WO2017191808A1 - 炎症性疾患治療用幹細胞の機能増強用スタチン封入ナノ粒子製剤、及びそれを含有する炎症性疾患治療用機能増強幹細胞 - Google Patents

炎症性疾患治療用幹細胞の機能増強用スタチン封入ナノ粒子製剤、及びそれを含有する炎症性疾患治療用機能増強幹細胞 Download PDF

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正明 伊井
田畑　泰彦
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    • C08L2203/02—Applications for biomedical use

Definitions

  • the present invention relates to nanoparticles that encapsulate statins, and more particularly to statin-encapsulated nanoparticles (particles used in a preparation, a preparation containing such particles, etc.) for enhancing the function of cells for the treatment of inflammatory diseases.
  • the present invention also relates to stem cells for the treatment of inflammatory diseases containing statin encapsulated nanoparticles.
  • Statins are known as compounds that inhibit HMG-CoA reductase, which is a rate-limiting enzyme for cholesterol biosynthesis in the liver. Because statins can lower cholesterol levels in blood, they are used as therapeutic agents for hypercholesterolemia. In addition to hypercholesterolemia, statins have been shown in clinical trials to be effective for ischemic heart diseases such as angina and myocardial infarction and diseases such as arteriosclerosis by their anti-inflammatory action. .
  • Patent Document 1 discloses that statins are administered for the purpose of promoting angiogenesis. It is disclosed that by encapsulating a statin in nanoparticles and locally administering the statin-encapsulated nanoparticle to a patient, it is possible to promote angiogenesis with a smaller amount of statin than ever before.
  • Non-Patent Document 1 discloses that simvastatin, which is a type of statin, exhibits anti-inflammatory activity in a mouse inflammatory bowel disease model.
  • Non-Patent Document 2 describes the anti-inflammatory effect of atorvastatin on Crohn's disease patients.
  • Stem cells generally include embryonic stem cells (ES cells), mesenchymal somatic stem cells such as bone marrow-derived stem cells and fat-derived stem cells, as well as artificial pluripotent stem cells (iPS cells) and the like. It is used for research. Above all, research on fat-derived stem cells easy to handle is rapidly developing, and clinical trials of regenerative medicine for various diseases are widely performed. In addition, it is also reported that fat-derived stem cells show an enteritis inhibitory effect not only in regenerative medicine but also in drug-induced enteritis mouse models (see, for example, non-patent document 3).
  • patent document 1 It is contemplated to encapsulate the statin in nanoparticles as disclosed in and administer the statin encapsulated nanoparticles to a patient.
  • statin-encapsulated nanoparticles are locally administered to a patient, and although this makes it possible to confirm the efficacy with a smaller amount of statin than before, the administered statin nanoparticles phagocytose macrophages. As a result, it is likely to be unevenly distributed to the lesion, and it may be difficult to obtain a stable therapeutic effect.
  • Non-Patent Document 3 even in the case of treating an inflammatory disease using only stem cells, local administration of stem cells to the affected area is necessary, and a large amount of cells are required. In addition to cost and time, the frequency of occurrence of side effects during cell administration may also increase. Furthermore, when autologous cell transplantation is assumed, there are few adipose tissues and few stem cells that can be separated, or in cases where stem cell function is reduced due to factors of metabolic disease such as old age and diabetes, excellent therapeutic effect can be achieved by a small number of stem cells. It is considered necessary to improve various functions of the stem cells in order to obtain them.
  • An object of the present invention is to improve the therapeutic effect of stem cells used as a cell preparation or the like on inflammatory diseases, and to improve the function of stem cells while suppressing side effects.
  • statin-encapsulated nanoparticles in which statins are encapsulated in nanoparticles into stem cells, the function of the stem cells is enhanced, and statins
  • the present invention has been accomplished by finding that it can be efficiently delivered to a desired affected area and exhibits high effects in the treatment of inflammatory diseases. That is, the statin-encapsulated nanoparticle according to the present invention is a statin-encapsulated nanoparticle in which a statin is encapsulated in a nanoparticle comprising a bioabsorbable polymer, which is a particle for enhancing the function of a stem cell, wherein the stem cell is And stem cells for the treatment of inflammatory diseases.
  • the statin-encapsulated nanoparticles according to the present invention can enhance the function of the treated stem cells by being processed into stem cells (specifically, by the nanoparticles being taken up into stem cells), the stem cells It shows various efficacy by in vivo administration of Specifically, when stem cells are treated with the statin-encapsulated nanoparticles according to the present invention, the treated stem cells incorporate the statin-encapsulated nanoparticles by phagocytosis, and the stem cells incorporating the statin-encapsulated nanoparticles have migration ability and proliferation ability In addition to the potentiation of immune function, the immunosuppressive ability is enhanced.
  • the enhanced immunosuppressive action of the stem cells and the statin released from the stem cells Show an excellent therapeutic effect on inflammatory diseases.
  • a polylactic acid (PLA) or a polylactic acid-co-glycolic acid (PLA) is used as a bioabsorbable polymer. be able to.
  • PLA and PLGA can be hydrolyzed in the body to release encapsulated statin, and PLA is decomposed into lactic acid by its hydrolysis, and PLGA is decomposed into lactic acid and glycol by its hydrolysis, It is extremely preferable to use PLA or PLGA as a nanoparticulate material, as it will ultimately be water and carbon dioxide and harmless to animals such as humans.
  • the statin-encapsulated nanoparticle according to the present invention is preferably for enhancing mesenchymal stem cells, particularly fat-derived stem cells, as the above-mentioned stem cells.
  • adipose-derived stem cells For adipose-derived stem cells, adipose tissue is collected, and the collected tissue is treated with collagenase, and then only mononuclear cells are collected by centrifugal density method, and the collected mononuclear cells are cultured in a culture plate for about 4 days, and then adhered.
  • the selected cells can be selected and separated as adipose-derived stem cells.
  • Adipose-derived stem cells belong to mesenchymal stem cells and have pluripotency, and as described above, they can be conveniently collected in large quantities, and thus they are used for regenerative medicine in various diseases. It is advantageous to Furthermore, adipose-derived stem cells produce and release anti-inflammatory cytokines and suppress the activity of inflammatory cells, which is advantageous for the treatment of inflammatory diseases.
  • the function-enhanced stem cell according to the present invention contains statin-encapsulated nanoparticles in which the statin is encapsulated in biocompatible nanoparticles, and is characterized in that it is for the treatment of inflammatory diseases.
  • Such a function-enhanced stem cell according to the present invention contains the above-described statin-encapsulated nanoparticle, and as described above, the statin-encapsulated nanoparticle enhances cell function such as immunosuppressive ability, thereby treating inflammatory disease. Can exert excellent effects.
  • the function enhancing cell according to the present invention can release statin slowly, and the anti-inflammatory action of the released statin is advantageous for the treatment of inflammatory diseases.
  • the function enhancing stem cell according to the present invention is preferably the above-mentioned fat-derived stem cell.
  • the function-enhanced stem cells according to the present invention can be formulated as a cell preparation by mixing with pharmaceutically acceptable solvents and excipients.
  • the administration of stem cells according to the present invention into a living body preferably does not require surgery such as laparotomy, and is preferably formulated as a cell preparation for intravenous administration or intraarterial administration. In this way, the stem cells according to the present invention can be conveniently administered to the patient. Since the function-enhancing stem cell preparation according to the present invention has an enhanced stem cell function, high effects can be obtained with a small dose even if administered intravenously or intraarterially.
  • the agent for enhancing the function of stem cells according to the present invention can accumulate stem cells in an inflamed part such as the intestine which is difficult to reach especially by intravenous administration by intra-arterial administration. Therefore, by using intra-arterial administration, it may be possible to uniformly distribute the cells to the lesion in a small volume and obtain a stable high effect.
  • the function enhancing stem cell preparation according to the present invention may be locally administered as long as it can obtain a certain desired effect.
  • statin-encapsulated nanoparticles according to the present invention and the function-enhanced stem cells containing the same can enhance the function of stem cells, and by administering the stem cells in vivo, excellent effects in the treatment of inflammatory diseases Indicates
  • Rhodamine red fluorescent dye-containing PLA nanoparticles are added to the culture medium of human adipose-derived stem cells to a final concentration of 20 ⁇ g / mL, 50 ⁇ g / mL, 80 ⁇ g / mL or 100 ⁇ g / mL, one hour later or 2 It is a photograph which shows the result of having observed a stem cell with a confocal laser fluorescence microscope after time.
  • Rhodamine red fluorescent dye-loaded PLGA nanoparticles are added in culture medium of mouse adipose-derived stem cells to a final concentration of 20 ⁇ g / mL, 50 ⁇ g / mL, 75 ⁇ g / mL or 100 ⁇ g / mL, and 30 minutes later in stem cells It is a photograph which shows the result of having measured the uptake
  • PBS phosphate buffer
  • statin non-encapsulation nanoparticle containing fat-derived stem cell or a statin inclusion nanoparticle containing fat-derived stem cell.
  • (A) is a graph showing the length of the large intestine of DSS enteritis model mice treated with PBS, non-encapsulated nanoparticle-containing adipose-derived stem cells, or statin-encapsulated nanoparticle-containing adipose cells, and (b) PBS, statin It is a graph which shows DAI score of DSS enteritis model mouse which administered the non-encapsulation nanoparticle containing fat origin stem cell or the statin inclusion nanoparticle containing fat origin stem cell. It is a table for explanation of DAI score.
  • A is a photograph showing the histological analysis result of the large intestine of DSS enteritis model mouse treated with PBS, fat-derived stem cells not containing statin nanoparticles, or fat-derived stem cells containing nanoparticle containing statins
  • (b) is a photograph It is the graph which scored it.
  • SFI sciatic nerve function index
  • the statin-encapsulated nanoparticle according to the present invention is a statin-encapsulated nanoparticle in which a statin is encapsulated (encapsulated) in a nanoparticle containing a polylactic acid glycolate copolymer, and in order to enhance the function of stem cells Used.
  • the statin-encapsulated nanoparticle preparation containing statin-encapsulated nanoparticles according to the present invention is generally used for the formulation of stabilizers, preservatives, buffers, pH adjusters, excipients, etc. in addition to the statin-encapsulated nanoparticles described above It may contain an additive.
  • statins include all compounds that are HMG-CoA (3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A) reductase inhibitors, and examples thereof include simvastatin, rosuvastatin, pitavastatin, atorvastatin, cerivastatin , Fluvastatin, pravastatin, lovastatin and mevastatin etc.
  • HMG-CoA 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors
  • examples thereof include simvastatin, rosuvastatin, pitavastatin, atorvastatin, cerivastatin , Fluvastatin, pravastatin, lovastatin and mevastatin etc.
  • statins are known to have a cholesterol-lowering effect, but it has also been shown in large-scale clinical trials to reduce the risk of developing or progressing cardiovascular events.
  • many reports have been made on the angiogenesis promoting action through vascular endothelial cells and vascular endothelial
  • the material of the nanoparticles is not limited as long as it is a bioabsorbable polymer capable of encapsulating statins, but polylactic acid (PLA) or polylactic acid glycolic acid copolymer (poly It is preferred to use nanoparticles comprising (lactic-co-glycolic acid): PLGA).
  • PLA is hydrolyzed in the body to be decomposed into lactic acid
  • PLGA is hydrolyzed in the body to be decomposed into lactic acid and glycol to finally become water and carbon dioxide respectively, which is harmless to the body and preferred.
  • statin-encapsulated nanoparticles are processed (manufactured) as described below for the upper limit and the lower limit of the number average particle diameter, as measured by the light scattering method, from the viewpoint of the uptake efficiency into stem cells.
  • the upper limit of the number average particle diameter is less than 1000 nm, preferably about 600 nm or less (more preferably 600 nm or less), more preferably about 400 nm or less (more preferably 400 nm or less).
  • the lower limit of the number average particle diameter is about 100 nm or more (more preferably 100 nm or more), preferably about 200 nm or more (more preferably 200 nm or more).
  • the number average particle size of the statin encapsulated nanoparticles is less than 1000 nm, preferably about 100 nm to about 600 nm (more preferably 100 nm to 600 nm), more preferably about 200 nm to about 400 nm (as measured by light scattering). More preferably, it is 200 nm to 400 nm).
  • the statine-encapsulated nanoparticles can be produced by any method that can be processed to satisfy the above-mentioned number average particle diameter, but preferably spherical crystallization is used. Manufactured.
  • Spherical crystallization is well known as a method capable of designing spherical crystal particles and directly controlling their physical properties for control by controlling the crystal formation / growth process in the final process of compound synthesis.
  • One of the spherical crystallization methods is the well-known emulsion solvent diffusion method (ESD method).
  • the emulsion solvent diffusion method is performed using two organic solvents of a good solvent capable of dissolving the bioabsorbable polymer such as the above-mentioned PLA or PLGA for encapsulating a statin and a poor solvent not dissolving the polymer.
  • a good solvent capable of dissolving the bioabsorbable polymer such as the above-mentioned PLA or PLGA for encapsulating a statin and a poor solvent not dissolving the polymer.
  • the solvent self-emulsifies to form submicron sized emulsion droplets. Thereafter, the mutual diffusion of the good solvent and the poor solvent proceeds further, and the solubility of the polymer such as PLA or PLGA and the statin in the emulsion drops decreases, resulting in the formation of polymer nanoparticles of spherical crystal particles including statin.
  • stem cells are totipotent, pluripotent or multipotent cells, and for example, somatic stem cells such as embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells) and mesenchymal stem cells Stem cells are included.
  • somatic stem cells such as embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells) and mesenchymal stem cells Stem cells.
  • mesenchymal stem cells obtained from bone marrow tissue, adipose tissue and the like from the viewpoint of obtaining a large number of stem cells more simply and in a large amount.
  • Adipose-derived stem cells have already been clinically used to be administered alone, and are known to differentiate into fat, bone, liver, heart and the like.
  • Adipose-derived stem cells can be obtained from adipose tissue, which can be easily obtained from subcutaneous fat and the like by minimally invasive techniques such as liposuction. Adipose-derived stem cells can be abundantly collected by being extracted and separated from the adipose tissue obtained as described above using a Celution system (manufactured by Cytoli) or the like. For this reason, it is extremely advantageous to use as a stem cell according to the present invention.
  • statin-encapsulated nanoparticles according to the present invention on stem cells is performed, for example, by adding them to a culture medium in which the stem cells are cultured.
  • the stem cells incorporate the statin-encapsulated nanoparticles into cells by phagocytosis, the statin-encapsulated nanoparticles can be easily contained in the stem cells without using a special reagent or the like.
  • the stem cells treated with the statin-encapsulated nanoparticles according to the present invention have particularly enhanced migration ability, proliferation ability and immunosuppressive ability, and in particular, the therapeutic effect on inflammatory diseases is enhanced.
  • Such enhanced stem cells according to the present invention show excellent effects at a small dose even by intravenous administration or intraarterial administration.
  • the fat-derived stem cells treated with the statin-encapsulated nanoparticles according to the present invention are administered intra-arterially, the fat-derived stem cells reach an organ exhibiting inflammation by blood flow such as intestine and accumulate and proliferate in the inflamed part Produces anti-inflammatory cytokines and also suppresses the activity of inflammatory cells. As a result, they exhibit excellent therapeutic effects on inflammatory diseases.
  • the inflammatory disease is a disease having an inflammation as one of the etiologies, and the characteristic symptoms of those diseases such as enteritis and pneumonia are not limited to those having inflammation, and those such as pulmonary hypertension and dementia. Also included are those in which inflammation is involved in the onset process of the disease.
  • the inflammatory diseases in the present invention include systemic lupus erythematosus, scleroderma, atopic dermatitis, chronic rheumatoid arthritis, interstitial pneumonia, bronchial asthma, pulmonary hypertension, ulcerative colitis and Crohn's disease etc.
  • IBD Inflammatory bowel disease
  • nerve injury spinal cord injury
  • stroke stroke or sequelae after cerebral hemorrhage
  • amyotrophic lateral sclerosis chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy
  • schizophrenia dementia
  • organ Rejection at the time of transplantation chronic nephritis (renal sclerosis) and the like can be mentioned.
  • fat-derived stem cells release the statin encapsulated therein by hydrolyzing the incorporated statin-encapsulated nanoparticle in the cells, so that when fat-derived stem cells are administered into the body, they are released after administration.
  • the statin can be released slowly and the released statin can provide additional anti-inflammatory effects.
  • statin-incorporated nanoparticle for enhancing stem cell function according to the present invention, the enhanced function stem cell containing the same and the like will be described.
  • statin encapsulated nanoparticles First, the method for producing statin encapsulated nanoparticles will be described.
  • simvastatin was used as a statin, and nanoparticles containing a polylactic acid polymer (PLA) or a polylactic acid / glycolic acid copolymer (PLGA) as nanoparticles were used.
  • PLA polylactic acid polymer
  • PLGA polylactic acid / glycolic acid copolymer
  • PLA weight average molecular weight 20000
  • simvastatin 50 mg were dissolved in a mixture of 2 mL of acetone and 0.5 mL of ethanol to obtain a polymer solution.
  • the resultant was dropped into 10 mL of a 2 wt% PVA solution stirred at 500 rpm at room temperature to obtain a simvastatin-encapsulated PLA nanoparticle suspension.
  • the organic solvent acetone, ethanol
  • the suspension was centrifuged at 60000 g for 30 minutes at 4 ° C., and the precipitate was collected and resuspended in distilled water.
  • statin encapsulated nanoparticles were used in the following tests as statin encapsulated nanoparticles.
  • adipose-derived stem cells (Adipose derived Stem Cell: AdSC) are obtained from human adipose tissue using a known method using collagenase treatment and centrifugal specific gravity method, and also, adipose-derived stem cells from mouse adipose tissue I got the cells. The details of the method will be described below.
  • the cells are suspended in 2 ml of 1 mM EDTA / PBS, collected in a single tube, 8 ml of hemolytic solution is added, mixed, and stored for 10 minutes in a cold (OnIce) (hemolytic operation). After adding 1 mM EDTA / PBS to around 45 mL, centrifuge at 1200 rpm (300 g) ⁇ 5 min and discard the supernatant.
  • the cell pellet is suspended in PBS ( ⁇ ) or 10% DMEM F12 and cultured for 3 to 4 days with 10% DMEM F12 in a 5% CO 2 incubator, and adherent cells are used for experiments as fat-derived stem cells (AdSC) (P0).
  • AdSC fat-derived stem cells
  • subculturing is further performed at a ratio of 1: 3 to 4 (density of 3000 to 4000 / cm 2 ) for 3 to 4 days.
  • the method for obtaining adipose-derived stem cells from mouse adipose tissue is as follows.
  • a collagenase type VIII (2 mg / mL, Sigma # C2139) / 1% BSA HBSS solution is thawed at 37 ° C. in a shaker thermostat.
  • 1 mM EDTA / PBS is prepared by diluting EDTA (0.5 M EDTA, pH 8.0, Life Technologies, AM9260 G), 10 ⁇ DPBS, Ca ( ⁇ ), Mg ( ⁇ ) (GIBCO, 14200-166).
  • mice are decapitated from the epigastrium using a syringe with a 26 to 29 G needle (such as an insulin syringe).
  • the subcutaneous fat (inguinal region-back) is collected and placed in a 3.5 cm culture dish (one drop of physiological saline in the center to make it easy to remove the adipose tissue).
  • the adipose tissue is put on the lid and cut into small pieces (about 20 to 30 times) with scissors, the adipose tissue is placed in a 15 mL tube with a collagenase solution of the same volume as the fat. Close the cap and invert the tube and incubate in a shaker oven at 37 ° C for 30 minutes.
  • the enzyme reaction is stopped by adding an equal volume of 10% FBS / DMEM F12 medium.
  • the supernatant is passed through a cell strainer (40 ⁇ m, BD, 352340) and collected in a new 50 mL tube. Centrifuge at 1200 rpm (250 g) x 5 min (with brake) and discard the supernatant.
  • the cell pellet is suspended in 10% FBS / DMEM F12 medium and then seeded on culture dishes (P0).
  • the cells are cultured in a 5% CO 2 incubator for 3 to 4 days, and adherent cells are passaged (P1) 1: 1 as AdSC.
  • the cells are cultured for 4 to 5 days in a 5% CO 2 incubator, and adherent cells are passaged 1: 3 as an AdSC (P2). Used for experiments when the cell density has increased to about 80 to 90%.
  • Rhodamine red fluorescent dye-encapsulated PLA nano obtained by encapsulating Rhodamine red fluorescent dye in place of statin in PLA nanoparticles using the above-described emulsion solvent diffusion method
  • the particles were added to the culture medium for the above-mentioned adipose-derived stem cells such that the final concentration was 20 ⁇ g / mL, 50 ⁇ g / mL, 80 ⁇ g / mL or 100 ⁇ g / mL.
  • One hour later (1 h) or 2 hours (2 h) the uptake of the rhodamine red fluorochrome-encapsulated PLA nanoparticles was observed using a confocal laser fluorescence microscope. Staining of nuclei was performed in a usual manner using DAPI. The results are shown in FIG.
  • rhodamine red fluorescent dye-containing nanoparticles were also incorporated into mouse adipose-derived stem cells in the same manner as described above, and the uptake was measured by flow cytometry (FACS) analysis.
  • FACS flow cytometry
  • PLGA nanoparticles are used as nanoparticles, and the final concentration of rhodamine red fluorescent dye-encapsulated PLGA nanoparticles is 20 ⁇ g / mL, 50 ⁇ g / mL, 75 ⁇ g / mL and 100 ⁇ g / mL.
  • measurement and analysis were performed using a FACS device (BD FACSAria, BD Biosceinces) and analysis software attached to the device. The results are shown in FIG.
  • the rhodamine red fluorochrome-encapsulated PLA nanoparticles were taken up by human fat-derived stem cells at any concentration. However, depending on the treatment concentration, the uptake amount of rhodamine red fluorescent dye-encapsulated PLA nanoparticles of human adipose-derived stem cells is increased. In addition, it can also be seen that the uptake amount of simvastatin-encapsulated PLA nanoparticles by human fat-derived stem cells is greater when the treatment time is 2 hours than in the case where the treatment time is 1 hour.
  • rhodamine red fluorescent dye-loaded PLGA nanoparticles are taken into mouse fat-derived stem cells at any concentration, and in particular, depending on the treatment concentration, mouse fat The uptake amount of rhodamine red fluorescent dye-loaded PLGA nanoparticles was increased in the stem cells derived therefrom.
  • PLGA nanoparticles having a particle size of 200 nm to 400 nm and PLGA nanoparticles having a particle size of 400 nm to 600 nm are prepared, and in the same manner as in the above test, Rhodamine red fluorescent dye was encapsulated in the PLGA nanoparticles.
  • Rhodamine red fluorescent dye-encapsulated PLGA nanoparticles of each particle size range were prepared.
  • the prepared PLGA nanoparticles were added to a culture medium (10% FBS / DMEM F12) of human adipose-derived stem cells to a final concentration of 100 ⁇ g / mL.
  • the rhodamine red fluorescent dye-loaded PLGA nanoparticles were taken up by human fat-derived stem cells regardless of the particle size. From these results, it was suggested that if the particle size of the nanoparticles is in the range of 200 nm to 600 nm, it can be well incorporated into adipose-derived stem cells. In each of the following tests, nanoparticles having a number average particle size of about 300 nm were used.
  • the amount of statin released into the culture medium was measured in order to examine how long it took to release statins from the cells in the fat-derived stem cells that have taken up the simvastatin-loaded nanoparticles thereafter .
  • the medium is changed, and 6 hours, 18 hours, 24 hours after medium replacement
  • the amount of simvastatin released into the medium was measured. Specifically, this measurement was performed using HPLC (High-pressure Liquid Chromatography) method. The measurement results are shown in FIG.
  • statins As shown in FIG. 4, about 60% of statins are released from human adipose-derived stem cells 24 hours after the start of measurement, and it takes about 336 hours for all statins to be released. From this result, it can be understood that the statin incorporated into human adipose-derived stem cells is not slowly released from human adipose-derived stem cells but is slowly released slowly. Therefore, since the statin can be released over a long time, a good therapeutic effect can be expected.
  • human adipose-derived stem cells were examined using a migration test kit (Transwell (registered trademark)). Specifically, human adipose-derived stem cells are seeded at 5 ⁇ 10 4 cells / well on the porous membrane of each well of the Transwell plate, and 20 ⁇ g / mL of PLA nanoparticles not containing statin, or simvastatin in the medium, or simvastatin Encapsulated PLA nanoparticles were added to concentrations of 20 ⁇ g / mL, 50 ⁇ g / mL and 100 ⁇ g / mL, and after 16-18 hours, the number of cells that had passed through the Transwell membrane was counted. The results are shown in FIG.
  • Transwell registered trademark
  • statin non-encapsulated PLA nanoparticles PLA 20
  • simvastatin encapsulated PLA nanoparticles PLA-ST 20
  • simvastatin-encapsulated PLA nanoparticles can enhance the migration ability of human fat-derived stem cells.
  • human adipose-derived stem cells are seeded at a density of 5000 cells / well in a 96-well microplate, and simvastatin-encapsulated PLA nanoparticles are added to a concentration of 20 ⁇ g / mL, 50 ⁇ g / mL or 100 ⁇ g / mL, and after 48 hours The medium was changed, MTT solution was added to each well, and after 2 hours, the absorbance at 450 nm was measured using a spectrophotometer. The results are shown in FIG.
  • adipose-derived stem cells become advantageous for the treatment of inflammatory diseases.
  • the preferred administration cell number and administration route of the stem cells according to the present invention were examined using an enteritis mouse model using dextran sulfate sodium (DSS). The method and results are described below.
  • mice instead of water, 6 to 8 weeks old C57BJ / 6J mice continue to be given water containing 2.5% DSS for 5 days to develop enteritis, and on day 5 mouse fat-derived stem cells Administered intravenously, intraperitoneally or transarterially.
  • mouse fat-derived stem cells those into which the rhodamine red fluorescent dye-loaded PLGA nanoparticles were previously incorporated by the same method as described above were used.
  • transarterial administration was carried out by ligating the distal portion of the left common carotid artery of a mouse with 6-0 silk thread, and immediately under an approximately 2 mm incision with scissors and inserting a 30 G catheter.
  • the number of cells administered was 2 ⁇ 10 4 , 1 ⁇ 10 5 and 3 ⁇ 10 5 cells. Then, it returned to normal water from the 5th day to the 8th day, and was taken as free drinking water. On the eighth day, the mice were euthanized and then dissected, and the large intestines were removed for histological analysis. Specifically, the uptake of the rhodamine red fluorescent dye-loaded PLGA nanoparticles was observed using a confocal laser fluorescence microscope. Staining of nuclei was performed in a usual manner using DAPI. The results are shown in FIG. 7 and FIG.
  • mice were continuously given water containing 2.5% DSS for 5 days instead of water to cause enteritis.
  • the dose of mouse adipose-derived stem cells was 2 ⁇ 10 5 cells / mouse.
  • statin non-encapsulated nanoparticles use PLGA
  • statin-encapsulated nanoparticles use the above-mentioned simvastatin-encapsulated PLGA nanoparticles, and 50 ⁇ g / mL of these nanoparticles and mouse fat-derived stem cells are co-cultured for 30 minutes to 1 hour
  • Mouse adipose-derived stem cells containing encapsulated nanoparticles or statin encapsulated nanoparticles were obtained.
  • mice were euthanized and then dissected, and the large intestines were removed for histological analysis. Specifically, measurement of the length of the large intestine, measurement of the Disease Activity Index (DAI) score, and measurement of gene expression involved in immune regulation such as inflammatory cytokines were performed.
  • DAI Disease Activity Index
  • FIG. 9 shows the weight measurement results of each group.
  • the graph in FIG. 9 shows the weight change ratio when the weight on day 0 is 100%.
  • DSS caused inflammation in the intestine and the weight decreased similarly on the fifth day.
  • a group administered with mouse adipose-derived stem cells containing non-encapsulated statin nanoparticles (AdSC group) and a mouse adipose-derived stem cell containing statin-encapsulated nanoparticles compared with the control group administered PBS
  • the rate of weight loss in the group (Sim-AdSC group) decreased, particularly in the Sim-AdSC group.
  • FIG. 10 (a) shows the measurement result of the length of the large intestine
  • FIG. 10 (b) shows the measurement result of the DAI score.
  • the length of the large intestine is longer in the order of the Sim-AdSC group, the AdSC group, and the Control group. It is known that inflammation in the large intestine usually shortens its length, so it can be seen that inflammation is suppressed in the order of the Sim-AdSC group, the AdSC group, and the Control group.
  • the score of the DAI score is also smaller in the order of the Sim-AdSC group, the AdSC group, and the Control group.
  • the DAI score is obtained by scoring the severity of each mouse according to the criteria shown in FIG. 11, and indicates that the larger the score, the more severe. Therefore, it can be seen that inflammation is suppressed in the order of the Sim-AdSC group, the AdSC group, and the Control group.
  • intestinal tissue in each group was collected, fixed in 4% paraformaldehyde solution, then sliced and prepared, and subjected to HE staining.
  • the degree of tissue injury was scored (biopsy tissue classification of Matts) according to the degree of infiltration of inflammatory cells and compared and examined.
  • the Matts biopsy tissue classification is scored according to the following criteria: 1 normal tissue 2 small amount of inflammatory cell infiltration in mucous membrane / submucosal layer 3 large amount of inflammatory cell infiltrating in mucous membrane / mucous layer 4 presence of crypt abscess and many inflammatory cell infiltrates all over mucous membrane 5 with inflammatory cell infiltration , Ulcers and necrosis of mucous membrane tissue.
  • FIG. 13 (a) is a stained photograph of a large intestine section in each group, and FIG. 13 (b) is a score.
  • FIGS. 13A and 13B it can be seen that inflammation is suppressed in the order of the Sim-AdSC group, the AdSC group, and the Control group.
  • interstitial pneumonia model mouse model a well-known model in which bleomycin is administered to a C57B6 / J mouse by a subcutaneous implantation type osmotic continuous infusion pump to cause interstitial pneumonia is used. Specifically, interstitial pneumonia was caused by first daily subcutaneous administration of bleomycin in an amount of 100 ⁇ g / day for 2 weeks to 6 to 8 week-old C57B6 / J mice. In addition, one week after the start of bleomycin administration, PBS, mouse fat-derived stem cells containing nanoparticles without inclusion of statins, or mouse fat-derived stem cells containing inclusion of statin-containing nanoparticles were intravenously administered.
  • the dose of mouse adipose-derived stem cells was 2.5 ⁇ 10 4 cells / mouse.
  • the statin non-encapsulated nanoparticles use PLGA, and the statin-encapsulated nanoparticles use the above-mentioned simvastatin-encapsulated PLGA nanoparticles, and 100 ⁇ g / mL of these nanoparticles and mouse fat-derived stem cells are co-cultured for 30 minutes to 1 hour
  • Mouse adipose-derived stem cells containing encapsulated nanoparticles or statin encapsulated nanoparticles were obtained.
  • FIG. 14 shows stained photographs of lung sections of each group.
  • FIG. 14 also shows a stained photograph of a lung section of a normal mouse to which bleomycin has not been administered.
  • scleroderma mouse model a known model in which BALE / c mice are administered bleomycin to develop scleroderma was used. Specifically, scleroderma was caused by subcutaneous administration of bleomycin daily at a dose of 100 ⁇ g / day for 3 weeks to 6-8 week-old BALB / c mice.
  • statin-encapsulated nano Murine adipose-derived stem cells 1.0 ⁇ 10 4 cells / mouse
  • Statin non-encapsulated nanoparticles use PLGA, and statin encapsulated nanoparticles co-culture 100 ⁇ g / mL or 200 ⁇ g / mL of these nanoparticles with mouse fat-derived stem cells for 30 minutes to 1 hour using the above simvastatin-encapsulated PLGA nanoparticles
  • mouse adipose-derived stem cells containing statin non-encapsulated nanoparticles or statin-encapsulated nanoparticles were obtained.
  • FIG. 15 shows a stained photograph of skin sections of each group.
  • FIG. 15 also shows a stained photograph of a skin section of a normal mouse to which bleomycin has not been administered.
  • mice As shown in FIG. 15, in the skin tissue of normal mice, the presence of the epidermis (white arrow) is recognized, but the skin tissue of mice treated only with PBS against bleomycin-induced scleroderma mice is normal The epidermis is extremely thin compared to the mouse, and the dermis (black arrow) is thick. Moreover, in mice (AdSC1 ⁇ 10 4 , AdSC 2.5 ⁇ 10 5 ) administered with mouse fat-derived stem cells containing non-encapsulated nanoparticles of statin, the thickness of the dermis is smaller compared to the above PBS group. In particular, it can be seen that the thickness of the dermis is smaller at AdSC 2.5 ⁇ 10 5 in which more stem cells are administered.
  • mice (Sim100-AdSC1.0 ⁇ 10 4 , Sim200-AdSC 1.0 ⁇ 10 4 ) administered with mouse fat-derived stem cells containing statin-encapsulated nanoparticles
  • the thickness of the dermis is smaller compared to the PBS group.
  • Sim200-AdSC 1.0 ⁇ 10 4 using nanoparticles in which 200 ⁇ g / mL statins are encapsulated recovers to a level close to the thickness of the dermis in the skin tissue of normal mice.
  • a nerve injury mouse model a well-known model in which the left sciatic nerve of a C57B6 / J mouse is tightened with a forceps for 20 seconds to produce a nerve injury was used. Specifically, first, skin incision is made in the left buttock area of a 10- to 12-week-old C57B6 / J mouse under anesthesia, and then the muscle sheath of the thigh is exfoliated to expose the left sciatic nerve. The nerve was injured by pressing the left sciatic nerve with forceps for 20 seconds.
  • mice adipose-derived stem cells containing non-encapsulated statin nanoparticles, or murine adipose-derived stem cells containing statin-encapsulated nanoparticles were intravenously administered.
  • the dose of mouse adipose-derived stem cells was 5 ⁇ 10 4 cells / mouse.
  • statin non-encapsulated nanoparticles use PLGA
  • statin-encapsulated nanoparticles use the above-mentioned simvastatin-encapsulated PLGA nanoparticles, and 100 ⁇ g / mL of these nanoparticles and mouse fat-derived stem cells are co-cultured for 30 minutes to 1 hour
  • Mouse adipose-derived stem cells containing encapsulated nanoparticles or statin encapsulated nanoparticles were obtained.
  • SFI sciatic nerve functional index
  • SFI is higher in mice administered with mouse adipose-derived stem cells containing non-encapsulated nanoparticles (AdSC) than in mice administered with PBS alone, and the motor function is enhanced. It is recognized that it has recovered. Furthermore, in mice administered with mouse adipose-derived stem cells containing statin-encapsulated nanoparticles (Sim-AdSC), it is observed that SFI is higher and motor function is restored.
  • mice in which Shn-2 has been knocked out can be used as a schizophrenia model.
  • statin non-encapsulated nanoparticles use PLGA (50 ⁇ g), and the statin encapsulated nanoparticles use the above-mentioned simvastatin-encapsulated PLGA nanoparticles (20 ⁇ g or 50 ⁇ g), for 30 minutes to 1 hour with these nanoparticles and mouse fat-derived stem cells Culture was performed to obtain mouse adipose-derived stem cells containing statin non-encapsulated nanoparticles or statin-encapsulated nanoparticles. After administration, felt was placed in the cage of each mouse, and one week after that, the condition of the felt was observed. Also, as shown in Table 1 below, scores were given based on the state of felt. The observation results and the score are shown in FIG.
  • nesting behavior is hardly observed in mice administered PBS alone, and symptoms of schizophrenia are strongly observed.
  • nesting behavior was also slightly observed in mice (PLGA 50 ⁇ g-AdSC) administered with mouse adipose-derived stem cells containing non-encapsulated nanoparticles of statin.
  • PLGA 50 ⁇ g-AdSC mouse adipose-derived stem cells containing statin-encapsulated nanoparticles
  • statin-encapsulated nanoparticles when 20 ⁇ g of simvastatin-encapsulated PLGA nanoparticles are used (SimPLGA 20 ⁇ g-AdSC), nesting behavior is partially observed and recovery of symptoms is observed .
  • OA mouse model As an OA mouse model, a known model was used in which cutting of the right anterior cruciate ligament and resection of the medial meniscus were performed on BALB / c mice. Specifically, while surgically cutting the anterior cruciate ligament in the right knee joint of BALB / c nude mice (male, 10 weeks old), the medial meniscus is resected, and 4 days after that (4 days after surgery) Day 7) A wheel exercise load of about 15,000 revolutions was applied to the mouse using a rotating wheel to induce OA.
  • PBS human adipose-derived stem cells
  • human adipose-derived stem cells containing statin-encapsulated nanoparticles were locally administered to the right knee joint joint of the mouse using a 29G injection needle.
  • the dose of PBS was 10 ⁇ L.
  • the dose of human adipose-derived stem cells was 1 ⁇ 10 4 cells / mouse, and 10 ⁇ L of PBS was used as a solvent.
  • FIG. 19 shows a stained photograph of articular cartilage tissue sections of each group.
  • FIG. 19 also shows a stained photograph of a articular cartilage tissue section of the right knee in a normal mouse which has not been subjected to the cutting of the right knee joint anterior cruciate ligament and the resection of the medial meniscus.
  • the cartilage layer of the tibia bone head is thicker than the above AdSC group, and safranin Many stained parts by O are also recognized.
  • the degree of joint damage was scored as the histopathological findings for the PBS group, AdSC group and Stain-AdSC group.
  • the scoring criteria were evaluated as follows based on Osteoarthritis and Cartilage 18 (2010) S17-S23.
  • C57BL / 6-App ⁇ tm3 (NL-G-F) Tcs> obtained from RIKEN BioResource Center was used.
  • fat-derived stem cells containing PBS, fat-derived stem cells, or statin-encapsulated nanoparticles were slowly administered from the tail vein of the mouse.
  • mouse fat-derived stem cells obtained from the subcutaneous fat of C57BL / 6 mice were used as fat-derived stem cells.
  • the dose of adipose-derived stem cells was 1 ⁇ 10 4 cells / mouse, and 200 ⁇ L of PBS was used as a solvent.
  • simvastatin-loaded PLGA nanoparticles are used as statin-encapsulated nanoparticles, and 20 ⁇ g of these nanoparticles are cultured with 1 ⁇ 10 4 cells of mouse fat-derived stem cells for 30 minutes at 37 ° C.
  • mice and normal wild-type mice were subjected to the well-known Burns maze test to evaluate their memory. Specifically, with the day of administration as day 0, on the 0th, 7th and 14th days as a memory analysis, each mouse is provided in the periphery of the Barnes maze table among 20 circles. Only one target hole was found, and the time and movement distance to reach an escape cage in communication with the target hole were measured. Memory training was performed once each in the morning and afternoon on the day before the day of the above measurement (memory analysis).
  • Each mouse was housed in one cage with a plurality of mice, and divided into individual cages and acclimatized to the environment at least one hour before the memory training and memory analysis.
  • the memory training first, after placing the mouse in a white cylindrical container placed at the center of the maze table for 1 minute, the cylindrical container was removed from the maze table, and an ultrasonic buzzer that the mouse disliked was rang. After that, the mouse was searched for a target hole for 3 minutes, and the ultrasonic buzzer was stopped when entering the escape cage. However, if the mouse does not enter the escape cage even after 3 minutes, put the mouse in a transparent cylindrical container and show the surrounding environment and memorize it while taking about 30 seconds to forcibly escape the mouse I put it in the cage. After being put in the escape cage, they were accustomed to the environment for 1 minute. Memory training repeated the above process three times.
  • the memory analysis performed on the next day of the memory training is similar to the memory training, in which the mouse is allowed to stand in a white cylindrical container placed at the center of the maze table for 1 minute and then the cylindrical container is removed from the maze table
  • the mouse beeps an ultrasonic buzzer at a frequency that it dislikes, and behavior tracking recording starts. After that, the mouse searched for the target hole, and when it entered the escape cage, the ultrasonic buzzer was stopped and behavior tracking recording was stopped.
  • behavior tracking recording using the behavior analysis system LimeLite software (ActiMetrics, Inc. IL, USA), the movement distance (target reaching movement distance) and time until the mouse enters the escape cage after the ultrasonic buzzer sounds. (Time to reach goal) was measured.
  • the results of memory analysis in each of the above mice are shown in FIG.
  • statin-encapsulated nanoparticles according to the present invention can enhance the function of stem cells, and the function-enhancing stem cells are accumulated in an inflammatory part such as intestine by being administered to a subject having an inflammatory disease Can exert anti-inflammatory effects.
  • the stem cells according to the present invention can release sustained statins, thereby providing an anti-inflammatory effect of the statin itself, which is useful for the treatment of inflammatory diseases.

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Abstract

本発明は、スタチンが生体吸収性ポリマーを含むナノ粒子に封入されてなるスタチン封入ナノ粒子などであり、幹細胞の機能を増強するために用いられ、該幹細胞は、炎症性疾患の治療用の幹細胞である。

Description

炎症性疾患治療用幹細胞の機能増強用スタチン封入ナノ粒子製剤、及びそれを含有する炎症性疾患治療用機能増強幹細胞
　本発明は、スタチンを封入するナノ粒子に関し、特に炎症性疾患治療用の細胞の機能を増強するためのスタチン封入ナノ粒子（製剤に用いられる粒子、この粒子を含む製剤など）に関する。また、本発明は、スタチン封入ナノ粒子を含有する炎症性疾患治療用の幹細胞に関する。
　スタチンは、肝臓でのコレステロール生合成の律速酵素であるＨＭＧ‐ＣｏＡ還元酵素を阻害する化合物として知られている。スタチンにより、血液中のコレステロール値を低下できるので、高コレステロール血症の治療薬に用いられている。また、スタチンは、高コレステロール血症以外にも、その抗炎症作用によって狭心症や心筋梗塞といった虚血性心疾患、及び動脈硬化等の疾患に有効であることも臨床試験により明らかとなっている。
　これまでに、スタチンによる疾患の治療効果の向上や、副作用の低減のために種々の研究が行われており、例えば特許文献１には、血管新生の促進を目的としてスタチンを投与する場合に、スタチンをナノ粒子に封入し、そのスタチン封入ナノ粒子を患者に局所投与することで、これまでよりも少量のスタチンで血管新生を促進できることが開示されている。
　スタチンは、上述の通り、種々の作用を示しており、特に抗炎症作用を有するため炎症性疾患への適用についても盛んに研究がなされている。例えば非特許文献１には、スタチンの一種であるシンバスタチンがマウス炎症性腸疾患モデルにおいて、抗炎症作用を示すことが開示されている。また、非特許文献２には、クローン病患者に対するアトルバスタチンの抗炎症効果について記載されている。
　また、近年、多能性を有する幹細胞を用いて、種々の疾患を治療する研究も行われている。幹細胞は、一般に胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や、骨髄由来幹細胞及び脂肪由来幹細胞等の間葉系の体性幹細胞の他、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等が知られており、種々の研究に用いられている。中でも、取り扱いが簡便な脂肪由来幹細胞に関する研究が急速に発展し、各種疾患に対する再生医療の臨床試験が広く行われている。また、脂肪由来幹細胞は、再生医療のみならず、薬剤誘発性腸炎マウスモデルにおいて腸炎抑制効果を示すことも報告されている（例えば非特許文献３を参照）。
特開２０１２－２１００２号公報
阿部洋介ら, 潰瘍, 37(2010), 169-173. Grip, O et al, Br J Pharmacol. 155(2008), 1085-1092. Gonzalez, MA et al. Gastroenterology 136(2009), 978-989.
　炎症性疾患を治療するために、例えば上記非特許文献１及び２に開示されているようにスタチンを用いる際に、スタチンの効果をより効率的に発揮できるようにするために、例えば特許文献１に開示するようにスタチンをナノ粒子に封入し、当該スタチン封入ナノ粒子を患者に投与することが考えられる。しかしながら、特許文献１では、スタチン封入ナノ粒子を患者に局所投与しており、このようにすることで、これまでよりも少量のスタチンで有効性が認められるが、投与したスタチンナノ粒子がマクロファージに貪食されるなどして不均一に病巣に分布しやすく安定した治療効果が得られにくいことがある。
　一方、非特許文献３に開示されているように、幹細胞のみを用いて炎症性疾患を治療する場合においても、幹細胞の患部への局所投与が必要であり、大量の細胞を必要とするため、コストや時間がかかるだけでなく細胞投与時の副作用の出現頻度も増加する可能性がある。さらに、自家細胞移植を想定した場合、脂肪組織が少なく分離できる幹細胞が少ない、あるいは、高齢・糖尿病などの代謝疾患の因子により幹細胞機能が低下した症例では、少ない数の幹細胞によって優れた治療効果を得るために、その幹細胞の種々の機能を向上させる必要があると考えられる。
　本発明は、前記の課題を鑑みてなされたものである。本発明を創作する目的は、細胞製剤等として用いられる幹細胞の炎症性疾患に対する治療効果を向上し、副作用を抑制しながらその幹細胞の機能を向上できるようにすることにある。
　前記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究した結果、スタチンがナノ粒子に封入されてなるスタチン封入ナノ粒子を幹細胞に含有させることにより、その幹細胞の機能が増強し、スタチンを所望の患部に効率よく送達等できて、炎症性疾患の治療において高い効果を示すことを見出して本発明を完成した。すなわち、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子は、スタチンが生体吸収性ポリマーを含むナノ粒子に封入されてなるスタチン封入ナノ粒子であり、幹細胞の機能を増強するための粒子であって、該幹細胞は、炎症性疾患の治療用の幹細胞であることを特徴とする。
　本発明に係るスタチン封入ナノ粒子は、幹細胞に処理されることにより（具体的にはこのナノ粒子が幹細胞に取り込まれることにより）、その処理された幹細胞の機能を増強することができ、その幹細胞を生体内に投与することにより、種々の有効性を示す。具体的に、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子により幹細胞を処理すると、処理された幹細胞は、ファゴサイトーシスによりスタチン封入ナノ粒子を取り込み、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ幹細胞は、遊走能及び増殖能の増強に加えて、免疫抑制能が増強する。このため、例えば炎症性疾患を患う患者の体内に、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子が処理された幹細胞を投与することにより、幹細胞の増強された免疫抑制作用と該幹細胞から徐放されるスタチンの抗炎症作用により、優れた炎症性疾患の治療効果を示す。
　本発明に係るスタチン封入ナノ粒子において、生体吸収性ポリマーとしては、ポリ乳酸重合体（poly lactic acid：ＰＬＡ）又はポリ乳酸グリコール酸共重合体（poly(lactic-co-glycolicacid)：ＰＬＧＡ）を用いることができる。
　ＰＬＡ及びＰＬＧＡは体内で加水分解されることにより、封入したスタチンを放出することができ、また、ＰＬＡはその加水分解により乳酸に分解され、ＰＬＧＡはその加水分解により乳酸とグリコールとに分解され、それぞれ最終的に水と炭酸ガスとなり、ヒト等の動物に対して無害であるため、ＰＬＡ又はＰＬＧＡをナノ粒子材料として用いることは極めて好ましい。
　本発明に係るスタチン封入ナノ粒子は、上記幹細胞として間葉系幹細胞、特に脂肪由来幹細胞を増強するためのものであることが好ましい。
　脂肪由来幹細胞は、脂肪組織を採取し、採取した組織をコラゲナーゼ処理した後に、遠心比重法により単核球細胞のみを採取し、採取した単核球細胞を培養プレートで４日間程度培養し、接着した細胞を脂肪由来幹細胞として選択及び分離できる。また、セリューションシステム（サイトリ社製）等を用いて脂肪組織から容易に且つ大量に抽出、分離培養することができる。脂肪由来幹細胞は、間葉系幹細胞に属し、多能性をも有し、また、上記のとおり、簡便に多くの量を採取することができるため、種々の疾病における再生医療のために用いるのに有利である。さらに、脂肪由来幹細胞は、抗炎症性サイトカインを産生放出し、炎症性細胞の活性を抑制するため、炎症性疾患の治療に有利である。
　また、本発明に係る機能増強幹細胞は、上記スタチンが生体適合性ナノ粒子に封入されてなるスタチン封入ナノ粒子を含有し、炎症性疾患の治療用であることに特徴がある。
　このような本発明に係る機能増強幹細胞は、上記スタチン封入ナノ粒子を含有しているため、上述のとおり、該スタチン封入ナノ粒子により免疫抑制能等の細胞機能が増強され、炎症性疾患の治療に優れた効果を発揮できる。また、本発明に係る機能増強細胞は、スタチンを徐放することができ、その放出されたスタチンの抗炎症作用により炎症性疾患の治療に有利となる。
　本発明に係る機能増強幹細胞は、上述の理由から、上記脂肪由来幹細胞であることが好ましい。
　また、本発明に係る機能増強幹細胞は、医薬として許容可能な溶媒及び賦形剤と混合して細胞製剤として製剤化することも可能である。本発明に係る幹細胞の生体内への投与は、開腹等の手術が不必要であることが好ましく、静脈内投与用又は動脈内投与用の細胞製剤として製剤化されていることが好ましい。このようにすると、簡便に患者に本発明に係る幹細胞を投与することができる。本発明に係る機能増強幹細胞製剤は、幹細胞の機能が増強されているため、静脈内投与又は動脈内投与であっても少ない投与量で高い効果を得ることができる。また、本発明に係る機能増強幹細胞製剤は、動脈内投与をすることで、特に静脈内投与では到達させることが困難な腸等の炎症部に幹細胞を集積させることができる。従って、動脈内投与を用いることで、少ない容量で均一に細胞を病巣に分布させて安定した高い効果を得ることができることもある。また、本発明に係る機能増強幹細胞製剤は、一定の所望の効果を得ることができるのであれば、局所投与されてもよい。
　本発明に係るスタチン封入ナノ粒子及びそれを含有する機能増強幹細胞などによると、幹細胞の機能を増強することができ、該幹細胞を生体内に投与することにより、炎症性疾患の治療に優れた効果を示す。
ヒト脂肪由来幹細胞の培養培地中にローダミン赤色蛍光色素封入ＰＬＡナノ粒子をその最終濃度が２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬとなるように添加し、その１時間後又は２時間後に幹細胞を共焦点レーザー蛍光顕微鏡で観察した結果を示す写真である。 マウス脂肪由来幹細胞の培養培地中にローダミン赤色蛍光色素封入ＰＬＧＡナノ粒子をその最終濃度が２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬとなるように添加し、その３０分後に幹細胞におけるローダミン赤色蛍光色素封入ＰＬＧＡナノ粒子の取り込み量をＦＡＣＳで測定した結果を示す写真である。 ヒト脂肪由来幹細胞の培養培地中に粒径が２００ｎｍ～４００ｎｍ又は４００ｎｍ～６００ｎｍのローダミン赤色蛍光色素封入ＰＬＧＡナノ粒子を添加し、その１時間後に幹細胞を共焦点レーザー蛍光顕微鏡で観察した結果を示す写真である。 ヒト脂肪由来幹細胞に対して１００μｇ／ｍＬの濃度でシンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子を１時間処理させた後に、脂肪由来幹細胞から培地中に放出されたシンバスタチンの量を測定した結果を示すグラフである。 マウス脂肪由来幹細胞に対して５０μｇ／ｍＬの濃度でシンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子を３０分処理させた後に、脂肪由来幹細胞から培地中に放出されたシンバスタチンの量を測定した結果を示すグラフである。 （ａ）はＰＬＡナノ粒子又はスタチン封入ＰＬＡナノ粒子を処理したヒト脂肪由来幹細胞の遊走性の測定結果を示すグラフであり、（ｂ）はスタチン封入ＰＬＡナノ粒子を処理したヒト脂肪由来幹細胞の増殖性の測定結果を示すグラフである。 静脈投与によりローダミン赤色蛍光色素封入ＰＬＧＡナノ粒子を含むマウス脂肪由来幹細胞が投与されたマウスの大腸を、共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて観察した結果を示す写真である。 動脈投与によりローダミン赤色蛍光色素封入ＰＬＧＡナノ粒子を含むマウス脂肪由来幹細胞が投与されたマウスの大腸を、共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて観察した結果を示す写真である。 ＰＢＳ（リン酸バッファー）、スタチン非封入ナノ粒子含有脂肪由来幹細胞、又はスタチン封入ナノ粒子含有脂肪由来幹細胞を投与したＤＳＳ腸炎モデルマウスの体重の経時的変化を示すグラフである。 （ａ）はＰＢＳ、スタチン非封入ナノ粒子含有脂肪由来幹細胞、又はスタチン封入ナノ粒子含有脂肪由来幹細胞を投与したＤＳＳ腸炎モデルマウスの大腸の長さを示すグラフであり、（ｂ）はＰＢＳ、スタチン非封入ナノ粒子含有脂肪由来幹細胞、又はスタチン封入ナノ粒子含有脂肪由来幹細胞を投与したＤＳＳ腸炎モデルマウスのＤＡＩスコアを示すグラフである。 ＤＡＩスコアの説明のための表である。 ＰＢＳ、スタチン非封入ナノ粒子含有脂肪由来幹細胞、又はスタチン封入ナノ粒子含有脂肪由来幹細胞を投与したＤＳＳ腸炎モデルマウスにおける、ＴＮＦα、ＩＬ－１７、ＩＬ－６及びＩＬ－１βの遺伝子発現量を示すグラフである。 （ａ）はＰＢＳ、スタチン非封入ナノ粒子含有脂肪由来幹細胞、又はスタチン封入ナノ粒子含有脂肪由来幹細胞を投与したＤＳＳ腸炎モデルマウスの大腸の組織学的解析結果を示す写真であり、（ｂ）はそれをスコア化したグラフである。 ＰＢＳ、スタチン非封入ナノ粒子含有脂肪由来幹細胞、又はスタチン封入ナノ粒子含有脂肪由来幹細胞を投与した間質性肺炎モデルマウス、及び正常マウスの肺の組織学的解析結果を示す写真である。 ＰＢＳ、スタチン非封入ナノ粒子含有脂肪由来幹細胞、又はスタチン封入ナノ粒子含有脂肪由来幹細胞を投与した強皮症モデルマウス、及び正常マウスの皮膚組織の組織学的解析結果を示す写真である。 ＰＢＳ、スタチン非封入ナノ粒子含有脂肪由来幹細胞、又はスタチン封入ナノ粒子含有脂肪由来幹細胞を投与した神経損傷モデルマウスの坐骨神経機能指数（ＳＦＩ）の測定結果を示すグラフである。 正常マウスとＳｈｎ－２ＫＯマウスの巣作り行動解析結果を示す写真である。 ＰＢＳ、スタチン非封入ナノ粒子含有脂肪由来幹細胞、又はスタチン封入ナノ粒子含有脂肪由来幹細胞を投与したＳｈｎ－２ＫＯマウスの巣作り行動解析結果を示す写真である。 ＰＢＳ、ヒト脂肪由来幹細胞、又はスタチン封入ナノ粒子含有ヒト脂肪由来幹細胞を投与した変形性関節症モデルマウス、正常マウスの関節軟骨組織の組織学的解析結果を示す写真である。 ＰＢＳ、ヒト脂肪由来幹細胞、又はスタチン封入ナノ粒子含有ヒト脂肪由来幹細胞を投与した変形性関節症モデルマウスの関節損傷度のスコアリング結果を示すグラフである。 ＰＢＳ、マウス脂肪由来幹細胞、又はスタチン封入ナノ粒子含有マウス脂肪由来幹細胞を投与した認知症モデルマウス、及び正常マウスの記憶解析の結果である。（ａ）はバーンズ迷路試験においてターゲットホールを見つけてエスケープケージに入るまでのマウスの移動距離を示すグラフであり、（ｂ）は該エスケープケージに入るまでの時間を示すグラフである。
　以下、本発明を実施するための形態を図面に基づいて説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。
　本発明に係るスタチン封入ナノ粒子は、スタチンがポリ乳酸グリコール酸共重合体を含むナノ粒子に封入されてなる（封入されている）スタチン封入ナノ粒子であって、幹細胞の機能を増強するために用いられる。本発明に係るスタチン封入ナノ粒子を含むスタチン封入ナノ粒子製剤は、上記スタチン封入ナノ粒子以外に、安定化剤、保存剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、賦形剤等の製剤化に通常用いられる添加剤を含んでいてもよい。
　本発明において、スタチンとは、ＨＭＧ－ＣｏＡ（３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－コエンザイムＡ）還元酵素阻害剤である化合物を全て含むものであり、例えば、シンバスタチン、ロスバスタチン、ピタバスタチン、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチン、ロバスタチン及びメバスタチン等が挙げられる。スタチンは、上述のとおり、コレステロール低下作用を有することが知られているが、この他に心血管イベントの発生や進行リスクを低下させることが大規模臨床試験で明らかになっている。また、血管内皮細胞や骨髄由来の血管内皮前駆細胞を介した血管新生促進作用についても多く報告がなされている。さらに、抗炎症作用を示すことも知られている。
　本発明において、ナノ粒子はスタチンを封入することができる生体吸収性ポリマーであればその材料は限定されないが、ポリ乳酸重合体（poly lactic acid：ＰＬＡ）又はポリ乳酸グリコール酸共重合体（poly(lactic-co-glycolicacid)：ＰＬＧＡ）を含むナノ粒子を用いることが好ましい。ＰＬＡは体内で加水分解されて乳酸に分解され、ＰＬＧＡは、体内で加水分解されて乳酸とグリコールとに分解され、それぞれ最終的に水と炭酸ガスとなるので、体内に無害であって好ましい。
　本発明において、スタチン封入ナノ粒子は、幹細胞への取り込み効率の観点から、光散乱法で測定したときに、個数平均粒径の上限と下限が、以下のように加工（製造）されている。
・個数平均粒径の上限は、１０００ｎｍ未満、好ましくは約６００ｎｍ以下（より好ましくは６００ｎｍ以下）、更に好ましくは約４００ｎｍ以下（より好ましくは４００ｎｍ以下）である。
・個数平均粒径の下限は、約１００ｎｍ以上（より好ましくは１００ｎｍ以上）、好ましくは約２００ｎｍ以上（より好ましくは２００ｎｍ以上）である。
例えば、スタチン封入ナノ粒子の個数平均粒径は、光散乱法で測定したときに、１０００ｎｍ未満、好ましくは約１００ｎｍ～約６００ｎｍ（より好ましくは１００ｎｍ～６００ｎｍ）、更に好ましくは約２００ｎｍ～約４００ｎｍ（より好ましくは２００ｎｍ～４００ｎｍ）となる。
　本発明において、スタチン封入ナノ粒子は、上述の個数平均粒径を満たすように加工することができる方法であればいかなる方法によっても製造されることができるが、好ましくは球形晶析法を使用して製造される。球形晶析法は、化合物合成の最終プロセスにおける結晶の生成・成長プロセスを制御することで、球状の結晶粒子を設計し、その物性を直接制御して加工することができる方法として周知である。この球形晶析法の一つに、周知のエマルジョン溶媒拡散法（ＥＳＤ法）がある。
　エマルジョン溶媒拡散法は、スタチンを封入するための上記ＰＬＡ又はＰＬＧＡ等の生体吸収性ポリマーを溶解可能な良溶媒と、ポリマーを溶解しない貧溶媒との２種の有機溶媒を用いて行われる。まず、良溶媒中にＰＬＡ又はＰＬＧＡ等のポリマーを溶解し、このポリマーが析出しないように、スタチン溶解液を良溶媒に添加し、混合する。この混合液を撹拌されている貧溶媒中に滴下すると、急速に良溶媒が貧溶媒に、また、貧溶媒は良溶媒に相互拡散するため、有機溶媒相と水相との界面が乱れ、良溶媒が自己乳化し、サブミクロンサイズのエマルジョン滴が形成される。その後、良溶媒及び貧溶媒の相互拡散がさらに進み、エマルジョン滴内のＰＬＡ又はＰＬＧＡ等のポリマー及びスタチンの溶解度が低下し、その結果、スタチンを包含した球形結晶粒子のポリマーナノ粒子が生成する。
　本発明において、幹細胞は、全能性、多能性又は多分化能を有する細胞であり、例えば胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）及び間葉系幹細胞等の体性幹細胞が挙げられる。本発明においては、多くの幹細胞をより簡便に且つ大量に得るという観点から骨髄組織や脂肪組織等から得られる間葉系幹細胞を用いることが好ましい。その中でも、特に脂肪由来幹細胞を用いることがより好ましい。脂肪由来幹細胞は、細胞単独で投与されることは既に臨床で行われており、脂肪をはじめ、骨、肝臓、心臓等に分化することが知られている。脂肪由来幹細胞は脂肪組織から得ることができ、該脂肪組織は脂肪吸引等の低侵襲技術で皮下脂肪等から容易に得ることができる。脂肪由来幹細胞は、上記のように得られた脂肪組織からセリューションシステム（サイトリ社製）等を利用して抽出及び分離されることで豊富に採取可能である。このため、本発明に係る幹細胞として用いるのに極めて有利である。
　本発明に係るスタチン封入ナノ粒子の幹細胞への処理は、例えば該幹細胞が培養されている培養培地中に添加することにより行われる。このようにすると、ファゴサイトーシスにより幹細胞がスタチン封入ナノ粒子を細胞内に取り込むため、特別な試薬等を用いることなく、簡便に幹細胞内にスタチン封入ナノ粒子を含有させることができる。
　本発明に係るスタチン封入ナノ粒子により処理された幹細胞は、特に遊走能、増殖能及び免疫抑制能が増強され、特に炎症性疾患に対する治療効果が増強する。このような、本発明に係る機能増強幹細胞は、静脈内投与又は動脈内投与によっても少ない投与量で優れた効果を示す。具体的に、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子により処理された上記脂肪由来幹細胞を動脈内投与すると、脂肪由来幹細胞が血流によって炎症を示す臓器、例えば腸に到達し、炎症部に集積及び増殖し、抗炎症性サイトカインを産生し、また、炎症性細胞の活性を抑制する。その結果、炎症性疾患に対する優れた治療効果を示す。
　本発明において炎症性疾患とは、炎症を病因の一つとする疾患をいい、腸炎や肺炎といったそれらの疾患の特徴的な症状が炎症であるものに限らず、肺高血圧症や認知症といったそれらの疾患の発症プロセスに炎症が関与するものも含む。具体的に、本発明における炎症性疾患は、全身性エリテマトーデス、強皮症、アトピー性皮膚炎、慢性関節リウマチ、間質性肺炎、気管支喘息、肺高血圧症、潰瘍性大腸炎やクローン病等の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、神経損傷、脊髄損傷、脳卒中（脳梗塞や脳出血後後遺症）、筋萎縮性側索硬化症、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、統合失調症、認知症、臓器移植時の拒絶反応、慢性腎炎（腎硬化症）等が挙げられる。
　また、脂肪由来幹細胞は、上述のとおり、取り込んだスタチン封入ナノ粒子を細胞内で加水分解することにより、封入されたスタチンを徐放するため、脂肪由来幹細胞は体内に投与された場合、投与後にスタチンを徐放し、放出されたスタチンにより更なる抗炎症効果を得ることができる。
　以下に、本発明に係る幹細胞機能増強用スタチン封入ナノ粒子及びそれを含有する機能増強幹細胞等を詳細に説明するための実施例を示す。
　まず、スタチン封入ナノ粒子の製造方法について説明する。ここでは、特にスタチンとしてシンバスタチンを用い、ナノ粒子としてポリ乳酸重合体（ＰＬＡ）又はポリ乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）を含むナノ粒子を用いた。
　ＰＬＡ（重量平均分子量20000）５０ｍｇとシンバスタチン２．５ｍｇとをアセトン２ｍＬ、エタノール０．５ｍＬの混液に溶解しポリマー溶液とした。これを室温、５００ｒｐｍで攪拌した２ｗｔ％ＰＶＡ溶液１０ｍＬ中に滴下しシンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子懸濁液を得た。続いて室温、５００ｒｐｍで攪拌を続けながら、有機溶媒（アセトン、エタノール）を留去した。約５時間溶媒留去後、懸濁液を４℃、６００００ｇで３０分間遠心分離し、沈殿物を回収して蒸留水に再懸濁させた。この遠心分離と蒸留水への再懸濁の操作は合計３回行った。その後、懸濁液を一晩凍結乾燥し、シンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子を得た。シンバスタチンは、１ｍｇのナノ粒子中に２４．９４μｇ封入された。シンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子も同様の方法により得た。
　これらをスタチン封入ナノ粒子として以下の試験で用いた。
　次に、幹細胞に対して上記のようにして得られたスタチン封入ナノ粒子を処理する際の最適な処理濃度を検討するために、以下の試験を行った。
　当該試験を行うために、まず、コラゲナーゼ処理及び遠心比重法を利用した周知の方法を用いてヒト脂肪組織から脂肪由来幹細胞（Adipose derived Stem Cell：ＡｄＳＣ）を得、また、マウス脂肪組織から脂肪由来細胞を得た。その方法の詳細について以下に説明する。
　まず、ヒト脂肪組織から脂肪由来幹細胞を得る方法について説明する。予め、Liberase TM RG（0.5mg/mL=0.47WU/mL, Sigma5401127001 50mg/vial）/ＨＢＳＳ（ThermoFisher14175095）溶液、及び１０×溶血溶液（NH4Cl 8.3g, NaHCO31.2g, 0.5M EDTA溶液 200μL/100mL）を準備しておく。５０ｍＬ吸引注射器内の脂肪３本（１５０ｍＬ）をノズル付きプラスチックボトル（アズワン#1-4640-03 広口洗浄瓶 1000ml）に移し、等量のＰＢＳ（－）で洗浄・廃液を４、５回繰り返す。上記Liberase TM RG溶液（50mg/vialを20mLのHBSSで溶解し、半量10mLをHBSS 40mL（合計50mL）で希釈したのちに約１５０ｍＬの脂肪組織に使用する。）を脂肪溶液のボトルに入れ、軽くVortexしてからシェーカー付恒温槽を用いて３７℃　２０分間振盪インキュベーションする。その後、20%FBS/DMEM F12 ５０ｍＬを該ボトル内に加えて、酵素反応を停止させる。ボトルのノズルから液層（脂肪の下層）をセルストレーナー（100μm, BD）に通しながら複数の新しい５０ｍＬチューブに分けて回収する。1200rpm (300g)×5minで遠心（ブレーキ有り）し、上清を捨てる。1mM EDTA/PBS 40mL/チューブで細胞ペレットを懸濁し、セルストレーナー（40μm, BD）に通しながら同数の新しい５０ｍＬチューブに移す。1200rpm(300g)×5minで遠心（ブレーキ有り）し、上清を捨てる。1mMEDTA/PBS 2mlで細胞を懸濁し１本のチューブにまとめ、溶血溶液８ｍＬを加えて混和後１０分間冷所（OnIce）保存する（溶血操作）。1mM EDTA/PBSを４５ｍＬ付近まで加えた後、1200rpm (300g)×5minで遠心し上清を捨てる。細胞ペレットをＰＢＳ（－）または10%DMEM F12で懸濁し、５％ＣＯ２インキュベーターで10%DMEMF12とともに３、４日間培養し、接着細胞を脂肪由来幹細胞（ＡｄＳＣ）として実験に用いる（P0）。継代培養する場合は、１：３～４の割合（3000-4000/cm2の密度）でさらに３、４日間継代培養する。
　一方、マウス脂肪組織から脂肪由来幹細胞を得る方法は、以下の通りである。予め、コラゲナーゼVIII型（２mg/mL, Sigma ＃C2139）/1%BSA HBSS溶液をシェーカー付恒温槽３７℃で解凍しておく。また、1mMEDTA/PBSは、EDTA（0.5MEDTA, pH 8.0, LifeTechnologies, AM9260G）、10X DPBS,Ca(-), Mg(-)（GIBCO, 14200-166）を希釈して作製しておく。その後、２、３匹のマウスを麻酔の後に心窩部より２６～２９Ｇ針付シリンジ（インスリンシリンジなど）で脱血死させる。皮下脂肪（鼠径部～背部）を採取し３．５ｃｍ培養皿（生理食塩水を中央に１滴滴下して脂肪組織が取り出しやすいようにおく）にまとめて置く。脂肪組織を蓋の上に載せたままハサミで小片（２０～３０回程度）になるようにカットした後、脂肪組織を脂肪と同じ体積のコラゲナーゼ溶液とともに１５ｍＬチューブに入れる。キャップを閉め、チューブを転倒混和の後にシェーカー付恒温槽を用いて３７℃　３０分間インキュベーションする。10%FBS/DMEM F12培地を同量加えて酵素反応を停止させる。最上部の脂肪層を吸引除去した後に、上清をセルストレーナー（40μm, BD, 352340）に通して新しい５０ｍＬチューブに回収する。1200rpm(250g)×5minで遠心（ブレーキ有り）し、上清を捨てる。1mM EDTA/PBS（-）を１０ｍｌまでチューブに加えて細胞ペレットを懸濁する。1200rpm(250g)×5minで遠心（ブレーキ有り）し、上清を捨てる。細胞ペレットを10%FBS/DMEM F12培地で懸濁してから培養皿に播種する（P0）。５％ＣＯ２インキュベーターで３、４日間培養し、接着細胞をＡｄＳＣとして１：１で継代（Ｐ１）する。５％ＣＯ２インキュベーターで４、５日間培養し、接着細胞をＡｄＳＣとして１：３で継代（Ｐ２）する。８０～９０％程度まで細胞密度が増加した時点で実験に用いる。
　上述した方法により、ヒト脂肪由来幹細胞を得た後に、上記エマルジョン溶媒拡散法を利用してスタチンの代わりにローダミン赤色蛍光色素をＰＬＡナノ粒子に封入することにより得られたローダミン赤色蛍光色素封入ＰＬＡナノ粒子をその最終濃度が２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬとなるように、上記脂肪由来幹細胞の培養培地中に添加した。その１時間後（１ｈ）又は２時間後（２ｈ）に、ローダミン赤色蛍光色素封入ＰＬＡナノ粒子の取り込みについて共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて観察した。なお、核の染色はＤＡＰＩを用いて常法で染色した。その結果を図１に示す。
　また、上記と同様の方法でマウス脂肪由来幹細胞においてもローダミン赤色蛍光色素封入ナノ粒子を取り込ませて、その取り込みについてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）解析によって測定した。但し、ナノ粒子としてＰＬＧＡナノ粒子を用い、ローダミン赤色蛍光色素封入ＰＬＧＡナノ粒子の最終濃度は、２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬとし、ローダミン赤色蛍光色素封入ＰＬＧＡナノ粒子の添加の３０分後にＦＡＣＳ装置（BD FACSAria, BD Biosceinces）及び該装置に付属の解析ソフトを用いて測定及び解析をした。その結果を図２に示す。
　図１に示すように、ローダミン赤色蛍光色素封入ＰＬＡナノ粒子は、いずれの濃度であってもヒト脂肪由来幹細胞に取り込まれたことがわかる。但し、処理濃度依存的に、ヒト肪由来幹細胞のローダミン赤色蛍光色素封入ＰＬＡナノ粒子の取り込み量が増大する。また、処理時間が１時間の場合よりも２時間の場合の方が、ヒト脂肪由来幹細胞によるシンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子の取り込み量が多いこともわかる。特に、ローダミン赤色蛍光色素封入ＰＬＡナノ粒子を１００μｇ／ｍＬの濃度でヒト脂肪由来幹細胞に処理した場合に多くのローダミン赤色蛍光色素封入ＰＬＡナノ粒子が幹細胞に取り込まれているのが確認された。
　一方、マウス脂肪由来細胞においても、図２に示すように、ローダミン赤色蛍光色素封入ＰＬＧＡナノ粒子は、いずれの濃度であってもマウス脂肪由来幹細胞に取り込まれ、特に処理濃度依存的に、マウス脂肪由来幹細胞のローダミン赤色蛍光色素封入ＰＬＧＡナノ粒子の取り込み量が増大した。
　次に、脂肪由来幹細胞によるナノ粒子の取り込みが、ナノ粒子の粒径によって差が生じるか否かを検討するために以下の試験を行った。
　まず、２００ｎｍ～４００ｎｍの粒径を有するＰＬＧＡナノ粒子と、４００ｎｍ～６００ｎｍの粒径を有するＰＬＧＡナノ粒子とを準備し、上記試験と同様に、上記エマルジョン溶媒拡散法を利用してスタチンの代わりにローダミン赤色蛍光色素を当該ＰＬＧＡナノ粒子に封入した。これにより、上記各粒径範囲のローダミン赤色蛍光色素封入ＰＬＧＡナノ粒子を調製した。次に、調製した当該ＰＬＧＡナノ粒子を最終濃度が１００μｇ／ｍＬとなるように、ヒト脂肪由来幹細胞の培養培地（10%FBS/DMEM F12）中に添加した。その１時間後に、ローダミン赤色蛍光色素封入ＰＬＧＡナノ粒子の取り込みについて共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて観察した。なお、核の染色はＤＡＰＩを用いて常法で染色した。その結果を図３に示す。
　図３に示すように、ローダミン赤色蛍光色素封入ＰＬＧＡナノ粒子は、いずれの粒径であってもヒト脂肪由来幹細胞に取り込まれたことがわかる。この結果から、ナノ粒子の粒径が２００ｎｍ～６００ｎｍの範囲であれば良好に脂肪由来幹細胞に取り込ませることが可能であることが示唆された。なお、以下の各試験では、個数平均粒径が約３００ｎｍのナノ粒子を用いた。
　次に、シンバスタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞が、その後に細胞内からスタチンをどの程度の時間をかけて放出するのかを検討するために、培地中に放出されたスタチンの量を測定した。ここでは、上記試験と同様にヒト脂肪由来幹細胞に対して１００μｇ／ｍＬの濃度でシンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子を１時間処理した後に、培地を交換し、培地交換から６時間後、１８時間後、２４時間、４８時間、７２時間、１２０時間、１６８時間及び３３６時間後に、培地中に放出されたシンバスタチンの量を測定した。具体的に、この測定は、ＨＰＬＣ (High-pressure Liquid Chromatography)法を用いて行った。この測定結果を図４に示す。
　また、上記と同様の方法でマウス脂肪由来幹細胞においてもスタチンをどの程度の時間をかけて放出するのかを測定した。但し、ここでは、５０μｇ／ｍＬの濃度でシンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子を３０分間処理した。その結果を図５に示す。
　図４に示すように、測定開始から２４時間後に約６０％程度のスタチンがヒト脂肪由来幹細胞から放出され、全てのスタチンが放出されるのに約３３６時間もの時間が掛かっている。この結果から、ヒト脂肪由来幹細胞に取り込まれたスタチンは、ヒト脂肪由来幹細胞から急速に放出されるのではなく、緩やかに徐放されることがわかる。従って、長い時間を掛けてスタチンを放出できるため、良好な治療効果を期待することができる。
　一方、マウス脂肪由来細胞においても、図５に示すように、ヒト脂肪由来幹細胞の場合と同様に、測定開始から２４時間後に約６０％程度のスタチンがマウス脂肪由来幹細胞から放出され、全てのスタチンが放出されるのに約３３６時間もの時間が掛かっている。この結果から、マウス脂肪由来幹細胞に取り込まれたスタチンも、長い時間を掛けて放出されるため、良好な治療効果を期待することができる。
　次に、上記シンバスタチン封入ナノ粒子による脂肪由来幹細胞の遊走能及び増殖能といった機能の増強について検討するために以下の試験を行った。
　まず、遊走性試験キット（Transwell（登録商標））を用いてヒト脂肪由来幹細胞の遊走能について検討した。具体的に、Transwellプレートの各ウェルの多孔メンブレン上にヒト脂肪由来幹細胞を５×１０４cells/wellで播種し、培地中に、スタチンを封入していないＰＬＡナノ粒子を２０μｇ／ｍＬ、又はシンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子を２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬの濃度となるように添加し、１６～１８時間後にTranswellのメンブレンを通過した細胞数を計測した。その結果を図６（ａ）に示す。
　図６（ａ）に示すように、２０μｇ／ｍＬのスタチン非封入ＰＬＡナノ粒子で処理した場合（ＰＬＡ２０）、及び２０μｇ／ｍＬのシンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子で処理した場合（ＰＬＡ－ＳＴ２０）は、未処理であるコントロール群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較してヒト脂肪由来幹細胞の遊走性に変化はなかったが、５０μｇ／ｍＬのシンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子で処理した場合（Ｓｔａｔｉｎ５０）は、ヒト脂肪由来幹細胞の遊走性が増大した。また、１００μｇ／ｍＬのシンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子で処理した場合（Ｓｔａｔｉｎ１００）は、ヒト脂肪由来幹細胞の遊走性が低減する結果となった。この結果から、最適な処理濃度があるものの、シンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子により、ヒト脂肪由来幹細胞の遊走能を亢進できることが示された。
　次に、シンバスタチン封入ナノ粒子による脂肪由来幹細胞の増殖性向上についてＭＴＴアッセイを用いて検討した結果について説明する。
　まず、ヒト脂肪由来幹細胞を９６ｗｅｌｌマイクロプレートに５０００cells/wellの細胞数で播種し、シンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子を２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬの濃度となるように添加し、４８時間後に培地を交換し、ＭＴＴ溶液を各ウェルに加え、２時間後に分光光度計を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図６（ｂ）に示す。
　図６（ｂ）に示すように、シンバスタチン封入ナノ粒子を２０μｇ／ｍＬ（Ｓｔａｔｉｎ２０）、５０μｇ／ｍＬ（Ｓｔａｔｉｎ５０）及び１００μｇ／ｍＬ（Ｓｔａｔｉｎ１００）の濃度で処理した場合のいずれも、未処理であるコントロール群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較してヒト脂肪由来幹細胞の増殖が認められ、特に、５０μｇ／ｍＬの濃度で処理した場合、コントロール群と比較して顕著な増殖性の増加が見られた。この結果から、シンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子により、ヒト脂肪由来幹細胞の増殖能を亢進できることが示された。
　以上のとおり、スタチン封入ナノ粒子による脂肪由来幹細胞の遊走能及び増殖能といった機能の増強について検討した結果、スタチン封入ナノ粒子により、脂肪由来幹細胞の機能を増強することができる。これらの機能が増強することにより、脂肪由来幹細胞は炎症性疾患の治療に有利となる。
　次に、マウスＩＢＤモデルを用いて、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子を含有する幹細胞の炎症性疾患の治療効果について検討した。
　まず、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を用いた腸炎マウスモデルを用いて、本発明にかかる幹細胞の好ましい投与細胞数及び投与経路を検討した。その方法及び結果について以下に説明する。
　まず、６～８週齢のC57BJ/6Jマウスに対して、水の代わりに２．５％のＤＳＳを含む水を５日間与え続けて腸炎を発症させ、５日目にマウス脂肪由来幹細胞を経静脈的、腹腔内又は経動脈的に投与した。なお、マウス脂肪由来幹細胞としては、予め上記と同様の方法でローダミン赤色蛍光色素封入ＰＬＧＡナノ粒子を取り込ませたものを用いた。経動脈的投与は、具体的に、マウスの左総頚動脈遠位を６－０絹糸にて結紮し、その直下にハサミで約２ｍｍ切開した後に３０Ｇのカテーテルを挿入して行った。投与細胞数は、２×１０４、１×１０５及び３×１０５ｃｅｌｌｓとした。その後、５日目から８日目までは通常の水に戻し、自由飲水とした。８日目にマウスを安楽死した上で解剖し、大腸を取り出して組織学的解析を行った。具体的に、ローダミン赤色蛍光色素封入ＰＬＧＡナノ粒子の取り込みについて共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて観察した。なお、核の染色はＤＡＰＩを用いて常法で染色した。その結果を図７及び図８に示す。
　図７に示すように、マウス脂肪由来幹細胞を経静脈的又は腹腔内に投与した場合は、ローダミン染色された幹細胞の存在が認められなかった。一方、図８に示すように、マウス脂肪由来幹細胞を経動脈的に投与した場合は、投与細胞数が１×１０５ｃｅｌｌｓ以上であれば、幹細胞の存在が認められ（図８の矢印部分）、すなわち、幹細胞が炎症を起こした腸に集積できると示唆された。
　次に、上記結果に基づいて、スタチン封入ナノ粒子を含む脂肪由来幹細胞の腸炎抑制効果について検討した。以下に、その方法及び結果について説明する。
　まず、上記試験と同様に、６～８週齢のC57BJ/6Jマウスに対して、水の代わりに２．５％のＤＳＳを含む水を５日間与え続けて腸炎を発症させた。５日目にＰＢＳ、スタチンが非封入のナノ粒子を含むマウス脂肪由来幹細胞、又はスタチン封入ナノ粒子を含むマウス脂肪由来幹細胞を経動脈的に投与した（各群ｎ＝６）。マウス脂肪由来幹細胞の投与量は２×１０５ｃｅｌｌｓ／マウスとした。スタチン非封入ナノ粒子はＰＬＧＡを用い、スタチン封入ナノ粒子は、上記シンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子を用い、それらのナノ粒子５０μｇ／ｍＬとマウス脂肪由来幹細胞とを３０分～１時間共培養してスタチン非封入ナノ粒子又はスタチン封入ナノ粒子を含むマウス脂肪由来幹細胞を得た。
　その後、５日目から８日目までは通常の水に戻し、自由飲水とした。試験開始０日目から８日目まで毎日体重測定をした。また、８日目にマウスを安楽死した上で解剖し、大腸を取り出して組織学的解析等を行った。具体的に、大腸長さの測定、Disease Activity Index（ＤＡＩ）スコアの測定、炎症性サイトカイン等の免疫制御に関わる遺伝子発現の測定を行った。
　まず、図９に上記各群の体重測定結果を示す。図９のグラフは、０日目の体重を１００％とした場合の体重の増減割合を示している。図９に示すように、各群において、ＤＳＳにより腸に炎症が生じて５日目を境に体重が同様に減少した。しかし、６日目以降、ＰＢＳを投与したControl群と比較して、スタチン非封入ナノ粒子を含むマウス脂肪由来幹細胞を投与した群（ＡｄＳＣ群）及びスタチン封入ナノ粒子を含むマウス脂肪由来幹細胞を投与した群（Ｓｉｍ－ＡｄＳＣ群）の体重の減少割合が小さくなり、特にＳｉｍ－ＡｄＳＣ群では体重の減少がほぼ見られなくなった。
　次に、図１０（ａ）に大腸の長さの測定結果を示し、図１０（ｂ）にＤＡＩスコアの測定結果を示す。
　図１０（ａ）に示すように、Ｓｉｍ－ＡｄＳＣ群、ＡｄＳＣ群、Control群の順に大腸の長さが長いことがわかる。大腸に炎症が生じると通常その長さが短くなることが知られており、従って、Ｓｉｍ－ＡｄＳＣ群、ＡｄＳＣ群、Control群の順に炎症が抑えられていることがわかる。
　また、図１０（ｂ）に示すように、ＤＡＩスコアについてもＳｉｍ－ＡｄＳＣ群、ＡｄＳＣ群、Control群の順にスコアが小さいことがわかる。ＤＡＩスコアとは、図１１に示す基準に従って、各マウスの重症度をスコア化したものであり、スコアが大きいほど重症であることを示す。従って、Ｓｉｍ－ＡｄＳＣ群、ＡｄＳＣ群、Control群の順に炎症が抑えられていることがわかる。
　次に、各群における炎症等の免疫制御に関わるサイトカインとしてＴＮＦα、ＩＬ－１７、ＩＬ－６及びＩＬ－１βの遺伝子発現について測定した結果を図１２に示す。具体的に、ここでは、各群における腸組織を採取し、それらの組織のＴＮＦα、ＩＬ－１７、ＩＬ－６及びＩＬ－１βの遺伝子発現について、マウスのそれら各遺伝子に特異的なプライマーを用いて定量的ＲＴ－ＰＣＲ法によって解析を行った。
　図１２に示すように、ＴＮＦα、ＩＬ－１７及びＩＬ－１βにおいて、Ｓｉｍ－ＡｄＳＣ群及びＡｄＳＣ群では、control群と比較してそれらの遺伝子発現量が顕著に低減した。また、ＩＬ－６においては、Ｓｉｍ－ＡｄＳＣ群が、control群及びＡｄＳＣ群と比較してその遺伝子発現量が顕著に低減した。これらの結果から、スタチン封入ナノ粒子を含む脂肪由来幹細胞によって、免疫抑制作用が生じて炎症を抑制できることが示唆される。
　次に、各群における、組織学的解析の結果を図１３に示す。具体的に、ここでは、各群における腸組織を採取し、４％パラホルムアルデヒド溶液にて固定の後に薄切標本を作製し、ＨＥ染色を行った。炎症細胞の浸潤程度により組織傷害程度のスコア化（Mattsの生検組織分類）を行い比較検討した。なお、Mattsの生検組織分類は以下の基準でスコア化するものである。
１　正常組織
２　粘膜・粘膜下層に少量の炎症性細胞浸潤
３　粘膜・粘膜下層に多量の炎症性細胞浸潤
４　クリプト膿瘍の存在と粘膜全層に多数の炎症性細胞浸潤
５　炎症性細胞浸潤を伴った粘膜組織のびらん・潰瘍・壊死。
　図１３（ａ）は、各群の大腸切片の染色写真であり、図１３（ｂ）はそれをスコア化したものである。
　図１３（ａ）及び（ｂ）に示すように、Ｓｉｍ－ＡｄＳＣ群、ＡｄＳＣ群、Control群の順に炎症が抑えられていることがわかる。
　次に、間質性肺炎マウスモデルを用いて、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子を含有する幹細胞の炎症性疾患の治療効果について検討した。その方法及び結果について以下に説明する。
　間質性肺炎マウスモデルとしてはＣ５７Ｂ６／Ｊマウスに皮下植込み式浸透圧性持続注入ポンプによってブレオマイシンを投与して間質性肺炎を発症させる周知のモデルを用いた。具体的に、まず、６～８週齢のＣ５７Ｂ６／Ｊマウスに対して、ブレオマイシンを毎日１００μｇ／日の量で２週間皮下投与することにより間質性肺炎を発症させた。また、ブレオマイシン投与開始から１週間後にＰＢＳ、スタチンが非封入のナノ粒子を含むマウス脂肪由来幹細胞、又はスタチン封入ナノ粒子を含むマウス脂肪由来幹細胞を静脈内に投与した。マウス脂肪由来幹細胞の投与量は２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／マウスとした。スタチン非封入ナノ粒子はＰＬＧＡを用い、スタチン封入ナノ粒子は、上記シンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子を用い、それらのナノ粒子１００μｇ／ｍＬとマウス脂肪由来幹細胞とを３０分～１時間共培養してスタチン非封入ナノ粒子又はスタチン封入ナノ粒子を含むマウス脂肪由来幹細胞を得た。
　その後、ブレオマイシンの投与開始から３週間後にマウスを安楽死した上で解剖し、肺を取り出して組織学的解析を行った。具体的に、ここでは、各群における肺組織を採取し、４％パラホルムアルデヒド溶液にて固定の後に薄切標本を作製し、ＨＥ染色を行った。図１４に、各群の肺切片の染色写真を示す。なお、図１４にはブレオマイシンを投与されていない正常なマウスの肺切片の染色写真も示す。
　図１４に示すように、正常なマウスの肺組織では、肺胞内に染色されない空洞部分が多く認められるが、ブレオマイシンにより間質性肺炎が生じたマウスに対しＰＢＳのみを投与したマウスの肺組織は、正常マウスと比較して炎症部分と考えられる領域が染色され、空洞部分の減少が認められる。また、スタチンが非封入のナノ粒子を含むマウス脂肪由来幹細胞を投与したマウス（ＡｄＳＣ）では、上記ＰＢＳ群と比較して染色部分が減少し、空洞領域の増大が認められる。さらに、スタチン封入ナノ粒子を含むマウス脂肪由来幹細胞を投与したマウス（Ｓｉｍ－ＡｄＳＣ）では、正常マウスと同等の程度にまでの回復が認められる。これらの結果から、スタチン封入ナノ粒子を含む脂肪由来幹細胞によって、間質性肺炎においても炎症を抑制できることが示唆される。
　次に、強皮症マウスモデルを用いて、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子を含有する幹細胞の炎症性疾患の治療効果について検討した。その方法及び結果について以下に説明する。
　強皮症マウスモデルとしてはＢＡＬＢ／ｃマウスにブレオマイシンを投与して強皮症を発症させる周知のモデルを用いた。具体的に、まず、６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに対して、ブレオマイシンを毎日１００μｇ／日の量で３週間皮下投与することにより強皮症を発症させた。また、ブレオマイシン投与開始から１週間後にＰＢＳ、スタチンが非封入のナノ粒子を含むマウス脂肪由来幹細胞（１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／マウス若しくは２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／マウス）、又はスタチン封入ナノ粒子を含むマウス脂肪由来幹細胞（１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／マウス）を静脈内に投与した。スタチン非封入ナノ粒子はＰＬＧＡを用い、スタチン封入ナノ粒子は、上記シンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子を用い、それらのナノ粒子１００μｇ／ｍＬ又は２００μｇ／ｍＬとマウス脂肪由来幹細胞とを３０分～１時間共培養してスタチン非封入ナノ粒子又はスタチン封入ナノ粒子を含むマウス脂肪由来幹細胞を得た。
　その後、ブレオマイシンの投与開始から３週間後にマウスを安楽死した上で解剖し、皮膚組織を採取して組織学的解析を行った。具体的に、ここでは、各群における皮膚組織を採取し、４％パラホルムアルデヒド溶液にて固定の後に薄切標本を作製し、ＨＥ染色を行った。図１５に、各群の皮膚切片の染色写真を示す。なお、図１５にはブレオマイシンを投与されていない正常なマウスの皮膚切片の染色写真も示す。
　図１５に示すように、正常なマウスの皮膚組織では、表皮（白色矢印）の存在が認められるが、ブレオマイシンにより強皮症が生じたマウスに対しＰＢＳのみを投与したマウスの皮膚組織は、正常マウスと比較して表皮が極めて薄くなり、真皮部分（黒色矢印）が厚くなっている。また、スタチンが非封入のナノ粒子を含むマウス脂肪由来幹細胞を投与したマウス（ＡｄＳＣ１×１０４、ＡｄＳＣ ２．５×１０５）では、上記ＰＢＳ群と比較して真皮の厚みが小さくなっており、特に幹細胞をより多く投与したＡｄＳＣ２．５×１０５では真皮の厚みがより小さくなっていることがわかる。また、スタチン封入ナノ粒子を含むマウス脂肪由来幹細胞を投与したマウス（Ｓｉｍ１００－ＡｄＳＣ１．０×１０４、Ｓｉｍ２００－ＡｄＳＣ １．０×１０４）では、上記ＰＢＳ群と比較して真皮の厚みが小さくなっており、特に２００μｇ／ｍＬのスタチンを封入したナノ粒子を用いたＳｉｍ２００－ＡｄＳＣ１．０×１０４では正常マウスの皮膚組織における真皮の厚みに近い程度まで回復していることがわかる。これらの結果から、スタチン封入ナノ粒子を含む脂肪由来幹細胞によって、強皮症の症状を改善できることが示唆される。
　次に、神経損傷マウスモデルを用いて、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子を含有する幹細胞の炎症性疾患の治療効果について検討した。その方法及び結果について以下に説明する。
　神経損傷マウスモデルとしてはＣ５７Ｂ６／Ｊマウスの左坐骨神経を鉗子で２０秒間締め付けて神経損傷を作製する周知のモデルを用いた。具体的に、まず、１０～１２週齢のＣ５７Ｂ６／Ｊマウスに対して、麻酔下で、左臀部の皮膚切開をした後、大腿部の筋肉の筋鞘を剥離して左坐骨神経を露出し、当該左坐骨神経を鉗子で２０秒間圧迫して神経損傷させた。その３日後にＰＢＳ、スタチンが非封入のナノ粒子を含むマウス脂肪由来幹細胞、又はスタチン封入ナノ粒子を含むマウス脂肪由来幹細胞を静脈内に投与した。マウス脂肪由来幹細胞の投与量は５×１０４ｃｅｌｌｓ／マウスとした。スタチン非封入ナノ粒子はＰＬＧＡを用い、スタチン封入ナノ粒子は、上記シンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子を用い、それらのナノ粒子１００μｇ／ｍＬとマウス脂肪由来幹細胞とを３０分～１時間共培養してスタチン非封入ナノ粒子又はスタチン封入ナノ粒子を含むマウス脂肪由来幹細胞を得た。
　そして、神経損傷の直前、上記投与の直前、神経損傷から１週間後、２週間後、３週間後、４週間後及び５週間後に運動機能評価を行った。運動機能は坐骨神経機能指数（Sciatic Functional Index：ＳＦＩ）を用いて評価した。ＳＦＩは、マウスの後脚の足痕の長さ（ＰＬ）、第一趾の中央から第五趾の中央までの距離（ＴＳ）、第二趾の中央から第四趾の中央までの距離（ＩＴ）を右側の正常な脚（Ｎ）と左側の神経損傷を受けた脚（Ｅ）の両方で測定し、以下の式から求めた。
SFI=-38.3×(EPL-NPL)/NPL+109.5×(ETS-NTS)/NTS+13.3×(EIT-NIT)/NIT-8.8
　各群におけるＳＦＩの測定結果を図１６のグラフに示す。図１６に示すように、ＰＢＳのみを投与したマウスと比較して、スタチンが非封入のナノ粒子を含むマウス脂肪由来幹細胞を投与したマウス（ＡｄＳＣ）では、ＳＦＩが高くなっており、運動機能が回復したことが認められる。さらに、スタチン封入ナノ粒子を含むマウス脂肪由来幹細胞を投与したマウス（Ｓｉｍ－ＡｄＳＣ）では、ＳＦＩがより高くなっており、より運動機能が回復したことが認められる。これらの結果から、スタチン封入ナノ粒子を含む脂肪由来幹細胞によって、神経損傷の症状を改善できることが示唆される。
　次に、統合失調症マウスモデルを用いて、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子を含有する幹細胞の炎症性疾患の治療効果について検討した。その方法及び結果について以下に説明する。
　統合失調症マウスモデルとしてはＣ５７Ｂ６／Ｊマウスのｓｃｈｎｕｒｒｉ－２（Ｓｈｎ－２）遺伝子をノックアウトしたマウスを用いた（ＲＩＫＥＮ　ＢＲＣ）。Ｓｈｎ－２ノックアウト（ＫＯ）マウスの脳は統合失調症患者の脳で報告されている特徴を極めて高い類似度で備えていることが知られている（K Takao et al.,Neuropsychophamacology (2013), 38, p1409-1425）。実際に、Ｓｈｎ－２ＫＯマウスが正常マウスと比較して、行動異常を示すか否かを巣作り行動で検討した。ここでは、正常マウス（ＷＴ）及びＳｈｎ－２ＫＯマウスにフェルトを与え、フェルトをかじり巣状態に敷くか否かを観察した。その結果を図１７に示す。
　図１７に示す通り、正常マウスでは、フェルトを全てかじり、それを敷いていたが、Ｓｈｎ－２ＫＯマウスではほとんどフェルトをかじることは無かった。この結果からも、Ｓｈｎ－２がノックアウトされたマウスは統合失調症モデルとして用いることができるといえる。
　そこで、上記Ｓｈｎ－２ＫＯマウスを用いて、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子を含有する幹細胞の統合失調症の治療効果について検討した。まず、上記Ｓｈｎ－２ＫＯマウスに対して、ＰＢＳ、スタチンが非封入のナノ粒子を含むマウス脂肪由来幹細胞、又はスタチン封入ナノ粒子を含むマウス脂肪由来幹細胞を静脈内に投与した。マウス脂肪由来幹細胞の投与量は１×１０４ｃｅｌｌｓ／マウスとした。スタチン非封入ナノ粒子はＰＬＧＡを用い（５０μｇ）、スタチン封入ナノ粒子は、上記シンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子（２０μｇ又は５０μｇ）を用い、それらのナノ粒子とマウス脂肪由来幹細胞とを３０分～１時間共培養してスタチン非封入ナノ粒子又はスタチン封入ナノ粒子を含むマウス脂肪由来幹細胞を得た。投与後に各マウスのケージ内にフェルトを入れ、その１週間後にフェルトの状態を観察した。また、下記表１に示すように、フェルトの状態に基づいてスコアを付けた。図１８に観察結果及びスコアを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　図１８に示すように、ＰＢＳのみを投与したマウスでは巣作り行動はほぼ見られず、統合失調症の症状が強く見られる。また、スタチンが非封入のナノ粒子を含むマウス脂肪由来幹細胞を投与したマウス（ＰＬＧＡ５０μｇ‐ＡｄＳＣ）においても、巣作り行動がわずかに見られる程度であった。一方、スタチン封入ナノ粒子を含むマウス脂肪由来幹細胞を投与したマウスにおいて、シンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子を２０μｇ用いた場合（ＳｉｍＰＬＧＡ２０μｇ‐ＡｄＳＣ）では、巣作り行動が一部見られ、症状の回復が認められる。また、シンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子を５０μｇ用いた場合（ＳｉｍＰＬＧＡ ５０μｇ‐ＡｄＳＣ）では、正常マウスに近い巣作り行動が見られ、症状の顕著な回復が認められる。これらの結果から、スタチン封入ナノ粒子を含む脂肪由来幹細胞によって、統合失調症の症状を改善できることが示唆される。
　次に、変形性関節症（osteoarthritis：ＯＡ）マウスモデルを用いて、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子を含有する幹細胞の炎症性疾患の治療効果について検討した。その方法及び結果について以下に説明する。
　ＯＡマウスモデルとしてはＢＡＬＢ／ｃマウスに対して右膝関節前十字靭帯の切断及び内側半月板の切除を行う周知のモデルを用いた。具体的には、外科的にＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（雄、１０週齢）の右膝関節における前十字靭帯を切断すると共に、内側半月板を切除し、その４日後から４日間（術後４～７日目）、当該マウスに対して回転ホイールを用いて１５０００回転程度のホイール運動負荷を与えて、ＯＡを誘導した。術後７日目に、ＰＢＳ、ヒト脂肪由来幹細胞、又はスタチン封入ナノ粒子を含むヒト脂肪由来幹細胞を、２９Ｇの注射針を用いて当該マウスの右膝内関節に局所投与した。ＰＢＳの投与量は１０μＬとした。また、ヒト脂肪由来幹細胞の投与量は１×１０４ｃｅｌｌｓ／マウスとし、溶媒として１０μＬのＰＢＳを用いた。スタチン封入ナノ粒子としては上記シンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子を用い、それらのナノ粒子２０μｇ／ｍＬとヒト脂肪由来幹細胞（１×１０４ｃｅｌｌｓ）とを３０分～１時間強培養してスタチン封入ナノ粒子を含むヒト脂肪由来幹細胞を得た。なお、各群ｎ＝３とした。
　上記投与から２週間後にマウスを安楽死した上で解剖し、右膝の関節軟骨組織を採取して組織学的解析を行った。具体的に、ここでは、各群における右膝の関節軟骨組織を採取し、４％パラホルムアルデヒド溶液による固定の後に薄切標本を作製し、サフラニンＯ染色を行った。サフラニンＯは、軟骨基質を染色する染色試薬である。図１９に、各群の関節軟骨組織切片の染色写真を示す。なお、図１９には右膝関節前十字靭帯の切断及び内側半月板の切除を受けていない正常なマウスにおける右膝の関節軟骨組織切片の染色写真も示す。
　図１９に示すように、正常なマウスの関節軟骨組織では、脛骨の骨頭部に厚い軟骨層が存在すると共に、サフラニンＯによる染色が認められる（濃い灰色部分）。これに対して、ＯＡが誘導されたマウスに対してＰＢＳを投与した群（ＰＢＳ群）では、脛骨の骨頭部の軟骨層が極めて薄くなっており、当該軟骨層においてサフラニンＯによる染色は認められない。一方、ＯＡが誘導されたマウスに対してヒト脂肪由来幹細胞を投与した群（ＡｄＳＣ群）では、ＰＢＳ群と比較して脛骨の骨頭部の軟骨層が厚く、サフラニンＯによる染色もわずかであるが認められる。また、ＯＡが誘導されたマウスに対してスタチン封入ナノ粒子を含むヒト脂肪由来幹細胞を投与した群（Ｓｔａｔｉｎ－ＡｄＳＣ群）では、上記ＡｄＳＣ群よりもさらに脛骨の骨頭部の軟骨層が厚く、サフラニンＯによる染色部分も多く認められる。
　さらに、上記ＰＢＳ群、ＡｄＳＣ群及びＳｔａｔｉｎ－ＡｄＳＣ群について、関節損傷度を病理組織学的所見でスコアリングした。なお、スコアリングの基準はOsteoarthritis and Cartilage 18 (2010) S17-S23に基づき、以下の通りに評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　上記スコアリングの基準に基づいて、各群のスコアリングを行った結果を図２０に示す。図２０に示すように、ＰＢＳ群ではスコアが高く、間接損傷度が高いが、ＡｄＳＣ群はＰＢＳ群よりもスコアが低く、さらにＳｔａｔｉｎ－ＡｄＳＣ群ではスコアがより低い結果となった。これらの結果から、スタチン封入ナノ粒子を含む脂肪由来幹細胞によって、変形性関節症の症状を改善できることが示唆される。
　次に、認知症マウスモデルを用いて、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子を含有する幹細胞の炎症性疾患の治療効果について検討した。その方法及び結果について以下に説明する。
　認知症モデルマウスとしては、理化学研究所バイオリソースセンターから得られたＣ５７ＢＬ／６－Ａｐｐ＜ｔｍ３（ＮＬ－Ｇ－Ｆ）Ｔｃｓ＞を用いた。当該モデルマウスに対して、ＰＢＳ、脂肪由来幹細胞、又はスタチン封入ナノ粒子を含む脂肪由来幹細胞を、マウスの尾静脈から緩徐に投与した。本試験では、脂肪由来幹細胞としてＣ５７ＢＬ／６マウスの皮下脂肪から得られたマウス脂肪由来幹細胞を用いた。脂肪由来幹細胞の投与量は１×１０４ｃｅｌｌｓ／マウスとし、溶媒として２００μＬのＰＢＳを用いた。スタチン封入ナノ粒子としては上記シンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子を用い、それらのナノ粒子２０μｇを１×１０４ｃｅｌｌｓのマウス脂肪由来幹細胞と３７℃で３０分培養してスタチン封入ナノ粒子を含むマウス脂肪由来幹細胞を得た。投与時の溶媒は２００μＬのＰＢＳを用いた。
　上記投与されたマウス及び正常な野生型マウスに対して、それらの記憶評価をするために周知のバーンズ迷路試験を行った。具体的に、上記投与の日を０日目として、０日目、７日目及び１４日目に記憶解析として、各マウスがバーンズ迷路テーブルの周縁部に設けられた２０個のサークルのうちの１つにのみ設けられたターゲットホールを見つけて、該ターゲットホールと連通するエスケープケージに達するまでの時間及び移動距離を測定した。また、上記測定（記憶解析）の日の前日の午前及び午後に各１回ずつ記憶訓練を行った。
　上記各マウスは、複数匹のマウスと共に１つのケージで飼育し、上記記憶訓練及び記憶解析の１時間以上前に個別ケージに分けて環境に慣らした。記憶訓練は、まず、マウスを迷路テーブルの中央に配置された白い円筒容器内に１分間静置した後、該円筒容器を迷路テーブルから取り外すと共に、マウスが嫌う超音波ブザーを鳴らした。その後３分間、マウスにターゲットホールを探させて、エスケープケージに入った時点で超音波ブザーを停止した。但し、３分経過してもマウスがエスケープケージに入らない場合は、マウスを透明な円筒容器に入れて周囲の環境を見せて記憶させながら３０秒程度の時間をかけて強制的にマウスをエスケープケージに入れた。エスケープケージに入れた後１分間はその環境に慣らした。記憶訓練は上記工程を３回繰り返した。
　記憶訓練の翌日に行う記憶解析は、まず、記憶訓練と同様に、マウスを迷路テーブルの中央に配置された白い円筒容器内に１分間静置した後、該円筒容器を迷路テーブルから取り外すと共に、マウスが嫌う周波数の超音波ブザーを鳴らし、行動追跡記録を開始した。その後、マウスがターゲットホールを探し、エスケープケージに入った時点で超音波ブザーを停止し、行動追跡記録を停止した。行動追跡記録には、行動解析システムであるLimeLiteソフト（ActiMetrics, Inc. IL, USA）を用い、超音波ブザーが鳴ってからマウスがエスケープケージに入るまでの移動距離（目標到達移動距離）と時間（目標到達時間）とを測定した。上記各マウスにおける記憶解析の結果を図２１に示す。
　図２１に示すように、０日目では、正常マウス（ＷＴ）と比較して、ＰＢＳが投与された認知症モデルマウス（ＰＢＳ）、脂肪由来幹細胞が投与された認知症モデルマウス（ＡｄＳＣ）及びスタチン封入ナノ粒子を含む脂肪由来幹細胞が投与された認知症モデルマウス（ＳｉｍＡｄＳＣ）のいずれも、エスケープケージに到達するまでの移動距離及び時間が長かった。しかし、７日目、１４日目と時間が経過するに従って、脂肪由来幹細胞又はスタチン封入ナノ粒子を含む脂肪由来幹細胞が投与された認知症モデルマウスは、ＰＢＳが投与された認知症モデルマウスと比較して、エスケープケージに到達するまでの移動距離及び時間が短くなった。特に、スタチン封入ナノ粒子を含む脂肪由来幹細胞が投与された認知症モデルマウスは、１４日目において正常マウスと同等の結果が認められた。これらの結果から、スタチン封入ナノ粒子を含む脂肪由来幹細胞によって、認知症の症状を改善できることが示唆される。
　以上の結果から、本発明に係るスタチン封入ナノ粒子は、幹細胞の機能を増強でき、この機能増強幹細胞は、炎症性疾患を有する対象に投与されることで腸等の炎症部に集積し、免疫を抑制して抗炎症作用を発揮できる。また、本発明に係る幹細胞は、取り込んだスタチンを徐放することができ、これにより、スタチン自体の抗炎症効果も得られるので、炎症性疾患の治療に有益である。

Claims (31)

  1. 　スタチンが生体吸収性ポリマーを含むナノ粒子に封入されてなるスタチン封入ナノ粒子であり、
    前記粒子は、幹細胞の機能を増強するための粒子であって、
    　前記幹細胞は、炎症性疾患の治療用の幹細胞である、
    ことを特徴とするスタチン封入ナノ粒子。
  2. 　前記生体吸収性ポリマーは、ポリ乳酸重合体（ＰＬＡ）又はポリ乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）であることを特徴とする請求項１に記載のスタチン封入ナノ粒子。
  3. 　前記幹細胞は、脂肪由来幹細胞であることを特徴とする請求項１又は２に記載のスタチン封入ナノ粒子。
  4. 　前記増強される幹細胞の機能は、遊走能又は増殖能であることを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載のスタチン封入ナノ粒子。
  5. 　前記炎症性疾患は、炎症性腸疾患であることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載のスタチン封入ナノ粒子。
  6. 　前記炎症性疾患は、間質性肺炎であることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載のスタチン封入ナノ粒子。
  7. 　前記炎症性疾患は、強皮症であることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載のスタチン封入ナノ粒子。
  8. 　前記炎症性疾患は、神経損傷であることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載のスタチン封入ナノ粒子。
  9. 　前記炎症性疾患は、統合失調症であることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載のスタチン封入ナノ粒子。
  10. 　前記炎症性疾患は、変形性関節症であることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載のスタチン封入ナノ粒子。
  11. 　前記炎症性疾患は、認知症であることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載のスタチン封入ナノ粒子。
  12. 　請求項１～４のいずれか１項に記載のスタチン封入ナノ粒子を含有する炎症性疾患の治療用機能増強幹細胞。
  13. 　脂肪由来幹細胞であることを特徴とする請求項１２に記載の機能増強幹細胞。
  14. 　前記幹細胞の増強された機能は、遊走能又は増殖能であることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の機能増強幹細胞。
  15. 　前記炎症性疾患は、炎症性腸疾患であることを特徴とする請求項１２～１４のいずれか１項に記載の機能増強幹細胞。
  16. 　前記炎症性疾患は、間質性肺炎であることを特徴とする請求項１２～１４のいずれか１項に記載の機能増強幹細胞。
  17. 　前記炎症性疾患は、強皮症であることを特徴とする請求項１２～１４のいずれか１項に記載の機能増強幹細胞。
  18. 　前記炎症性疾患は、神経損傷であることを特徴とする請求項１２～１４のいずれか１項に記載の機能増強幹細胞。
  19. 　前記炎症性疾患は、統合失調症であることを特徴とする請求項１２～１４のいずれか１項に記載の機能増強幹細胞。
  20. 　前記炎症性疾患は、変形性関節症であることを特徴とする請求項１２～１４のいずれか１項に記載の機能増強幹細胞。
  21. 　前記炎症性疾患は、認知症であることを特徴とする請求項１２～１４のいずれか１項に記載の機能増強幹細胞。
  22. 　請求項１２～１４のいずれか１項に記載の機能増強幹細胞を含むことを特徴とする炎症性疾患を治療するための動脈投与用細胞製剤。
  23. 　請求項１２～１４のいずれか１項に記載の機能増強幹細胞を含むことを特徴とする炎症性疾患を治療するための静脈投与用細胞製剤。
  24. 　請求項１２～１４のいずれか１項に記載の機能増強幹細胞を含むことを特徴とする炎症性疾患を治療するための局所投与用細胞製剤。
  25. 　前記炎症性疾患は、炎症性腸疾患であることを特徴とする請求項２２～２４のいずれか１項に記載の細胞製剤。
  26. 　前記炎症性疾患は、間質性肺炎であることを特徴とする請求項２２～２４のいずれか１項に記載の細胞製剤。
  27. 　前記炎症性疾患は、強皮症であることを特徴とする請求項２２～２４のいずれか１項に記載の細胞製剤。
  28. 　前記炎症性疾患は、神経損傷であることを特徴とする請求項２２～２４のいずれか１項に記載の細胞製剤。
  29. 　前記炎症性疾患は、統合失調症であることを特徴とする請求項２２～２４のいずれか１項に記載の細胞製剤。
  30. 　前記炎症性疾患は、変形性関節症であることを特徴とする請求項２２～２４のいずれか１項に記載の細胞製剤。
  31. 　前記炎症性疾患は、認知症であることを特徴とする請求項２２～２４のいずれか１項に記載の細胞製剤。
     

     
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