CN109152764A - 用于增强炎性疾病治疗用干细胞的功能的包封抑制素的纳米粒子制剂、以及含有其的炎性疾病治疗用功能增强干细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明提供抑制素包封在含有生物吸收性聚合物的纳米粒子中而成的包封抑制素的纳米粒子等，用于增强干细胞的功能，该干细胞是用于治疗炎性疾病的的干细胞。

Description

用于增强炎性疾病治疗用干细胞的功能的包封抑制素的纳米 粒子制剂、以及含有其的炎性疾病治疗用功能增强干细胞
技术领域
本发明涉及包封抑制素的纳米粒子，尤其涉及用于增强炎性疾病治疗用细胞的功能的包封抑制素的纳米粒子(制剂中所用的粒子、含有该粒子的制剂等)。另外，本发明还涉及含有包封抑制素的纳米粒子的炎性疾病治疗用干细胞。
背景技术
抑制素(statin)作为抑制肝脏中胆固醇生物合成的限速酶即HMG-CoA还原酶而为人所知。通过抑制素可以使血液中的胆固醇值下降，因此被用于高胆固醇血症的治疗药物。另外，临床试验表明，除了高胆固醇血症以外，抑制素因其抗炎作用而对心绞痛、心肌梗死之类的缺血性心脏病、以及动脉硬化等疾病也有效。
迄今为止，为了提高抑制素对疾病的治疗效果、降低副作用而进行了各种研究，例如专利文献1中公开了在为了促进血管新生而施用抑制素的情况下，通过将抑制素包封在纳米粒子内，并对患者局部施用该包封抑制素的纳米粒子，能够用比以往更少量的抑制素促进血管新生。
抑制素如上所述显示出各种作用，特别是由于具有抗炎作用，因此其在炎性疾病中的应用成为研究热点。例如非专利文献1中公开了一种抑制素即辛伐他汀在小鼠炎性肠病模型中显示出抗炎作用。另外，非专利文献2记载了阿托伐他汀对克罗恩病患者的抗炎效果。
另外，近年来还进行了使用具有多潜能性的干细胞治疗各种疾病的研究。干细胞通常已知胚胎干细胞(ES细胞)、骨髓源性干细胞和脂肪源性干细胞等间充质成体干细胞，此外还已知诱导多能干细胞(iPS细胞)等，用于各种研究。其中，关于处理简便的脂肪源性干细胞的研究急速发展，对各种疾病的再生医学临床试验广泛进行。另外，脂肪源性干细胞除了再生医学以外，还被报道在药物诱发性肠炎小鼠模型中显示出肠炎抑制效果(例如参照非专利文献3)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2012-21002号公报
非专利文献
非专利文献1：阿部洋介等，溃疡，37(2010)，169-173.
非专利文献2：Grip，Oet al，Br J Pharmacol.155(2008)，1085-1092.
非专利文献3：Gonzalez，MA et al.Gastroenterology 136(2009)，978-989.
发明内容
-发明所要解决的问题-
为了治疗炎性疾病，在使用例如上述非专利文献1和2所公开的抑制素时，为了能更有效地发挥抑制素的效果，考虑像例如专利文献1所公开的那样将抑制素包封于纳米粒子中，对患者施用该包封抑制素的纳米粒子。然而，虽然在专利文献1中，通过对患者局部施用包封抑制素的纳米粒子，使用比以往更少量的抑制素即可确认有效性，但是有时由于所施用的抑制素纳米粒子会被巨噬细胞吞噬而不均匀地分布在病灶中，难以获得稳定的治疗效果。
另一方面，非专利文献3公开了即使在仅使用干细胞治疗炎性疾病的情况下，也需要对患部的局部施用干细胞，从而需要大量细胞，因此不但耗费成本、时间，而且细胞施用时的副作用的出现频率也有可能增加。进而，设想自体细胞移植的情况下，在脂肪组织少、可分离的干细胞少的病例，或者干细胞功能因高龄、糖尿病等代谢疾病因素而下降的病例中，为了利用少量的干细胞获得优异的治疗效果，考虑有必要提高该干细胞的各种功能。
本发明是鉴于上述问题而完成的。本发明的创作目的在于，提高作为细胞制剂等而使用的干细胞对炎性疾病的治疗效果，并能在抑制副作用的同时提高该干细胞的功能。
-用于解决问题的方案-
为了达成上述目的，本发明人进行了深入研究，结果发现通过使干细胞中含有抑制素包封在纳米粒子内而成的包封抑制素的纳米粒子，能够增强该干细胞的功能，将抑制素高效地传递至所需患部等，在炎性疾病的治疗中显示出良好的效果，从而完成了本发明。即，本发明涉及的包封抑制素的纳米粒子特征在于，其是抑制素包封在含有生物吸收性聚合物(bioabsorbablepolymer)的纳米粒子中而成的包封抑制素的纳米粒子，是用于增强干细胞的功能的粒子，该干细胞是用于治疗炎性疾病的干细胞。
本发明涉及的包封抑制素的纳米粒子通过对干细胞进行处理(具体而言该纳米粒子掺入干细胞中)，能够增强该处理后的干细胞的功能，通过对生物体内施用该干细胞，显示出各种有效性。具体而言，若使用本发明涉及的包封抑制素的纳米粒子对干细胞进行处理，则处理后的干细胞通过吞噬作用而摄取包封抑制素的纳米粒子，摄取了包封抑制素的纳米粒子的干细胞除了迁移能力(migratory capacity)和增殖能力增强以外，免疫抑制能力也增强。因此，通过将经本发明涉及的包封抑制素的纳米粒子处理的干细胞施用于例如患有炎性疾病的患者的体内，利用干细胞增强后的免疫抑制作用和从该干细胞中缓慢释放的抑制素的抗炎作用，显示出优异的炎性疾病的治疗效果。
在本发明涉及的包封抑制素的纳米粒子中，作为生物吸收性聚合物，可以使用聚乳酸聚合物(poly lactic acid：PLA)或者聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)：PLGA)。
通过PLA和PLGA在体内水解，可将包封的抑制素释放，另外，PLA通过水解而分解成乳酸，PLGA通过水解而分解成乳酸和乙二醇，最终分别成为水和二氧化碳，对人和动物无害，因此特别优选使用PLA或PLGA作为纳米粒子材料。
优选地，本发明涉及的包封抑制素的纳米粒子用于增强作为上述干细胞的间充质干细胞、特别是脂肪源性干细胞。
脂肪源性干细胞可如下获得：采集脂肪组织，对所采集的组织进行胶原酶处理后，利用离心比重法(centrifugal specific gravity method)仅采集单核细胞，用培养板将所采集的单核细胞培养4日左右，选取并分离出粘附的细胞作为脂肪源性干细胞。另外，还可以使用Celution系统(Cytori Therapeutics，Inc.制)等简便而大量地从脂肪组织中提取、分离培养脂肪源性干细胞。脂肪源性干细胞属于间充质干细胞，还具有多潜能性，而且如上所述，由于脂肪源性干细胞能够简便而大量地采集，因此有利于用于各种疾病的再生医学。进而，脂肪源性干细胞产生和释放抗炎性细胞因子，抑制炎性细胞的活性，因此有利于炎性疾病的治疗。
另外，本发明涉及的功能增强干细胞特征在于，含有上述抑制素包封在生物相容性纳米粒子内而成的包封抑制素的纳米粒子，用于治疗炎性疾病。
这种本发明涉及的功能增强干细胞含有上述包封抑制素的纳米粒子，因此如上所述，可以利用该包封抑制素的纳米粒子来增强免疫抑制能力等细胞功能，对炎性疾病的治疗发挥优异的效果。另外，本发明涉及的功能增强细胞能够缓慢释放出抑制素，因此通过该释放出的抑制素的抗炎作用有利于炎性疾病的治疗。
由于上述理由，本发明涉及的功能增强干细胞优选为上述脂肪源性干细胞。
另外，本发明涉及的功能增强干细胞还可以与药学上可接受的溶剂和赋形剂混合而制成细胞制剂。本发明涉及的干细胞对生物体内的给药优选无需开胸等手术，还优选制成用于静脉给药或动脉给药的细胞制剂。由此，能够简便地对患者施用本发明涉及的干细胞。本发明涉及的功能增强干细胞制剂增强干细胞的功能，因此即使是静脉给药或动脉给药，也能以较少的给药量获得良好的效果。另外，本发明涉及的功能增强干细胞制剂通过动脉给药，能够使干细胞集聚在静脉给药时特别难以到达的肠等炎症部位。因此，通过动脉给药，还能够以较少的剂量使细胞均匀地分布于病灶，获得稳定的良好效果。另外，本发明涉及的功能增强干细胞制剂只要能获得一定的所需效果，则也可以局部给药。
-发明的效果-
根据本发明涉及的包封抑制素的纳米粒子和含有其的功能增强干细胞等，能够增强干细胞的功能，通过将该干细胞施用于生物体内，对炎性疾病的治疗显示出优异的效果。
附图说明
图1是示出向人脂肪源性干细胞的培养基中添加包封罗丹明红荧光色素(rhodamine red fluorescent dye)的PLA纳米粒子，使得其终浓度达到20μg/mL、50μg/mL、80μg/mL或100μg/mL，1小时后或者2小时后用激光共聚焦荧光显微镜(confocal laserfluorescence microscope)观察干细胞所得结果的照片。
图2是示出向小鼠脂肪源性干细胞的培养基中添加包封罗丹明红荧光色素的PLGA纳米粒子，使得其终浓度达到20μg/mL、50μg/mL、75μg/mL或100μg/mL，30分钟后用FACS测定干细胞中包封罗丹明红荧光色素的PLGA纳米粒子的掺入量所得结果的照片。
图3是示出向人脂肪源性干细胞的培养基中添加粒径为200nm～400nm或者400nm～600nm的包封罗丹明红荧光色素的PLGA纳米粒子，1小时后用激光共聚焦荧光显微镜观察干细胞所得结果的照片。
图4是示出以100μg/mL的浓度用包封辛伐他汀的PLA纳米粒子对人脂肪源性干细胞进行1小时处理后，测定从脂肪源性干细胞释放到培养基中的辛伐他汀量所得结果的图表。
图5是示出以50μg/mL的浓度用包封辛伐他汀的PLA纳米粒子对小鼠脂肪源性干细胞进行30分钟处理后，测定从脂肪源性干细胞释放到培养基中的辛伐他汀量所得结果的图表。
图6(a)是示出经PLA纳米粒子或包封抑制素的PLA纳米粒子处理后的人脂肪源性干细胞的迁移性的测定结果的图表，(b)是示出经包封抑制素的PLA纳米粒子处理后的人脂肪源性干细胞的增殖性的测定结果的图表。
图7是示出通过静脉给药对小鼠的大肠施用含有包封罗丹明红荧光色素的PLGA纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞，然后用激光共聚焦荧光显微镜观察小鼠的大肠所得结果的照片。
图8是示出通过动脉给药对小鼠的大肠施用含有包封罗丹明红荧光色素的PLGA纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞，然后用激光共聚焦荧光显微镜观察小鼠的大肠所得结果的照片。
图9是示出施用了磷酸缓冲液(PBS)、含有未包封抑制素的纳米粒子的脂肪源性干细胞、或者含有包封抑制素的纳米粒子的脂肪源性干细胞后，DSS肠炎模型小鼠的体重经时变化的图表。
图10(a)是示出施用了PBS、含有未包封抑制素的纳米粒子的脂肪源性干细胞、或者含有包封抑制素的纳米粒子的脂肪源性干细胞后，DSS肠炎模型小鼠的大肠长度的图表，(b)是示出施用了PBS、含有未包封抑制素的纳米粒子的脂肪源性干细胞、或者含有包封抑制素的纳米粒子的脂肪源性干细胞后，DSS肠炎模型小鼠的疾病活动指数(Disease ActivityIndex，DAI)分数的图表。
图11是用于说明DAI分数的表。
图12是示出施用了PBS、含有未包封抑制素的纳米粒子的脂肪源性干细胞、或者含有包封抑制素的纳米粒子的脂肪源性干细胞后，DSS肠炎模型小鼠中TNFα、IL-17、IL-6和IL-1β的基因表达量的图表。
图13(a)是示出施用了PBS、含有未包封抑制素的纳米粒子的脂肪源性干细胞、或者含有包封抑制素的纳米粒子的脂肪源性干细胞后，DSS肠炎模型小鼠的大肠组织学分析结果的照片，(b)是对该结果进行评分所得的图表。
图14是示出施用了PBS、含有未包封抑制素的纳米粒子的脂肪源性干细胞、或者含有包封抑制素的纳米粒子的脂肪源性干细胞后，间质性肺炎模型小鼠、以及正常小鼠的肺组织学分析结果的照片。
图15是示出施用了PBS、含有未包封抑制素的纳米粒子的脂肪源性干细胞、或者含有包封抑制素的纳米粒子的脂肪源性干细胞后，硬皮病模型小鼠和正常小鼠的皮肤组织的组织学分析结果的照片。
图16是示出施用了PBS、含有未包封抑制素的纳米粒子的脂肪源性干细胞、或者含有包封抑制素的纳米粒子的脂肪源性干细胞后，神经损伤模型小鼠的坐骨神经功能指数(SFI)的测定结果的图表。
图17是示出正常小鼠与Shn-2敲除(Shn-2KO)小鼠的筑巢行为分析结果的照片。
图18是示出施用了PBS、含有未包封抑制素的纳米粒子的脂肪源性干细胞、或者含有包封抑制素的纳米粒子的脂肪源性干细胞后，Shn-2KO小鼠的筑巢行为分析结果的照片。
图19是示出施用了PBS、人脂肪源性干细胞、或者含有包封抑制素的纳米粒子的人脂肪源性干细胞后，骨性关节炎模型小鼠、正常小鼠的关节软骨组织的组织学分析结果的照片。
图20是示出施用了PBS、人脂肪源性干细胞、或者含有包封抑制素的纳米粒子的人脂肪源性干细胞后，对骨性关节炎模型小鼠的关节损伤度的评分结果的图表。
图21是施用了PBS、小鼠脂肪源性干细胞、或者含有包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞后，痴呆症模型小鼠、以及正常小鼠的记忆分析结果。(a)是示出巴恩斯迷宫试验(Bames maze testing)中发现目标洞进入逃脱笼为止的小鼠移动距离的图表，(b)是示出进入该逃脱笼为止的时间的图表。
具体实施方式
以下，根据附图对本发明的实施方式进行说明。以下的优选实施方式的说明本质上仅是示例，并不意图限制本发明、本发明的适用方法、或者本发明的用途。
本发明涉及的包封抑制素的纳米粒子是将抑制素包封在含有聚乳酸-羟基乙酸共聚物的纳米粒子中而成的包封(封入)抑制素的纳米粒子，用于增强干细胞的功能。含有本发明涉及的包封抑制素的纳米粒子的包封抑制素的纳米粒子制剂除了上述包封抑制素的纳米粒子以外，还可以包含稳定剂、保存剂、缓冲剂、pH调整剂、赋形剂等常用于制剂的添加剂。
本发明中，抑制素包括所有3-羟基-3-甲戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂类化合物，例如可列举出：辛伐他汀、瑞舒伐他汀、匹伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀、以及美伐他汀等。如上所述，已知抑制素具有降低胆固醇的作用，而除此之外在大规模临床试验中明确了抑制素可使心血管事件的发生及发展风险降低。另外，对于来源于血管内皮细胞或来源于骨髓的血管内皮祖细胞介导的血管生成促进作用也多有报道。进而，还已知显示出抗炎作用。
本发明中，纳米粒子只要是可包封抑制素的生物吸收性聚合物则其材料没有限定，优选使用含有聚乳酸聚合物(poly lactic acid：PLA)或聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)：PLGA)的纳米粒子。PLA在体内水解而分解成乳酸，PLGA在体内水解而分解成乳酸和乙二醇，最终分别成为水和二氧化碳，因此对体内无害而优选。
本发明中，从对干细胞的掺入效率的观点出发，对包封抑制素的纳米粒子进行加工(制备)，使其在用光散射法测定时达到如下个数平均粒径的上限和下限。
·个数平均粒径的上限为小于1000nm、优选为约600nm以下(更优选为600nm以下)、进一步优选为约400nm以下(更进一步优选为400nm以下)。
·个数平均粒径的下限为约100nm以上(更优选为1O0nm以上)、进一步优选为约200nm以上(更进一步优选为200nm以上)。
例如，在用光散射法测定时，包封抑制素的纳米粒子的个数平均粒径为小于1000nm、优选为约100nm～约600nm(更优选为100nm～600nm)、进一步优选为约200nm～约400nm(更进一步优选为200nm～400nm)。
本发明中，只要是能够满足上述个数平均粒径进行加工的方法，则包封抑制素的纳米粒子可以使用任何方法进行制备，但优选使用球晶制粒法(spherical crystallizationmethod)制备。众所周知，球晶制粒法是一种可以通过控制化合物合成的最终工序中结晶的生成、生长过程来设计球状晶粒，从而直接控制其物性进行加工的方法。已知乳化溶剂扩散法(ESD法)是该球晶制粒法中的一种。
乳化溶剂扩散法使用能够溶解用于包封抑制素的上述PLA或PLGA等生物吸收性聚合物的良溶剂、以及不能溶解该聚合物的不良溶剂这两种有机溶剂来进行。首先，将PLA或PLGA等聚合物溶解于良溶剂中，向良溶剂中添加、混合抑制素溶液而不让该聚合物析出。若将所得混合液滴入搅拌下的不良溶剂中，则良溶剂急速地向不良溶剂中、且不良溶剂向良溶剂中相互扩散，因此有机溶剂相与水相的界面紊乱，良溶剂自乳化，形成亚微米尺寸的乳液滴。然后，良溶剂和不良溶剂的相互扩散进一步发展，乳液滴内的PLA或者PLGA等聚合物和抑制素的溶解度下降，其结果，生成包封有抑制素的球形晶粒的聚合物纳米粒子。
本发明中，干细胞是具有全能性、多潜能性(multipotency)或多能性(pluripotency)的细胞例如可列举出胚胎干细胞(ES细胞)、诱导多能干细胞(iPS细胞)和间充质干细胞等成体干细胞。本发明中，从更简便且大量地获得很多干细胞的观点出发，优选使用从骨髓组织、脂肪组织等中得到的间充质干细胞。其中，特别优选使用脂肪源性干细胞。已知脂肪源性干细胞已在临床上进行细胞单独给药，分化成脂肪、骨、肝脏、心脏等。脂肪源性干细胞可以从脂肪组织中获得，该脂肪组织可以通过吸脂等微创技术从皮下脂肪等中容易地获得。脂肪源性干细胞可以通过使用Celution系统(Cytori Therapeutics，Inc.制)等从上述所得的脂肪组织中提取和分离而大量采集。因此，用作本发明涉及的干细胞极为有利。
本发明涉及的包封抑制素的纳米粒子对干细胞的处理可通过例如添加到培养有该干细胞的培养基中而进行。由此，干细胞通过吞噬作用而将包封抑制素的纳米粒子摄入细胞内，因此无需使用特别的试剂等即可简便地使干细胞中含有包封抑制素的纳米粒子。
经本发明涉及的包封抑制素的纳米粒子处理后的干细胞，其迁移能力、增殖能力和免疫抑制能力特别增强，尤其是对炎性疾病的治疗效果增强。这样的本发明涉及的功能增强干细胞即使通过静脉给药或动脉给药也能以较少给药量显示出优异的效果。具体而言，如果经动脉给药施用由本发明涉及的包封抑制素的纳米粒子处理后的上述脂肪源性干细胞，则脂肪源性干细胞通过血流而到达出现炎症的脏器、例如肠，在炎症部位集聚和增殖，产生抗炎性细胞因子，并且抑制炎性细胞的活性。其结果，对炎性疾病显示出优异的治疗效果。
本发明中炎性疾病是指，以炎症为病因之一的疾病，除了肠炎、肺炎之类的以炎症为特征性症状的疾病以外，还包括肺动脉高压、痴呆症之类的炎症参与了疾病发病过程的疾病。具体而言，本发明中的炎性疾病可列举出：系统性红斑狼疮、硬皮病、特应性皮炎、类风湿关节炎、间质性肺炎、支气管哮喘、肺动脉高压、溃疡性结肠炎或克罗恩病等炎性肠病(IBD)、神经损伤、脊髓损伤、脑卒中(脑梗死或脑出血后后遗症)、肌萎缩侧索硬化症、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、精神分裂症、痴呆症、脏器移植时的排斥反应、慢性肾炎(肾硬化症)等。
另外，如上所述，脂肪源性干细胞在细胞内将掺入的包封抑制素的纳米粒子水解，从而缓慢释放出被包封的抑制素，因此在对体内施用脂肪源性干细胞的情况下，能够在施用后缓慢释放出抑制素，利用释放出的抑制素获得进一步的抗炎效果。
[实施例]
以下，示出实施例以对本发明涉及的用于增强干细胞功能的包封抑制素的纳米粒子、以及含有其的功能增强干细胞等进行详细说明。
首先，对包封抑制素的纳米粒子的制备方法进行说明。此处，特别使用辛伐他汀作为抑制素，使用含有聚乳酸聚合物(PLA)或者聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)的纳米粒子作为纳米粒子。
将PLA(重均分子量20000)50mg和辛伐他汀2.5mg溶解在丙酮2mL、乙醇0.5mL的混合液中制成聚合物溶液。将该聚合物溶液滴入室温下以500rpm搅拌的2wt％PVA溶液10mL中，得到包封辛伐他汀的PLA纳米粒子悬浮液。接着，一边继续在室温下以500rpm搅拌一边将有机溶剂(丙酮、乙醇)蒸馏除去。经过约5小时蒸馏除去溶剂后，将悬浮液在4℃下、以60000g离心分离30分钟，将沉淀物回收并再悬浮于蒸馏水中。该离心分离及再悬浮于蒸馏水中的操作共计进行3次。然后，将悬浮液冷冻干燥一夜，得到包封辛伐他汀的PLA纳米粒子。在1mg的纳米粒子中包封有24.94μg辛伐他汀。包封辛伐他汀的PLGA纳米粒子也通过同样的方法获得。
将包封辛伐他汀的PLA纳米粒子和包封辛伐他汀的PLGA纳米粒子作为包封抑制素的纳米粒子用于以下试验。
接着，为了讨论用如上所得的包封抑制素的纳米粒子对干细胞进行处理时的最适处理浓度，进行以下试验。
为了进行该试验，首先，采用利用胶原酶处理和离心比重法的公知方法从人脂肪组织中获得脂肪源性干细胞(Adipose derived Stem Cell：AdSC)，另外，从小鼠脂肪组织中获得脂肪源性细胞。该方法的细节说明如下。
首先，对从人脂肪组织中获得脂肪源性干细胞的方法进行说明。预先准备好Liberase(注册商标)RG(0.5mg/mL＝0.47WU/mL，Sigma 5401127001 50mg/vial)/HBSS(ThermoFisher 14175095)溶液、以及10×溶血溶液(NH4Cl 8.3g，NaHCO3 1.2g，0.5M EDTA溶液200μL/100mL)。将三个50mL抽吸注射器内的脂肪3(150mL)移入带喷嘴的塑料瓶(ASONE Corporation，#1-4640-03广口洗瓶1000m1)中，用等量的PBS(-)洗涤并弃去废液，重复进行4、5次。将上述Liberase(注册商标)RG溶液(50mg/vial用20mL的HBSS溶解，将半量10mL用HBSS 40mL(合计50mL)稀释后用于约150mL的脂肪组织中。)放入脂肪溶液的瓶中，轻微涡旋混合(Vortex)后用带有震动器(shaker)的恒温槽在37℃下振荡培养20分钟。然后，将20％FBS/DMEM F1250mL加入该瓶内，使酶反应停止。从瓶喷嘴将液层(脂肪的下层)一边过细胞筛(100μm，BD)一边分配回收至多个新的50mL试管中。以1200rpm(300g)×5min进行离心(有制动器)，弃去上清。以1mM EDTA/PBS 40mL/管将细胞团块(cell pellet)悬浮，边过细胞筛(40μm，BD)边移入相同数量的新50mL试管中。以1200rpm(300g)×5min进行离心(有制动器)，弃去上清。以1mM EDTA/PBS 2ml将细胞悬浮，合并至1个试管中，添加溶血溶液8mL，混和后在冷处(冰上)保存10分钟(溶血操作)。添加1mM EDTA/PBS至45mL左右，然后以1200rpm(300g)×5min进行离心，弃去上清。将细胞团块悬浮于PBS(-)或10％DMEM F12中，在5％CO2培养箱中与10％DMEM F12一起培养3、4日将粘附细胞作为脂肪源性干细胞(AdSC)用于实验中(P0)。在传代培养的情况下，以1∶3～4的比例(3000-4000/cm2的密度)进一步传代培养3、4日。
另一方面，从小鼠脂肪组织中获得脂肪源性干细胞的方法如下所示。预先用带有震动器的恒温槽在37℃下将胶原酶VIII型(2mg/mL，Sigma#C2139)/1％BSA HBSS溶液解冻。另外，将EDTA(0.5M EDTA，pH 8.0，LifeTechnologies，AM9260G)、10X DPBS，Ca(-)，Mg(-)(GIBCO，14200-166)稀释制成1mMEDTA/PBS。然后，将2、3只小鼠麻醉后用带有26～29G针的注射器(胰岛素注射器等)从上腹部取血致死。收集皮下脂肪(腹股沟部至背部)合并于3.5cm培养皿(中央滴1滴生理盐水以便取出脂肪组织)中放置。将脂肪组织载置于盖上用剪刀切成小片(20～30次左右)，然后将脂肪组织与和脂肪同体积的胶原酶溶液一起移入15mL试管中。关上盖子，将试管倒置混和后，使用带有震动器的恒温槽在37℃下培养30分钟。添加同量的10％FBS/DMEM F12培养基使酶反应停止。吸去最上部的脂肪层，然后将上清过细胞筛(40μm，BD，352340)，回收至新的50mL试管中。以1200rpm(250g)×5min进行离心(有制动器)，弃去上清。向试管中添加1mM EDTA/PBS(-)至10ml，将细胞团块悬浮。以1200rpm(250g)×5min进行离心(有制动器)，弃去上清。将细胞团块悬浮于10％FBS/DMEM F12培养基中，然后接种在培养皿中(P0)。在5％CO2培养箱中培养3、4日，将粘附细胞作为AdSC以1∶1进行传代(P1)。在5％CO2培养箱中培养4、5日，将粘附细胞作为AdSC以1∶3进行传代(P2)。在细胞密度增加至80～90％左右的时刻用于实验中。
通过上述方法得到人脂肪源性干细胞后，采用上述乳化溶剂扩散法，代替抑制素将罗丹明红荧光色素包封在PLA纳米粒子中，由此得到包封罗丹明红荧光色素的PLA纳米粒子，将该包封罗丹明红荧光色素的PLA纳米粒子添加到上述脂肪源性干细胞的培养基中，使得终浓度达到20μg/mL、50μg/mL、80μg/mL或100μg/mL。1小时后(1h)或2小时后(2h)，使用激光共聚焦荧光显微镜，对包封罗丹明红荧光色素的PLA纳米粒子的掺入进行观察。应予说明，核的染色使用DAPI按照常法进行染色。其结果示于图1。
另外，采用与上述相同的方法，在小鼠脂肪源性干细胞中掺入包封罗丹明红荧光色素的纳米粒子，通过流式细胞术(FACS)分析对其掺入进行测定。然而，当将PLGA纳米粒子用作纳米粒子，包封罗丹明红荧光色素的PLGA纳米粒子的终浓度为20μg/mL、50μg/mL、75μg/mL和100μg/mL，添加包封罗丹明红荧光色素的PLGA纳米粒子30分钟之后，使用FACS装置(BD FACSAria，BD Biosceinces)和该装置所附的分析软件进行测定和分析。其结果示于图2。
如图1所示，可知包封罗丹明红荧光色素的PLA纳米粒子在所有浓度下均掺入人脂肪源性干细胞中。然而，人脂肪源性干细胞中包封罗丹明红荧光色素的PLA纳米粒子的掺入量呈处理浓度依赖性地增大。而且还可知与处理时间为1小时的情况相比，处理时间为2小时的情况下人脂肪源性干细胞中包封辛伐他汀的PLA纳米粒子的掺入量更多。特别是，在以100μg/mL的浓度用包封罗丹明红荧光色素的PLA纳米粒子对人脂肪源性干细胞进行处理的情况下，确认了大量包封罗丹明红荧光色素的PLA纳米粒子掺入干细胞中。
另一方面，如图2所示，在小鼠脂肪源性细胞中，包封罗丹明红荧光色素的PLGA纳米粒子在所有的浓度下均掺入小鼠脂肪源性干细胞中，特别是，小鼠脂肪源性干细胞中包封罗丹明红荧光色素的PLGA纳米粒子的掺入量呈处理浓度依赖性地增大。
接着，为了讨论脂肪源性干细胞中纳米粒子的掺入是否因纳米粒子的粒径而产生差异，进行以下试验。
首先，准备具有200nm～400nm粒径的PLGA纳米粒子、以及具有400nm～600nm粒径的PLGA纳米粒子，与上述试验同样，采用上述乳化溶剂扩散法将罗丹明红荧光色素代替抑制素包封于该PLGA纳米粒子中。由此，制成上述各粒径范围的包封罗丹明红荧光色素的PLGA纳米粒子。接着，将所制备的该PLGA纳米粒子添加到人脂肪源性干细胞的培养基(10％FBS/DMEM F12)中，使得终浓度达到100μg/mL。1小时后，使用激光共聚焦荧光显微镜对包封罗丹明红荧光色素的PLGA纳米粒子的掺入进行观察。应予说明，核的染色使用DAPI按照常法进行染色。其结果示于图3。
如图3所示，可知包封罗丹明红荧光色素的PLGA纳米粒子在所有浓度下均掺入人脂肪源性干细胞中。该结果表明只要纳米粒子的粒径在200nm～600nm的范围内，即可良好地掺入脂肪源性干细胞中。应予说明，在以下各试验中，使用个数平均粒径为约300nm的纳米粒子。
接着，为了讨论掺入了包封辛伐他汀的纳米粒子的脂肪源性干细胞在此后要耗费多长时间从细胞内释放出抑制素，对释放到培养基中的抑制素的量进行测定。此处，与上述试验同样，以100μg/mL的浓度用包封辛伐他汀的PLA纳米粒子对人脂肪源性干细胞进行1小时处理后，更换培养基，测定从更换培养基起6小时后、18小时后、以及24小时、48小时、72小时、120小时、168小时和336小时后释放到培养基中的辛伐他汀的量。具体而言，该测定采用HPLC(High-pressure Liquid Chromatography)法进行。其测定结果示于图4。
另外，采用与上述同样的方法测定在小鼠脂肪源性干细胞中要耗费多长时间释放出抑制素。然而，此处以50μg/mL的浓度对包封辛伐他汀的PLGA纳米粒子进行30分钟处理。其结果示于图5。
如图4所示，在测定开始24小时后从人脂肪源性干细胞中释放出约60％左右的抑制素，释放出所有抑制素要耗费长达约336小时的时间。从此结果可知，掺入人脂肪源性干细胞中的抑制素不是从人脂肪源性干细胞中急速释放，而是缓慢释放。因此，由于能够长时间地释放抑制素，因此可以期待良好的治疗效果。
另一方面，如图5所示，在小鼠脂肪源性细胞中，与人脂肪源性干细胞的情况同样，在测定开始24小时后从小鼠脂肪源性干细胞中释放出约60％左右的抑制素，释放出所有抑制素需要耗费长达约336小时的时间。从此结果可知，掺入小鼠脂肪源性干细胞中的抑制素能够长时间地释放，因此可以期待良好的治疗效果。
接着，为了讨论由上述包封辛伐他汀的纳米粒子引起的脂肪源性干细胞的迁移能力和增殖能力之类的功能的增强，进行以下试验。
首先，使用迁移性试剂盒(Transwell(注册商标))对人脂肪源性干细胞的迁移能力进行讨论。具体而言，在Transwell板(Transwell plate)各孔的多孔膜上以5×104细胞/孔(cells/well)接种人脂肪源性干细胞，向培养基中添加未包封抑制素的PLA纳米粒子使得浓度达到20μg/mL，或者添加包封辛伐他汀的PLA纳米粒子使得浓度达到20μg/mL、50μg/mL和100μg/mL，16～18小时后对通过Transwell的膜的细胞数进行计数。其结果示于图6(a)。
如图6(a)所示，在用20μg/mL的未包封抑制素的PLA纳米粒子进行处理的情况(PLA20)、以及用20μg/mL的包封辛伐他汀的PLA纳米粒子进行处理的情况(PLA-ST20)下，与未处理的对照组(Control)相比，人脂肪源性干细胞的迁移性无变化，而在用50μg/mL包封辛伐他汀的PLA纳米粒子进行处理的情况(Statin50)下，人脂肪源性干细胞的迁移性增大。另外，在用100μg/mL包封辛伐他汀的PLA纳米粒子进行处理的情况(Statin 100)下，其结果为人脂肪源性干细胞的迁移性降低。此结果表明，虽然有最适处理浓度，但是包封辛伐他汀的PLA纳米粒子能够使人脂肪源性干细胞的迁移能力亢进。
接着，使用MTT比色(MTT assay)讨论包封辛伐他汀的纳米粒子引起的脂肪源性干细胞增殖性的提高，对其结果进行说明。
首先，将人脂肪源性干细胞以5000cells/well的细胞数接种在96孔微孔板中，添加包封辛伐他汀的PLA纳米粒子使得浓度达到20μg/mL、50μg/mL或100μg/mL，48小时后更换培养基，向各孔中添加MTT溶液，2小时后使用分光光度计测定450nm的吸光度。其结果示于图6(b)。
如图6(b)所示，在用包封辛伐他汀的纳米粒子以20μg/mL(Statin20)、50μg/mL(Statin50)和100μg/mL(Statin100)的浓度进行处理的情况下，与未处理的对照组(Control)相比，均出现人脂肪源性干细胞的增殖，特别在以50μg/mL的浓度进行处理的情况下，与对照组相比，可见增殖性的显著增加。此结果表明，包封辛伐他汀的PLA纳米粒子能够使人脂肪源性干细胞的增殖能力亢进。
如上所述，讨论包封抑制素的纳米粒子对脂肪源性干细胞的迁移能力和增殖能力等功能的增强，其结果表明，包封抑制素的纳米粒子可以增强脂肪源性干细胞的功能。通过这些功能的增强，脂肪源性干细胞有利于炎性疾病的治疗。
接着，采用小鼠IBD模型，讨论含有本发明涉及的包封抑制素的纳米粒子的干细胞对炎性疾病的治疗效果。
首先，采用使用了葡聚糖硫酸钠(DSS)的肠炎小鼠模型，讨论本发明涉及的干细胞的优选给药细胞数和给药途径。以下，对其方法和结果进行说明。
首先，对6～8周龄的C57BJ/6J小鼠持续5日给予含有2.5％DSS的水代替水以诱发肠炎，在第5日通过经静脉给药、腹腔给药或者经动脉给药施用小鼠脂肪源性干细胞。应予说明，作为小鼠脂肪源性干细胞，使用预先通过与上述同样的方法掺入了包封罗丹明红荧光色素的PLGA纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞。具体而言，经动脉给药如下进行：用6-0丝线将小鼠的左颈总动脉远端结扎，用剪刀在其正下方剪开约2mm后，插入30G的导管。给药细胞数为2×104、1×105和3×105cells。然后，从第5日到第8日，恢复给予普通水，自由饮水。在第8日对小鼠实施安乐死后，解剖，取出大肠进行组织学分析。具体而言，使用激光共聚焦荧光显微镜对包封罗丹明红荧光色素的PLGA纳米粒子的掺入进行观察。应予说明，核的染色使用DAPI按照常法进行染色。其结果示于图7和图8中。
如图7所示，在经静脉给药或腹腔给药施用小鼠脂肪源性干细胞的情况下，未观察到罗丹明染色的干细胞的存在。另一方面，如图8所示，在经动脉给药施用小鼠脂肪源性干细胞的情况下，只要给药细胞数为1×105cells以上，则可观察到干细胞的存在(图8中箭头部分)，即表明干细胞可以聚集在发生炎症的肠中。
接着，基于上述结果，讨论含有包封抑制素的纳米粒子的脂肪源性干细胞的肠炎抑制效果。以下，对其方法和结果进行说明。
首先，与上述试验同样，对6～8周龄的C57BJ/6J小鼠持续5日给予含有2.5％DSS的水代替水以诱发肠炎。在第5日经静脉给药施用PBS、含有未包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞、或者含有包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞(各组n＝6)。小鼠脂肪源性干细胞的给药量为2×105cells/小鼠。未包封抑制素的纳米粒子采用PLGA，包封抑制素的纳米粒子采用上述包封辛伐他汀的PLGA纳米粒子，将这些纳米粒子50μg/mL与小鼠脂肪源性干细胞共培养30分钟～1小时，得到含有未包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞、或者含有包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞。
然后，从第5日到第8日，恢复给予普通水，自由饮水。从试验开始第0日至第8日，每天测定体重。另外，在第8日对小鼠实施安乐死后，解剖，取出大肠进行组织学分析。具体而言，进行大肠长度的测定、Disease Activity Index(DAI)分数的测定、炎性细胞因子等与免疫调节相关的基因表达的测定。
首先，图9示出上述各组的体重测定结果。图9的图表示出了以第0日的体重为100％时体重的增减比例。如图9所示，各组中，由DSS在肠中诱发炎症，以第5日为分界线体重同样减少。然而，第6日以后，与施用PBS的对照组相比，在施用含有未包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞的组(AdSC组)和施用含有包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞的组(Sim-AdSC组)中，体重的减少比例较小，特别在Sim-AdSC组中，几乎未观察到体重的减少。
接着，图10(a)示出大肠长度的测定结果，图10(b)示出DAI分数的测定结果。
如图10(a)所示，可知大肠长度以Sim-AdSC组、AdSC组、对照组的顺序增长。已知若大肠发生炎症，则通常其长度会变短，因此可知炎症以Sim-AdSC组、AdSC组、对照组的顺序被抑制。
另外，如图10(b)所示，可知对于DAI分数，也是以Sim-AdSC组、AdSC组、对照组的顺序减小。DAI分数是指，按照图11中所示的标准，对各小鼠的重症度评分而得的分数，分数越大疾病越严重。因此，可知炎症的抑制程度以Sim-AdSC组、AdSC组、对照组的顺序增强。
接着，作为各组中与炎症等的免疫控制相关的细胞因子，对TNFot、IL-17、IL-6和IL-1β的基因表达进行测定，测定结果示于图12。具体而言，此处，采集各组中的肠组织，对于这些组织的TNFα、IL-17、IL-6和IL-1β的基因表达，将特异性引物用于小鼠的这些基因中通过定量RT-PCR法进行分析。
如图12所示，在TNFα、IL-17和IL-1β中，Sim-AdSC组和AdSC组与对照组相比，基因表达量显著降低。另外，在IL-6中，Sim-AdSC组与对照组和AdSC组相比，基因表达量显著降低。这些结果表明，含有包封抑制素的纳米粒子的脂肪源性干细胞能够产生免疫抑制作用以抑制炎症。
接着，各组的组织学分析结果示于图13中。具体而言，此处，采集各组的肠组织，用4％多聚甲醛溶液固定后制成切片标本，进行HE染色。根据炎症细胞的浸润程度对组织损伤程度进行评分(Matts活检组织分类)，并进行比较讨论。应予说明，Matts活检组织分类根据以下标准进行评分。
1正常组织
2粘膜、粘膜下层中有少量炎性细胞浸润
3粘膜、粘膜下层中有大量炎性细胞浸润
4存在隐窝脓肿(crypt abscess)，并且在所有粘膜层中有很多炎性细胞浸润
5伴随着炎性细胞浸润发生粘膜组织的糜烂、溃疡、坏死。
图13(a)是各组的大肠切片的染色照片，图13(b)是该染色照片的评分。
如图13(a)和(b)所示，炎症以Sim-AdSC组、AdSC组、对照组的顺序被抑制。
接着，采用间质性肺炎小鼠模型，讨论含有本发明涉及的包封抑制素的纳米粒子的干细胞对炎性疾病的治疗效果。以下，对其方法和结果进行说明。
作为间质性肺炎小鼠模型，采用通过皮下植入式持续输注渗透压泵(osmoticpump implanted subcutaneously for continuous infusion)对C57B6/J小鼠施用博来霉素诱发间质性肺炎的已知模型。具体而言，首先，通过对6～8周龄的C57B6/J小鼠以每日100μg/日的量经皮下给药施用博来霉素2周，以诱发间质性肺炎。另外，在开始给药博来霉素1周后，经静脉给药施用PBS、含有未包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞、或者含有包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞。小鼠脂肪源性干细胞的给药量为2.5×104cells/小鼠。未包封抑制素的纳米粒子采用PLGA，包封抑制素的纳米粒子采用上述包封辛伐他汀的PLGA纳米粒子，将这些纳米粒子100μg/mL与小鼠脂肪源性干细胞共培养30分钟～1小时，得到含有未包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞、或者含有包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞。
然后，在给药博来霉素开始3周后，对小鼠实施安乐死，然后解剖，取出肺进行组织学分析。具体而言，此处，采集各组的肺组织，用4％多聚甲醛溶液固定后制成切片标本，进行HE染色。图14中示出各组的肺切片的染色照片。应予说明，图14中还示出了未施用博来霉素的正常小鼠的肺切片的染色照片。
如图14所示，在正常小鼠的肺组织中，肺胞内观察到大量未染色的空洞部分，而由博来霉素诱发间质性肺炎后对小鼠仅施用了PBS的小鼠肺组织与正常小鼠相比，被认为是炎症部分的区域被染色，观察到空洞部分的减少。另外，施用了含有未包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞的小鼠(AdSC)与上述PBS组相比，观察到染色部分减少，空洞区域增大。进而，施用了含有包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞后，小鼠(Sim-AdSC)观察到与正常小鼠同等程度的恢复。这些结果表明，含有包封抑制素的纳米粒子的脂肪源性干细胞在间质性肺炎中也能抑制炎症。
接着，采用硬皮病小鼠模型，讨论含有本发明涉及的包封抑制素的纳米粒子的干细胞对炎性疾病的治疗效果。以下，对其方法和结果进行说明。
作为硬皮病小鼠模型，采用对BALB/c小鼠施用博来霉素诱发硬皮病的已知模型。具体而言，首先，通过对6～8周龄的BALB/c小鼠以每日100μg/日的量经皮下给药施用博来霉素3周，以诱发硬皮病。另外，在开始给药博来霉素1周后，经静脉给药施用PBS、含有未包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞(1.0×104cells/小鼠或2.5×105cells/小鼠)、或者含有包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞(1.0×104cells/小鼠)。未包封抑制素的纳米粒子采用PLGA，包封抑制素的纳米粒子采用上述包封辛伐他汀的PLGA纳米粒子，将这些纳米粒子100μg/mL或者200μg/mL与小鼠脂肪源性干细胞共培养30分钟～1小时，得到含有未包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞、或者含有包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞。
然后，在开始施用博来霉素3周后，对小鼠实施安乐死，然后解剖，取出皮肤组织进行组织学分析。具体而言，此处，采集各组的皮肤组织，用4％多聚甲醛溶液固定后制成切片标本，进行HE染色。图15中示出各组的皮肤切片的染色照片。应予说明，图15中还示出了未施用博来霉素的正常小鼠的皮肤切片的染色照片。
如图15所示，在正常小鼠的肺组织中，观察到表皮(白色箭头)的存在，而由博来霉素诱发硬皮病后对小鼠仅施用了PBS的小鼠皮肤组织与正常小鼠相比，表皮变得极薄，真皮部分(黑色箭头)增厚。而且还可知，施用了含有未包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞的小鼠(AdSC 1×104、AdSC 2.5×105)与上述PBS组相比，真皮的厚度减小，特别在施用了更多干细胞的AdSC 2.5×105中，真皮的厚度更小。另外还可知，施用了含有包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞的小鼠(Sim100-AdSC 1.0×104、Sim200-AdSC 1.0×104)与上述PBS组相比，真皮的厚度减小，特别在施用了包封有200μg/mL的抑制素的纳米粒子的Sim200-AdSC 1.0×104中，恢复至与正常小鼠的皮肤组织中的真皮厚度相近的程度。这些结果表明，含有包封抑制素的纳米粒子的脂肪源性干细胞能够改善硬皮病的症状。
接着，采用神经损伤小鼠模型，讨论含有本发明涉及的包封抑制素的纳米粒子的干细胞对炎性疾病的治疗效果。以下，对其方法和结果进行说明。
作为神经损伤小鼠模型，采用将C57B6/J小鼠的左侧坐骨神经用钳子夹紧20秒诱发神经损伤的已知模型。具体而言，首先，对于10～12周龄的C57B6/J小鼠，在麻醉下将左臀部的皮肤切开后，将大腿部肌肉的肌膜剥离以露出左侧坐骨神经，将该左侧坐骨神经用钳子压迫20秒，诱发神经损伤。3日后，经静脉给药施用PBS、含有未包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞、或者含有包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞。小鼠脂肪源性干细胞的给药量为5×104cells/小鼠。未包封抑制素的纳米粒子采用PLGA，包封抑制素的纳米粒子采用上述包封辛伐他汀的PLGA纳米粒子，将这些纳米粒子100μg/mL与小鼠脂肪源性干细胞共培养30分钟～1小时，得到含有未包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞、或者含有包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞。
然后，在神经损伤之前、上述给药之前、神经损伤1周后、2周后、3周后、4周后和5周后进行运动功能评价。运动功能采用坐骨神经功能指数(Sciatic Functional Index：SFI)进行评价。SFI如下求出：对于小鼠右侧的正常脚(N)和左侧受到神经损伤的脚(E)，分别测定后脚的足印长度(PL)、从第一脚趾中央到第五脚趾中央的距离(TS)、从第二脚趾中央到第四脚趾中央的距离(IT)，通过下式求出SFI。
SFI＝38.3×(EPL-NPL)/NPL+109.5×(ETS-NTS)/NTS+13.3×(EIT-NIT)/NIT-8.8
各组中SFI的测定结果示于图16的图表中。如图16所示，与仅施用了PBS的小鼠相比，在施用了含有未包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞后，小鼠(AdSC)中观察到SFI增大，运动功能恢复。进而，在施用了含有包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞后，小鼠(Sim-AdSC)中观察到SFI进一步增大，运动功能进一步恢复。这些结果表明，含有包封抑制素的纳米粒子的脂肪源性干细胞能够改善神经损伤的症状。
接着，采用精神分裂症小鼠模型，讨论含有本发明涉及的包封抑制素的纳米粒子的干细胞对炎性疾病的治疗效果。以下，对其方法和结果进行说明。
作为精神分裂症小鼠模型，采用敲除(knock-out，KO)C57B6/J小鼠的schnurri-2(Shn-2)基因的小鼠(RIKEN BRC)。已知Shn-2敲除(KO)小鼠的脑与精神分裂症患者的脑所报道的特征(K Takao et al.，Neuropsychophamacology(2013)，38，p1409-1425)具有极高的相似度。实际上，通过筑巢行为讨论Shn-2KO小鼠与正常小鼠相比是否表现出行动异常。此处，对正常小鼠(WT)和Shn-2KO小鼠提供毛毡，观察小鼠是否咬住毛毡并铺成巢状。其结果示于图17中。
如图17所示，正常小鼠将所有毛毡咬住并铺在巢里，而Shn-2KO小鼠几乎未咬住毛毡。从该结果可知，敲除Shn-2的小鼠可用作精神分裂症模型。
因此，使用上述Shn-2KO小鼠，讨论含有本发明涉及的包封抑制素的纳米粒子的干细胞对精神分裂症的治疗效果。首先，对于上述Shn-2KO小鼠，经静脉给药施用PBS、含有未包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞、或者含有包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞。小鼠脂肪源性干细胞的给药量为1×104cells/小鼠。未包封抑制素的纳米粒子采用PLGA(50μg)、包封抑制素的纳米粒子采用上述包封辛伐他汀的PLGA纳米粒子(20μg或50μg)，将这些纳米粒子与小鼠脂肪源性干细胞共培养30分钟～1小时，得到含有未包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞、或者含有包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞。给药后在各小鼠的笼内放入毛毡，1周后观察毛毡的状态。另外，如下表1所示，根据毛毡的状态打分。图18中示出观察结果和分数。
[表1]
分数 毛毡的状态
5 几乎未咬
4 咬住1/4
3 咬住1/3
2 咬住1/2
1 咬住全部
0 巢状态
如图18所示，仅施用了PBS的小鼠几乎未观察到筑巢行为，观察到很强的精神分裂症的症状。另外，施用了含有未包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞后，小鼠(PLGA 50μg-AdSC)也仅是略微观察到筑巢行为的程度。另一方面，施用了含有包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞后，小鼠在使用20μg包封辛伐他汀的PLGA纳米粒子的情况下(SimPLGA 20μg-AdSC)，部分观察到筑巢行为，观察到症状的恢复。另外，在使用50μg包封辛伐他汀的PLGA纳米粒子的情况下(SimPLGA 50μg-AdSC)，观察到与正常小鼠相近的筑巢行为，观察到症状的显著恢复。这些结果表明，含有包封抑制素的纳米粒子的脂肪源性干细胞能够改善精神分裂症的症状。
接着，采用骨性关节炎(osteoarthritis：OA)小鼠模型，讨论含有本发明涉及的包封抑制素的纳米粒子的干细胞对炎性疾病的治疗效果。以下，对其方法和结果进行说明。
作为OA小鼠模型，采用对BALB/c小鼠进行了右膝关节前十字韧带切断和内侧半月板切除的已知模型。具体而言，通过外科手术将BALB/c裸鼠(雄性，10周龄)右膝关节的前十字韧带切断，并将内侧半月板切除，从4日后开始，在4日内(术后第4～7日)使用转轮(rotating wheel)对该小鼠施加约15000转的转轮运动负荷以诱发OA。术后第7日，使用29G的注射针经局部给药对该小鼠的右膝内关节施用PBS、人脂肪源性干细胞、或者含有包封抑制素的纳米粒子的人脂肪源性干细胞。PBS的给药量为10μL。另外，人脂肪源性干细胞的给药量为1×104cells/小鼠，作为溶剂使用10μL的PBS。作为包封抑制素的纳米粒子，使用上述包封辛伐他汀的PLGA纳米粒子，将这些纳米粒子20μg/mL与人脂肪源性干细胞(1×104cells)共培养30分钟～1小时得到含有包封抑制素的纳米粒子的人脂肪源性干细胞。应予说明，各组n＝3。
在上述给药2周后，对小鼠实施安乐死，然后解剖，采集右膝的关节软骨组织进行组织学分析。具体而言，此处，采集各组中右膝的关节软骨组织，用4％多聚甲醛溶液固定后制成切片标本，进行番红O染色。番红O是对软骨基质进行染色的染色试剂。图19中示出各组的关节软骨组织切片的染色照片。应予说明，图19中还示出了未实施右膝关节前十字韧带切断和内侧半月板切除的正常小鼠右膝的关节软骨组织切片的染色照片。
如图19所示，在正常小鼠的关节软骨组织中，胫骨的骨头部(bone head part)存在较厚的软骨层，并且观察到番红O的染色(深灰色部分)。与之相对，在对诱发OA的小鼠施用了PBS的组(PBS组)中，胫骨的骨头部的软骨层极薄，该软骨层中未观察到番红O的染色。另一方面，对诱发OA的小鼠施用了人脂肪源性干细胞的组(AdSC组)与PBS组相比，胫骨的骨头部的软骨层较厚，虽然很轻微但也观察到番红O的染色。另外，对诱发OA的小鼠施用了含有包封抑制素的纳米粒子的人脂肪源性干细胞的组(Statin-AdSC组)与上述AdSC组相比，胫骨的骨头部的软骨层更厚，还观察到大量番红O的染色部分。
进而，对于上述PBS组、AdSC组和Statin-AdSC组，以病理组织学的观察结果对关节损伤度进行评分。应予说明，评分标准根据Osteoarthritis and Cartilage 18(2010)S17-S23，如下进行评价。
[表2]
分数 软骨层的病理学观察结果
0 正常
0.5 番红O染色区域减少(组织构建保持)
1 少量纤维蛋白沉积(软骨组织未减少)
2 龟裂(限于软骨表层+表面薄膜略为减少)
3 龟裂+糜烂(到达钙化软骨层+周长的25％以下)
4 龟裂+糜烂(到达钙化软骨层+周长的25～50％)
5 龟裂+糜烂(到达钙化软骨层+周长的50～75％)
6 龟裂+糜烂(到达钙化软骨层+周长的75％以上)
根据上述评分标准对各组进行评分的结果示于图20中。如图20所示，结果为：PBS组的分数高、关节损伤度高，而AdSC组的分数比PBS组低，Statin-AdSC组的分数更低。这些结果表明，含有包封抑制素的纳米粒子的脂肪源性干细胞能够改善骨性关节炎的症状。
接着，采用痴呆症小鼠模型，讨论含有本发明涉及的包封抑制素的纳米粒子的干细胞对炎性疾病的治疗效果。以下，对其方法和结果进行说明。
作为痴呆症模型小鼠，采用从理化学研究所生物资源中心(Riken BioResourceCenter)获得的C57BL/6-App<tm3(NL-G-F)Tcs>。对于该模型小鼠，经尾静脉给药缓慢施用PBS、脂肪源性干细胞、或者含有包封抑制素的纳米粒子的脂肪源性干细胞。在本试验中，施用从C57BL/6小鼠的皮下脂肪中获得的小鼠脂肪源性干细胞作为脂肪源性干细胞。脂肪源性干细胞的给药量为1×104cells/小鼠，作为溶剂使用200μL的PBS。作为包封抑制素的纳米粒子，使用上述包封辛伐他汀的PLGA纳米粒子将这些纳米粒子20μg与1×104cells的小鼠脂肪源性干细胞在37℃下培养30分钟，得到含有包封抑制素的纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞。给药时的溶剂采用200μL的PBS。
对于上述给药后的小鼠和正常的野生型小鼠，进行公知的巴恩斯迷宫试验以进行记忆评价。具体而言，仅在巴恩斯迷宫台(Bames maze table)周缘部所设的20个圆中的一个上设置目标洞，以上述给药日为第0日，在第0日、第7日和第14日，作为记忆分析测定各小鼠发现该目标洞并达到与该目标洞连通的逃脱笼为止的时间和移动距离。另外，在进行上述测定(记忆分析)之日的前一日的上午和下午各进行一次记忆训练。
上述各小鼠与多只小鼠一起饲养在一个笼中，在上述记忆训练和记忆分析之前1小时以上，分配至单独的笼中以适应环境。记忆训练如下进行：首先，将小鼠在配置于迷宫台中央的白色圆筒容器内静置1分钟，然后将该圆筒容器从迷宫台上取下，并且鸣响小鼠厌恶的超声波蜂鸣器。3分钟后，让小鼠探寻目标洞，在小鼠进入逃脱笼的时刻停止超声波蜂鸣器。应予说明，在经过3分钟小鼠也不进入逃脱笼的情况下，将小鼠放入透明的圆筒容器中让其观察并记住周围环境，同时耗费30秒左右的时间强制地将小鼠放入逃脱笼。将小鼠放入逃脱笼中1分钟后，使其适应环境。记忆训练将上述过程重复进行3次。
在记忆训练的翌日如下进行记忆分析：首先，与记忆训练同样，将小鼠在配置于迷宫台中央白色圆筒容器内静置1分钟，然后将该圆筒容器从迷宫台上取下，并且鸣响小鼠厌恶的频率的超声波蜂鸣器，开始记录行动轨迹。然后，小鼠探寻目标洞，在进入逃脱笼的时刻停止超声波蜂鸣器，并停止记录行动轨迹。行动轨迹记录中，使用行动分析系统LimeLitesoftware(ActiMetrics，Inc.IL，USA)，测定从超声波蜂鸣器鸣响至小鼠进入逃脱笼为止的移动距离(目标到达移动距离)和时间(目标到达时间)。上述各小鼠的记忆分析结果示于图21中。
如图21所示，在第0日，与正常小鼠(WT)相比，施用了PBS的痴呆症模型小鼠(PBS)、施用了脂肪源性干细胞的痴呆症模型小鼠(AdSC)、以及施用了含有包封抑制素的纳米粒子的脂肪源性干细胞的痴呆症模型小鼠(SimAdSC)到达逃脱笼为止的移动距离和时间均很长。但是，随着时间的推移，在第7日、第14日，施用了脂肪源性干细胞或者含有包封抑制素的纳米粒子的脂肪源性干细胞后，痴呆症模型小鼠与施用了PBS的痴呆症模型小鼠相比，到达逃脱笼为止的移动距离和时间缩短。特别是，施用了含有包封抑制素的纳米粒子的脂肪源性干细胞后，痴呆症模型小鼠在第14日观察到与正常小鼠同等的结果。这些结果表明，含有包封抑制素的纳米粒子的脂肪源性干细胞能够改善痴呆症的症状。
从以上结果可知，本发明涉及的包封抑制素的纳米粒子能够增强干细胞的功能，该功能增强干细胞通过施用于患有炎性疾病的对象，能够集聚到肠等炎症部位，抑制免疫而发挥抗炎作用。另外，本发明涉及的干细胞可以缓慢释放出掺入的抑制素，由此，还可获得抑制素本身的抗炎效果，有益于炎性疾病的治疗。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.包封抑制素的纳米粒子，其特征在于，
所述包封抑制素的纳米粒子是抑制素包封在含有生物吸收性聚合物的纳米粒子中而成的包封抑制素的纳米粒子，
所述粒子是用于增强干细胞的功能的粒子，
所述干细胞是用于治疗炎性疾病的的干细胞。
2.根据权利要求1所述的包封抑制素的纳米粒子，其特征在于，
所述生物吸收性聚合物为聚乳酸聚合物或聚乳酸-羟基乙酸共聚物。
3.根据权利要求1或2所述的包封抑制素的纳米粒子，其特征在于，
所述干细胞为脂肪源性干细胞。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的包封抑制素的纳米粒子，其特征在于，
所述增强的干细胞的功能为迁移能力或者增殖能力。
5.功能增强干细胞，其是用于治疗炎性疾病的功能增强干细胞，其特征在于，
所述功能增强干细胞含有权利要求1至4中任一项所述的包封抑制素的纳米粒子。
6.根据权利要求5所述的功能增强干细胞，其特征在于，
所述功能增强干细胞为脂肪源性干细胞。
7.根据权利要求5或6所述的功能增强干细胞，其特征在于，
所述干细胞所增强的功能为迁移能力或者增殖能力。
8.细胞制剂，其是用于治疗炎性疾病的动脉给药用细胞制剂，其特征在于，
所述细胞制剂包含权利要求5至7中任一项所述的功能增强干细胞。
9.细胞制剂，其是用于治疗炎性疾病的静脉给药用细胞制剂，其特征在于，
所述细胞制剂包含权利要求5至7中任一项所述的功能增强干细胞。
10.细胞制剂，其是用于治疗炎性疾病的局部给药用细胞制剂，其特征在于，
所述细胞制剂包含权利要求5至7中任一项所述的功能增强干细胞。

Claims (31)

1.包封抑制素的纳米粒子，其特征在于，
所述包封抑制素的纳米粒子是抑制素包封在含有生物吸收性聚合物的纳米粒子中而成的包封抑制素的纳米粒子，
所述粒子是用于增强干细胞的功能的粒子，
所述干细胞是用于治疗炎性疾病的的干细胞。
2.根据权利要求1所述的包封抑制素的纳米粒子，其特征在于，
所述生物吸收性聚合物为聚乳酸聚合物或聚乳酸-羟基乙酸共聚物。
3.根据权利要求1或2所述的包封抑制素的纳米粒子，其特征在于，
所述干细胞为脂肪源性干细胞。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的包封抑制素的纳米粒子，其特征在于，
所述增强的干细胞的功能为迁移能力或者增殖能力。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的包封抑制素的纳米粒子，其特征在于，
所述炎性疾病为炎性肠病。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的包封抑制素的纳米粒子，其特征在于，
所述炎性疾病为间质性肺炎。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的包封抑制素的纳米粒子，其特征在于，
所述炎性疾病为硬皮病。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的包封抑制素的纳米粒子，其特征在于，
所述炎性疾病为神经损伤。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的包封抑制素的纳米粒子，其特征在于，
所述炎性疾病为精神分裂症。
10.根据权利要求1至4中任一项所述的包封抑制素的纳米粒子，其特征在于，
所述炎性疾病为骨性关节炎。
11.根据权利要求1至4中任一项所述的包封抑制素的纳米粒子，其特征在于，
所述炎性疾病为痴呆症。
12.功能增强干细胞，其是用于治疗炎性疾病的功能增强干细胞，其特征在于，
所述功能增强干细胞含有权利要求1至4中任一项所述的包封抑制素的纳米粒子。
13.根据权利要求12所述的功能增强干细胞，其特征在于，
所述功能增强干细胞为脂肪源性干细胞。
14.根据权利要求12或13所述的功能增强干细胞，其特征在于，
所述干细胞所增强的功能为迁移能力或者增殖能力。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的功能增强干细胞，其特征在于，
所述炎性疾病为炎性肠病。
16.根据权利要求12至14中任一项所述的功能增强干细胞，其特征在于，
所述炎性疾病为间质性肺炎。
17.根据权利要求12至14中任一项所述的功能增强干细胞，其特征在于，
所述炎性疾病为硬皮病。
18.根据权利要求12至14中任一项所述的功能增强干细胞，其特征在于，
所述炎性疾病为神经损伤。
19.根据权利要求12至14中任一项所述的功能增强干细胞，其特征在于，
所述炎性疾病为精神分裂症。
20.根据权利要求12至14中任一项所述的功能增强干细胞，其特征在于，
所述炎性疾病为骨性关节炎。
21.根据权利要求12至14中任一项所述的功能增强干细胞，其特征在于，
所述炎性疾病为痴呆症。
22.细胞制剂，其是用于治疗炎性疾病的动脉给药用细胞制剂，其特征在于，
所述细胞制剂包含权利要求12至14中任一项所述的功能增强干细胞。
23.细胞制剂，其是用于治疗炎性疾病的静脉给药用细胞制剂，其特征在于，
所述细胞制剂包含权利要求12至14中任一项所述的功能增强干细胞。
24.细胞制剂，其是用于治疗炎性疾病的局部给药用细胞制剂，其特征在于，
所述细胞制剂包含权利要求12至14中任一项所述的功能增强干细胞。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的细胞制剂，其特征在于，
所述炎性疾病为炎性肠病。
26.根据权利要求22至24中任一项所述的细胞制剂，其特征在于，
所述炎性疾病为间质性肺炎。
27.根据权利要求22至24中任一项所述的细胞制剂，其特征在于，
所述炎性疾病为硬皮病。
28.根据权利要求22至24中任一项所述的细胞制剂，其特征在于，
所述炎性疾病为神经损伤。
29.根据权利要求22至24中任一项所述的细胞制剂，其特征在于，
所述炎性疾病为精神分裂症。
30.根据权利要求22至24中任一项所述的细胞制剂，其特征在于，
所述炎性疾病为骨性关节炎。
31.根据权利要求22至24中任一项所述的细胞制剂，其特征在于，
所述炎性疾病为痴呆症。
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