CN112912068A - 包封有抑制素的纳米颗粒制剂、含有其的牙髓源性干细胞和含有该干细胞的细胞制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于改善干细胞功能的技术，该干细胞用作细胞制剂并且能够改善对各种疾病的治疗效果。本发明涉及一种包封有抑制素的纳米颗粒制剂，其用于增强牙髓源性干细胞的功能，并且其包含包封有抑制素的纳米颗粒，在该纳米颗粒中抑制素被包封在包括生物吸收性聚合物的纳米颗粒中。

Description

包封有抑制素的纳米颗粒制剂、含有其的牙髓源性干细胞和 含有该干细胞的细胞制剂
技术领域
本发明涉及一种包封有抑制素的纳米颗粒制剂、一种含有该包封有抑制素的纳米颗粒制剂的牙髓源性干细胞以及含有该牙髓源性干细胞的细胞制剂。
背景技术
抑制素(statin)作为抑制肝脏中胆固醇生物合成的限速酶即HMG-CoA还原酶的化合物为人所知。抑制素可以降低血液中的胆固醇值，因此被用于高胆固醇血症的治疗药物。此外，临床试验还表明，除了高胆固醇血症之外，抑制素因其抗炎作用而对心绞痛、心肌梗塞之类的缺血性心脏病、以及动脉硬化等疾病也有效。
为了提高抑制素对上述疾病的治疗效果、降低副作用进行了各种研究。例如，专利文献1公开了在为了促进血管生成而施用抑制素的情况下，通过将抑制素包覆在纳米颗粒中，并对患者局部施用该包覆有抑制素的纳米颗粒，从而能够用比以往更少量的抑制素促进血管生成。
如上所述，抑制素展现出不同的活性并且尤其具有抗炎症活性，因此，已经积极研究了抑制素在炎症性疾病中的应用。例如，非专利文献1公开了辛伐他汀，辛伐他汀是一类抑制素，其展现出在小鼠肠炎疾病模型中的抗炎症活性。此外，非专利文献2描述了阿托伐他汀对患有克罗恩氏病的患者的抗炎症效果。
此外，近年来已经进行了用多潜能干细胞治疗各种疾病的研究。干细胞的实例通常包括胚胎干细胞(ES cells)和间充质干细胞例如骨髓源性干细胞和脂肪源性干细胞，此外，诱导多潜能干细胞(iPS cells)等以及这些细胞在各种研究中被采用。其中脂肪源性干细胞的研究正在迅速发展，并且针对各种疾病的再生医学的临床试验被广泛进行。例如，非专利文献3公开了将源自脂肪组织的干细胞被直接施用于心肌梗塞模型小鼠的心肌，从而改善心脏的功能并减小梗塞尺寸。
此外，据报道，除用于再生医学之外，脂肪源性干细胞在药物诱发的肠炎小鼠模型中展现出肠炎抑制作用(例如，见非专利文献4)。
引用文献列表
专利文献
[专利文献1]Japanese Laid-Open Patent Publication No.2012-21002
非专利文献
[非专利文献1]Yosuke,Abe等，Ucer,37(2010),169-173。
[非专利文献2]Grip,O等，Br J Pharmacol.155(2008),1085-1092。
[非专利文献3]Masaaki Ii等，Laboratory Investigation(2011)91,539-552
[非专利文献4]Gonzalez,MA等，Gastroenterology 136(2009),978-989。
发明内容
技术问题
为了治疗缺血性心脏疾病例如心肌梗塞，例如，在施用如非专利文献1中公开的包封有抑制素的纳米颗粒的情况下，已经认识到通过对患者局部施用包封有抑制素的纳米颗粒，用比以往更少剂量的抑制素是有效的，但需要对患处局部施用，而施用并不容易并且还期望提高效用。此外，当不使用局部施用而使用静脉给药等时，需要更多剂量并且可能出现副作用。
另一方面，在通过使用非专利文献3中公开的干细胞来治疗缺血性心脏疾病例如心肌梗塞的情况下，需要将干细胞局部施用至患处，并且例如当施用至小鼠的心肌时，需要5×105细胞/小鼠的量来获得治疗效果。源自间充组织的成体干细胞可以用作干细胞，并且这些干细胞可以从骨髓或脂肪组织获得，但一次可获得的细胞数量有限。因此，当干细胞用于治疗等时，优选使用少量细胞。因此，为了通过少量干细胞方式获得显著治疗效果，需要改进干细胞的各种功能。
为了通过使用例如在非专利文献1和2中公开的抑制素更有效地发挥抑制素在治疗炎症性疾病中展现出的作用，抑制素可以被包覆在纳米颗粒中，以获得包覆有抑制素的纳米颗粒，其可以施用于例如专利文献1中公开的患者。然而，在专利文献1中，包覆有抑制素的纳米颗粒局部施用于患者。因此，用比以往更少量的抑制素的效用可以被确认，但由于所施用的抑制素纳米颗粒例如被巨噬细胞吞噬，其可能不均匀地分布在病变部位，因此很难获得稳定的治疗效果。
同时，当仅使用如非专利文献4中公开的干细胞治疗炎症性疾病时，需要将干细胞局部施用于患病部位，并且需要大量细胞。因此，不仅需要成本和时间，而且由于细胞施用而出现副作用的频率增加。此外，当自体细胞移植时假设，在其中脂肪组织少从而可分离的干细胞数量少的情况下或者在其中由于转化性疾病因素例如老年和/或糖尿病而导致干细胞功能退化的情况下，必须改进干细胞的各种功能，以便从少量干细胞获得显著的治疗效果。
鉴于上述问题提出了本发明，并且本发明的目的在于改进用作细胞制剂的干细胞功能并且改进对疾病的治疗效果。
用于解决问题的方案
作为深入研究的结果，发明人发现通过将由包封在纳米颗粒中的抑制素构成的包封有抑制素的纳米颗粒掺入到牙髓源性干细胞，干细胞功能得以增强并且抑制素可以有效地递送至期望的病变部位，并且已发现在治疗各种疾病例如缺血性疾病和炎症性疾病中展现出高的效果。
即本发明如下：
在本发明的一个方面中，本发明涉及
[1]一种用于牙髓源性干细胞功能增强的包封有抑制素的纳米颗粒制剂，其包括：含有生物吸收性聚合物的纳米颗粒；以及包覆在纳米颗粒中的抑制素。
根据本发明的包封有抑制素的纳米颗粒制剂可以在用包封有抑制素的纳米颗粒制剂处理牙髓源性干细胞时增强经处理的牙髓源性干细胞的功能，并且将牙髓源性干细胞施用到活体中展现出不同效用。特别地，当用根据本发明的包封有抑制素的纳米颗粒制剂处理干细胞时，经处理的牙髓源性干细胞通过吞噬作用捕获包封有抑制素的纳米颗粒，并且除增强迁移能力和产生血管生成因子能力之外，牙髓源性干细胞掺入包封有抑制素的纳米颗粒增强了抑制免疫反应能力。因此，当用根据本发明的包封有抑制素的纳米颗粒制剂经处理的牙髓源性干细胞施用于遭受不同疾病的患者身体时，通过干细胞功能增强的功能和抑制素逐渐从干细胞中释放的功能展现出各种显著的疾病治疗效果。
在本发明的包封有抑制素的纳米颗粒制剂的一个实施方式中，
[2]该生物吸收性聚合物包括聚乳酸聚合物(PLA)或聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)。
PLA和PLGA可以在体内水解，从而释放出被包封的抑制素。此外，PLA通过水解而分解为乳酸，PLGA通过水解而分解为乳酸和乙二醇。最终，PLA和PLGA被分解为对人等动物无害的水和二氧化碳，因此优选将PLA或PLGA用作纳米粒子材料。
在本发明的包封有抑制素的纳米颗粒制剂的一个实施方式中，
[3]牙髓源性干细胞的增强的功能是迁移能力和产生血管生成因子能力中的至少一种。
在本发明的包封有抑制素的纳米颗粒制剂的一个实施方式中，
[4]根据[1]或[2]的包封有抑制素的纳米颗粒制剂，其中牙髓源性干细胞的增强的功能是HGF表达的增加。
在本发明的另一方面中，本发明涉及
[5]一种包封有抑制素的纳米颗粒制剂，该包封有抑制素的纳米颗粒制剂包括：含有生物吸收性聚合物的纳米颗粒；以及包覆在纳米颗粒中的抑制素，其中该制剂用于增强细胞制剂的疗效，所述细胞制剂包含用于治疗缺血性疾病、炎症性疾病或神经退行性疾病的牙髓源性干细胞。
在本发明的另一方面中，本发明涉及
[6]一种包封有抑制素的纳米颗粒制剂，该包封有抑制素的纳米颗粒制剂包括：含有生物吸收性聚合物的纳米颗粒；以及包覆在纳米颗粒中的抑制素，其中该制剂用于增强细胞制剂的疗效，所述细胞制剂包含用于治疗炎症性疾病或神经退行性疾病的牙髓源性干细胞或脂肪源性干细胞。
在本发明的另一方面中，本发明涉及
[7]一种牙髓源性干细胞，其包括上面[1]至[3]中任一项所述的包封有抑制素的纳米颗粒制剂。
由于根据本发明的牙髓源性干细胞包含包封有抑制素的纳米颗粒，通过包封有抑制素的纳米颗粒增强了细胞功能，并且牙髓源性干细胞在治疗包括缺血性疾病的各种疾病方面具有优良的效果。
在本发明的另一方面中，本发明涉及
[8]一种用于治疗缺血性疾病的细胞制剂，该细胞制剂包括上面[7]中所述的牙髓源性干细胞。
在本发明的另一方面中，本发明涉及
[9]一种用于治疗炎症性疾病的细胞制剂，该细胞制剂包括上面[7]中所述的牙髓源性干细胞。
在本发明的另一方面中，本发明涉及
[10]一种用于治疗神经退行性疾病的细胞制剂，该细胞制剂包括上面[7]中所述的牙髓源性干细胞。
在本发明的另一方面中，本发明涉及
[11]根据[7]至[10]中任一项所述的细胞制剂，其中该细胞制剂其特征在于用于静脉给药、动脉给药或局部给药。
根据本发明的牙髓源性干细胞可以通过与药学上可接受的溶剂以及赋形剂混合配置成细胞制剂。优选将干细胞施用至活体无需手术例如开腹，并且优选干细胞配置成用于静脉给药或动脉内给药的细胞制剂。因此，根据本发明的干细胞可以简单地施用于患者。由于干细胞功能增强，即使以静脉给药或动脉内给药，而不以局部给药方式，也可以小剂量获得优良的效果。此外，根据本发明的功能增强的干细胞制剂能够在难以通过静脉给药到达而以动脉内给药施用方式的炎症性部位例如肠道中积聚。因此，无需进行局部给药，并且通过动脉内给药方式，细胞可以小剂量均匀地递送至病变部位，并且可以获得稳定的高的效果。
在本发明的另一方面中，本发明涉及
[12]一种用于治疗有关神经炎症疾病的细胞制剂，该细胞制剂包括牙髓源性干细胞。
在本发明的另一方面中，本发明涉及
[13]一种用于治疗患有缺血性疾病的对象的方法，该方法包括将包含根据上面[7]所述的牙髓源性干细胞的细胞制剂施用于对象。
在本发明的另一方面中，本发明涉及
[14]一种用于治疗患有炎症性疾病的对象的方法，该方法包括将包含根据上面[7]所述的牙髓源性干细胞的细胞制剂施用于对象。
在本发明的另一方面中，本发明涉及
[15]一种用于治疗患有神经退行性疾病的对象的方法，该方法包括将包含根据上面[7]所述的牙髓源性干细胞的细胞制剂施用于对象。
在本发明的另一方面中，本发明涉及
[16]一种包含根据上面[7]所述的牙髓源性干细胞的细胞制剂，该细胞制剂用于治疗患有缺血性疾病的对象。
在本发明的另一方面中，本发明涉及
[17]一种包含根据上面[7]所述的牙髓源性干细胞的细胞制剂，该细胞制剂用于治疗患有炎症性疾病的对象。
在本发明的另一方面中，本发明涉及
[18]一种包含根据上面[7]所述的牙髓源性干细胞的细胞制剂，该细胞制剂用于治疗患有神经退行性疾病的对象。
在本发明的另一方面中，本发明涉及
[19]包含根据上面[7]所述的牙髓源性干细胞的细胞制剂在制备用于缺血性疾病的治疗试剂中的用途。
在本发明的另一方面中，本发明涉及
[20]包含根据上面[7]所述的牙髓源性干细胞的细胞制剂在制备用于炎症性疾病的治疗试剂中的用途。
在本发明的另一方面中，本发明涉及
[21]包含根据上面[7]所述的牙髓源性干细胞的细胞制剂在制备用于神经退行性疾病的治疗试剂中的用途。
本发明的效果
根据包封有抑制素的纳米颗粒制剂、含有该包封有抑制素的纳米颗粒制剂的牙髓源性干细胞、和含有本发明的牙髓源性干细胞的细胞制剂，可以增强牙髓源性干细胞的功能，并且当干细胞施用在活体中时，可以对各种疾病带来优良的治疗效果。
附图说明
图1是示出用包封有抑制素的纳米颗粒经处理的牙髓源性干细胞的迁移的测量结果的图表。
图2是示出用包封有抑制素的纳米颗粒经处理的牙髓源性干细胞和脂肪源性干细胞的HGF表达水平的测量结果的图表。
图3是示出从施用PBS或牙髓源性干细胞起53天后心肌梗塞模型小鼠的心脏的照片。
图4是示出从施用含有包封有抑制素的纳米颗粒的牙髓源性干细胞或脂肪源性干细胞起53天后心肌梗塞模型小鼠的心脏的照片。
图5是示出对施用了PBS的来自心肌梗塞模型小鼠的心脏的梗塞切片进行三色染色的结果的照片。
图6是示出对施用了牙髓源性干细胞的来自心肌梗塞模型小鼠的心脏的梗塞切片进行三色染色的结果的照片。
图7是示出对施用了含有包封有抑制素的纳米颗粒的脂肪源性干细胞的来自心肌梗塞模型小鼠的心脏的梗塞切片进行三色染色的结果的照片。
图8是示出对施用了含有包封有抑制素的纳米颗粒的牙髓源性干细胞的来自心肌梗塞模型小鼠的心脏的梗塞切片进行三色染色的结果的照片。
图9(A)是示出来自心肌梗塞模型小鼠的心脏的梗塞部分的切片中纤维化部分的面积的图表，其中施用了PBS、牙髓源性干细胞、含有包封有抑制素的纳米颗粒的脂肪源性干细胞或含有包封有抑制素的纳米颗粒的牙髓干细胞，(B)是示出切片中纤维化部分的长度的图表，以及(C)是示出每个切片中纤维化部分的心肌壁的厚度的图表。
图10是示出心肌梗塞模型小鼠的心脏的超声诊断的结果的图表，其中施用了PBS、牙髓源性干细胞、含有包封有抑制素的纳米颗粒的脂肪源性干细胞或含有包封有抑制素的纳米颗粒的牙髓干细胞；(A)示出左心室舒张末期前后径(LVDD)，和(B)示出左心室缩短分数(FS)。
图11是示出心肌梗塞模型小鼠的心脏的梗塞部分的同工凝集素(Isolectin)B4染色片段的血管密度的测试结果的图表，其中施用了PBS、牙髓源性干细胞、含有包封有抑制素的纳米颗粒的脂肪源性干细胞或含有包封有抑制素的纳米颗粒的牙髓干细胞；(a)示出片段染色后的显微相片，和(b)是示出经测量的血管密度的图表。
图12是痴呆模型小鼠的记忆分析(storage analysis)的结果，其中施用了PBS、牙髓源性干细胞、含有包封有抑制素的纳米颗粒的脂肪源性干细胞或含有包封有抑制素的纳米颗粒的牙髓干细胞。(a)是示出在巴恩斯迷宫实验中通过寻找目标洞直至进入逃生笼中小鼠的移动距离的图表，和(b)是示出直至小鼠进入逃生笼中的时间的图表。
图13示出对改良的关节病模型小鼠进行触痛测试(Von Frey test)的结果，其中施用了PBS、牙髓源性干细胞、含有包封有抑制素的纳米颗粒的脂肪源性干细胞或含有包封有抑制素的纳米颗粒的牙髓干细胞；
(A)示出在施用两周后引起逃逸反应的阈值得分；和(B)示出施用两周后的得分与施用当天的得分的比率。
图14是示出骨关节炎模型小鼠的关节软骨组织的组织学分析结果的照片，其中施用了PBS、牙髓源性干细胞、含有包封有抑制素的纳米颗粒的脂肪源性干细胞或含有包封有抑制素的纳米颗粒的牙髓干细胞。
图15(a)和(b)是示出骨关节炎模型小鼠的关节损伤程度的得分结果的图表，其中施用了PBS、牙髓源性干细胞、含有包封有抑制素的纳米颗粒的脂肪源性干细胞或含有包封有抑制素的纳米颗粒的牙髓干细胞。
图16是示出正常小鼠和Shn-2 KO小鼠的筑巢行为分析结果的照片。
图17是示出在施用牙髓源性干细胞、含有包封有抑制素的纳米颗粒的脂肪源性干细胞或含有包封有抑制素的纳米颗粒的牙髓干细胞之前(第0天)Shn-2 KO小鼠的筑巢行为分析结果的照片。
图18是示出在施用牙髓源性干细胞、含有包封有抑制素的纳米颗粒的脂肪源性干细胞或含有包封有抑制素的纳米颗粒的牙髓干细胞一周之后(第7天)Shn-2 KO小鼠的筑巢行为分析结果的照片。
图19是示出在施用牙髓源性干细胞、含有包封有抑制素的纳米颗粒的脂肪源性干细胞或含有包封有抑制素的纳米颗粒的牙髓干细胞两周之后(第14天)Shn-2 KO小鼠的筑巢行为分析结果的照片。
图20是反映图17至图19的结果的图表。
具体实施方式
下面结合附图描述用于实现本发明的实施例。下面描述的优选实施例是出于示例性目的而描述的，而无意于限制本发明、其应用方法或其用途。
在本发明的包封有抑制素的纳米颗粒制剂中使用的包封有抑制素的纳米颗粒是其中抑制素被包封在含有聚乳酸羟基乙酸共聚物的纳米颗粒中的包封有抑制素的纳米颗粒，并且用于增强牙髓源性干细胞的功能。除包封有抑制素的纳米颗粒之外，包封有抑制素的纳米颗粒制剂可以包含通常用于制剂的添加剂例如稳定剂、防腐剂、缓冲液、pH调节剂、赋形剂等。
在本发明中，抑制素包括作为HMG-CoA(3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A)还原酶抑制剂的所有化合物，其包括例如辛伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀和美伐他汀。众所周知，抑制素具有如上所述的降低胆固醇功能，并且大规模临床试验表明抑制素可以减少心血管事件的发生及其发展的风险。此外，已有许多报道关于通过源自骨髓的血管内皮细胞和血管内皮祖细胞的血管生成促进作用。还已知抑制素示出抗炎作用。
在本发明中，纳米颗粒不受限制，只要是能够包封抑制素的生物吸收性聚合物即可。优选使用含有聚乳酸聚合物(PLA)或聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)的纳米颗粒。由于PLA在体内被水解分解为乳酸，而PLGA在体内被水解分解为乳酸和乙二醇，最终变成水和二氧化碳，对身体无害并且因此优选用于身体。在制备纳米颗粒中使用的PLA或PLGA的重均分子量不限于以下，但可以使用例如在5000至50000的范围中。即使材料与所使用的PLA和PLGA不同，本领域技术人员可以选择适合分子量的材料。
在本发明中，包封有抑制素的纳米颗粒可以通过当其从牙髓源性干细胞的吸收效率观点通过光散射方法测量时可以被处理为小于1000nm，优选大约100nm至400nm，并且更优选200nm至400nm的任何方法制备。优选通过使用球形结晶方法来制备。众所周知，球形结晶方法是一种能够设计球形晶体颗粒并通过在化合物合成的最终过程中控制晶体的生成/生长过程来直接控制和处理物理性质的方法。球形结晶方法之一是众所周知的乳液溶剂扩散方法(ESD方法)。
通过使用包括用于包封抑制素的能够溶解生物吸收性聚合物例如PLA或PLGA的良溶剂和聚合物在其中不溶解的不良溶剂的两种有机溶剂进行乳液溶剂扩散方法。首先，聚合物例如PLA或PLGA溶解于良溶剂中，并且将抑制素溶液添加至良溶剂并且混合，使得聚合物不沉淀。
当混合液滴入到不良溶剂中时进行搅拌，由于良溶剂快速相互扩散成不良溶剂并且不良溶剂快速相互扩散成良溶剂，在有机溶剂相和水相之间的界面受到干扰，良溶剂自乳化，并且形成亚微米尺寸的乳滴。此后，进一步促进良溶剂和不良溶剂的互扩散，聚合物和抑制素例如PLA或PLGA在乳滴中的溶解度降低，结果生成含有抑制素的球形晶体颗粒的聚合物纳米颗粒。
在制备包封有抑制素的纳米颗粒中使用的生物吸收性聚合物和抑制素不受限制，只要所获得的包封有抑制素的纳米颗粒可以增强牙髓源性干细胞的功能，但其优选例如以5％的速率混合。如下面实例所示，当通过使用50mg的PLGA(重均分子量为20000)、辛伐他汀(2.5mg)、丙酮(2mL)和乙醇(0.5mL)作为良溶剂，并且2重量％的PVA溶液(10mL)作为不良溶液制备包封有抑制素的纳米颗粒时，大约50μg的抑制素可以被包封在1mg的纳米颗粒中。尽管只要可以增强牙髓源性干细胞的功能而包封有抑制素的纳米颗粒不受限制，但优选大约30μg至60μg的抑制素被包封在1mg的纳米颗粒中。
在本发明中可使用的牙髓源性干细胞包含在从牙髓组织中再生的牙髓细胞群。作为在本发明中使用的牙髓源性干细胞，可以使用含有牙髓源性干细胞的牙髓细胞群，因为通过从牙髓组织中再生牙髓细胞群并且根据需要使用例如αMEM培养基来培养而获得。含有牙髓源性干细胞的牙髓细胞群可以冷藏保存并且在冷藏保存后解冻。作为优选的实施例，牙髓源性干细胞可以进步选自含有牙髓源性干细胞的细胞群，并且可以使用仅由再生的牙髓源性干细胞构成的细胞群。用于从牙髓细胞中选择牙髓源性干细胞的方法是已知的(例如，Yamaza等，“Immunity property of stem cells from human exfoliated deciduousteeth”.Stem Cell Res Ther.(2010)1:5)
“牙髓组织”可以从任何乳牙和恒牙中收集，并且可以从被作为医用废弃物处理的拔牙例如乳牙或智齿的牙髓中获得。即，牙髓组织可以从在牙科医疗设备中经牙科处理的牙齿中取出，并且可以从自然拔掉的牙齿或自然脱落的牙齿中提取。从牙齿中取出牙髓组织的方法是众所周知的，本领域技术人员可以适当地进行。当无法立即在现场进行冷冻处理例如经过牙科处理的牙齿时，可以通过将其浸入诸如α最低必需培养基(αMEM)的培养基中并在低温(例如4℃)下储藏来保存和运输牙齿。牙髓可以源自人类和其他哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔子、狗、猫、猴子、绵羊、牛、马)。优选地，牙髓源性干细胞来源于人牙髓组织。
例如，通过将纳米颗粒添加到其中培养有干细胞的培养基中进行包封有抑制素的纳米颗粒进入到牙髓源性干细胞的处理。由于干细胞通过吞噬作用吸收包封有抑制素的纳米颗粒，因此，可以容易地将包封有抑制素的纳米颗粒掺入到干细胞中，而无需使用特殊试剂等(见例如美国专利第6,110578号)。只要包封有抑制素的纳米颗粒被摄入到牙髓源性干细胞中并且增强了牙髓源性干细胞的功能，包封有抑制素的纳米颗粒至牙髓源性干细胞的处理条件不受限制。条件例如优选在37℃下30分钟至1小时。在使用其中30μg至60μg的抑制素被包封在1mg的纳米颗粒中的包封有抑制素的纳米颗粒的情况下，只要牙髓源性干细胞的功能增强，用于在处理含有牙髓源性干细胞的细胞群中使用的纳米颗粒浓度不受限制，但例如优选大约25μg/5×104个细胞至大约200μg/5×104个细胞的浓度，更优选大约50μg/5×104个细胞至大约200μg/5×104个细胞的浓度。
在一个实施方式中，根据本发明的包封有抑制素的纳米颗粒增强了牙髓源性干细胞的HGD表达。HGF基因是参与血管生成和肝细胞增殖能力的基因。特别是在血管生成中，与其他血管生成因子VEGF和bFGF相比，HGF在平滑肌细胞中显示出优异的迁移能力。此外，据报道，HGF的血管生成没有由EGF诱导的血管生成形成的水肿，也没有如bFGF在血管生成中所见的炎症(T.Kaga等，“Hepatocyte growth factor stimulated angiogenesis withoutinflammation:Differential actions between hepatocyte growth factor,vascularendothelial growth factor and basic fibroblast growth factor”VascularPharmacology，2012年8月19日，第57卷，第1期，第3-9页)。因此，暗示其中通过根据本发明的抑制素纳米颗粒增强HGF表达的牙髓源性干细胞可以有助于形成更多正常成熟血管。根据本发明的包封有抑制素的纳米颗粒优选可以增强HGF基因表达数量大约1.2倍或更多，更优选大约1.5倍或更多，并且更优选大约1.7倍或更多。因此，具有增强HGF基因表达的牙髓源性干细胞优选用于治疗缺血性疾病(缺血性心脏病、阻塞性动脉硬化、动脉血栓形成(thrombosis arterial flame)等)、肝硬化等。
用根据本发明的含有抑制素的纳米颗粒处理的牙髓源性干细胞尤其具有增强的迁移能力和增强的血管生成因子产生能力，并且尤其具有对于各种疾病的增强的治疗效果。即使通过静脉内给药或动脉内给药而无需局部给药，根据本发明的功能增强的干细胞也以小剂量展现出显着的效果。
在本发明中，缺血性疾病是指由于动脉的狭窄或闭塞或缺血引起的疾病而使组织缺血持续的状态。缺血性疾病不限于以下，例如，缺血性心脏病如心绞痛和心肌梗塞，脑缺血性疾病如脑梗塞，慢性脑缺血性疾病如烟雾病，脊髓缺乏症，缺血性肠病如缺血性结肠炎和肠系膜动脉闭塞，下肢缺血性疾病如闭塞性动脉硬化和伯格氏病(Buerger's disease)，视网膜缺血性疾病如糖尿病性视网膜病变等。
特别地，当将用根据本发明的包封有抑制素的纳米颗粒处理的牙髓源性干细胞静脉注射施用于缺血性心脏病患者时，牙髓源性干细胞通过血液流动和其迁移能力到达心脏，并且在缺血性损伤心肌部分积聚和增值并且分化成心血管细胞。此外，积聚的含有牙髓源性干细胞的包封有抑制素的纳米颗粒促进血管生成因子的产生和释放并且通过许多血管生成因子促进心肌组织的再生。在一个实施方式中，用根据本发明的包封有抑制素的纳米颗粒处理的牙髓源性干细胞可以动脉内给药。当动脉内给药时，牙髓源性干细胞通过血液流动达到发炎的器官例如肠道，在发炎部位积聚和增殖，产生抗炎细胞因子，并且抑制炎症细胞活性。结果其显示出对炎症性疾病的显著的治疗效果。
在本发明中，炎症性疾病是指以炎症为病因之一的疾病，并且不限于以炎症为表征症状的疾病如肠炎和肺炎，并且包括其中炎症参与其发展过程的疾病，例如肺动脉高压和痴呆。具体地，本发明中的炎症性疾病是系统性红斑狼疮、硬皮病、特应性皮炎、类风湿性关节炎、间质性肺炎、支气管哮喘、肺动脉高压、炎性肠病(IBD)例如溃疡性结肠炎和克罗恩氏病、神经损伤、脊髓损伤、中风(脑梗塞和脑出血后遗症)、肌肉萎缩性侧索硬化、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经炎、精神分裂症、痴呆症、器官移植过程中的排斥反应、慢性肾炎(肾硬化)等。在本发明中，神经退行性疾病是指引起中枢神经系统(例如，脑或脊髓)中的神经细胞的特定神经细胞群由于紊乱而逐渐脱落，运动能力下降，平衡感下降，肌肉力量下降和/或认知能力下降的疾病。神经退行性疾病包括但不限于肌萎缩性侧索硬化症(ALS)，帕金森氏综合征(帕金森氏病等)，阿尔茨海默氏病，莱维型痴呆(Lewy-type dementia)，皮质基底核变性(cortical basal nucleus degeneration)，进行性核麻痹(PSP)，亨廷顿氏病，多系统萎缩(MSA)(黑条变性(Black streak degeneration)(SND))，夏伊德雷格氏综合征(Shy-Drager综合征)，橄榄体脑桥小脑萎缩(OPCA)等)，脊髓小脑变性(SCD)(脊椎小脑失衡(SCA3，通常已知的马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph's disease)等)，弗里德里希共济失调症(Friedreich'sataxia等)等。
如上所述，由于牙髓源性干细胞可以通过水解在细胞中掺入的包封有抑制素的纳米颗粒方式逐渐释放包封的抑制素，当将牙髓源性干细胞施用到身体中时，牙髓源性干细胞在给药后可以逐渐释放抑制素，并且通过释放的抑制素可以提供进一步的抗炎效果。
在一个实施方式中，含有用根据本发明的包封有抑制素的纳米颗粒处理的牙髓源性干细胞的细胞制剂可以用作用于改善疼痛的细胞制剂。在一个实施方式中，含有用根据本发明的包封有抑制素的纳米颗粒处理的牙髓源性干细胞的细胞制剂可以用作用于改善软骨损伤的细胞制剂。
用包封有抑制素的纳米颗粒处理的牙髓源性干细胞对于作为痴呆模型小鼠的基因敲入小鼠的痴呆症具有治疗效果，其中基因突变被插入到小鼠APP基因的淀粉样β区中。据报道，基因突变被插入到小鼠APP基因的淀粉样β区中的基因敲入小鼠会增加大脑中有毒淀粉样β物质(Aβ42)的产生比例，从而促进形成淀粉样变性病，并且识别神经发炎和突触的损失。因此，含有用根据本发明的包封有抑制素的纳米颗粒处理的牙髓源性干细胞的细胞制剂的一个实施方式可以用作用于治疗由淀粉样β的积聚引起的神经炎症的制剂。
用根据本发明的包封有抑制素的纳米颗粒处理的牙髓源性干细胞对于精神分裂症模型小鼠的SHN-2敲除(KO)小鼠具有精神分裂症的治疗效果。因此，含有用根据本发明的包封有抑制素的纳米颗粒处理的牙髓源性干细胞的细胞制剂的一个实施方式可以用作用于由SHN-2的表达降低或敲除引起的精神分裂症的治疗制剂。此外，据报道，在SHN-2敲除(KO)小鼠的大脑中，神经炎症是由星形胶质细胞的活化引起的，并且用根据本发明的包封有抑制素的纳米颗粒处理的牙髓源性干细胞被认为能够抑制由星形胶质细胞的活化引起的神经炎症。
实施例
下面示出用于详细阐述根据本发明的用于增强干细胞功能的包封有抑制素的纳米颗粒制剂的实例和含有该抑制素的功能增强的干细胞的实例。
首先，描述了一种用于制备包封有抑制素的纳米颗粒的方法。在这些实例中，辛伐他汀被用作抑制素，聚乳酸聚合物/聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)被用作纳米颗粒。
将50mg的PLGA(重均分子量为20000)和2.5mg的辛伐他汀溶解在2mL的丙酮和0.5mL的乙醇混合物中，以制备聚合物溶液。将聚合物溶液滴入2重量％的10ml的PVA溶液中，在室温和500rpm转速下搅拌，以得到包封有辛伐他汀的PLGA纳米颗粒悬浮液。随后，在室温和500rpm转速下搅拌的同时，将有机溶剂(丙酮、乙醇)蒸馏掉。溶剂蒸馏约5小时后，将悬浮液在4℃和6000g下离心30分钟，将沉淀物回收再悬浮于蒸馏水中。离心和再悬浮到蒸馏水中的操作进行三次。此后，将该悬浮液冷冻干燥过夜，得到包封有辛伐他汀的PLGA纳米颗粒，该颗粒在后续试验中用作包封有抑制素的纳米颗粒。
本实例中使用的牙髓源性干细胞制备如下。牙髓组织是用镊子等从收集来自附属牙科诊所的病人(4-13岁)的乳牙中提取的。用手术刀或类似的方法对提取的牙髓组织进行精细切割，并使用用于组织分散的酶液(如Accutase)进行细胞分散。将分散的细胞悬浮在含血清的α-MEM培养基中，以计数细胞数量。根据细胞数的计数结果，用具有适当大小的细胞培养烧瓶，在37℃和5％CO2下培养细胞。每2-3天更换培养基总用量。原代培养的细胞在烧瓶中培养，直到半汇合状态(semi-confluent state)(细胞密度：70-80％)。
通过显微可视化确认半汇合状态，并且去除全部量的培养基。为了完全去除含有血清的培养基，采用D-PBS(-)洗涤烧瓶底部表面，重复两次此操作。洗涤后，加入适量的TrypLE Select(Gibco)，使其扩散到烧瓶的整个底部表面，并在37℃下孵育。在一个时间，当一部分细胞从烧瓶的底部表面剥离时，通过缓慢转动瓶中的溶液，将细胞从烧瓶底部表面分离出来。将烧瓶倾斜，加入含血清的α-MEM培养基，以便使其流过整个烧瓶，并将细胞剥离以制备细胞悬浮液。细胞悬浮液回收至15mL试管。加入新的α-MEM培养基，使其流过整个烧瓶，细胞被剥离。细胞悬浮液回收至15mL试管。将回收的细胞悬浮液离心，去除上清液，加入含血清的α-MEM培养基，形成悬浮液以计数细胞数。用具有与细胞密度2000-5000个细胞/cm2相适应的大小的细胞培养烧瓶，在37℃和5％CO2下培养细胞。扩大培养重复两个传代(passages)。
在确认扩大培养中的细胞处于半汇合状态(细胞密度：70-80％)后，将培养上清液回收到一个新的50ml试管中。将上清液回收后的烧瓶中的细胞冷冻，并将收集在50ml试管中的培养上清液用于以下检查。通过HBV定量测定、HCV定量测定、HIV定量测定、细小病毒IgG、细小病毒IgM、CMV-IgG、CMV-IgM、FTA-ABS、STD-支原体鉴定和内毒素检查，确认细胞的安全性。在确认扩大培养中的半汇合状态和去除培养上清液后，用D-PBS(-)洗涤烧瓶底部表面，以便从烧瓶内部完全去除含有血清的培养基组分，并在相应的烧瓶重复两次操作。将TrypLE select加入到每个烧瓶中，使其扩散到烧瓶的整个底部表面，并在37℃下孵育烧瓶。在一个时间，当一部分细胞从烧瓶的底部表面剥离时，通过缓慢转动瓶中的溶液，将细胞从烧瓶底部表面分离出来。加入α-MEM培养基使其流过整个烧瓶，分离细胞以制备细胞悬浮液。将细胞悬浮液回收至15ml试管中。在每个烧瓶中加入3ml的α-MEM培养基，并使其流过整个烧瓶，将烧瓶中的剩余细胞剥离以制备细胞悬浮液，并将细胞悬浮液回收到15ml试管中。将回收的细胞悬浮液离心，去除其上清液，加入D-PBS(-)，形成悬浮液以计数细胞数量。通过离心再次去除上清液。使用移液管轻轻地加入细胞库2，其是一种根据细胞数量(最终浓度：0.9至1.3×106个细胞/ml)的量的冷冻保存液。将1ml含有细胞的冷冻保存溶液逐一转移到冷冻试管中。冷冻试管放置在Bicel中，在-80℃冷柜冷冻，并在3天内转移到液氮罐。
大约70％的含有冷冻保存的牙髓干细胞的冷冻保存溶液在恒温罐中迅速溶解。大约70％的溶解的冷冻保存溶液被加入到加热到37℃的α-MEM培养基中。溶解后，执行离心，去除上清液。加入新的培养基以计数细胞数量。用具有与2000-5000个细胞/cm2细胞密度相适应的大小的细胞培养烧瓶，在37℃恒温箱中和5％CO2下培养细胞。播种后，每2-3天更换培养基总用量。重复扩大培养，直到获得将要用于试验的细胞的需要的数量，准备好含有牙髓源性干细胞的细胞群。像这样准备好的含有牙髓源性干细胞的细胞群被应用于以下示例。在下文中，含有牙髓源性干细胞的细胞群被方便地称为“牙髓源性干细胞”。
接下来，通过包封有辛伐他汀的纳米颗粒进行以下测试，以检查牙髓源性干细胞的功能的增强，如迁移能力和产生血管生成因子的能力。
首先，用迁移试验试剂盒
Figure GDA0003035031790000151
检测牙髓源性干细胞(PdSC)的迁移能力。具体地，将一株牙髓源性干细胞(#221)分配到α-MEM中，使得其在多个微试管中处于5×104个细胞/500μl/试管；并添加包封有辛伐他汀的PLGA纳米颗粒，使得其数量为0μg/5×104个细胞、25μg/5×104个细胞、50μg/5×104个细胞、100μg/5×104个细胞或200μg/5×104个细胞，并静置18小时。将20％FBSα-MEM培养基中的牙髓源性干细胞以5×104个细胞播种在Transwell平板的每个孔的多孔膜上，6小时后，测量通过Transwell平板的膜的细胞数。作为对照，在0％FBSα-MEM培养基中将牙髓源性干细胞以5×104个细胞播种，而不使用包封有辛伐他汀的PLGA纳米颗粒处理。结果如图1所示。
如图1所示，当用25或50μg/5×104个细胞的低浓度的包封有辛伐他汀的PLGA纳米颗粒处理时，与未经处理的比较，牙髓源性干细胞的迁移能力没有变化，但是当用100或200μg/5×104个细胞，尤其是250μg/5×104个细胞的高浓度的包封有辛伐他汀的PLGA纳米颗粒处理时，牙髓源性干细胞的迁移能力增加。结果表明，相对高浓度的包封有辛伐他汀的PLGA纳米颗粒可以增强牙髓干细胞的迁移能力。
接下来，采用定量PCR方法对牙髓源性干细胞中血管生成因子的mRNA表达量进行了分析，以检测包封有辛伐他汀的纳米颗粒对牙髓源性干细胞血管生成因子产生能力的影响。在该实例中，测量HGF的细胞内mRNA的表达量作为血管生成因子。
首先，将三株牙髓源性干细胞(#221)分配到微试管中，使得1×105个细胞/1毫升/试管，在微试管中加入包封有辛伐他汀的PLGA纳米颗粒，使得其浓度为0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL或400μg/mL，微试管静置30分钟。然后，用PBS洗涤细胞，用20％FBSα-MEM培养基中在6孔培养皿中播种细胞。细胞在48小时后回收，用NucleoSpinRNA试剂盒(TakaraBio)提取其RNA。然后，通过使用与HGF的DNA序列相关的引物的定量PCR方法测量每个细胞中HGF的mRNA表达量。测量是通过使用RverTraAce qPCR RT试剂盒(TOYOBO)从提取的RNA中合成cDNA，并将cDNA与SsoFastEvaGreen Mastermix试剂(Biorad)和引物在热循环器(Cfxconnect Biorad)中反应(一个周期在95℃持续30秒，40个周期在95℃持续5秒/56℃持续5秒)。作为比较，三株(#101，#103，#104)脂肪源性干细胞(AdSC)的处理方式与上述相同，以测量HGF的mRNA表达量。测量结果如图2所示。结果指示了基于GAPDH的mRNA表达量的上述因子表达量的每一比率。
如图2所示，尤其在用50μg/mL(25μg/5×104)、100μg/mL(50μg/5×104)的低浓度的包封有辛伐他汀的PLGA纳米颗粒处理的任何一株牙髓源性干细胞中，都观察到HGF表达的增加。另一方面，尽管在一株用包封有辛伐他汀的PLGA纳米颗粒处理的脂肪源性干细胞中观察到了HGF表达的增加，但是在两株中都没有HGF表达的增加。
如上所述，已经发现，由于包封有抑制素的纳米颗粒，作为的检查功能的增强的结果，例如迁移能力和产生牙髓源性干细胞的血管生成因子的能力，包封有抑制素的纳米颗粒可以增强牙髓源性干细胞的功能。通过增强这些功能，牙髓源性干细胞被认为对于治疗各种疾病是有利的。
接下来，用心肌梗塞模型小鼠，研究了根据本发明的含有包封有抑制素的纳米颗粒的牙髓源性干细胞的心肌梗塞治疗效果。
首先，对10-12周龄的雄性BALB/c裸鼠(第0天)进行缺血诱导(冠状动脉前降支结扎模型)，然后在3天后(第3天)，将PBS(磷酸盐缓冲盐水)、牙髓源性干细胞(5×104个细胞)、含有包封有抑制素的PLGA纳米颗粒的牙髓干细胞(100μg/5×104个细胞，#221株)或含有包封有抑制素的PLGA纳米颗粒的脂肪源性干细胞(100μg/5×104个细胞，#104株)从尾静脉施加。53天后(第56天)，进行心脏超声图像诊断，然后通过解剖心脏进行心脏组织分析。在心脏超声图像诊断中，测量左心室内部短轴缩短率(FS)和左心室舒张末期前后径(LVDD)，并评估从第3天到第56天的变化率。作为组织学分析，通过常规方法制备每组取出的心脏中的梗塞部分的切片，使用Masson三色染色法分析梗塞部分的纤维化面积比、纤维化长度比、梗塞心肌壁厚比。第56天的心脏照片示于图3和图4，在不同部分的Masson三色染色切片(组织标本)的照片示于图5-8，使用组织样本对左心室心肌形态分析的结果示于图9，心脏超声图像诊断的结果示于图10。
如图3和图4所示，与PBS组和施加了牙髓源性干细胞的PdSC组相比，作为对照，从外观上证实，在施加了含有包封有抑制素的纳米颗粒的脂肪源性干细胞的组(抑制素-AdSC组)中，心脏的扩张被抑制，从外观上也证实了，在施加了含有包封有抑制素的纳米颗粒的牙髓源性干细胞的组中(抑制素-PdSC组)，心脏的扩张被进一步抑制。虽然在PBS组和PdSC组中有许多小鼠死亡，但在抑制素-AdSC组中5只小鼠中只有一只死亡，而在抑制素-PdSC组中没有小鼠死亡。
如上所述，图5-8显示了在第56天在心脏不同部位的Masson三色染色部分的照片。由于缺血坏死的心肌细胞部分由成纤维细胞取代而变成纤维化。纤维化和蓝色染色疤痕部分的面积用箭头指示。如图5-8所示，作为对照，PBS组中大面积纤维化；另一方面，在施加了牙髓源性干细胞的PdSC组和施加了含有包封有抑制素的纳米颗粒的脂肪源性干细胞的组(抑制素-AdSC组)中，纤维面积缩小；在施加含有包封有抑制素的纳米颗粒的牙髓源性干细胞组中，纤维化面积几乎看不到。
图9显示了基于图5-8的分析结果，具体地，当心脏的整个面积为100％时，图9(a)显示每组中变成蓝色的纤维化部分的比率，当整个周长的长度为100％时，图9(b)显示了每组中变成蓝色的纤维化部分长度的比率，当正常心肌壁的厚度为100％时，图9(c)显示了纤维化并变成蓝色的心肌壁的厚度的比率。如图9(a)和图9(b)所示，作为对照，在PBS组中许多区域变成纤维化，PdSC组和抑制素-AdSC组有改善，抑制素-PdSC组有进一步改善。如图9(c)所示，同样，作为对照，PBS组心肌壁厚度极薄，PdSC组和抑制素-AdSC组有轻微改善，抑制素-PdSC组有显著改善。
接下来，将参考图10解释心脏超声图像诊断的结果。图10(a)显示每组第56天的左心室舒张末期前后径(LVDD)与第3天的左心室舒张末期前后径的变化率(ΔLVDD)，图10(b)显示每组第56天的左心室内部短轴缩短率(FS)与第3天的左心室内部短轴缩短率的变化率(ΔFS)。如图10(a)所示，在PBS组中观察到明显的肥大，在抑制素-PdSC组、抑制素-AdSC组和PdSC组中，有高的对这种肥大的抑制作用，且逐组升高。如图10(b)所示，PBS组中左心室内部短轴缩短率(FS)恶化，PdSC组中无改善。另一方面，抑制素-AdSC组有改善，抑制素-PdSC组比抑制素-AdSC组有进一步改善。
因此，可以通过仅使用牙髓源性干细胞来改善心脏功能，而且可以通过使用含有包封有抑制素的纳米颗粒的牙髓源性干细胞来获得更显著的改善效果。改善效果优于使用含有包封有抑制素的纳米颗粒的脂肪源性干细胞。
为了检查缺血边界区的血管密度，使用一种抗体进行荧光染色，该抗体与一种与血管内皮细胞中表达的糖蛋白结合的植物源性蛋白同工凝集素B4结合，并测量显微镜场染色区域的大小。测量结果以血管密度图示。结果如图11所示。如图11(a)和11(b)所示，与PBS组相比，PdSC组和抑制素-AdSC组的血管密度增加，并证实抑制素-PdSC组与其他组相比血管密度进一步增加。因此，认为由于施加含有包封有抑制素的纳米颗粒的牙髓源性干细胞，在梗塞周围部分(缺血部分)促进血管生成，以促进心肌组织再生。
上述结果表明，根据本发明的含有抑制素的纳米颗粒的牙髓源性干细胞，有可能对心肌梗塞等缺血性心脏病获得优越的治疗效果。具体地，本发明的包封有抑制素的纳米颗粒可以增强牙髓源性干细胞的迁移能力和产生血管生成因子的能力，功能增强的干细胞在梗塞部位整合并增殖，释放血管生成因子促进梗塞部位血管生成。进一步地，通过将积累的干细胞分化为心肌，促进了心肌的再生，从而获得心肌梗塞等缺血性心脏病的优越治疗效果。干细胞对缺血性心脏病的治疗是有用的，因为它们可以缓慢释放内含的抑制素，从而获得抑制素特有的各种效果，如抑制素本身的血管生成效果。特别是，与使用脂肪源性干细胞相比，当使用牙髓源性干细胞时，它对(I)抑制纤维化、(II)改善心肌壁厚度和(III)促进血管生成具有优越的效果。
接下来，用痴呆模型小鼠研究根据本发明的含有包封有抑制素的纳米颗粒的牙髓源性干细胞的治疗效果。方法和结果描述如下。作为痴呆模型小鼠，使用从Riken生物资源研究中心获得的C57BL/6-App<tm3(NL-G-F)Tcs>。将PBS、牙髓源性干细胞(#221)、含有包封有抑制素的纳米颗粒的脂肪源性干细胞或含有包封有抑制素的纳米颗粒的牙髓源性干细胞(#221)缓慢地从模型小鼠的尾静脉施加。每个干细胞的剂量为1×104个细胞/小鼠，使用200μl的PBS作为溶剂。使用包封有辛伐他汀的PLGA纳米颗粒作为包封有抑制素的纳米颗粒，20μg的这些纳米颗粒与脂肪源性干细胞或牙髓源性干细胞在37℃下培养30分钟，以获得含有包封有抑制素的纳米颗粒的脂肪源性干细胞或牙髓源性干细胞。著名的巴恩斯迷宫测试作为用于每只小鼠的记忆分析而实施，这些小鼠已被给药。给药日被定义为第0天，分别在第0天、第7天、第14天、第21天和第28天测量了直到小鼠找到仅在青铜迷宫台外围边缘部分提供的20个圆圈中的一个所提供的目标洞，并到达与目标洞连通的逃生笼的时间和移动距离，作为记忆分析。在实施测试(记忆分析)那天的前一天上午和下午，逐只小鼠进行了记忆训练。
每只小鼠与多只小鼠一起在一个笼子中饲养，在记忆训练和记忆分析前一小时或更长时间将其分为单个笼子，然后置于一个环境。记忆训练首先将小鼠放置在设置在迷宫台中心的白色圆柱形容器中一分钟，然后将圆柱形容器从迷宫台上移除，并发出小鼠不喜欢的超声波蜂鸣。之后，小鼠搜索目标洞3分钟，在小鼠进入逃生笼时，停止超声波蜂鸣。然而，当小鼠即使在3分钟后也没有进入逃生笼时，小鼠被放入一个透明的圆柱形容器中，在显示周围环境的同时，用大约30秒的时间将小鼠强行放入逃生笼中。小鼠在被放入逃生笼中后适应环境1分钟。记忆训练重复3次。
在记忆训练的第二天进行的记忆分析中，首先，允许小鼠在设置在迷宫台中心的白色圆柱形容器中站立一分钟，然后将圆柱形容器从迷宫台中拆除，启动具有小鼠不喜欢的频率的超声波蜂鸣，并开启动作跟踪记录。然后，在小鼠搜索目标洞并进入逃生笼的时间点时，停止超声波蜂鸣，并停止动作跟踪记录。在动作跟踪记录中，使用LimeLite软件(ActiMetrics，Inc.IL，USA)测量直到小鼠从超声波蜂鸣的发声中进入逃生笼的移动距离(目标到达移动距离)和时间(目标到达时间)，这是一个行为分析系统。每个小鼠的记忆分析结果如图12所示。
如图12(a)和12(b)所示，在第0天，每组PBS给药的痴呆模型小鼠、牙髓源性干细胞(PdSC)给药的痴呆模型小鼠、含有包封有抑制素的纳米颗粒的脂肪源性干细胞给药的痴呆模型小鼠(SimAdSC)和含有包封有抑制素的纳米颗粒的牙髓源性干细胞给药的痴呆模型小鼠(SimPdSC)的直到到达逃生笼的移动距离和时间都长。然而，伴随第7天和第14天的时间推移，与PBS组相比，特别是SimAdSC组的直到到达逃生笼的移动距离和时间明显缩短。然而，这种效果在SimAdSC组在第28天减小了。另一方面，在SimPdSC组中，移动距离逐渐缩短，在第28天直到到达逃生笼的移动距离和时间明显缩短。由于这个示例，给出提示，根据本发明的含有包封有抑制素的纳米颗粒的牙髓源性干细胞可以改善痴呆的症状。
接下来，利用骨关节炎(OA)模型小鼠，研究了根据本发明的含有包封有抑制素的纳米颗粒的牙髓源性干细胞对骨关节炎的治疗效果。方法和结果描述如下。使用了著名的模型小鼠作为OA模型小鼠，该模型小鼠通过切割BALB/c小鼠的右膝关节前交叉韧带和切除BALB/c小鼠的内半月板准备。具体地，将BALB/c裸鼠(雄性，10周龄)的右膝关节前交叉韧带切割，内半月板也被切割，并为了诱导OA，对小鼠实施了跑步机运动(30分钟/日，15°倾角，27-33cm/秒)。在术后第21天，将PBS、牙髓源性干细胞(PdSC；#221)、含有包封有抑制素的纳米颗粒的脂肪源性干细胞(StAdSC；#221)或含有包封有抑制素的纳米颗粒的牙髓源性干细胞(StPdSC)用29G注射针顶部给药到小鼠右膝关节。PBS的剂量为10μl。牙髓源性干细胞的用量为1×104个细胞/小鼠，10μl的PBS作为溶剂。使用包封有辛伐他汀的PLGA纳米颗粒作为包封有抑制剂的纳米颗粒，将20μg/mL的这类纳米颗粒与脂肪源性干细胞或牙髓源性干细胞(1×104个细胞)共同培养30分钟至1小时，以获得含有包封有抑制素的纳米颗粒的干细胞。
此外，在给药当天和给药当天两周后的第二天，实施著名的Von Frey测试作为疼痛测试。通过向老鼠后肢足底施加可以提供确定的力的多条纤维丝，测试测量了逃避反射的阈值。结果如图13所示。图13(a)显示给药两周后测量的引起逃避反射的阈值的分数(数值表示弯曲纤维丝所需的重量(g))，图13(b)显示了给药两周后的分数与给药当天的分数的比率。如图13所示，与PBS组相比，PdSC组和StAdSC组的疼痛有所改善，StPdSC组获得进一步改善的结果。
除Von Frey测试外，在上述给药后进行Von Frey试验后的两周内，对小鼠进行安乐死和解剖，并收集右膝关节软骨组织以进行组织学分析。具体地，收集各组右膝关节软骨组织，用4％多聚甲醛溶液固定后制备薄切样品，进行番红O染色。番红O是一种染色试剂，用于染色软骨基质。图14显示每组关节软骨组织部分的染色照片。
如图14所示，在施加PBS的OA诱导的小鼠的组(PBS组)中，胫骨骨头的软骨层极薄，软骨层未见番红O染色(图中为深灰色)。另一方面，在施加牙髓源性干细胞的OA诱导的小鼠的组(PdSC组)中，胫骨骨头的软骨层与PBS组相比为厚，并轻微观察到番红O染色。在施加含有包封抑制素的纳米颗粒的脂肪源性干细胞的OA诱导的小鼠的组(Statin-AdSC组)和施加含有包封有抑制素的纳米颗粒的牙髓源性干细胞的OA诱导的小鼠的组(Statin-PdSC组)中，两组胫骨骨头的软骨层比PdSC组的更厚，也观察到大面积的番红O染色。
进一步，对于每一组，关节损伤的程度由组织病理学发现评分。评分标准以《骨关节炎和软骨》第18卷(2010年)S17-S23和《骨关节炎和软骨》第13卷(2005年)第632-642页文献为基础，评价如下。
表1
Figure GDA0003035031790000211
表2
分数 软骨损伤
0 正常
1 软骨表面软骨损伤
2 上潮线软骨损伤
3 钙化软骨层软骨损伤
4 软骨下骨暴露
基于表1所示的等级的评估结果如图15(a)所示，基于表2所示的等级的评估结果如图15(b)所示。如图15(a)与15(b)所示，与PBS组相比，PdSC组的软骨损伤有所改善，观察到StAdSC组和StPdSC组的软骨损伤进一步改善。
因此，很明显，含有包封有抑制素的纳米颗粒的干细胞可以改善骨关节炎的症状。
接下来，用精神分裂症模型小鼠研究了根据本发明的含有包封有抑制素的纳米颗粒的牙髓源性干细胞对精神分裂症的治疗效果。方法和结果描述如下。
使用已敲除Schnurri-2(Shn-2)基因的C57B6/J小鼠(RIKEN BRC)为精神分裂症模型小鼠。已知Shn-2基因敲除(KO)小鼠的大脑与精神分裂症患者大脑中报告的特征具有极高的相似性(K Takao等人，神经心理生理学(2013年)，38卷，1409-1425页)。实际上，与正常小鼠相比，观察Shn-2KO小鼠的筑巢动作，以检查是否识别出异常动作。给普通小鼠(WT)和Shn-2KO小鼠一块毛毡，观察小鼠是否在毛毡上啃食以将毛毡铺入巢中。结果如图16所示。
如图16所示，正常的小鼠啃食所有的毛毡来铺放它们，但Shn-2KO小鼠几乎没有啃食毛毡。因此，Shn-2被敲除的小鼠可以用作精神分裂症模型。
因此，用Shn-2KO小鼠研究了根据本发明的含有包封有抑制素的纳米颗粒的牙髓源性干细胞对精神分裂症的治疗效果。首先，将PBS、牙髓源性干细胞(PdSC)、含有包封有抑制素的纳米颗粒的脂肪源性干细胞(StAdSC)或含有包封有抑制素的纳米颗粒的牙髓源性干细胞(StPdSC)静脉施加给Shn-2KO小鼠。小鼠脂肪源性干细胞的剂量为1×104个细胞/小鼠。包封有辛伐他汀的PLGA纳米颗粒(50μg)作为包封有抑制素的纳米颗粒，将这些纳米颗粒与脂肪源性干细胞或牙髓源性干细胞共同培养30分钟至1小时，获得含有包封有抑制素的纳米颗粒的干细胞。一只毛毡被放置在笼子里，笼子里的每只老鼠都给过药，一周和两周后观察毛毡的情况。此外，如下面表3所示，基于毛毡的情况实施评分。图17至20显示观察结果和分数。
表3
分数 毛毡情况
1 没有可查觉的触碰(90％或以上未受损)
2 部分避免(40～50％)
3 部分咬碎
4 存在扁平的巢
5 存在完整的巢
如图17至20所示，在PBS组中，即使在给药后，筑巢行为也几乎未见到，精神分裂症的症状明显见到。在PdSC组中，也有一个个体在给药两周后采取了筑巢动作，但有些个体没有表现出任何筑巢行为。另一方面，在施加含有包封抑制素的纳米颗粒的脂肪源性干细胞组(StAdSC组)或施加含有包封有抑制素的纳米颗粒的牙髓源性干细胞组(StPdSC)中，在给药一周后见到筑巢动作，观察到症状明显恢复。从这些结果中，给出提示，含有包封有抑制素的纳米颗粒的干细胞可以改善精神分裂症的症状。
从上述结果中，根据本发明的包封有抑制素的纳米颗粒可以增强牙髓源性干细胞的功能，而功能增强的干细胞对缺血性心脏病、炎症性疾病等具有治疗作用，因为它们对治疗这些疾病是有用的。

Claims (11)

1.一种用于牙髓源性干细胞功能增强的包封有抑制素的纳米颗粒制剂，所述包封有抑制素的纳米颗粒制剂包括包封有抑制素的纳米颗粒，其中所述抑制素被包封在含有生物吸收性聚合物的纳米颗粒中。
2.根据权利要求1所述的包封有抑制素的纳米颗粒制剂，
其中所述生物吸收性聚合物是聚乳酸聚合物(PLA)或聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)。
3.根据权利要求1或2所述的包封有抑制素的纳米颗粒制剂，
其中所述牙髓源性干细胞功能增强是迁移能力和产生血管生成因子能力中的至少一种。
4.根据权利要求1或2所述的包封有抑制素的纳米颗粒制剂，
其中所述牙髓源性干细胞功能增强是HGF表达的增加。
5.一种包封有抑制素的纳米颗粒制剂，所述包封有抑制素的纳米颗粒制剂包括包封有抑制素的纳米颗粒，其中所述抑制素被包封在含有生物吸收性聚合物的纳米颗粒中，其中所述包封有抑制素的纳米颗粒制剂用于增强细胞制剂的治疗效果，所述细胞制剂包括用于治疗缺血性疾病、炎症性疾病或神经退行性疾病的牙髓源性干细胞。
6.一种包封有抑制素的纳米颗粒制剂，所述包封有抑制素的纳米颗粒制剂包括包封有抑制素的纳米颗粒，其中所述抑制素被包封在含有生物吸收性聚合物的纳米颗粒中，其中所述包封有抑制素的纳米颗粒制剂用于增强细胞制剂的疗效，所述细胞制剂包括用于治疗炎症性疾病或神经退行性疾病的牙髓源性干细胞或脂肪源性干细胞。
7.一种牙髓源性干细胞，其包括根据权利要求1至3中任一项所述的包封有抑制素的纳米颗粒制剂。
8.一种用于治疗缺血性疾病的细胞制剂，所述细胞制剂包括根据权利要求7所述的牙髓源性干细胞。
9.一种用于治疗炎症性疾病的细胞制剂，所述细胞制剂包括根据权利要求7所述的牙髓源性干细胞。
10.一种用于治疗神经退行性疾病的细胞制剂，所述细胞制剂包括根据权利要求7所述的牙髓源性干细胞。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的细胞制剂用于静脉内给药、动脉给药或局部给药。
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