JP2019196342A - スタチン封入ナノ粒子製剤、それを含有する歯髄由来幹細胞及びそれを含む細胞製剤。 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞製剤として用いられる幹細胞の機能を向上して、疾患に対する治療効果を向上できるようにする。【解決手段】本発明は、スタチンが生体吸収性ポリマーを含むナノ粒子に封入されてなるスタチン封入ナノ粒子を含む、歯髄由来幹細胞の機能を増強するためのスタチン封入ナノ粒子製剤である。【選択図】なし

Description

本発明は、スタチン封入ナノ粒子製剤、それを含有する歯髄由来幹細胞及びそれを含む細胞製剤に関する。

スタチンは、肝臓でのコレステロール生合成の律速酵素であるＨＭＧ‐ＣｏＡ還元酵素を阻害する化合物として知られている。スタチンにより、血液中のコレステロール値を低下できるので、高コレステロール血症の治療薬に用いられている。また、スタチンは、高コレステロール血症以外にも、その抗炎症作用によって狭心症や心筋梗塞といった虚血性心疾患、及び動脈硬化等の疾患に有効であることも臨床試験により明らかとなっている。

これまでに、スタチンによる疾患の治療効果の向上や、副作用の低減のために種々の研究が行われており、例えば特許文献１には、血管新生の促進を目的としてスタチンを投与する場合に、スタチンをナノ粒子に封入し、そのスタチン封入ナノ粒子を患者に局所投与することで、これまでよりも少量のスタチンで血管新生を促進できることが開示されている。

スタチンは、上述の通り、種々の作用を示しており、他にも抗炎症作用を有するので炎症性疾患への適用についても盛んに研究がなされており、例えば非特許文献１には、スタチンの一種であるシンバスタチンがマウス炎症性腸疾患モデルにおいて、抗炎症作用を示すことが開示されている。また、非特許文献２には、クローン病患者に対するアトルバスタチンの抗炎症効果について記載されている。

また、近年、多能性を有する幹細胞を用いて、種々の疾患を治療する研究も行われている。幹細胞は、一般に胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や、骨髄由来幹細胞及び脂肪由来幹細胞等の間葉系の体性幹細胞の他、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等が知られており、種々の研究に用いられている。中でも、脂肪由来幹細胞に関する研究が急速に発展し、各種疾患に対する再生医療の臨床試験が広く行われている。例えば非特許文献３には、脂肪組織由来の幹細胞を、心筋梗塞モデルマウスの心筋に直接に投与することにより、心臓の機能の改善及び梗塞サイズの減少が認められた旨が開示されている。また、脂肪由来幹細胞は、再生医療のみならず、薬剤誘発性腸炎マウスモデルにおいて腸炎抑制効果を示すことも報告されている（例えば非特許文献４を参照）。

特開２０１２−２１００２号公報

阿部洋介ら, 潰瘍, 37(2010), 169-173. Grip, O et al, Br J Pharmacol. 155(2008), 1085-1092. Masaaki Ii et al., Laboratory Investigation (2011) 91, 539-552 Gonzalez, MA et al. Gastroenterology 136(2009), 978-989.

心筋梗塞等の虚血性心疾患を治療するために、例えば上記特許文献１に開示されているようなスタチン封入ナノ粒子を投与する場合、上述のとおり、スタチン封入ナノ粒子を患者に局所投与することで、これまでよりも少量のスタチンで有効性が認められるが、患部への局所投与が必要であり、投与が簡便でなく、有効性のさらなる向上も望まれる。また、局所投与を用いずに静脈内投与等を用いる場合は、より多くの容量が必要となり、副作用が生じるおそれもある。

一方、非特許文献３に開示されているように、幹細胞を用いて心筋梗塞等の虚血性心疾患を治療する場合も、幹細胞の患部への局所投与が必要であり、例えばマウスの心筋に投与する場合、治療効果を得るために５×１０^５ｃｅｌｌｓ／マウスもの量の細胞を必要としている。幹細胞としては、例えば間葉系に由来する体性幹細胞を用いることができ、そのような幹細胞は骨髄や脂肪組織から得ることができるが、一度に得られる幹細胞の量には限りがあるため、幹細胞を上記治療等に用いる場合、用いる細胞数は少ない方が好ましい。このように、より少ない数の幹細胞によって、優れた治療効果を得るためには、その幹細胞の種々の機能を向上させる必要がある。

また、炎症性疾患を治療するために、例えば上記非特許文献１及び２に開示されているようにスタチンを用いる際に、スタチンの効果をより効率的に発揮できるようにするために、例えば特許文献１に開示するようにスタチンをナノ粒子に封入し、当該スタチン封入ナノ粒子を患者に投与することが考えられる。しかしながら、特許文献１では、スタチン封入ナノ粒子を患者に局所投与しており、このようにすることで、これまでよりも少量のスタチンで有効性が認められるが、投与したスタチンナノ粒子がマクロファージに貪食されるなどして不均一に病巣に分布しやすく安定した治療効果が得られにくい。

一方、非特許文献４に開示されているように、幹細胞のみを用いて炎症性疾患を治療する場合においても、幹細胞の患部への局所投与が必要であり、大量の細胞を必要とするため、コストや時間がかかるだけでなく細胞投与時の副作用の出現頻度も増加する。さらに、自家細胞移植を想定した場合、脂肪組織が少なく分離できる幹細胞が少ない、あるいは、高齢・糖尿病などの代謝疾患の因子により幹細胞機能が低下した症例では、少ない数の幹細胞によって優れた治療効果を得るために、その幹細胞の種々の機能を向上させる必要がある。

本発明は、前記の問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、細胞製剤として用いられる幹細胞の機能を向上して、疾患に対する治療効果を向上できるようにすることにある。

前記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究した結果、スタチンがナノ粒子に封入されてなるスタチン封入ナノ粒子を歯髄由来幹細胞に含有させることにより、その幹細胞の機能が増強し、スタチンを所望の患部に効率よく送達できて、虚血性疾患や炎症性疾患等の種々の疾患の治療において高い効果を示すことを見出して本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである：
本発明の一態様は、
〔１〕スタチンが生体吸収性ポリマーを含むナノ粒子に封入されてなるスタチン封入ナノ粒子を含む、歯髄由来幹細胞の機能を増強するためのスタチン封入ナノ粒子製剤に関する。

本発明に係るスタチン封入ナノ粒子製剤は、歯髄由来幹細胞に処理されることにより、その処理された歯髄由来幹細胞の機能を増強することができ、その歯髄由来幹細胞を生体内に投与することにより、種々の有効性を示す。具体的に、幹細胞に本発明に係るスタチン封入ナノ粒子製剤を処理すると、処理された歯髄由来幹細胞は、ファゴサイトーシスによりスタチン封入ナノ粒子を取り込み、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ歯髄由来幹細胞は、遊走能及び血管新生因子の産生能の増強に加えて、免疫抑制能が増強する。このため、種々の疾患を患う患者の体内に、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子が処理された歯髄由来幹細胞を投与することにより、幹細胞の増強された上記機能と該幹細胞から徐放されるスタチンの作用により、種々の優れた疾患治療効果を示す。

ここで、本発明のスタチン封入ナノ粒子製剤の一実施の形態は、
〔２〕生体吸収性ポリマーが、ポリ乳酸重合体（poly lactic acid：ＰＬＡ）またはポリ乳酸グリコール酸共重合体（poly(lactic-co-glycolic acid)：ＰＬＧＡ）であることを特徴とする。

ＰＬＡ及びＰＬＧＡは体内で加水分解されることにより、封入したスタチンを放出することができ、また、ＰＬＡはその加水分解により乳酸に分解され、ＰＬＧＡはその加水分解により乳酸とグリコールとに分解され、それぞれ最終的に水と炭酸ガスとなり、ヒト等の動物に対して無害であるため、ＰＬＡまたはＰＬＧＡをナノ粒子材料として用いることは極めて好ましい。

また、本発明のスタチン封入ナノ粒子製剤の一実施の形態は、
〔３〕増強される歯髄由来幹細胞の機能が、遊走能及び血管新生因子の産生能の少なくともいずれか１つであることを特徴とする。
また、本発明のスタチン封入ナノ粒子製剤の一実施の形態は、
〔４〕上記〔１〕または〔２〕に記載のスタチン封入ナノ粒子製剤であって、歯髄由来幹細胞の機能の増強がＨＧＦの発現の亢進である

また、本発明の別の態様は、
〔５〕スタチンが生体吸収性ポリマーを含むナノ粒子に封入されてなるスタチン封入ナノ粒子を含むスタチン封入ナノ粒子製剤であって、虚血性疾患、炎症性疾患、または、神経変性疾患を治療するための歯髄由来幹細胞を含む細胞製剤の治療効果を増強するためのスタチン封入ナノ粒子製剤に関する。

また、本発明の別の態様は、
〔６〕スタチンが生体吸収性ポリマーを含むナノ粒子に封入されてなるスタチン封入ナノ粒子を含むスタチン封入ナノ粒子製剤であって、炎症性疾患または神経変性疾患を治療するための歯髄由来幹細胞または脂肪由来幹細胞を含む細胞製剤の治療効果を増強するためのスタチン封入ナノ粒子製剤に関する。

また、本発明の別の態様は、
〔７〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のスタチン封入ナノ粒子製剤を含有する歯髄由来幹細胞に関する。
このような本発明に係る歯髄由来幹細胞は、上記スタチン封入ナノ粒子を含有しているため、上述のとおり、該スタチン封入ナノ粒子により細胞機能が増強され、虚血性疾患をはじめ各種疾患の治療に優れた効果を発揮できる。

また、本発明の別の態様は、
〔８〕上記〔７〕に記載の歯髄由来幹細胞を含む虚血性疾患治療用の細胞製剤に関する。
また、本発明の別の態様は、
〔９〕上記〔７〕に記載の歯髄由来幹細胞を含む炎症性疾患治療用の細胞製剤に関する。
また、本発明の別の態様は、
〔１０〕上記〔７〕に記載の歯髄由来幹細胞を含む神経変性疾患治療用の細胞製剤に関する。
また、本発明の別の態様は、
〔１１〕上記〔７〕〜〔１０〕のいずれかに記載の細胞製剤であって、動脈投与用、静脈投与用または局所投与用であることを特徴とする。
本発明に係る歯髄由来幹細胞は、医薬として許容可能な溶媒及び賦形剤と混合して細胞製剤として製剤化することも可能である。本発明に係る幹細胞の生体内への投与は、開腹等の手術が不必要であることが好ましく、静脈内投与用または動脈内投与用の細胞製剤として製剤化されていることが好ましい。このようにすると、簡便に患者に本発明に係る幹細胞を投与することができる。本発明に係る機能増強幹細胞製剤は、幹細胞の機能が増強されているため、局所投与ではなく、静脈内投与または動脈内投与であっても少ない投与量で高い効果を得ることができる。また、本発明に係る機能増強幹細胞製剤は、動脈内投与をすることで、特に静脈内投与では到達させることが困難な腸等の炎症部に幹細胞を集積させることができる。従って、局所投与をする必要がなく、動脈内投与を用いることで、少ない容量で均一に細胞を病巣に分布させて安定した高い効果を得ることができる。
また、本発明の別の態様は、
〔１２〕神経炎症に関連する疾患を治療するための歯髄由来幹細胞を含む細胞製剤に関する。

本発明に係るスタチン封入ナノ粒子製剤、それを含有する歯髄由来幹細胞及びそれを含む細胞製剤によると、歯髄由来幹細胞の機能を増強することができ、該幹細胞を生体内に投与することにより、種々の疾患に対して優れた治療効果が得られる。

スタチン封入ナノ粒子を処理した歯髄由来幹細胞の遊走性の測定結果を示すグラフである。 スタチン封入ナノ粒子を処理した歯髄由来幹細胞及び脂肪由来幹細胞のＨＧＦ発現量の測定結果を示すグラフである。 ＰＢＳまたは歯髄由来幹細胞を投与して５３日後の心筋梗塞モデルマウスの心臓を示す写真である。 スタチン封入ナノ粒子を含む歯髄由来幹細胞または脂肪由来幹細胞を投与して５３日後の心筋梗塞モデルマウスの心臓を示す写真である。 ＰＢＳを投与した心筋梗塞モデルマウスの心臓の梗塞部の切片をマッソン・トリクローム染色した結果を示す写真である。 歯髄由来幹細胞を投与した心筋梗塞モデルマウスの心臓の梗塞部の切片をマッソン・トリクローム染色した結果を示す写真である。 スタチン封入ナノ粒子を含む脂肪由来幹細胞を投与した心筋梗塞モデルマウスの心臓の梗塞部の切片をマッソン・トリクローム染色した結果を示す写真である。 スタチン封入ナノ粒子を含む歯髄由来幹細胞を投与した心筋梗塞モデルマウスの心臓の梗塞部の切片をマッソン・トリクローム染色した結果を示す写真である。 （ａ）はＰＢＳ、歯髄由来幹細胞、スタチン封入ナノ粒子を含む脂肪由来幹細胞またはスタチン封入ナノ粒子を含む歯髄由来幹細胞を投与した心筋梗塞モデルマウスの心臓の梗塞部の切片における繊維化部分の面積を示すグラフであり、（ｂ）はそれら切片における繊維化部分の長さを示すグラフであり、（ｃ）は各切片における繊維化部分の心筋壁の厚さを示すグラフである。 ＰＢＳ、歯髄由来幹細胞、スタチン封入ナノ粒子を含む脂肪由来幹細胞またはスタチン封入ナノ粒子を含む歯髄由来幹細胞を投与した心筋梗塞モデルマウスの心臓の超音波診断を行った結果を示すグラフであり、（ａ）は左室拡張末期径（ＬＶＤｄ）を示し、（ｂ）は左室内径短縮率（ＦＳ）を示している。 ＰＢＳ、歯髄由来幹細胞、スタチン封入ナノ粒子を含む脂肪由来幹細胞またはスタチン封入ナノ粒子を含む歯髄由来幹細胞を投与した心筋梗塞モデルマウスの心臓の梗塞部の切片をイソレクチンＢ４により染色し、血管密度を計測した結果を示し、（ａ）は切片を染色した後の顕微鏡写真を示し、（ｂ）は計測された血管密度を示すグラフである。 ＰＢＳ、歯髄由来幹細胞、スタチン封入ナノ粒子を含む脂肪由来幹細胞またはスタチン封入ナノ粒子を含む歯髄由来幹細胞を投与した認知症モデルマウスの記憶解析の結果である。（ａ）はバーンズ迷路試験においてターゲットホールを見つけてエスケープケージに入るまでのマウスの移動距離を示すグラフであり、（ｂ）は該エスケープケージに入るまでの時間を示すグラフである。 ＰＢＳ、歯髄由来幹細胞、スタチン封入ナノ粒子を含む脂肪由来幹細胞またはスタチン封入ナノ粒子を含む歯髄由来幹細胞を投与した変形性関節症モデルマウスに対して、Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験を行った結果を示し、（ａ）は投与から２週間後において、逃避反応を起こす閾値をスコア化したものを示し、（ｂ）は投与日におけるスコアに対する投与から２週間後におけるスコアの割合を示す。 ＰＢＳ、歯髄由来幹細胞、スタチン封入ナノ粒子を含む脂肪由来幹細胞またはスタチン封入ナノ粒子を含む歯髄由来幹細胞を投与した変形性関節症モデルマウスの関節軟骨組織の組織学的解析結果を示す写真である。 （ａ）及び（ｂ）はＰＢＳ、歯髄由来幹細胞、スタチン封入ナノ粒子を含む脂肪由来幹細胞またはスタチン封入ナノ粒子を含む歯髄由来幹細胞を投与した変形性関節症モデルマウスの関節損傷度のスコアリング結果を示すグラフである。 正常マウスとＳｈｎ−２ＫＯマウスの巣作り行動解析結果を示す写真である。 歯髄由来幹細胞、スタチン封入ナノ粒子を含む脂肪由来幹細胞またはスタチン封入ナノ粒子を含む歯髄由来幹細胞を投与する前（ｄａｙ０）におけるＳｈｎ−２ＫＯマウスの巣作り行動解析結果を示す写真である。 歯髄由来幹細胞、スタチン封入ナノ粒子を含む脂肪由来幹細胞またはスタチン封入ナノ粒子を含む歯髄由来幹細胞を投与して１週間後（ｄａｙ７）におけるＳｈｎ−２ＫＯマウスの巣作り行動解析結果を示す写真である。 歯髄由来幹細胞、スタチン封入ナノ粒子を含む脂肪由来幹細胞またはスタチン封入ナノ粒子を含む歯髄由来幹細胞を投与して２週間後（ｄａｙ１４）におけるＳｈｎ−２ＫＯマウスの巣作り行動解析結果を示す写真である。 図１７〜図１９の結果をまとめたグラフである。

以下、本発明を実施するための形態を図面に基づいて説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。

本発明に係るスタチン封入ナノ粒子製剤に用いられるスタチン封入ナノ粒子は、スタチンがポリ乳酸グリコール酸共重合体を含むナノ粒子に封入されてなるスタチン封入ナノ粒子であって、歯髄由来幹細胞の機能を増強するために用いられる。本発明に係るスタチンナノ封入粒子製剤は、上記スタチン封入ナノ粒子以外に、安定化剤、保存剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、賦形剤等の製剤化に通常用いられる添加剤を含んでいてもよい。

本発明において、スタチンとは、ＨＭＧ−ＣｏＡ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−コエンザイムＡ）還元酵素阻害剤である化合物を全て含むものであり、例えば、シンバスタチン、ロスバスタチン、ピタバスタチン、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチン、ロバスタチン及びメバスタチン等が挙げられる。スタチンは、上述のとおり、コレステロール低下作用を有することが知られているが、この他に心血管イベントの発生や進行リスクを低下させることが大規模臨床試験で明らかになっている。また、血管内皮細胞や骨髄由来の血管内皮前駆細胞を介した血管新生促進作用についても多く報告がなされている。さらに、抗炎症作用を示すことも知られている。

本発明において、ナノ粒子はスタチンを封入することができる生体吸収性ポリマーであればその材料は限定されないが、ポリ乳酸重合体（poly lactic acid：ＰＬＡ）またはポリ乳酸グリコール酸共重合体（poly(lactic-co-glycolic acid)：ＰＬＧＡ）を含むナノ粒子を用いることが好ましい。ＰＬＡは体内で加水分解されて乳酸に分解され、ＰＬＧＡは、体内で加水分解されて乳酸とグリコールとに分解され、それぞれ最終的に水と炭酸ガスとなるので、体内に無害であって好ましい。ナノ粒子の製造に用いるＰＬＡやＰＬＧＡの重量平均分子量は、以下に限定されないが、例えば５，０００〜５０，０００の範囲のものを使用することができる。ＰＬＡ、ＰＬＧＡ以外の材料を用いる場合であっても、当業者は適宜好ましい分子量の材料を選択することができる。

本発明において、スタチン封入ナノ粒子は、歯髄由来幹細胞の取り込み効率の観点から光散乱法で測定したときに１０００ｎｍ未満、好ましくは約１００ｎｍ〜４００ｎｍ、より好ましくは２００ｎｍ〜４００ｎｍに加工することができる方法であればいかなる方法によっても製造することができるが、好ましくは球形晶析法を使用して製造する。球形晶析法は、化合物合成の最終プロセスにおける結晶の生成・成長プロセスを制御することで、球状の結晶粒子を設計し、その物性を直接制御して加工することができる方法として周知である。この球形晶析法の一つに、周知のエマルジョン溶媒拡散法（ＥＳＤ法）がある。

エマルジョン溶媒拡散法は、スタチンを封入するための上記ＰＬＡまたはＰＬＧＡ等の生体吸収性ポリマーを溶解可能な良溶媒と、ポリマーを溶解しない貧溶媒との２種の有機溶媒を用いて行われる。まず、良溶媒中にＰＬＡまたはＰＬＧＡ等のポリマーを溶解し、このポリマーが析出しないように、スタチン溶解液を良溶媒に添加し、混合する。この混合液を撹拌されている貧溶媒中に滴下すると、急速に良溶媒が貧溶媒に、また、貧溶媒は良溶媒に相互拡散するため、有機溶媒相と水相との界面が乱れ、良溶媒が自己乳化し、サブミクロンサイズのエマルジョン滴が形成される。その後、良溶媒及び貧溶媒の相互拡散がさらに進み、エマルジョン滴内のＰＬＡまたはＰＬＧＡ等のポリマー及びスタチンの溶解度が低下し、その結果、スタチンを包含した球形結晶粒子のポリマーナノ粒子が生成する。
スタチン封入ナノ粒子を製造する際に用いる生体吸収性ポリマーとスタチンとは、得られたスタチン封入ナノ粒子が歯髄由来幹細胞の機能を増強できる限りにおいて限定されないが、例えば、５％の割合で混合することが好ましい。下記実施例に示すように、ＰＬＧＡ（重量平均分子量20000）５０ｍｇ、シンバスタチン２．５ｍｇ、良溶媒としてアセトン２ｍＬおよびエタノール０．５ｍＬ、ならびに、貧溶媒として２ｗｔ％ＰＶＡ溶液１０ｍＬを用いてスタチン封入ナノ粒子を製造した場合、ナノ粒子１ｍｇ中には約５０μｇのスタチンが封入できる。スタチン封入ナノ粒子が歯髄由来幹細胞の機能を増強できる限りにおいて限定されないが、ナノ粒子１ｍｇ中にはスタチンを約３０〜６０μｇで封入することが好ましい。

本発明において用いられる歯髄由来幹細胞は、歯髄組織より回収された歯髄細胞集団中に含まれる。本発明において用いられる歯髄由来幹細胞は、歯髄組織より回収した歯髄細胞集団を必要に応じてαMEM等の培地を用いて培養し、培養後に得られた歯髄由来幹細胞を含む歯髄細胞集団をそのまま用いることができる。歯髄由来幹細胞を含む歯髄細胞集団は、凍結保存後に解凍したものを用いてもよい。好ましい一実施の形態として、歯髄由来幹細胞を含む細胞集団より歯髄由来幹細胞をさらに選別して、回収した歯髄由来幹細胞のみからなる細胞集団を用いることもできる。なお歯髄細胞から歯髄由来幹細胞を選別する手法は公知である（例えば、Yamaza et al., "Immunomodulatory properties of stem cells from human exfoliated deciduous teeth". Stem Cell Res Ther. (2010)1:5）。

「歯髄組織」は、乳歯及び永久歯のいずれからも採取することができ、従来医療廃棄物として処理されてきた乳歯や親知らず（智歯）などの抜去歯の歯髄から得ることが可能である。すなわち歯髄組織は、歯科医療施設において歯科処置的に抜歯された歯からも取り出すことができるし、自然抜歯または自然脱落された歯から取り出されてもよい。なお、歯より歯髄組織を取り出す方法は公知であり、当業者は適宜実施することができる。なお、歯科処置的に抜歯された歯など、その場ですぐに凍結処理を行うことができない場合には、輸送のため、例えば、alpha-minimum essential medium (alpha-MEM) などの培地に歯を浸し、低温（例えば、4℃）で保存・輸送することができる。歯髄組織の由来はヒトに限られず、その他の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ヒツジ、ウシ、ウマ）とすることもできる。好ましくはヒト由来の歯髄組織から採取した歯髄由来幹細胞である。

本発明に係るスタチン封入ナノ粒子の歯髄由来幹細胞への処理は、例えば該幹細胞が培養されている培養培地中に添加することにより行われる。このようにすると、ファゴサイトーシスにより幹細胞がスタチン封入ナノ粒子を細胞内に取り込むため、特別な試薬等を用いることなく、簡便に幹細胞内にスタチン封入ナノ粒子を含有させることができる（例えば特許６１１０５７８号を参照）。歯髄由来幹細胞へのスタチン封入ナノ粒子の処置の条件は、スタチン封入ナノ粒子が歯髄由来幹細胞に取り込まれ、歯髄由来幹細胞の機能が増強される限り限定されないが、例えば、好ましくは３７℃で３０分〜１時間とすることができる。また、ナノ粒子１ｍｇ中に約３０〜６０μｇのスタチンが封入されているスタチン封入ナノ粒子を用いる場合において歯髄由来幹細胞を含む細胞集団の処置に用いるナノ粒子の濃度は、歯髄由来幹細胞の機能が増強される限り限定されないが、例えば、約２５μｇ／５×１０^４ｃｅｌｌｓ〜約２００μｇ／５×１０^４ｃｅｌｌｓの濃度で処置することが好ましく、より好ましくは約５０μｇ／５×１０^４ｃｅｌｌｓ〜約２００μｇ／５×１０^４ｃｅｌｌｓの濃度で処置する形態である。

本発明に係るスタチン封入ナノ粒子は、一実施の形態において、歯髄由来幹細胞のＨＧＦの発現の亢進をさせるものである。ここで、ＨＧＦ遺伝子は、血管新生及び肝細胞増殖能に関与する遺伝子である。特に血管新生において、HGFは他の血管新生因子であるVEGFやbFGFと比較して平滑筋細胞に対する優れた遊走能を有しており、さらにHGFによる血管新生は、VEGFによる血管新生で形成される浮腫やbFGFによる血管新生でみられるような炎症が認められないことが報告されている（T. Kaga et al., “Hepatocyte growth factor stimulated angiogenesis without inflammation: Differential actions between hepatocyte growth factor, vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor” Vascular Pharmacology, (2012) Volume 57, Issue 1, 19 August, Pages 3-9）。このように本発明に係るスタチンナノ粒子によりHGFの発現が亢進した歯髄由来幹細胞は、より正常な成熟血管の形成に寄与できると考えられる。本発明に係るスタチン封入ナノ粒子は好ましくは約１．２倍以上、より好ましくは約１．５倍以上、さらに好ましくは約１．７倍以上ＨＧＦ遺伝子の発現量を亢進させることができる。このようにＨＧＦ遺伝子の発現が亢進した歯髄由来幹細胞は、虚血性疾患（虚血性心疾患、閉塞性動脈硬化症、血栓性動脈炎など）や肝硬変症などの治療おいて好ましい。

本発明に係るスタチン封入ナノ粒子により処理された歯髄由来幹細胞は、特に遊走能及び血管新生因子の産生能が増強され、特に種々の疾患に対する治療効果が増強する。
このような、本発明に係る機能増強幹細胞は、局所投与せずとも、静脈内投与または動脈内投与によっても少ない投与量で優れた効果を示す。
本発明において虚血性疾患とは、動脈の狭窄や閉塞により、組織の虚血が持続している状態、または虚血により引き起こされる疾患をいう。虚血性疾患としては、以下に限定するものではないが例えば、狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患、脳梗塞などの脳虚血疾患、もやもや病などの慢性脳虚血疾患、脊髄虚血疾患、虚血性大腸炎、腸間膜動脈閉塞症などの虚血性腸疾患、閉塞性動脈硬化症やバージャー病などの下肢虚血疾患、糖尿病網膜症などの網膜虚血疾患等が挙げられる。
特に、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子により処理された上記歯髄由来幹細胞を虚血性心疾患の患者に静脈内投与すると、増強された遊走性及び増殖性により、歯髄由来幹細胞が血流及びその遊走性によって心臓に到達し、虚血傷害心筋部分に集積及び増殖し、心血管系細胞に分化する。また、集積したスタチン封入ナノ粒子含有歯髄由来幹細胞は、血管新生因子の産生及び放出が促進され、多くの血管新生因子により心筋組織の再生が促進される。
また、一実施の形態において、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子により処理された上記歯髄由来幹細胞は動脈内投与してもよい。動脈内投与すると、歯髄由来幹細胞が血流によって炎症を示す臓器、例えば腸に到達し、炎症部に集積及び増殖し、抗炎症性サイトカインを産生し、また、炎症性細胞の活性を抑制する。その結果、炎症性疾患に対する優れた治療効果を示す。

本発明において炎症性疾患とは、炎症を病因の一つとする疾患をいい、腸炎や肺炎といったそれらの疾患の特徴的な症状が炎症であるものに限らず、肺高血圧症や認知症といったそれらの疾患の発症プロセスに炎症が関与するものも含む。具体的に、本発明における炎症性疾患は、全身性エリテマトーデス、強皮症、アトピー性皮膚炎、慢性関節リウマチ、間質性肺炎、気管支喘息、肺高血圧症、潰瘍性大腸炎やクローン病等の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、神経損傷、脊髄損傷、脳卒中（脳梗塞や脳出血後後遺症）、筋萎縮性側索硬化症、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、統合失調症、認知症、臓器移植時の拒絶反応、慢性腎炎（腎硬化症）等が挙げられる。
また本発明において神経変性疾患とは、中枢神経系（例えば脳や脊髄）にある神経細胞のうち特定の神経細胞群が徐々に障害を受けて脱落し、運動能力の低下、バランス感覚の低下、筋力の低下、認知能力の低下などを生じる疾患をいう。神経変性疾患は以下に限定されないが、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン症候群（パーキンソン病など）、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、ハンチントン病、多系統萎縮症（ＭＳＡ）（黒質線状体変性症（ＳＮＤ）、シャイ・ドレーガー症候群（Ｓｈｙ−Ｄｒａｇｅｒ症候群）、オリーブ橋小脳萎縮症（ＯＰＣＡ）など）、脊髄小脳変性症（ＳＣＤ）（脊髄小脳失調症（ＳＣＡ３、通称マシャド・ジョセフ病など）、フリードライヒ失調症（フリードライヒ運動失調症など）等が挙げられる。

また、歯髄由来幹細胞は、上述のとおり、取り込んだスタチン封入ナノ粒子を細胞内で加水分解することにより、封入されたスタチンを徐放するため、歯髄由来幹細胞は体内に投与された場合、投与後にスタチンを徐放し、放出されたスタチンにより更なる抗炎症効果を得ることができる。

本発明に係るスタチン封入ナノ粒子により処理された歯髄由来幹細胞を含む細胞製剤は、一実施の形態において、疼痛を改善するための細胞製剤として用いることができる。
また、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子により処理された歯髄由来幹細胞を含む細胞製剤は、一実施の形態において、軟骨損傷を改善するための細胞製剤として用いることができる。

本発明に係るスタチン封入ナノ粒子により処理された歯髄由来幹細胞は、認知症モデルマウスであるマウスApp遺伝子のアミロイドβ領域に遺伝子変異を挿入したノックインマウスに対して、認知症の治療効果を有する。マウスApp遺伝子のアミロイドβ領域に遺伝子変異を挿入したノックインマウスは脳内において毒性アミロイドβ種(Aβ42)の産生比率が高まり、その結果アミロイド班の形成が促進され、神経炎症およびシナプスの脱落が認められると報告されている。すなわち、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子により処理された歯髄由来幹細胞を含む細胞製剤の一実施の形態は、アミロイドβの蓄積に起因する神経炎症の治療用製剤として用いることができる。

本発明に係るスタチン封入ナノ粒子により処理された歯髄由来幹細胞は、統合失調症モデルマウスであるＳｈｎ−２ノックアウト（ＫＯ）マウスに対して統合失調症の治療効果を有する。すなわち、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子により処理された歯髄由来幹細胞を含む細胞製剤の一実施の形態は、Ｓｈｎ−２の発現低下またはノックアウトにより生じた統合失調症の治療用製剤として用いることができる。また、Ｓｈｎ−２ノックアウト（ＫＯ）マウスの脳内においては、アストログリア細胞の活性化により神経炎症が起こることが報告されており、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子により処理された歯髄由来幹細胞は、アストログリア細胞の活性化により生じる神経炎症を抑えることができると考えられる。

以下に、本発明に係る幹細胞機能増強用スタチン封入ナノ粒子製剤、及びそれを含有する機能増強幹細胞を詳細に説明するための実施例を示す。
まず、スタチン封入ナノ粒子の製造方法について説明する。ここでは、特にスタチンとしてシンバスタチンを用い、ナノ粒子としてはポリ乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）を含むナノ粒子を用いた。

ＰＬＧＡ（重量平均分子量20000）５０ｍｇとシンバスタチン２．５ｍｇとをアセトン２ｍＬ、エタノール０．５ｍＬの混液に溶解しポリマー溶液とした。これを室温、５００ｒｐｍで攪拌した２ｗｔ％ＰＶＡ溶液１０ｍＬ中に滴下しシンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子懸濁液を得た。続いて室温、５００ｒｐｍで攪拌を続けながら、有機溶媒（アセトン、エタノール）を留去した。約５時間溶媒留去後、懸濁液を４℃、６００００ｇで３０分間遠心分離し、沈殿物を回収して蒸留水に再懸濁させた。この遠心分離と蒸留水への再懸濁の操作は合計３回行った。その後、懸濁液を一晩凍結乾燥し、シンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子を得た。これをスタチン封入ナノ粒子として以下の試験で用いた。

本実施例で用いる歯髄由来幹細胞は以下のようにして得られた。
提携先の歯科クリニックの患者（４〜１３歳）より採取した抜去乳歯からピンセットなどを用いて歯髄組織を取り出した。取り出した歯髄組織はスカルペルなどを用いて細切し、Accutaseなどの組織分散用の酵素液を用いて細胞分散を行った。分散した細胞を血清含有α-MEM培地にて懸濁し、細胞数のカウントを行った。細胞数のカウントの結果から適切なサイズの細胞培養用フラスコを用いて３７℃、５％ＣＯ_２にて培養した。２〜３日おきに全量の培地交換を実施した。初代培養細胞がフラスコ内でセミコンフルエント（細胞密度：７０〜８０％）状態になるまで培養した。

検鏡によってセミコンフルエント状態であることを確認し、培地を全量取り除いた。血清を含む培地を完全に除去するためにD-PBS(-)を適量用いてフラスコ底面の洗浄を行い、この操作を２回繰り返した。洗浄後、TrypLE Select（Gibco）を適量加え、フラスコの底面全体に行き渡らせ、３７℃にてインキュベートを行った。一部の細胞がフラスコ底面より剥離したタイミングで、フラスコの中でゆっくりと液を循環させ、細胞をフラスコ底面より剥離させた。検鏡によりフラスコから細胞が剥がれていることを確認した。フラスコを傾け血清含有α-MEM培地をフラスコ全体に流すように加え、細胞を剥がし細胞懸濁液とした。細胞懸濁液を15mL tubeへ回収した。新たにα-MEM培地をフラスコ全体に流すように加え、細胞を剥がした。細胞懸濁液を先ほどの15mL tubeへ回収した。回収した細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、血清含有α-MEM培地を加えて懸濁し、細胞数のカウントを行った。細胞密度2,000〜5,000cells/cm²で適切なサイズの細胞培養用フラスコを用いて、37℃，5%CO₂にて培養した。２継代、拡大培養を繰り返した。

拡大培養中の細胞がセミコンフルエント(細胞密度：70-80%)状態であることを確認後、培養上清を新しい50mLチューブに回収した。上清回収後のフラスコ内の細胞は凍結処理を行い、50mLチューブに回収した培養上清は、各種検査に用いた。HBV定量、HCV定量、HIV定量、パルボIgG、パルボIgM、CMV-IgG、CMV-IgM、FTA-ABS、STD-マイコプラズマ同定、エンドトキシンを含む検査により細胞の安全性を確認した。拡大培養中セミコンフルエント状態になり、培養上清を回収した後のフラスコ内から血清を含む培地成分を完全に除去するためにD-PBS(-)を用いてフラスコ底面の洗浄を行い、この操作を各フラスコ2回繰り返した。TrypLE Selectを各フラスコへ加え、フラスコの底面全体へ行き渡らせ、37℃にてインキュベートを行った。一部の細胞がフラスコ底面より剥離したタイミングで、フラスコの中でゆっくりと液を循環させ、細胞をフラスコ底面より剥離させた。α-MEM培地をフラスコ全体に流すように加え、細胞を剥がし細胞懸濁液とした。細胞懸濁液を15mL チューブへ回収した。新たに各フラスコにα-MEM培地を3mLずつフラスコ全体を流すように加え、フラスコ内の残りの細胞を剥がして細胞懸濁液とし、15mlチューブへ回収した。回収した細胞懸濁液は遠心分離を行い、その後上清を除去し、D-PBS(-)を加えて懸濁し、細胞数のカウントを行った。再度、遠心分離を行い、上清を除去した。細胞数に応じた量(最終濃度：0.9〜1.3×10⁶cells/ml)の凍結保存液であるセルバンカー2を加え、優しくピペッティングを行った。細胞を含む凍結保存液をクライオチューブへ1mLずつ移した。クライオチューブをバイセルに入れ-80℃フリーザーで凍結させ、3日以内に液体窒素タンクへ移し保管した。

凍結保存していた歯髄幹細胞を含む凍結細胞液を恒温槽中で7割ほど急速解凍した。7割ほど解凍した凍結細胞液を37℃に加温したαMEM培地へ加えた。解凍後、遠心分離を行い、その後上清を除去した。新たに培地を加えて、細胞数をカウントした。細胞密度2,000〜5,000cells/cm²で適切なサイズの細胞培養用フラスコを用いて、37℃、5%CO₂のインキュベータ内で培養を行った。播種後、2〜3日おきに全量の培地交換を行った。試験に用いる必要細胞数を得るまで拡大培養を繰り返し、歯髄由来幹細胞を含む細胞集団を調製した。このようにして調製した歯髄由来幹細胞を含む細胞集団を以下の実施例に用いた。以下では、歯髄由来幹細胞を含む細胞集団を便宜的に「歯髄由来幹細胞」という。

次に、上記シンバスタチン封入ナノ粒子による歯髄由来幹細胞の遊走能及び血管新生因子の産生能といった機能の増強について検討するために以下の試験を行った。

まず、遊走性試験キット（Transwell（登録商標））を用いて歯髄由来幹細胞（ＰｄＳＣ）の遊走能について検討した。具体的に、歯髄由来幹細胞の細胞株（＃２２１）を複数のマイクロチューブに５×１０^４ｃｅｌｌｓ／５００μＬ／ｔｕｂｅになるようにα−ＭＥＭ中に分注し、シンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子を０μｇ／５×１０^４ｃｅｌｌｓ、２５μｇ／５×１０^４ｃｅｌｌｓ、５０μｇ／５×１０^４ｃｅｌｌｓ、１００μｇ／５×１０^４ｃｅｌｌｓまたは２００μｇ／５×１０^４ｃｅｌｌｓの濃度となるように添加し、１８時間静置した。その後、Transwellプレートの各ウェルの多孔メンブレン上に歯髄由来幹細胞を２０％ＦＢＳ αＭＥＭ培地で５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞数で播種し、６時間後にTranswellのメンブレンを通過した細胞数を計測した。なお、コントロールとしてシンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子を処理せずに０％ＦＢＳ αＭＥＭ培地で５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞数で播種したものを用いた。その結果を図１に示す。

図１に示すように、２５または５０μｇ／５×１０^４ｃｅｌｌｓの低濃度のシンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子で処理した場合は、処理しなかったものと比較して歯髄由来幹細胞の遊走性に変化はなかったが、１００または２００μｇ／５×１０^４ｃｅｌｌｓ、特に２００μｇ／５×１０^４ｃｅｌｌｓの高濃度のシンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子で処理した場合は、歯髄由来幹細胞の遊走性が増大した。この結果から、比較的高い濃度のシンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子により、歯髄由来幹細胞の遊走能を亢進できることが示された。

次にシンバスタチン封入ナノ粒子による歯髄由来幹細胞の血管新生因子産生能に対する効果について検討するために、歯髄由来幹細胞内における血管新生因子のｍＲＮＡ発現量について定量ＰＣＲ法を用いて解析した。ここでは、血管新生因子としてＨＧＦの細胞内ｍＲＮＡ発現量を測定した。

まず、歯髄由来幹細胞の３つの細胞株（＃２２１）をマイクロチューブに１×１０^５ｃｅｌｌｓ／１ｍＬ／ｔｕｂｅになるように分注し、それらにシンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子を０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬまたは４００μｇ／ｍＬの濃度となるように添加し、３０分間静置した。その後、それらをＰＢＳで洗浄して６ｗｅｌｌ培養皿に２０％ＦＢＳ αＭＥＭ培地を用いて播種した。その４８時間後に細胞を回収し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎＲＮＡキット（タカラバイオ）を用いてそれらのＲＮＡを抽出した。その後、ＨＧＦのＤＮＡ配列に関するプライマーを用いて、定量ＰＣＲ法により各細胞におけるＨＧＦのｍＲＮＡ発現量を測定した。測定は、ReverTra Ace qPCR RT キット（TOYOBO）を用いて抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、SsoFastEvaGreen Mastermix試薬（バイオラッド）とプライマーとともにサーマルサイクラー（CFXConnectバイオラッド）を用いて反応（９５℃３０秒を１サイクル、９５℃５秒／５６℃５秒を４０サイクル）させて行った。また、対比のために脂肪由来幹細胞（ＡｄＳＣ）の３つの細胞株（＃１０１、＃１０３、＃１０４）についても、上記と同様の処理を行ってそれらのＨＧＦのｍＲＮＡ発現量を測定した。その測定結果を図２に示す。なお、結果は、それぞれのＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量を基準とした上記各因子の発現量の比率を示している。

図２に示すように、歯髄由来幹細胞では、いずれの株においても特に５０μｇ／ｍＬ（２５μｇ／５×１０^４）、１００μｇ／ｍＬ（５０μｇ／５×１０^４）の低濃度のシンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子によりＨＧＦの発現が増大した。一方、脂肪由来幹細胞では一つの細胞株においてシンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子によりＨＧＦの発現が増大したが、二つの株ではＨＧＦの発現の増大は見られなかった。

以上のとおり、スタチン封入ナノ粒子による歯髄由来幹細胞の遊走能及び血管新生因子の産生能といった機能の増強について検討した結果、スタチン封入ナノ粒子により、歯髄由来幹細胞の機能を増強することが明らかとなった。これらの機能を増強することにより、歯髄由来幹細胞は種々の疾患の治療に有利となると考えられる。

次に、心筋梗塞モデルマウスを用いて、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子を含有する歯髄由来幹細胞の心筋梗塞治療効果について検討した。

まず、１０〜１２週齢の雄のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに対して虚血誘発（冠動脈前下行枝結紮モデル）を行い（０日目）、その３日後（３日目）に、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、歯髄由来幹細胞（５×１０^４ｃｅｌｌｓ）、スタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子を取り込んだ歯髄由来幹細胞（１００μｇ／５×１０^４ｃｅｌｌｓ、＃２２１株）、またはスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞（１００μｇ／５×１０^４ｃｅｌｌｓ、＃１０４株）を尾静脈に投与した。その５３日後（５６日目）に心臓超音波画像診断を行い、その後に解剖して心臓の組織学的解析を行った。心臓超音波画像診断では、左室内径短縮率（ＦＳ）及び左室拡張末期径（ＬＶＤｄ）を測定し、３日目から５６日目における変化率を評価した。組織学的解析としては、各群の取り出した心臓における梗塞部の切片を常法で作製し、マッソン・トリクローム染色をして繊維化面積率、繊維化長さ率、梗塞部心筋壁厚率について解析した。５６日目の心臓の写真を図３及び図４に示し、それらの異なる部分におけるマッソン・トリクローム染色をした切片（組織標本）写真を図５〜図８に示し、それらの組織標本を用いた左室心筋形態学的解析結果について図９に示し、心臓超音波画像診断の結果を図１０に示す。

図３及び図４に示すように、コントロールであるＰＢＳ群及び歯髄由来幹細胞を投与したＰｄＳＣ群と比較して、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した群（ｓｔａｔｉｎ−ＡｄＳＣ群）の心臓は、その拡大が抑制されていることがその外観から認められ、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ歯髄由来幹細胞を投与した群（ｓｔａｔｉｎ−ＰｄＳＣ群）の心臓は、その拡大がさらに抑制されていることがその外観から認められた。また、ＰＢＳ群及びＰｄＳＣ群では多くのマウスが死亡したが、ｓｔａｔｉｎ−ＡｄＳＣ群では５匹中１匹のみが死亡し、ｓｔａｔｉｎ−ＰｄＳＣ群では死亡したマウスはいなかった。

また、図５〜図８では、上述の通り、５６日目の心臓の異なる部分におけるマッソン・トリクローム染色をした切片の写真を示す。虚血により壊死した心筋細胞部分は、線維芽細胞に置き換わることによって繊維化する。繊維化して青く染まった瘢痕部分の範囲を矢印により示している。図５〜図８に示すように、コントロールであるＰＢＳ群では、広い領域で繊維化しており、これに対して歯髄由来幹細胞を投与したＰｄＳＣ群やスタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を投与した群（ｓｔａｔｉｎ−ＡｄＳＣ群）では、繊維化した領域が縮小しており、また、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ歯髄由来幹細胞を投与した群（ｓｔａｔｉｎ−ＰｄＳＣ群）では、繊維化した領域がほとんど見られなかった。

図９は、図５〜図８に示す結果に基づいて解析した結果を示し、具体的に、図９（ａ）は各群における青く染まった繊維化部分の面積を、心臓全体の面積を１００％とした場合の割合を示し、図９（ｂ）は各群における青く染まった繊維化部分の長さを、全周の長さを１００％とした場合の割合を示し、図９（ｃ）は青く染まった繊維化部分の心筋壁の厚さを、正常の心筋壁の厚さを１００％とした場合の割合で示している。図９（ａ）、（ｂ）に示すように、コントロールであるＰＢＳ群では多くの領域が繊維化しており、ＰｄＳＣ群及びｓｔａｔｉｎ−ＡｄＳＣ群では改善が認められ、ｓｔａｔｉｎ−ＰｄＳＣ群では更なる改善が認められる。また、図９（ｃ）に示すように、心筋壁の厚さに関しても同様に、コントロールであるＰＢＳ群ではその厚さが極めて薄くなっており、ＰｄＳＣ群及びｓｔａｔｉｎ−ＡｄＳＣ群ではわずかに改善し、ｓｔａｔｉｎ−ＰｄＳＣ群では顕著な改善が認められた。

次に、心臓超音波画像診断の結果について図１０を参照しながら説明する。図１０（ａ）は３日目における左室拡張末期径（ＬＶＤｄ）に対する各群における５６日目の左室拡張末期径の変化率（ΔＬＶＤｄ）を示し、図１０（ｂ）は３日目における左室内径短縮率（ＦＳ）に対する各群における５６日目の左室内径短縮率の変化率（ΔＦＳ）を示す。図１０（ａ）に示すように、ＰＢＳ群では顕著に肥大しており、ｓｔａｔｉｎ−ＰｄＳＣ群、ｓｔａｔｉｎ−ＡｄＳＣ群、ＰｄＳＣ群の順でその肥大の抑制効果が高い。また、図１０（ｂ）に示すように、左室内径短縮率（ＦＳ）についてＰＢＳ群では悪化しており、ＰｄＳＣ群では改善は見られなかった。一方、ｓｔａｔｉｎ−ＡｄＳＣ群では改善が見られ、ｓｔａｔｉｎ−ＰｄＳＣ群ではｓｔａｔｉｎ−ＡｄＳＣ群よりも改善が認められた。

以上の結果から、歯髄由来幹細胞のみでも心機能を改善するが、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ歯髄由来幹細胞によってより顕著な改善効果が得られることが分かる。なお、その改善効果はスタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞を用いた場合よりも優れていた。

次に、虚血境界領域における血管密度について検討するために、上記各群の繊維化部分について、血管内皮細胞に発現する糖タンパク質に結合する植物由来蛋白であるイソレクチンＢ４に結合する抗体を用いて蛍光染色を行い、顕微鏡視野における染色領域の大きさを測定した。また、その測定結果を血管密度としてグラフ化した。その結果を図１１に示す。図１１（ａ）及び（ｂ）に示すように、ＰＢＳ群と比較して、ＰｄＳＣ群及びｓｔａｔｉｎ−ＡｄＳＣ群では血管密度が増大し、また、それらと比較してｓｔａｔｉｎ−ＰｄＳＣ群ではさらに血管密度が増大していることが確認できた。この結果から、特にスタチン封入ナノ粒子を取り込んだ歯髄由来幹細胞を投与することで、梗塞周辺部分（虚血部分）において血管新生が促進されて心筋組織再生に寄与しているものと考えられる。

以上の結果から本発明に係るスタチンナノ粒子を含む歯髄由来幹細胞によると、心筋梗塞等の虚血性心疾患に対する優れた治療効果が得られるといえる。具体的には、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子は、歯髄幹細胞の遊走性及び血管新生因子の産生能等の機能を増強でき、この機能増強幹細胞は、梗塞部に集積し、増殖すると共に、血管新生因子を放出することにより、梗塞部の血管新生を促進できる。さらに、その集積した幹細胞が心筋に分化することにより、心筋の再生を促し、その結果、優れた心筋梗塞等の虚血性心疾患の治療効果を示す。また、その幹細胞は、取り込んだスタチンを徐放することができ、これにより、スタチン自体の血管新生効果等のスタチン特有の種々の効果も得られるので、虚血性心疾患の治療に有益である。特に脂肪由来幹細胞を用いた場合と比較して、歯髄由来幹細胞を用いた場合、ｉ）線維化の抑制、ｉｉ）心筋壁の厚さの改善、ｉｉｉ）血管新生の促進の点において優れた効果を示す。

次に、認知症マウスモデルを用いて、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子を含有する歯髄由来幹細胞の認知症に対する治療効果について検討した。その方法及び結果について以下に説明する。認知症モデルマウスとしては、理化学研究所バイオリソースセンターから得られたＣ５７ＢＬ／６−Ａｐｐ＜ｔｍ３（ＮＬ−Ｇ−Ｆ）Ｔｃｓ＞を用いた。当該モデルマウスに対して、ＰＢＳ、歯髄由来幹細胞（＃２２１）、スタチン封入ナノ粒子を含む脂肪由来幹細胞（＃２２１）またはスタチン封入ナノ粒子を含む歯髄由来幹細胞を、マウスの尾静脈から緩徐に投与した。それぞれの幹細胞の投与量は１×１０^４ｃｅｌｌｓ／マウスとし、溶媒として２００μＬのＰＢＳを用いた。スタチン封入ナノ粒子としては上記シンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子を用い、それらのナノ粒子２０μｇを１×１０^４ｃｅｌｌｓの脂肪由来幹細胞または歯髄由来幹細胞と３７℃で３０分培養してスタチン封入ナノ粒子を含む脂肪由来幹細胞または歯髄由来幹細胞を得た。上記投与されたそれぞれのマウスに対して、それらの記憶評価をするために周知のバーンズ迷路試験を行った。具体的に、上記投与の日を０日目として、０日目、７日目、１４日目、２１日目及び２８日目に記憶解析として、各マウスがバーンズ迷路テーブルの周縁部に設けられた２０個のサークルのうちの１つにのみ設けられたターゲットホールを見つけて、該ターゲットホールと連通するエスケープケージに達するまでの時間及び移動距離を測定した。また、上記測定（記憶解析）の日の前日の午前及び午後に各１回ずつ記憶訓練を行った。

上記各マウスは、複数匹のマウスと共に１つのケージで飼育し、上記記憶訓練及び記憶解析の１時間以上前に個別ケージに分けて環境に慣らした。記憶訓練は、まず、マウスを迷路テーブルの中央に配置された白い円筒容器内に１分間静置した後、該円筒容器を迷路テーブルから取り外すと共に、マウスが嫌う超音波ブザーを鳴らした。その後３分間、マウスにターゲットホールを探させて、エスケープケージに入った時点で超音波ブザーを停止した。但し、３分経過してもマウスがエスケープケージに入らない場合は、マウスを透明な円筒容器に入れて周囲の環境を見せて記憶させながら３０秒程度の時間をかけて強制的にマウスをエスケープケージに入れた。エスケープケージに入れた後１分間はその環境に慣らした。記憶訓練は上記工程を３回繰り返した。

記憶訓練の翌日に行う記憶解析は、まず、記憶訓練と同様に、マウスを迷路テーブルの中央に配置された白い円筒容器内に１分間静置した後、該円筒容器を迷路テーブルから取り外すと共に、マウスが嫌う周波数の超音波ブザーを鳴らし、行動追跡記録を開始した。その後、マウスがターゲットホールを探し、エスケープケージに入った時点で超音波ブザーを停止し、行動追跡記録を停止した。行動追跡記録には、行動解析システムであるLimeLiteソフト（ActiMetrics, Inc. IL, USA）を用い、超音波ブザーが鳴ってからマウスがエスケープケージに入るまでの移動距離（目標到達移動距離）と時間（目標到達時間）とを測定した。上記各マウスにおける記憶解析の結果を図１２に示す。

図１２（ａ）及び（ｂ）に示すように、０日目では、ＰＢＳが投与された認知症モデルマウス（ＰＢＳ）、歯髄由来幹細胞が投与された認知症モデルマウス（ＰｄＳＣ）、スタチン封入ナノ粒子を含む脂肪由来幹細胞が投与された認知症モデルマウス（ＳｉｍＡｄＳＣ）及びスタチン封入ナノ粒子を含む歯髄由来幹細胞が投与された認知症モデルマウス（ＳｉｍＰｄＳＣ）のいずれも、エスケープケージに到達するまでの移動距離及び時間が長かった。しかし、７日目、１４日目と時間が経過するに従って、特に、ＳｉｍＡｄＳＣ群ではＰＢＳ群と比較して、エスケープケージに到達するまでの移動距離及び時間が顕著に短くなった。しかし、ＳｉｍＡｄＳＣ群では２８日目にはその効果が減衰した。一方、ＳｉｍＰｄＳＣ群では、徐々に移動距離の短縮が見られて、２８日目においてエスケープケージに到達するまでの移動距離及び時間が顕著に短くなった。本実施例の結果から、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子を含む歯髄由来幹細胞によって、認知症の症状を改善できることが示唆された。

次に、変形性関節症（osteoarthritis：ＯＡ）マウスモデルを用いて、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子を含有する歯髄由来幹細胞の変形性関節症に対する治療効果について検討した。その方法及び結果について以下に説明する。ＯＡマウスモデルとしてはＢＡＬＢ／ｃマウスに対して右膝関節前十字靭帯の切断及び内側半月板の切除を行う周知のモデルを用いた。具体的には、外科的にＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（雄、１０週齢）の右膝関節における前十字靭帯を切断すると共に、内側半月板を切除し、その７日後から二週間、当該マウスに対してトレッドミル運動負荷（３０分／１日、１５°傾斜、２７〜３３ｃｍ／ｓｅｃ）を与えて、ＯＡを誘導した。術後２１日目に、ＰＢＳ、歯髄由来幹細胞（ＰｄＳＣ；＃２２１）、スタチン封入ナノ粒子を含む脂肪由来幹細胞（ＳｔＡｄＳＣ；＃２２１）またはスタチン封入ナノ粒子を含む歯髄由来幹細胞（ＳｔＰｄＳＣ）を、２９Ｇの注射針を用いて当該マウスの右膝内関節に局所投与した。ＰＢＳの投与量は１０μＬとした。また、歯髄由来幹細胞の投与量は１×１０^４ｃｅｌｌｓ／マウスとし、溶媒として１０μＬのＰＢＳを用いた。スタチン封入ナノ粒子としては上記シンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子を用い、それらのナノ粒子２０μｇ／ｍＬと脂肪由来幹細胞または歯髄由来幹細胞（１×１０^４ｃｅｌｌｓ）とを３０分〜１時間強培養してスタチン封入ナノ粒子を含む幹細胞を得た。

また、それら投与日と同日、及び投与から２週間後に、痛覚試験として周知のＶｏｎ Ｆｒｅｙ試験を行った。当該試験は、決まった力を与えることができるいくつかのフィラメントをラット後肢の足底にあてて、逃避反応を起こす閾値を測定するものである。その結果を図１３に示す。なお、図１３（ａ）は投与から２週間後に測定し、逃避反応を起こす閾値をスコア化（値は、フィラメントが曲がるの必要な重さ（ｇ）を示す）したものであり、図１３（ｂ）は投与日におけるスコアに対する投与から２週間後におけるスコアの割合を示す。図１３に示すように、ＰＢＳ群と比較してＰｄＳＣ群及びＳｔＡｄＳＣ群では痛みが改善されており、ＳｔＰｄＳＣ群ではさらに痛みが改善する結果が得られた。

また、上記Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験の他に、上記投与から２週間後でＶｏｎ Ｆｒｅｙ試験を行った後にマウスを安楽死させた上で解剖し、右膝の関節軟骨組織を採取して組織学的解析を行った。具体的に、ここでは、各群における右膝の関節軟骨組織を採取し、４％パラホルムアルデヒド溶液による固定の後に薄切標本を作製し、サフラニンＯ染色を行った。サフラニンＯは、軟骨基質を染色する染色試薬である。図１４に、各群の関節軟骨組織切片の染色写真を示す。

図１４に示すように、ＯＡが誘導されたマウスに対してＰＢＳを投与した群（ＰＢＳ群）では、脛骨の骨頭部の軟骨層が極めて薄くなっており、当該軟骨層においてサフラニンＯによる染色（図中では濃い灰色）は認められない。一方、ＯＡが誘導されたマウスに対して歯髄由来幹細胞を投与した群（ＰｄＳＣ群）では、ＰＢＳ群と比較して脛骨の骨頭部の軟骨層が厚く、サフラニンＯによる染色もわずかであるが認められる。また、ＯＡが誘導されたマウスに対してスタチン封入ナノ粒子を含む脂肪由来幹細胞を投与した群（Ｓｔａｔｉｎ−ＡｄＳＣ群）及びスタチン封入ナノ粒子を含む歯髄由来幹細胞を投与した群（Ｓｔａｔｉｎ−ＰｄＳＣ群）では、上記ＰｄＳＣ群よりもさらに脛骨の骨頭部の軟骨層が厚く、サフラニンＯによる染色部分も多く認められる。

さらに、上記各群について、関節損傷度を病理組織学的所見でスコアリングした。なお、スコアリングの基準はOsteoarthritis and Cartilage 18 (2010) S17-S23及びOsteoarthritis and Cartilage 13 (2005) 632-642に基づき、以下の通りに評価した。

上記表１に示す基準で評価した結果を図１５（ａ）に示し、上記表２に示す基準で評価した結果を図１５（ｂ）に示す。図１５（ａ）及び（ｂ）に示すように、いずれの基準においてもＰＢＳ群と比較して、ＰｄＳＣ群では軟骨損傷が改善しており、ＳｔＡｄＳＣ群及びＳｔＰｄＳＣ群ではさらに改善が認められた。

以上の結果から、スタチン封入ナノ粒子を含む幹細胞によって、変形性関節症の症状を改善できることが明らかとなった。

次に、統合失調症マウスモデルを用いて、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子を含有する歯髄幹細胞の統合失調症に対する治療効果について検討した。その方法及び結果について以下に説明する。

統合失調症マウスモデルとしてはＣ５７Ｂ６／Ｊマウスのｓｃｈｎｕｒｒｉ−２（Ｓｈｎ−２）遺伝子をノックアウトしたマウスを用いた（ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ）。Ｓｈｎ−２ノックアウト（ＫＯ）マウスの脳は統合失調症患者の脳で報告されている特徴を極めて高い類似度で備えていることが知られている（K Takao et al.,Neuropsychophamacology (2013), 38, p1409-1425）。実際に、Ｓｈｎ−２ＫＯマウスが正常マウスと比較して、行動異常を示すか否かを巣作り行動で検討した。ここでは、正常マウス（ＷＴ）及びＳｈｎ−２ＫＯマウスにフェルトを与え、フェルトをかじり巣状態に敷くか否かを観察した。その結果を図１６に示す。

図１６に示す通り、正常マウスでは、フェルトを全てかじり、それを敷いていたが、Ｓｈｎ−２ＫＯマウスではほとんどフェルトをかじることは無かった。この結果からも、Ｓｈｎ−２がノックアウトされたマウスは統合失調症モデルとして用いることができるといえる。

そこで、上記Ｓｈｎ−２ＫＯマウスを用いて、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子を含有する歯髄幹細胞の統合失調症の治療効果について検討した。まず、上記Ｓｈｎ−２ＫＯマウスに対して、ＰＢＳ、歯髄由来幹細胞（ＰｄＳＣ）、スタチン封入ナノ粒子を含む脂肪由来幹細胞（ＳｔＡｄＳＣ）、またはスタチン封入ナノ粒子を含む歯髄由来幹細胞（ＳｔＰｄＳＣ）を静脈内に投与した。マウス脂肪由来幹細胞の投与量は１×１０^４ｃｅｌｌｓ／マウスとした。スタチン封入ナノ粒子は、上記シンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子（５０μｇ）を用い、それらのナノ粒子と脂肪由来幹細胞または歯髄由来幹細胞とを３０分〜１時間共培養してスタチン封入ナノ粒子を含む幹細胞を得た。投与後に各マウスのケージ内にフェルトを入れ、その１週間後及び２週間後にフェルトの状態を観察した。また、下記表３に示すように、フェルトの状態に基づいてスコアを付けた。図１７〜図２０に観察結果及びスコアを示す。

図１７〜図２０に示すように、ＰＢＳ群では投与後も巣作り行動はほぼ見られず、統合失調症の症状が強く見られる。また、ＰｄＳＣ群では投与の２週間後において巣作り行動が見られた個体もいたが、全く巣作り行動は見られない個体もいた。一方、スタチン封入ナノ粒子を含む脂肪由来幹細胞を投与した群（ＳｔＡｄＳＣ群）またはスタチン封入ナノ粒子を含む歯髄由来幹細胞を投与した群（ＳｔＰｄＳＣ群）では、投与の１週間後から巣作り行動が見られ、症状の顕著な回復が認められた。これらの結果から、スタチン封入ナノ粒子を含む幹細胞によって、統合失調症の症状を改善できることが示唆される。

以上の結果から、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子は、歯髄由来幹細胞の機能を増強でき、この機能増強幹細胞は、虚血性心疾患や炎症性疾患等に対して治療効果を奏するため、それらの疾患の治療に有益である。

Claims (11)

1. スタチンが生体吸収性ポリマーを含むナノ粒子に封入されてなるスタチン封入ナノ粒子を含む、歯髄由来幹細胞の機能を増強するためのスタチン封入ナノ粒子製剤。
2. 前記生体吸収性ポリマーは、ポリ乳酸重合体（ＰＬＡ）またはポリ乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）であることを特徴とする請求項１に記載のスタチン封入ナノ粒子製剤。
3. 前記増強される歯髄由来幹細胞の機能は、遊走能及び血管新生因子の産生能の少なくともいずれか１つであることを特徴とする請求項１または２に記載のスタチン封入ナノ粒子製剤。
4. 請求項１または２に記載のスタチン封入ナノ粒子製剤であって、歯髄由来幹細胞の機能の増強がＨＧＦの発現の亢進である、スタチン封入ナノ粒子製剤。
5. スタチンが生体吸収性ポリマーを含むナノ粒子に封入されてなるスタチン封入ナノ粒子を含むスタチン封入ナノ粒子製剤であって、虚血性疾患、炎症性疾患、または、神経変性疾患を治療するための歯髄由来幹細胞を含む細胞製剤の治療効果を増強するためのスタチン封入ナノ粒子製剤。
6. スタチンが生体吸収性ポリマーを含むナノ粒子に封入されてなるスタチン封入ナノ粒子を含むスタチン封入ナノ粒子製剤であって、炎症性疾患または神経変性疾患を治療するための歯髄由来幹細胞または脂肪由来幹細胞を含む細胞製剤の治療効果を増強するためのスタチン封入ナノ粒子製剤。
7. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のスタチン封入ナノ粒子製剤を含有する歯髄由来幹細胞。
8. 請求項７に記載の歯髄由来幹細胞を含む虚血性疾患治療用の細胞製剤。
9. 請求項７に記載の歯髄由来幹細胞を含む炎症性疾患治療用の細胞製剤。
10. 請求項７に記載の歯髄由来幹細胞を含む神経変性疾患治療用の細胞製剤。
11. 静脈投与用、動脈投与用または局所投与用であることを特徴とする請求項７〜１０のいずれか１項に記載の細胞製剤。