サイクルを通して維持された。さらに、分子学的分析により、正常及び罹患組織由来のEPO発現細胞が、EPO及び他の低酸素制御遺伝子標的(vEGFを含む)のHIF1α駆動性の誘導を伴うin vitro低酸素状態に反応したことが確認された。コラゲナーゼ+ディスパーゼを用いた酵素消化を介して、細胞をブタ腎組織から単離し、及び、1回の機械的消化及び移植片培養を行うことにより、別の実験においてもまた単離した。2回継代した時点で、移植片由来細胞培養(epo発現細胞を含有)を、大気状態(21%)及び変動低酸素状態(<5%)培養条件の両方に供し、低酸素状態に曝すことで、EPO遺伝子発現がアップレギュレートされるかどうかを測定した。げっ歯類培養で示したように(実施例3を参照)、正常なブタは、EPO遺伝子の酸素依存性の発現及び制御を呈した。驚いたことに、CKDブタは尿毒症状態/貧血状態であるにもかかわらず(ヘマトクリット<34、クレアチニン>9.0)、EPO発現細胞は、組織から容易に単離及び増殖し、EPO遺伝子の発現は低酸素制御された状態を維持していた(PresnellらのWO/2010/056328の図2に示される。その全体で参照により本明細書に援用される)。PresnellらのWO/2010/056328(その全体で参照により本明細書に援用される)の図3に示されるように、増殖培養中の細胞は、尿細管様構造への自己組織化能力を示した。PresnellらのWO/2010/056328(その全体で参照により本明細書に援用される)の図4に示されるように、培養中の機能性尿細管細胞の存在(3継代目)は、培養細胞による、受容体介在性のFITC結合アルブミンの取り込みが観察されたことにより確認された。緑色のドット(薄白の矢印により示されている)は、尿細管細胞特異的受容体(メガリン及びキュビリン)により介在される、フルオレセイン結合アルブミンのエンドサイトーシスを表し、このことから、機能性尿細管細胞によるタンパク質の再吸収が示唆される。青色染色(薄白矢印により示される)は、Hoescht染色された核である。まとめると、これらのデータから、ブタの腎組織(たとえCKDに罹患し重度に弱っている腎組織であっても)から機能性尿細管及び内分泌細胞を単離、増殖させることができることが示される。さらに、これらの結果から、自己細胞をベースとした、CKD治療のための治療用製品の利点が支持される。
腎細胞単離:簡潔に述べると、10のバッチ、2週齢のオスのLewisラットの腎臓を、供給業者(Hilltop Lab Animals Inc.)から購入し、Viaspan保存培地中、約4℃で一晩輸送した。本明細書に開示される全ての工程は、滅菌性を保つために生物学的安全キャビネット(BSC)中にて行われた。腎臓をHank's平衡塩溶液(HBSS)中で3回洗浄し、Viaspan保存培地を洗い流した。3回の洗浄の後、残った腎臓被膜を、残りの間質組織と共に除去した。大腎杯もまた、マイクロ切開技術を用いて除去した。次いで、滅菌外科用メスを用いて腎臓を細かくスラリーへと分割した。次いで、スラリーを50mlのコニカル遠心管へと移し、重量を計測した。少しのサンプルをRNAのために採取し、RNAseフリーの滅菌1.5mlマイクロ遠心管へと入れ、液体窒素中で急速冷凍した。凍結した時点で、分析を行うまで−80℃の冷凍庫へと移した。10の幼齢動物の腎臓の組織重量はおよそ1gであった。バッチ重量に基づき、消化培地を調整し、組織1g当たり、20mlの消化培地とした。この手順のための消化緩衝液は、HBSSに溶解した4ユニットのディスパーゼ1(Stem Cell Tech)、300ユニット/mlのIV型コラゲナーゼ(Worthington)と5mMのCaCl2(Sigma)を含有した。
培養のための清浄で、増殖可能な細胞群を得るために、細胞懸濁液を「腎細胞単離」で上述されたように作製した。任意選択の工程として、及び、最初の調製物を清浄化する手段として、滅菌東宝緩衝液中で懸濁された、最大で100万個のトータル細胞を、60%(w/v)イオジキサノールのストックから室温で調製した等量の30%Optiprep(登録商標)と1:1で完全に混合し(最終的に15%w/v Optiprep溶液となる)、6回転倒混和することにより完全に混合させた。混合した後、1mlのPBS緩衝液を混合細胞懸濁液の上に注意深く重ねた。次いで、勾配チューブを注意深く遠心管に入れ、適切なバランスを取った。勾配チューブを、800xgで、15分間、25℃にてブレーキをかけずに遠心した。清浄化された細胞群(増殖能があり、機能性の集合尿細管細胞、尿細管細胞、内分泌細胞、糸球体細胞及び血管細胞を含有する)を、6%〜8%(w/v)のOptiprep(登録商標)(1.025〜1.045g/mLの密度に相当)で分割させた。他の細胞及び残渣は、チューブの底に沈殿した。
混合細胞バンド及びペレットを、次いで、組織培養処置三重フラスコ(NuncT500)またはその均等物に、抗生物質/抗真菌物質を有する、DMEM(高グルコース)/KSFM(5%(v/v)FBS、2.5μg EGF、25mg BPE、1X ITS(インスリン/トランスフェリン/セレナイトナトリウム培地補充物))の50:50の混合物150ml中、30,000細胞/cm2の細胞濃度で播種した。細胞を、加湿した5%CO2インキュベーター(細胞に21%の大気酸素レベルを供給する)で2〜3日間培養した。2日後、培地を交換し、培養物を、CO2/窒素ガスのマルチガス加湿インキュベーター(Sanyo)により供給される2%酸素レベル環境下に、24時間置いた。24時間のインキュベート後、細胞を60mlの1xPBSで洗浄し、次いで、40mlの0.25%(w/v)トリプシン/EDTA(Gibco)を用いて回収した。回収した時点で、細胞懸濁液を、等量のKSFM(10%FBS含有)を用いて中和した。次いで、細胞を300xgで10分間遠心することにより洗浄した。洗浄後、細胞を20mlのKSFMに再懸濁し、50mlのコニカルチューブに移し、細胞計数のためのサンプルを採取した。トリパンブルー排除法を用いて活性のある細胞を計数した時点で、100万個の細胞を、RNAサンプルのために採取し、PBSで洗浄し、液体窒素中で急速冷凍した。細胞を再度PBSで洗浄し、300xg、5分間遠心することにより回収した。洗浄した細胞ペレットを、3750万個の細胞/mlの濃度でKSFMに再懸濁した。
培養した腎細胞(主に腎尿細管細胞から構成されるが、他の細胞群(集合尿細管、糸球体、血管及び内分泌系)も小数含有する)を、イオジキサノール(Optiprep)の複数の濃度w/vから作製された密度段階勾配を用いて、その構成要素亜群に分離した。培養物を、採取と勾配への適用の前に低酸素環境下に24時間置いた。段階づけられた勾配は、15mlの滅菌コニカルチューブ中に、互いに上に4つの異なる密度の培地を重ねることにより作製された(最も高い密度を有する溶液を底に置き、最も低い密度の溶液を一番上に重ねる)。細胞を段階勾配の一番上に置き、遠心することにより、サイズと粒度に基づき、複数のバンドへと群が分割される。
プロトタイプB2及びB4の分布及び組成に対する酸素条件の影響を測定するために、異なる種由来の新しい腎細胞調製物を、勾配工程の前に、異なる酸素条件に曝した。げっ歯類の新しい腎増殖(NKA)細胞調製物(RK069)は、上述の標準的なラット細胞単離及び培養開始のための手順を用いて確立された。全てのフラスコは、21%(大気)酸素条件下で、2〜3日間培養された。培地を交換し、次いで、フラスコの半分を、酸素制御されたインキュベーター(2%酸素に設定)へと移し、残ったフラスコは21%酸素条件にさらに24時間維持された。次いで、上述の標準的な酵素による回収手順を用いて、各設定条件から細胞を回収した。段階勾配は、標準的な手順に従い調製され、「正常酸素」(21%酸素)及び「低酸素」(2%酸素)培養は別々に回収され、同じ段階勾配に一緒に適用した(図27)。4つのバンドとペレットが両方の条件下において生成されたが、勾配全体の細胞分布は21%と2%の酸素培養バッチで異なっていた(表3)。具体的には、B2の収量は低酸素条件で増加し、B3で減少した。さらに、B4特異的遺伝子(たとえば、エリスロポエチン)の発現は、低酸素培養細胞から作製された勾配で増強されていた(PresnellらのWO/2010/056328、図73)。
本明細書に開示される酵素単離方法により、正常なヒト腎組織から尿細管及び糸球体細胞を単離し、増殖させた。上述の勾配法により、尿細管細胞分画をex vivo及び培養後に富化した。PresnellらのWO/2010/056328、図68(その全体で参照により本明細書に援用される)に示されるように、表現型の特性は、単離中及び増殖中に維持されていた。尿細管細胞の機能(標識アルブミンの取り込みにより評価された)もまた、繰り返しの継代と凍結保存の後に維持されていた。PresnellらのWO/2010/056328、図69(その全体で参照により本明細書に援用される)において、尿細管富化群及び尿細管欠落群が3D動的培養で培養された場合、尿細管マーカー(カドヘリン)発現の著しい増加が、尿細管富化群で現れた。このことにより、細胞が3D動的環境下で培養された際に最初の富化を超えて尿細管細胞の富化が、維持され得たことが確認される。実施例7に上述される、同じ腎細胞培養群を、フローサイトメトリー分析に供し、フォワードスキャッターとサイドスキャッターを検証した。この小さく、粒度の小さいEPO産生細胞群は識別可能であり(8.15%)、フローサイトメーターのソーティング能力を用いて、当該小さく、粒度の小さい群の陽性選択を介して、分離された(PresnellらのWO/2010/056328、図70(その全体で参照により本明細書に援用される))。
自己免疫性糸球体腎炎患者の試料から、腎細胞の未分画混合物を上述のように単離した。腎組織から単離及び増殖された腎細胞の特定の亜群の、偏りのない遺伝子型組成を測定するために、定量的リアルタイムPCR(qRTPCR)分析(Brunskillら、上記、2008)を行って、細胞亜分画の間で、異なる細胞型に特異的な、及び、経路特異的な遺伝子発現パターンを特定した。IlaganらのPCT/US2011/036347の表6.1に示されるように、HK20は、自己免疫性糸球体腎炎患者の試料である。IlaganらのPCT/US2011/036347の表6.2に示されるように、HK20から生成された細胞は、糸球体細胞を欠いている(qRTPCRにより測定)。
蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)を用いて、単離初代腎組織から、1以上の単離腎細胞を富化させても良く、及び/または、1以上の特定の腎細胞型を、枯渇させても良い。
70%エタノール;洗浄緩衝液(PBS);50:50腎細胞培地(50%DMEM高グルコース):50%角化細胞−SFM;トリパンブルー0.4%;標的腎細胞群に対する一次抗体(たとえば、腎内皮細胞に対するCD31、及び、腎糸球体細胞に対するネフリン)。対応するアイソタイプ特異的蛍光二次抗体;染色緩衝液(PBSに溶解した0.05%BSA)
生物学的安全キャビネット(BSC)を清浄化するための標準的な手順を行った後、初代単離物、または培養細胞のいずれか由来の腎細胞の単一細胞懸濁液を、T500T/C処置フラスコから得て、腎細胞培地に再懸濁し、氷上に置いても良い。次いで、細胞数と活性を、トリパンブルー排除法を用いて測定する。たとえば、異種群由来の糸球体細胞または内皮細胞等の腎細胞富化/枯渇に関しては、少なくとも70%の活性を有する10〜50x106生細胞が得られる。次いで、異種腎細胞群を、標的細胞型に特異的な一次抗体で染色する(開始濃度は1μg/0.1ml(染色緩衝液)/1x106細胞(もし必要であれば力価))。標的抗体は、結合されていても(たとえばCD31 PE(腎内皮細胞に特異的))、または、結合されていなくても良い(たとえばネフリン(腎糸球体細胞に特異的))。
1以上の単離腎細胞を富化しても良く、及び/または、1以上の特定の腎細胞型を、単離初代腎組織から枯渇させても良い。
70%エタノール、洗浄緩衝液(PBS)、50:50腎細胞培地(50%DMEM高グルコース):50%角化細胞−SFM、トリパンブルー0.4%、泳動緩衝液(PBS、2mM EDTA、0.5% BSA)、リンス緩衝液(PBS、2mM EDTA)、クリーニング溶液(70%v/vエタノール)、Miltenyi FCRブロッキング試薬、Miltenyiマイクロビーズ(IgGアイソタイプ、標的抗体(たとえばCD31(PECAM)またはネフリン)または二次抗体のいずれかに特異的)。
生物学的安全キャビネット(BSC)を清浄化するための標準的な手順を行った後、初代単離物、または培養物のいずれか由来の腎細胞の単一細胞懸濁液を得て、腎細胞培地に再懸濁する。細胞数と活性を、トリパンブルー排除法を用いて測定する。たとえば、異種群由来の糸球体細胞または内皮細胞等の腎細胞富化/枯渇に関しては、少なくとも70%の活性を有する少なくとも10x106〜4x109生細胞が得られる。
本実験の目的は、高含量分析(HCA)を介してヒトNKA細胞の機能的特徴を測定することである。高含量イメージング(HCI)により、多数の試料の、複数の細胞内事象の2以上の蛍光プローブを用いた(マルチプレックス)同時イメージングがもたらされる。高含量分析(HCA)により、高含量イメージングで捕捉された複数の細胞パラメーターの同時定量的測定がもたらされる。簡潔に述べると、未分画(UNFX)培養を生成し(Aboushwarebら、上記、2008)、標準的な生検法を用いて進行した慢性腎疾患(CKD)を有する5人のヒト腎臓、及び非CKDの3人のヒト腎臓から採取されたコア生検から、独立して維持される。ex vivoでUNFXを2回継代した後、細胞を回収し、密度勾配法(実施例2に記述)に供し、亜分画(B2、B3及び/またはB4亜分画を含有)を生成する。
24ウェルのIV型コラーゲンプレート(BD Biocoat(商標))でコンフルエントまで増殖した細胞の培養培地を、1x抗真菌物質/抗生物質と2mMグルタミンを含有する、フェノールレッドフリー、血清フリー、低グルコースDMEM(pr−/s−/Ig DMEM)と18〜24時間置き換えた。分析を行う直前に、細胞を洗浄し、pr−/s−/lg DMEM+10mM HEPES、2mMグルタミン、1.8mM CaCl2、及び1mM MgCl2と30分間インキュベートした。細胞を、25μg/mLローダミン結合ウシアルブミン(Invitrogen)に30分間曝し、氷冷PBSを用いて洗浄し、エンドサイトーシスを停止させ、ただちに2%パラホルムアルデヒド(25μg/mLのヘキスト核色素を含有)を用いて固定した。阻害実験に対しては、1μMの受容体関連タンパク質(RAP)(Ray Biotech,Inc.,Norcross GA)をアルブミン添加の10分前に添加した。顕微鏡イメージングと分析を、BD Pathway(商標)855 High−Content BioImager(Becton Dickinson)を用いて行った(Kelley et al.Am J Physiol Renal Physiol.2010 Nov;299(5):F1026−39.Epub Sep 8,2010を参照のこと)。
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Claims (38)
- 異種腎細胞群及び生物活性のある非腎細胞群を含有するスフェロイドであって、該異種腎細胞群は、腎尿細管細胞が富化され、生物活性のある非腎細胞群が、非腎内皮細胞群、非腎内皮前駆細胞群、非腎間葉系幹細胞群、または非腎脂肪由来前駆細胞群である、スフェロイド。
- 生物活性のある非腎細胞群が、非腎内皮細胞群である、請求項1に記載のスフェロイド。
- 内皮細胞群が、細胞株である、請求項2に記載のスフェロイド。
- 内皮細胞群が、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を含む、請求項3に記載のスフェロイド。
- 内皮細胞群の細胞が、CD31を発現する、請求項1から4のいずれか1項に記載のスフェロイド。
- 生物活性のある非腎細胞群が、間葉系幹細胞群である、請求項1に記載のスフェロイド。
- 生物活性のある非腎細胞群が、脂肪由来前駆細胞群である、請求項1に記載のスフェロイド。
- 異種腎細胞群が、内分泌細胞、血管細胞、及び糸球体細胞をさらに含む、請求項1から7のいずれか1項に記載のスフェロイド。
- 腎尿細管細胞が、近位尿細管細胞を含む、請求項1から8のいずれか1項に記載のスフェロイド。
- 異種腎細胞群の細胞が、低酸素耐性及びイオジキサノール耐性である、請求項1から8のいずれか1項に記載のスフェロイド。
- 異種腎細胞群が、受容体介在性アルブミン移送をすることのできる細胞を含む、請求項1から10のいずれか1項に記載のスフェロイド。
- 異種腎細胞群が、ヒアルロン酸合成酵素2を発現する腎尿細管細胞を含む、請求項1から11のいずれか1項に記載のスフェロイド。
- 異種腎細胞群の細胞が、GGT−1及びCK18を発現する、請求項1から12のいずれか1項に記載のスフェロイド。
- 異種腎細胞群が、エリスロポエチン(EPO)産生細胞を含む、請求項1から13のいずれか1項に記載のスフェロイド。
- 異種腎細胞群及び生物活性のある非腎細胞群が、異種、同系、同種、または自己である、請求項1から14のいずれか1項に記載のスフェロイド。
- スフェロイドの形成方法であって、
(a)異種腎細胞群及び生物活性のある非腎細胞群を混合すること、及び
(b)該異種腎細胞群及び該生物活性のある非腎細胞群を、スフェロイドが形成されるまで3D培養システム中で培養すること、を含み、
該異種腎細胞群は、腎尿細管細胞が富化され、生物活性のある非腎細胞群が、非腎内皮細胞群、非腎内皮前駆細胞群、非腎間葉系幹細胞群、または非腎脂肪由来前駆細胞群である、スフェロイドの形成方法。 - 3D培養システムが、スピナーフラスコを含む、請求項16に記載の方法。
- 生物活性のある非腎細胞群が、内皮細胞群である、請求項16または17に記載の方法。
- 内皮細胞群が、細胞株であるか、または、HUVEC細胞を含有する、請求項18に記載の方法。
- 異種腎細胞群及び生物活性のある非腎細胞群が、異種、同系、同種、または自己である、請求項16から19のいずれか1項に記載の方法。
- 異種腎細胞群及び生物活性のある非腎細胞群が、第一の期間の間は別々に培養され、第二の期間の間に、混合され、及び培養される、請求項16から20のいずれか1項に記載の方法。
- 第二の期間が、少なくとも24時間である、請求項21に記載の方法。
- 第二の期間が、24時間〜72時間である、請求項21に記載の方法。
- 腎細胞群及び生物活性のある非腎細胞群が、1:1の比率であるか又は増殖培地中に懸濁されている、請求項16から20のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1つの請求項1から15のいずれか1項に記載のスフェロイド、及び、液体培地を含有する、注射可能な製剤。
- 液体培地が、細胞増殖培地、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項25に記載の製剤。
- スフェロイドが、液体培地中に懸濁されている、請求項25に記載の製剤。
- 請求項1から15のいずれか1項に記載のスフェロイド、及び、
(i)約8℃以下で実質的に固形状態、及び、
(ii)およそ環境温度以上で実質的に液体状態、
を維持する温度感受性細胞安定化バイオマテリアルを含有する、注射可能な製剤。 - (i)スフェロイドが、実質的に、細胞安定化バイオマテリアルの体積全体に均一に分散されており、(ii)バイオマテリアルは、約8℃〜およそ環境温度以上で、固形−液体の遷移状態を有し、(iii)実質的に固形状態とは、ゲル状態であり、(iv)細胞安定化バイオマテリアルは、ハイドロゲルを含有する、請求項28に記載の製剤。
- ハイドロゲルが、ゼラチンを含有する、請求項29に記載の製剤。
- ゼラチンが、約0.5%〜約1%(w/v)で、または、約0.75%(w/v)で、製剤中に存在する、請求項30に記載の製剤。
- 必要のある対象において腎疾患を治療するための、請求項1から15のいずれか1項に記載のスフェロイド。
- 必要のある対象において腎疾患を治療するための注射可能な製剤であって、請求項28から31のいずれか1項に記載の製剤を含む、注射可能な製剤。
- 対象が哺乳類である、請求項32に記載のスフェロイド、または、請求項33に記載の注射可能な製剤。
- 哺乳類がヒトである、請求項34に記載のスフェロイドまたは注射可能な製剤。
- 対象が腎疾患を有している、請求項34に記載のスフェロイドまたは注射可能な製剤。
- 以下の基準のうちのいずれか1つにおける改善が認められる、請求項32に記載のスフェロイド、または、請求項33に記載の注射可能な製剤:
貧血(Hct、Hgb、RBC)、炎症(WBC)、尿濃縮(spGrav)及び高窒素血症(BUN)。 - 腎疾患が慢性腎疾患である、請求項34から37のいずれか1項に記載のスフェロイドまたは注射可能な製剤。
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