JPWO2019146612A1 - 皮膚疾患治療用組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、優れた皮膚疾患治療用組成物（医薬品、医薬部外品、化粧品等）を提供する。本発明に係る皮膚疾患治療用組成物は、幹細胞（例えば脂肪由来幹細胞）から分泌されたエクソソームを含むものであって、前記幹細胞は、薬物（例えばスタチン、エストロゲン、レチノイン酸、アスコルビン酸）が生体吸収性ポリマーを含むナノ粒子に封入されてなる薬物封入ナノ粒子を含有するものであることを特徴とする。

Description

本発明は、皮膚疾患を治療するための組成物に関する。より詳しくは、本発明は、薬物封入ナノ粒子を抱合する脂肪由来幹細胞を含む、または脂肪由来幹細胞から分泌されたエクソソームを含む、皮膚疾患治療用組成物に関する。

近年、多能性を有する幹細胞を用いて、種々の疾患を治療する研究が行われている。幹細胞は、一般に胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や、骨髄由来幹細胞及び脂肪由来幹細胞等の間葉系の体性幹細胞の他、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等が知られており、種々の研究に用いられている。例えば、体性幹細胞を用いた自家細胞移植は、炎症性疾患、虚血性疾患、アレルギー性疾患、神経変性疾患等の多数の疾患に対する治療応用に向けた基礎研究及び臨床試験が欧米諸国を初めとし、日本でも盛んに行われている。中でも、取り扱いが簡便な脂肪由来幹細胞に関する研究が急速に発展し、各種疾患に対する再生医療の臨床試験が広く行われている。また、脂肪由来幹細胞は、再生医療のみならず、薬剤誘発性腸炎マウスモデルにおいて腸炎抑制効果を示すことも報告されている（例えば非特許文献１を参照）。

上記のような脂肪由来幹細胞による疾患の治療効果を向上させるための手段として、例えば特許文献１には、スタチンが封入されたナノ粒子を脂肪由来幹細胞に取り込ませることによって、幹細胞の増殖能やサイトカイン合成能等の細胞機能を増強する方法が開示されている。

一方、脂肪由来幹細胞自体を疾患治療に用いるのではなく、脂肪由来幹細胞の培養上清や、脂肪由来幹細胞から放出されるエクソソームを疾患治療薬に用いる研究もなされている。

例えば、特許文献２には、ウマの間葉系幹細胞（脂肪由来幹細胞等）の培養上清を配合した、化粧品や皮膚疾患治療剤（抗アレルギー治療用組成物、発毛または育毛用組成物等）が開示されている。

また、エクソソームとは細胞から分泌される膜小胞であり、細胞内のタンパク質や遺伝情報（mRNA, microRNA等）を細胞外に運搬することにより、局所や全身における細胞間の情報伝達を担っている。その機能は多岐に亘り、例えば、感染性病原体や腫瘍に対する適応免疫応答の媒介、組織修復、神経伝達や病原性タンパク質の運搬等の機能を有することが報告されている。エクソソームの機能は、その由来する細胞によって異なることも示唆されている。例えば、脂肪由来幹細胞等の間葉系幹細胞由来エクソソームであれば、心筋虚血再灌流障害の軽減機能や低酸素時の肺高血圧の軽減機能を有することが報告されており、心筋前駆細胞由来エクソソームであれば、心筋のアポトーシスの抑制機能を有することが報告されている（非特許文献２〜５等を参照）。このため、各種の細胞から分泌されるエクソソームを用いることによって、様々な生理的機能をもたらしたり、様々な疾患の治療に繋げたりすることができると考えられている。

特許第６１１０５７８号公報（ＷＯ２０１６／０７６２２７号） 特許第６１５２２０５号公報（特開２０１８−２４５９５号公報）

Gonzalez, MA et al. Gastroenterology136(2009),978-989. Ruenn Chai Lai et al. Stem Cell Research (2010) 4, 214-222. Fatih arslan et al. Stem Cell Research (2013)10, 301-312. Changjin Lee et al. Circulation. 2012;126:2601-2611. Lucio Barile et al. Cardiovascular Research(2014) 103, 530-541.

上述した先行技術文献の開示にもかかわらず、現在のところ、皮膚疾患治療用組成物として十分な有効性を示すものはない。また利便性の観点からは、外用剤として利用したときにも高い有効性を示す皮膚疾患治療用組成物が望まれている。

本発明は、優れた治療効果を奏する皮膚疾患治療用組成物を提供することを課題とする。

上記の課題を解決するために、本発明者は、鋭意研究した結果、薬物がナノ粒子に封入されてなる薬物封入ナノ粒子を幹細胞に含有させると、当該幹細胞から分泌されたエクソソームには、各種の皮膚疾患の治療にとって有用な成分、すなわちナノ粒子に封入されていた薬物と血管新生因子等の幹細胞の細胞内で産生される種々の因子が豊富に含まれていること、そのようなエクソソームを有効成分として用いることにより、皮膚疾患に対して顕著に優れた治療効果を奏する、外用剤として使用できる皮膚疾患治療用組成物を調製することができることを見出して、本発明を完成した。

すなわち、本発明は一側面において下記の事項を提供する。
［項１］
幹細胞から分泌されたエクソソームを含む皮膚疾患治療用組成物であって、
前記幹細胞は、薬物が生体吸収性ポリマーを含むナノ粒子に封入されてなる薬物封入ナノ粒子を含有する幹細胞である
ことを特徴とする、皮膚疾患治療用組成物。
［項２］
前記幹細胞が脂肪由来幹細胞である、項１に記載の組成物。
［項３］
前記薬物が、皮膚疾患の治療に有効であるとともに、幹細胞が産生する皮膚疾患の治療に有効な因子の発現量を亢進する薬物である、項１または２に記載の組成物。
［項４］
前記薬物がスタチンである、項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
［項５］
前記薬物がエストロゲンである、項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
［項６］
前記薬物がビタミンＡまたはその誘導体である、項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
［項７］
前記薬物がビタミンＣまたはその誘導体である、項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
［項８］
前記皮膚疾患が脱毛症又は無毛症である、項１〜４、６および７のいずれか一項に記載の組成物。
［項９］
前記皮膚疾患が皮膚損傷又は皮膚潰瘍である、項１〜３、５および６のいずれか一項に記載の組成物。
［項１０］
経皮投与用の剤形を有する、項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
［項１１］
医薬品、医薬部外品または化粧品である、項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。

なお、上記「薬物封入ナノ粒子を含有する幹細胞」から「分泌されたエクソソーム」の性状、特に当該エクソソームの内包物の組成（成分および各成分の量）は、本明細書において後述するように、例えば、ナノ粒子に封入した薬物の種類、幹細胞中の薬物封入ナノ粒子の量（幹細胞の培地中の薬物封入ナノ粒子の濃度）、幹細胞が薬物封入ナノ粒子を含有してからエクソソームを回収するまでの時間（継代数）などによって変動し得るものであり、一概に決定できるものではない。一般的には、上記「薬物封入ナノ粒子を含有する幹細胞」から「分泌されたエクソソーム」には、皮膚疾患治療にとって有効な量の、薬物封入ナノ粒子に封入されていた薬物と、エクソソームを分泌する幹細胞が発現した因子（タンパク質、核酸等）とが内包されている。また、好ましくは、薬剤封入ナノ粒子を含有する幹細胞から分泌されたエクソソーム中の因子（タンパク質、核酸等）の量は、薬剤封入ナノ粒子を含有しない幹細胞（コントロール）から分泌されたエクソソーム中の因子の量と比較して、増加している。言い換えれば、本発明の皮膚疾患治療用組成物を製造する際の、薬剤封入ナノ粒子を含有する幹細胞から分泌されたエクソソームの使用量は、好ましくは、薬剤封入ナノ粒子を含有しない幹細胞から分泌されたエクソソームの使用量よりも、同等の治療効果を達成する上で、少なくて済む。

本発明は他の側面において、「薬物が生体吸収性ポリマーを含むナノ粒子に封入されてなる薬物封入ナノ粒子を含有する幹細胞から分泌されたエクソソームの有効量を投与する（接触させる、塗布する等）ことを含む、皮膚疾患の治療方法」を提供する。当該「皮膚疾患の治療方法」に係る発明は、前記項１等に記載した「皮膚疾患治療用組成物」に係る発明から、当業者であれば転換可能である。本明細書中で詳細に説明する「皮膚疾患治療用組成物」に関する事項は、上記「皮膚疾患の治療方法」に対しても同様に適用することができる。

本発明は他の側面において、「薬物が生体吸収性ポリマーを含むナノ粒子に封入されてなる薬物封入ナノ粒子を含有する幹細胞から分泌されたエクソソームの、皮膚疾患治療用組成物の製造における使用」を提供する。当該「使用」に係る発明は、前記項１等に記載した「皮膚疾患治療用組成物」に係る発明から、当業者であれば転換可能である。本明細書中で詳細に説明する「皮膚疾患治療用組成物」に関する事項は、上記「皮膚疾患の治療方法」に対しても同様に適用することができる。

本発明は、さらなる側面において、「薬物が生体吸収性ポリマーを含むナノ粒子に封入されてなる薬物封入ナノ粒子を幹細胞に含有させる工程、および当該幹細胞から分泌されたエクソソームを回収する工程を含む、皮膚疾患治療用組成物の製造方法」を提供する。当該「皮膚疾患治療用組成物の製造方法」に係る発明は、前記項１等に記載した「皮膚疾患治療用組成物」に係る発明に基づき、また本明細書中で詳細に説明する「皮膚疾患治療用組成物」に関する事項を参照しながら、当業者であれば導出可能である。第１実施者が「薬物が生体吸収性ポリマーを含むナノ粒子に封入されてなる薬物封入ナノ粒子を幹細胞に含有させる工程」を行い、第１実施者から当該幹細胞を受け取った第２実施者が「当該幹細胞から分泌されたエクソソームを回収する工程」を行う実施形態も、上記「皮膚疾患治療用組成物の製造方法」の一実施形態である。

本発明に係る皮膚疾患治療用組成物は従来のものに比べて顕著に優れた治療効果を奏し、脱毛症又は無毛症、皮膚損傷又は皮膚潰瘍など、様々な皮膚疾患の治療において極めて有用である。また、本発明に係る皮膚疾患治療用組成物は、経皮吸収性が高いエクソソームを有効成分として利用しているため、外用剤として（経皮投与により）使用することのできる医薬品、医薬部外品または化粧品の形態とすることができる。

ヒト脂肪由来幹細胞の培養培地中にローダミン赤色蛍光色素封入ＰＬＡナノ粒子をその最終濃度が２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬとなるように添加し、その１時間後又は２時間後に幹細胞を共焦点レーザー蛍光顕微鏡で観察した結果を示す写真である。 マウス脂肪由来幹細胞の培養培地中にローダミン赤色蛍光色素封入ＰＬＧＡナノ粒子をその最終濃度が２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬとなるように添加し、その３０分後に幹細胞におけるローダミン赤色蛍光色素封入ＰＬＧＡナノ粒子の取り込み量をＦＡＣＳで測定した結果を示す写真である。 ヒト脂肪由来幹細胞に対して１００μｇ／ｍＬの濃度でシンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子を１時間処理した後に、脂肪由来幹細胞から培地中に放出されたシンバスタチンの量を測定した結果を示すグラフである。 マウス脂肪由来幹細胞に対して５０μｇ／ｍＬの濃度でシンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子を３０分処理した後に、脂肪由来幹細胞から培地中に放出されたシンバスタチンの量を測定した結果を示すグラフである。 スタチン封入ナノ粒子で処理された脂肪由来幹細胞における血管新生因子のｍＲＮＡ発現を、定量ＰＣＲ法を用いて測定した結果を示すグラフであり、血管新生因子として（ａ）はＶＥＧＦ−Ａ、（ｂ）はＶＥＧＦ−Ｃ、（ｃ）はＦＧＦ−２のＲＮＡ発現を測定した結果を示している。 スタチン封入ナノ粒子で処理された脂肪由来幹細胞から分泌されたエクソソームの発毛及び育毛効果を示す写真である。 へアレスマウスを用いて、スタチン封入ナノ粒子で処理された脂肪由来幹細胞から分泌されたエクソソームの発毛及び育毛効果を示す写真である。 スタチン封入ナノ粒子又はエストラジオール封入ナノ粒子で処理された脂肪由来幹細胞から分泌されたエクソソームの皮膚再生効果を示す光学顕微鏡写真である。 エストラジオール封入PLGAナノ粒子を作用させた71歳女性の脂肪由来幹細胞におけるVEGF(-A)遺伝子発現を表すグラフである。 エストラジオール封入PLGAナノ粒子を作用させた71歳女性の脂肪由来幹細胞におけるHGF遺伝子発現を表すグラフである。 エストラジオール封入PLGAナノ粒子を作用させた71歳女性の脂肪由来幹細胞におけるFGF2遺伝子発現を表すグラフである。 ビタミンＣ封入PLGAナノ粒子を作用させた71歳女性の脂肪由来幹細胞におけるVEGF(-A)遺伝子発現を表すグラフである。 ビタミンＣ封入PLGAナノ粒子を作用させた71歳女性の脂肪由来幹細胞におけるHGF遺伝子発現を表すグラフである。 ビタミンＣ封入PLGAナノ粒子を作用させた71歳女性の脂肪由来幹細胞におけるFGF2遺伝子発現を表すグラフである。 レチノイン酸封入PLGAナノ粒子を作用させた71歳女性の脂肪由来幹細胞におけるVEGF(-A)遺伝子発現を表すグラフである。 レチノイン酸封入PLGAナノ粒子を作用させた71歳女性の脂肪由来幹細胞におけるHGF遺伝子発現を表すグラフである。 レチノイン酸封入PLGAナノ粒子を作用させた71歳女性の脂肪由来幹細胞におけるFGF2遺伝子発現を表すグラフである。

以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。以下の詳細な説明において、必要に応じて好ましい実施形態や図面、実施例等によって開示されている実施形態に言及するが、それらの実施形態は本質的に例示に過ぎず、本発明の技術的範囲を不必要に制限することを意図するものではない。

本発明に係る皮膚疾患治療用組成物は、薬物が生体吸収性ポリマーを含むナノ粒子に封入されてなる薬物封入ナノ粒子を含有する幹細胞（本明細書において「ナノ粒子含有幹細胞」と呼ぶことがある。）から分泌されたエクソソームを含む。

＜薬物封入ナノ粒子＞
本発明において、エクソソームを回収するための幹細胞に含有させる、ナノ粒子に封入する「薬物」は、人体に対して作用を及ぼす効能を有する、より具体的には、幹細胞から分泌されるエクソソームに内包される成分に影響し、そのエクソソームを使用したときに皮膚疾患の治療用途に関する本発明の作用効果を奏させることができる、様々な物質から選択することができる。「幹細胞から分泌されるエクソソームに内包される成分」には、エクソソームに封入されていた「薬物」と、幹細胞によって産生される種々の因子（特に皮膚疾患の治療に有効な血管新生因子等の因子）が含まれ、「薬物」は、それ自体がエクソソームの内包成分に加わることができ、好ましくはさらに幹細胞が産生する因子の発現量を亢進することができる意味で、エクソソームの内包成分に「影響する」ものである。そのような「薬物」としては、例えば、ペプチド（ペプチドホルモンなどを含む）又はその誘導体、タンパク質、核酸、多糖類、ワクチン、アジュバント、水溶性または脂溶性低分子化合物に属する化合物から選択することができ、医薬品、医薬部外品または化粧品の成分として公知になっている薬物、特に皮膚疾患の治療にとって有効な医薬品、医薬部外品または化粧品の成分として公知になっている薬物であってもよい。

本発明の好ましい一実施形態において、ナノ粒子に封入する薬物（低分子化合物）は「スタチン」である。本発明における「スタチン」は、ＨＭＧ−ＣｏＡ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−コエンザイムＡ）還元酵素阻害剤である化合物を全て包含する用語である。本発明で用いることのできるスタチンとしては、例えば、シンバスタチン、ロスバスタチン、ピタバスタチン、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチン、ロバスタチンおよびメバスタチンが挙げられる。また、スタチンは血管内皮細胞や骨髄由来の血管内皮前駆細胞に作用し、それらの細胞を介した血管新生促進作用を引き出すことについても多く報告がなされている。

本発明の好ましい一実施形態において、ナノ粒子に封入する薬物（ペプチドホルモン）は「エストロゲン」である。本発明における「エストロゲン」は、一般に卵胞ホルモン類などと呼ばれることもある、ステロイド骨格を有するすべての女性ホルモン、その代謝物、およびその化学的誘導体（ホモエストロン、ドワジノールなど）を包含する用語である。本発明で用いることのできるエストロゲンとしては、例えば、１７β―エストラジオール、エストロン、エストリオール、１７α−エチニルエストラジオール、エキリン、エキレニン、およびその代謝物が挙げられる。

本発明の好ましい一実施形態において、ナノ粒子に封入する薬物（低分子化合物）は「ビタミンＡまたはその誘導体」であり、好ましくは「レチノイン酸」である。レチノイン酸はビタミンＡ（レチノール）の誘導体であり、生理活性はビタミンＡと同様であるが、生理活性の強さはビタミンＡよりも著しく高い。レチノイン酸は、シミ、ニキビ、シワ、ケロイド等の治療（美白、皮膚再生等）のために利用できることが知られている。なお、レチノイン酸による美白作用は、メラニン色素の抑制ではなく皮膚のターンオーバーの促進によってもたらされるものと推定されている。

本発明の好ましい一実施形態において、ナノ粒子に封入する薬物（低分子化合物）は「ビタミンＣ（アスコルビン酸）またはその誘導体」である。ビタミンＣは、皮膚、腱、軟骨等の結合組織を構成するコラーゲンの合成に不可欠なビタミンであり、また、メラニン色素合成酵素であるチロシナーゼの活性阻害、すなわちメラニン色素の合成の抑制（もしくは生成されたメラニン色素の希薄化）、活性酸素の除去、血行の促進、過剰な皮脂分泌の抑制などの作用も有している。そのため、ビタミンＣは、美白（シミの予防等）と共に、皮膚の健康を維持する、創傷を治癒するなど、皮膚疾患の治療のために利用できることが知られている。ビタミンＣの誘導体には、ビタミンＣの水溶性または脂溶性を向上させるための誘導体があり、発明の作用効果を考慮して選択することができるが、例えばパルミチン酸アスコルビル、テトラヘキシルデカン酸アスコルビルなどの脂溶性ビタミンＣを利用することができる。

ナノ粒子に封入する薬物は、ビタミンＣと同様に美白剤として用いられている成分、例えば、メラニン色素の合成抑制作用を有するハイドロキノン、アルブチン、コウジ酸、トラネキサム酸、レゾルシノール、リノール酸、エラグ酸、アゼライン酸、フラーレン等；ターンオーバー促進作用を有するケミカルピーリング剤（グリコール酸、サリチル酸、乳酸、トリクロロ酢酸などを含んでいてもよい）などであってもよい。

さらに、ナノ粒子に封入する薬物は、ビタミンＢ、ビタミンＥ、その他のビタミン類であってもよい。これらのビタミン類には、皮膚を介した末梢神経傷害や末梢循環障害に効果がある。ビタミンＢ、ビタミンＥ、プラセンタおよびカモミラＥＴ（カミツレの花からスクワランで抽出して得られるエキス）を含有する組成物は、美白剤としても知られている。

本発明において、薬物は、１種類のみを用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。すなわち、エクソソームを回収するための幹細胞に含有させる薬物内包ナノ粒子は、１種類のみの薬物を封入したものであってもよいし、２種類以上の薬物を組み合わせて封入したものであってもよい。あるいは、本発明で使用するエクソソームは、単一の薬物内包ナノ粒子を含有する幹細胞から分泌されたエクソソームであってもよいし、それぞれ異なる薬物を封入した薬物内包ナノ粒子を含有する幹細胞から分泌されたエクソソームの混合物であってもよい。上記のような実施形態において、薬物の組み合わせは、例えば、スタチン、エストロゲン、ビタミンＡおよびその誘導体、ならびにビタミンＣおよびその誘導体からなる群より選ばれる２種類以上の薬物を含む組み合わせである。

本発明において、ナノ粒子の材料として用いられる「生体吸収性ポリマー」は、薬物を封入したナノ粒子を作製することができる様々な化合物から選択することができる。そのような生体吸収性ポリマーの代表例としては、ポリ乳酸重合体（poly lactic acid：ＰＬＡ）およびポリ乳酸グリコール酸共重合体（poly(lactic-co-glycolicacid)：ＰＬＧＡ）が挙げられる。ＰＬＡは体内で加水分解されて乳酸に分解され、ＰＬＧＡは体内で加水分解されて乳酸とグリコールとに分解され、それぞれ最終的に水と炭酸ガスとなるので、無害である（生体毒性が認められない）材料として好ましい。

本発明において、薬物封入ナノ粒子は、幹細胞の取り込み効率の観点から、光散乱法で測定したときの個数平均粒径が、通常１０００ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍ〜４００ｎｍ、より好ましくは２００ｎｍ〜４００ｎｍとなるよう作製される。

薬物封入ナノ粒子は、上記のような個数平均粒子径を有するものが得られる方法であれば、いかなる方法によって製造してもよいが、好ましくは球形晶析法を使用して製造する。球形晶析法は、化合物合成の最終プロセスにおける結晶の生成・成長プロセスを制御することで、球状の結晶粒子を設計し、その物性を直接制御して加工することができる方法として周知である。この球形晶析法の一つに、周知のエマルジョン溶媒拡散法（ＥＳＤ法）がある。

エマルジョン溶媒拡散法は、薬物を封入するためのＰＬＡ又はＰＬＧＡ等の生体吸収性ポリマーを溶解可能な良溶媒と、ポリマーを溶解しない貧溶媒との２種の有機溶媒を用いて行われる。まず、良溶媒中にＰＬＡ又はＰＬＧＡ等のポリマーを溶解し、このポリマーが析出しないように、薬物溶解液を良溶媒に添加し、混合する。この混合液を撹拌されている貧溶媒中に滴下すると、急速に良溶媒が貧溶媒に、また、貧溶媒は良溶媒に相互拡散するため、有機溶媒相と水相との界面が乱れ、良溶媒が自己乳化し、サブミクロンサイズのエマルジョン滴が形成される。その後、良溶媒及び貧溶媒の相互拡散がさらに進み、エマルジョン滴内のＰＬＡ又はＰＬＧＡ等のポリマー及び薬物の溶解度が低下し、その結果、薬物を包含した球形結晶粒子のポリマーナノ粒子が生成する。

＜幹細胞＞
本発明において、「幹細胞」は、自己複製能および全能性、多能性又は多分化能を有する細胞を指し、当業者が理解する様々な種類の幹細胞が包含される。幹細胞としては、例えば胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）及び間葉系幹細胞等の体性幹細胞が挙げられる。幹細胞は、典型的には所定の１種または２種以上の遺伝子またはタンパク質（いわゆるマーカー遺伝子またはマーカータンパク質）の発現が陽性または陰性であることをもって、他の細胞と区別することができる。

本発明においては、多くの幹細胞をより簡便に且つ大量に得るという観点から、骨髄組織や脂肪組織等から得られる間葉系幹細胞、特に脂肪組織から得られる間葉系幹細胞である「脂肪由来幹細胞」を用いることが好ましい。脂肪由来幹細胞は、細胞単独で投与されることは既に臨床で行われており、脂肪をはじめ、骨、肝臓、心臓等に分化することが知られている。脂肪由来幹細胞は、脂肪吸引等の低侵襲技術により得られる皮下脂肪等から、容易にかつ大量に抽出、分離することができる。例えば、採取した脂肪組織をコラゲナーゼ処理した後に、遠心比重法により単核球細胞のみを回収し、回収した単核球細胞を培養プレートで４日間程度培養し、接着した細胞を脂肪由来幹細胞として選択及び単離することができる。また、脂肪由来幹細胞は、採取した脂肪組織から、セリューションシステム（サイトリ社製）のような全自動型脂肪組織由来幹細胞抽出機器を利用して抽出及び分離することもできる。このような効率性（経済性）の観点からも、本発明に係る幹細胞として脂肪由来幹細胞を用いることは極めて有利である。

幹細胞は、採取された組織に含まれている細胞（初代培養細胞）であってもよいし、初代培養細胞を所定の回数、継代培養して得られた細胞（継代培養細胞）であってもよい。

幹細胞（を単離するための組織）のドナーは、ヒトであっても、ヒト以外の哺乳動物（マウス等）であってもよいが、本発明に係る皮膚疾患治療用組成物を使用する対象と同じ生物種であることが好ましい。特に、本発明に係る皮膚疾患治療用組成物をヒト（患者）に対して使用するための医薬品、化粧品等として製造する場合は、ドナーはヒトであることが好ましい。ドナーは、皮膚疾患治療用組成物を使用する対象と同一であっても（自家）、異なっていても（他家）よい。また、ドナーの性別や年齢は特に制限されない。

薬物封入ナノ粒子を含有する幹細胞は、例えば、幹細胞が培養されている培地中に薬物封入ナノ粒子を添加するといった、簡便な処理により調製することができる。培地中の薬物封入ナノ粒子は、特別な試薬等を用いなくとも容易に、ファゴサイトーシスにより幹細胞の細胞内に取り込まれる。培地中の薬物封入ナノ粒子の濃度、または所定の数の幹細胞に対する薬物封入ナノ粒子の重量は、用いる幹細胞の種類や状態（継代の回数等）、薬物封入ナノ粒子の性状（薬物の種類、一定量の薬物封入ナノ粒子に含まれている薬物の重量等）などに応じて、また分泌されたエクソソームを配合した組成物によって所望の皮膚疾患の治療効果が奏されるよう、適宜調節することができる。

本発明の一実施形態において、培地中の薬物封入ナノ粒子の濃度は、例えば５〜５００μｇ／ｍＬ、好ましくは１０〜２００μｇ／ｍＬ、より好ましくは２０〜１００μｇ／ｍＬである。本発明の一実施形態において、５００００個の幹細胞（代表的には脂肪由来幹細胞）あたりの培地中の薬物封入ナノ粒子の重量は、例えば５〜１０００μｇ、好ましくは１０〜５００μｇ、より好ましくは２５〜３００μｇである。薬物封入ナノ粒子への薬物の封入率（一定重量の薬物封入ナノ粒子に対する、そこに封入されている薬物の重量の比率）を上記薬物封入ナノ粒子の重量に乗じれば、薬物封入ナノ粒子の数値範囲は、封入されている薬物の数値範囲に換算することができる。

薬物封入ナノ粒子を含有する幹細胞は、遊走能、増殖能及び免疫抑制能などの機能が増強されるとともに、血管新生に関与する因子（例えば、ＦＧＦ−２などのＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）；ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−ＣなどのＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）；ＨＧＦ（幹細胞増殖因子）など）のように、皮膚疾患の治療にとって有用な因子の産生能が増強されている。本発明において用いられる、そのようにして増強された幹細胞から分泌されたエクソソームには、ナノ粒子に封入されていた薬物とともに、幹細胞によって産生される種々の因子、特に皮膚疾患の治療にとって有用な血管新生因子が内包されている。なお、生体吸収性ポリマーからなるナノ粒子は、通常は細胞内で分解されるため、細胞外に分泌されるエクソソームには内包されていない。

エクソソームは、例えば、薬物封入ナノ粒子が添加された培地中で幹細胞を所定の期間培養し、必要に応じて所定の回数継代培養した後、培地から公知の方法を用いて回収することができる。薬物封入ナノ粒子が添加された培地中での幹細胞の培養期間は適地調節することができるが、通常は４〜５日間程度である。また、薬物封入ナノ粒子が添加された培地中で幹細胞を培養したときの培地から回収されるエクソソームよりも、その幹細胞を（薬物封入ナノ粒子が添加されていない通常の培地中で）もう１代、もう２代、またはそれ以上、継代培養したときの培地から回収されるエクソソームの方が、幹細胞によって産生された種々の因子（血管新生因子等）および／またはナノ粒子に封入されていた薬物を高濃度で含む場合がある。目的とするエクソソームがそのような性質のものであるときは、必要な回数、継代培養を行った後に、エクソソームを回収することが好ましい。エクソソームの回収は、例えば遠心分離など、公知の手段を用いて行うことができる。

＜皮膚疾患治療用組成物＞
本発明において「皮膚疾患」とは、皮膚における異常や損傷を生じる疾患、または皮膚に生じた異常や損傷等の症状、状態等をいい、皮膚そのものの異常や損傷に係るもののみならず、皮膚における毛髪に関する異常等も含む。そのような皮膚疾患（症状、状態等）としては、例えば、重度熱傷等による皮膚損傷、褥瘡等の難治性皮膚潰瘍、放射線潰瘍、円形脱毛症や抗がん剤の副作用による脱毛等の脱毛症、及び無毛症等が挙げられる。なお、上記皮膚や毛髪の異常や損傷（症状、状態等）には、老化によるものも含まれる。

本発明において「治療」とは、皮膚疾患（疾患自体または疾患に伴う症状、状態等）に対して、完全にまたは部分的に治癒すること、軽減もしくは改善すること、進行を減速させること、発生を遅延させるもしくは予防すること、発生のリスクを低減することなどの効果、またはそれらの組み合わせを包含する。上記のような広範な概念を包含する観点から、「治療」〔therapeutical treatment〕という用語は、狭義の治癒〔cure〕等と同義と解釈すべきではなく、「処置」〔treatment〕という用語に置き換えることもできる。

スタチンは、それ自体が血管新生を促す効果を有すると共に、幹細胞に作用して種々の機能を増強し、特に血管新生因子の生成能を向上させることができる。したがって、スタチン封入ナノ粒子を含有する幹細胞から分泌されるエクソソームには、スタチン自体を含めて、血管新生を促進する因子及び物質を豊富に含ませることができる。そのようなエクソソームの有効量を配合することにより、脱毛症、無毛症、その他の血管新生が治療上有効である疾患に対する効果に優れた皮膚疾患治療用組成物を調製できる。

また、エストロゲンは、繊維芽細胞からコラーゲンの産生を促したり、血管新生を促進する効果を有する。したがって、エストロゲン封入ナノ粒子を含有する幹細胞から分泌されるエクソソームには、エストロゲン自体を含めて、血管新生や真皮の再生を促すことができる因子及び物質を豊富に内包させることができる。そのようなエクソソームの有効量を配合することにより、皮膚損傷、皮膚潰瘍、その他の血管新生や真皮の再生が治療上有効である疾患に対する効果に優れた皮膚疾患治療用組成物を調製できる。

他にも、ビタミンＡまたはその誘導体（レチノイン酸等）や、ビタミンＣまたはその誘導体（パルミチン酸アスコルビル等）を封入したナノ粒子を幹細胞に含有させた場合にも、分泌されるエクソソームには、それらの化合物とともに、血管新生および／または真皮再生を促進する作用を有する因子等が豊富に内包されており、そのエクソソームを使用することで上述したスタチンおよび／またはエストロゲンと同様の疾患に対する効果に優れた皮膚疾患治療用組成物を調製することができる。

本発明の一実施形態において、皮膚疾患として脱毛症または無毛症を治療するための組成物に関して、薬剤封入ナノ粒子に封入する薬物は、スタチン、ビタミンＡおよびその誘導体、ならびにビタミンＣおよびその誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種類の薬物を含む。本発明の一実施形態において、皮膚疾患として皮膚損傷または皮膚潰瘍を治療するための組成物に関して、薬剤封入ナノ粒子に封入する薬物は、エストロゲン、ならびにビタミンＡおよびその誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種類の薬物を含む。

本発明に係る皮膚疾患治療用組成物は、各国の法制度に従って、医薬品、化粧品、またはそれらの中間的な位置づけである医薬部外品（薬用化粧品）などの分類に従った、また種々の皮膚疾患を治療対象として標榜した、各種の組成物として製造することができる。（薬用）化粧品としての皮膚疾患治療用組成物は、例えば、加齢による皮膚の老化を予防することなど、いわゆるアンチエイジングを目的とした製品としてもよい。

本発明に係る皮膚疾患治療用組成物の剤形または投与経路は適宜選択することができるが、患部の皮膚に直接的に塗布する外用剤、言い換えれば経皮投与で用いられる剤形とすることが好適である。皮膚疾患治療用組成物を外用剤（経皮投与用）とすることにより、エクソソームに内包されている各種の成分を患部周囲に局所的に作用させることができる、すなわち比較的低い濃度で治療効果を発揮させることができるため、当該成分を高濃度で含有する全身投与用の剤形とした場合に懸念される副作用を回避することができる。しかしながら、そのような問題がなければ、本発明に係る皮膚疾患治療用組成物を、例えば注射剤（静脈内投与用）として製造することも可能である。

なお、本出願の優先権書類に記載されている皮膚疾患治療用の「医薬組成物」〔a pharmaceutical composition〕は、上記のように、医薬品〔a drug〕、医薬部外品〔a quasi-drug〕、化粧品〔a cosmetic〕などとして製造することができる、本発明の皮膚疾患治療用の「組成物」〔a composition〕に相当する概念である。

皮膚外用剤の剤形としては、例えば、液剤、スプレー剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤などが挙げられる。また、皮膚外用剤が（薬用）化粧品である場合は、例えば、化粧水、クリーム、乳液、美容液、洗顔料などの基礎化粧品；化粧下地などのメイクアップ化粧品；シャンプー、コンディショナー、整髪料などのヘアケア製品、美白剤、脱毛剤などのその他の化粧料が挙げられる。

本発明に係る皮膚疾患治療用組成物は、その分類（医薬品、医薬部外品、化粧品等）や剤形に応じて、薬物封入ナノ粒子を含有する幹細胞（ナノ粒子含有幹細胞）から分泌されたエクソソームと、それ以外の成分を含むことができる。皮膚疾患治療用組成物中のエクソソームの含有量は、用いるエクソソームの性状（特に、エクソソームに内包されている成分の種類や濃度）などを考慮しながら、医薬品、医薬部外品または化粧品などとして期待される効果を奏するのに有効な量であればよく、当業者であれば、一般的に行われているような試験を通じて適切に調節することができる。

エクソソーム以外の成分としては、例えば、安定化剤、保存剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、賦形剤など、医薬品、医薬部外品、化粧品等の製造に一般的に用いられる添加剤（好ましくは外用剤（経皮投与用組成物）の製造に用いられている添加剤）のが挙げられる。そのようなエクソソーム以外の成分の含有量も、当業者であれば適宜調節することができる。

本発明に係る皮膚疾患治療用組成物は、薬物が生体吸収性ポリマーを含むナノ粒子に封入されてなる薬物封入ナノ粒子を幹細胞に含有させる工程、および当該幹細胞から分泌されたエクソソームを回収する工程を含む製造方法によって製造することができる。皮膚疾患治療用組成物の製造方法に関する一般的な事項、例えば上記以外の工程や、各工程に用いられる機器、製造条件等は、公知のエクソソームを含有する皮膚疾患またはその他の治療用組成物の製造方法に準じたものとすることができる。

以下に、本発明で用いられる薬物封入ナノ粒子、及びそれを含有する幹細胞の調製や、当該ナノ粒子含有幹細胞から分泌されたエクソソームを配合した皮膚疾患治療用組成物の製造および治療効果などを詳細に説明するための実施例を示す。

［作製例１］スタチン（シンバスタチン）封入ナノ粒子の作製
薬物としてスタチン（シンバスタチン）を用い、ナノ粒子の材料としてポリ乳酸重合体（ＰＬＡ）又はポリ乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）を用いた、スタチン封入ナノ粒子を以下の手順で作製した。

ＰＬＡ（重量平均分子量10000）５０ｍｇおよびシンバスタチン１０ｍｇを、アセトン２ｍＬおよびエタノール０．５ｍＬの混合液に溶解してポリマー溶液とした。得られたポリマー溶液を、室温、５００ｒｐｍで攪拌されている２ｗｔ％ＰＶＡ溶液２５ｍＬ中に滴下し、シンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子懸濁液を得た。続いて室温、５００ｒｐｍで約１６時間（１６〜２４時間の間）、攪拌を続けながら、有機溶媒（アセトン、エタノール）を留去した。溶媒留去後、懸濁液を４℃、６００００ｇで３０分間遠心分離し、沈殿物を回収して蒸留水に再懸濁させた。この遠心分離と蒸留水への再懸濁の操作は合計３回行った。その後、懸濁液を一晩凍結乾燥し、シンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子を得た。シンバスタチンは、１ｍｇのＰＬＡナノ粒子中に２４．９４μｇ封入された。

また、ナノ粒子の材料としてＰＬＡの代わりに同量のＰＬＧＡ（重量平均分子量6500）を用い、それ以外は上記のシンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子と同様の作製方法により、シンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子も作製した。

［作製例２］エストロゲン（エストラジオール：Ｅ２）封入ナノ粒子の作製
薬物としてシンバスタチン１０ｍｇの代わりにエストラジオール（Ｅ２）１０ｍｇを用い、それ以外は作製例１のシンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子と同様の作製方法により、エストラジオール封入ＰＬＧＡナノ粒子を作製した。

［作製例３］ビタミンＣ封入ナノ粒子の作製
薬物としてシンバスタチン１０ｍｇの代わりにビタミンＣ（パルミチン酸アスコルビル）１０ｍｇを用い、それ以外は作製例１のシンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子と同様の作製方法により、ビタミンＣ封入ＰＬＧＡナノ粒子を作製した。

［作製例４］レチノイン酸封入ナノ粒子の作製
薬物としてシンバスタチン１０ｍｇの代わりにレチノイン酸１０ｍｇを用い、それ以外は作製例１のシンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子と同様の作製方法により、レチノイン酸封入ＰＬＧＡナノ粒子を作製した。

［作製例５］ローダミン封入ナノ粒子の作製
模擬薬物としてシンバスタチン１０ｍｇの代わりにローダミン（赤色蛍光色素）１０ｍｇを用い、それ以外は作製例１のシンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子およびシンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子と同様の作製方法により、ローダミン封入ＰＬＡナノ粒子およびローダミン封入ＰＬＧＡナノ粒子を作製した。

［参考例１］ローダミン封入ＰＬＡナノ粒子を用いた脂肪由来幹細胞の処理
後記参考例２（スタチン（シンバスタチン）封入ナノ粒子を用いた脂肪由来幹細胞の処理）の予備試験として、脂肪由来幹細胞を薬物（スタチン）封入ナノ粒子を処理する際の最適な処理濃度を検討するために、模擬薬物としてローダミンを封入した、作製例５により得られたローダミン封入ナノ粒子を用いて、以下の試験を行った。

当該試験を行うために、まず、コラゲナーゼ処理及び遠心比重法を利用した周知の方法を用いて、具体的には以下の手順により、ヒト脂肪組織およびマウス脂肪組織のそれぞれから脂肪由来幹細胞（Adipose derived Stem Cell：ＡｄＳＣ）を得た。

（ヒト脂肪組織からの脂肪由来幹細胞の単離）
予め、LiberaseTM RG（0.5mg/mL=0.47WU/mL, Sigma5401127001 50mg/vial）/ＨＢＳＳ（ThermoFisher14175095）溶液、及び１０×溶血溶液（NH₄Cl 8.3g, NaHCO₃1.2g, 0.5M EDTA溶液 200μL/100mL）を準備した。５０ｍＬ吸引注射器内の脂肪３本（１５０ｍＬ、６５歳女性より採取）をノズル付きプラスチックボトル（アズワン#1-4640-03 広口洗浄瓶 1000ml）に移し、等量のＰＢＳ（−）で洗浄・廃液を４、５回繰り返した。上記Liberase TM RG溶液（50mg/vialを20mLのHBSSで溶解し、半量10mLをHBSS 40mL（合計50mL）で希釈したのちに約１５０ｍＬの脂肪組織に使用した。）を脂肪溶液のボトルに入れ、軽くVortexしてからシェーカー付恒温槽を用いて３７℃で２０分間振盪インキュベーションした。その後、20%FBS/DMEM F12 ５０ｍＬを該ボトル内に加えて、酵素反応を停止させた。ボトルのノズルから液層（脂肪の下層）をセルストレーナー（100μm, BD）に通しながら複数の新しい５０ｍＬチューブに分けて回収した。1200rpm (300g)×5minで遠心（ブレーキ有り）し、上清を捨てた。1mM EDTA/PBS 40mL/チューブで細胞ペレットを懸濁し、セルストレーナー（40μm, BD）に通しながら同数の新しい５０ｍＬチューブに移した。1200rpm(300g)×5minで遠心（ブレーキ有り）し、上清を捨てた。1mMEDTA/PBS 2mlで細胞を懸濁し１本のチューブにまとめ、溶血溶液８ｍＬを加えて混和後１０分間冷所（OnIce）保存した（溶血操作）。1mM EDTA/PBSを４５ｍＬ付近まで加えた後、1200rpm (300g)×5minで遠心し上清を捨てた。細胞ペレットをＰＢＳ（−）または10%DMEM F12で懸濁し、５％ＣＯ_２インキュベーターで10%DMEMF12とともに３、４日間培養し、接着細胞を脂肪由来幹細胞（ＡｄＳＣ）として実験に用いた（P0）。継代培養する場合は、１：３〜４の割合（3000-4000/cm²の密度）でさらに３、４日間継代培養した。

（マウス脂肪組織からの脂肪由来幹細胞の単離）
予め、コラゲナーゼVIII型（２mg/mL, Sigma ＃C2139）/1%BSA HBSS溶液をシェーカー付恒温槽３７℃で解凍した。また、1mMEDTA/PBSは、EDTA（0.5MEDTA, pH 8.0, LifeTechnologies, AM9260G）、10X DPBS,Ca(-), Mg(-)（GIBCO, 14200-166）を希釈して作製した。その後、２、３匹のマウスを麻酔の後に心窩部より２６〜２９Ｇ針付シリンジ（インスリンシリンジなど）で脱血死させた。皮下脂肪（鼠径部〜背部）を採取し３．５ｃｍ培養皿（生理食塩水を中央に１滴滴下して脂肪組織が取り出しやすいようにおく）にまとめて置いた。脂肪組織を蓋の上に載せたままハサミで小片（２０〜３０回程度）になるようにカットした後、脂肪組織を脂肪と同じ体積のコラゲナーゼ溶液とともに１５ｍＬチューブに入れた。キャップを閉め、チューブを転倒混和の後にシェーカー付恒温槽を用いて３７℃で３０分間インキュベーションした。10%FBS/DMEM F12培地を同量加えて酵素反応を停止させた。最上部の脂肪層を吸引除去した後に、上清をセルストレーナー（40μm, BD, 352340）に通して新しい５０ｍＬチューブに回収した。1200rpm(250g)×5minで遠心（ブレーキ有り）し、上清を捨てた。1mM EDTA/PBS（-）を１０ｍｌまでチューブに加えて細胞ペレットを懸濁した。1200rpm(250g)×5minで遠心（ブレーキ有り）し、上清を捨てた。細胞ペレットを10%FBS/DMEM F12培地で懸濁してから培養皿に播種した（P0）。５％ＣＯ２インキュベーターで３、４日間培養し、接着細胞をＡｄＳＣとして１：１で継代（Ｐ１）した。５％ＣＯ_２インキュベーターで４、５日間培養し、接着細胞をＡｄＳＣとして１：３で継代（Ｐ２）した。８０〜９０％程度まで細胞密度が増加した時点で実験に用いた。

（ローダミン封入ナノ粒子の取り込み）
上記方法により得られたヒト脂肪由来幹細胞の培地に、作製例５により得られたローダミン封入ＰＬＡナノ粒子を、その最終濃度が２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬとなるように添加した。添加から１時間後（１ｈ）又は２時間後（２ｈ）に、ローダミン封入ＰＬＡナノ粒子の取り込みについて共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて観察した。なお、核の染色はＤＡＰＩを用いて常法で染色した。その結果を図１に示す。

一方、上記方法により得られたマウス脂肪由来幹細胞の培地に、作製例５により得られたローダミン封入ＰＬＧＡナノ粒子を、その最終濃度が２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬとなるように添加した。添加から３０分後にＦＡＣＳ装置（BD FACSAria, BD Biosceinces）及び該装置に付属の解析ソフトを用いて、フローサイトメトリー解析をした。その結果を図２に示す。

図１に示すように、ローダミン封入ＰＬＡナノ粒子は、いずれの濃度であってもヒト脂肪由来幹細胞に取り込まれたことがわかる。但し、ヒト脂肪由来幹細胞のローダミン封入ＰＬＡナノ粒子の取り込み量は処理濃度依存的に増大しており、特に１００μｇ／ｍＬの濃度において多量のローダミン封入ＰＬＡナノ粒子がヒト脂肪由来幹細胞に取り込まれているのが確認された。また、処理時間が１時間の場合よりも２時間の場合の方が、ヒト脂肪由来幹細胞のローダミン封入ＰＬＡナノ粒子の取り込み量が多いこともわかる。

同様に、図２に示すように、ローダミン封入ＰＬＧＡナノ粒子は、いずれの濃度であってもマウス脂肪由来幹細胞に取り込まれるが、その取り込み量は処理濃度依存的に増大することが分かる。

［参考例２］スタチン（シンバスタチン）封入ナノ粒子を用いた脂肪由来幹細胞の処理

（脂肪由来幹細胞から培地中へのスタチンの放出）
スタチン（シンバスタチン）封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞から、シンバスタチンがどのように放出されるのかを検討するために、培地中に放出されたシンバスタチンの量を経時的に測定した。具体的な手順は次の通りである。参考例１と同様に、ヒト脂肪由来幹細胞の培地に、１００μｇ／ｍＬの濃度でシンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子を添加して１時間培養した。その後、培地を交換し、培地交換から６時間後、１８時間後、２４時間、４８時間、７２時間、１２０時間、１６８時間及び３３６時間後に、シンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子を含有するヒト脂肪由来幹細胞から培地中に放出されたシンバスタチンの量をＨＰＬＣ（High-pressure Liquid Chromatography）法により測定した。結果を図３に示す。

また、マウス脂肪由来幹細胞の培地に、５０μｇ／ｍＬの濃度でシンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子を添加して３０分間培養し、それ以外は上記と同様の方法で、シンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子を含有するマウス脂肪由来幹細胞から培地中に放出されたシンバスタチンの量を測定した。結果を図４に示す。

図３に示すように、培地交換から２４時間後までの間に約６０％程度のシンバスタチンがヒト脂肪由来幹細胞から放出され、約３３６時間後にはほぼ全てのシンバスタチンが放出された。この結果から、ヒト脂肪由来幹細胞に取り込まれたシンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子に封入されていたシンバスタチンは、緩やかに徐放されて、そのほぼ全てが放出されることが分かる。

一方、マウス脂肪由来細胞においても、図４に示すように、ヒト脂肪由来幹細胞の場合と同様に、培地交換から２４時間後までの間に約６０％程度のシンバスタチンがマウス脂肪由来幹細胞から放出され、約３３６時間後にはほぼ全てのシンバスタチンが放出された。この結果から、マウス脂肪由来幹細胞に取り込まれたシンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子に封入されていたシンバスタチンも、緩やかに徐放されて、そのほぼ全てが放出されることが分かる。

（脂肪由来幹細胞の血管新生因子産生能に対する効果）
次に、シンバスタチン封入ナノ粒子による脂肪由来幹細胞の血管新生因子産生能に対する効果について検討するために、下記の手順で、脂肪由来幹細胞内における血管新生因子のｍＲＮＡ発現量について定量ＰＣＲ法を用いて解析した。本解析では、血管新生因子としてＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ及びＦＧＦ−２の細胞内ｍＲＮＡ発現量を測定した。

まず、脂肪由来幹細胞を培養する培養培地中にシンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子を２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬの濃度となるように添加した。２４時間後に各濃度で処理された細胞を回収し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎＲＮＡキット（タカラバイオ）を用いて、それらの細胞に含まれる全ＲＮＡを抽出した。ReverTra Ace qPCR RT キット（TOYOBO）を用いて、抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成した後、各血管新生因子（ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ及びＦＧＦ−２）のＤＮＡ配列に対応したプライマーを用いて、定量ＰＣＲ法により各細胞集団におけるＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ及びＦＧＦ−２のｍＲＮＡ発現量を測定した。定量ＰＣＲ法は、ｃＤＮＡ溶液にSsoFastEvaGreen Mastermix試薬（バイオラッド）と各血管新生因子に対応したフォワードおよびリバースプライマーとを添加し、サーマルサイクラー（CFXConnectバイオラッド）を用いてＰＣＲ反応（９５℃３０秒を１サイクル、９５℃５秒／５６℃５秒を４０サイクル）させて行った。その測定結果を図５に示す。なお、結果は、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量を基準とした上記各因子の発現量の比率を示している。ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ及びＦＧＦ−２の定量に用いたフォワードおよびリバースプライマーの塩基配列は下記の通りである。
VEGF-A用フォワードプライマー：
5’- TTACTCTCACCTGCTTCT -3’（配列番号１）
VEGF-A用リバースプライマー：
5’- CTGCTTCTTCCAACAATG -3’（配列番号２）
VEGF-C用フォワードプライマー：
5’- TCAAGGACAGAAGAGACTA -3’（配列番号３）
VEGF-C用リバースプライマー：
5’- CCACATCTATACACACCTC -3’（配列番号４）
FGF-2用フォワードプライマー：
5’- TTCTTCCAATGTCTGCTAA -3’（配列番号５）
FGF-2用リバースプライマー：
5’- RGACCAATTATCCAAACTGAG -3’（配列番号６）

図５（ａ）に示すように、ＶＥＧＦ−ＡのｍＲＮＡ発現量は、シンバスタチン封入ナノ粒子を２０μｇ／ｍＬ（Ｓｔａｔｉｎ２０）、５０μｇ／ｍＬ（Ｓｔａｔｉｎ５０）及び１００μｇ／ｍＬ（Ｓｔａｔｉｎ１００）のいずれの濃度で処理した場合も、未処理であるコントロール群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して増大し、特に、シンバスタチン封入ナノ粒子を１００μｇ／ｍＬの濃度で処理した場合に顕著な増大が認められた。

また、図５（ｂ）に示すように、ＶＥＧＦ−ＣのｍＲＮＡ発現量は、シンバスタチン封入ナノ粒子を２０μｇ／ｍＬ（Ｓｔａｔｉｎ２０）、５０μｇ／ｍＬ（Ｓｔａｔｉｎ５０）及び１００μｇ／ｍＬ（Ｓｔａｔｉｎ１００）のいずれの濃度で処理した場合も、未処理であるコントロール群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して増大し、特に、シンバスタチン封入ナノ粒子を５０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬの濃度で処理した場合に顕著な増大が認められた。

同様に、図５（ｃ）に示すように、ＦＧＦ−２のｍＲＮＡ発現量も、シンバスタチン封入ナノ粒子を２０μｇ／ｍＬ（Ｓｔａｔｉｎ２０）、５０μｇ／ｍＬ（Ｓｔａｔｉｎ５０）及び１００μｇ／ｍＬ（Ｓｔａｔｉｎ１００）のいずれの濃度で処理した場合も、未処理であるコントロール群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して増大し、特に、シンバスタチン封入ナノ粒子を５０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬの濃度で処理した場合に顕著な増大が認められた。これらの結果からシンバスタチン封入ＰＬＡナノ粒子により、脂肪由来幹細胞の血管新生因子産生能が亢進することが示された。

以上のとおり、スタチン封入ナノ粒子で処理することにより、脂肪由来幹細胞の血管新生因子の産生能を増強できること、また脂肪由来幹細胞に取り込まれた（スタチン封入ナノ粒子に封入されていた）スタチンは経時的に当該細胞から放出されることが確認された。この参考例２の結果から、スタチン封入ナノ粒子を含有する脂肪由来幹細胞は、ナノ粒子に封入されている薬剤とともに皮膚疾患の治療に有効な成分を多く含有する、皮膚疾患治療用組成物を製造するために利用できることを示している。

［実施例１］スタチン（シンバスタチン）封入ナノ粒子を含有する脂肪由来幹細胞から分泌されたエクソソームを含む皮膚疾患（脱毛症等）治療用組成物
以下の手順で、スタチン封入ナノ粒子を取り込んだ脂肪由来幹細胞から分泌されたエクソソームを含む皮膚疾患治療用組成物を製造し、その皮膚疾患（脱毛症等）に対する治療効果について評価した。

（試験組成物Ｓ１の製造）
１×１０^６個のヒト脂肪由来幹細胞（参考例１参照）を、シンバスタチンをＰＬＧＡナノ粒子に封入したスタチン封入ナノ粒子（シンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子、作製例１参照）２ｍｇと１時間共培養した。その後、そのヒト脂肪由来細胞を７２時間培養し、培地を回収し、超遠心法（210,000 RCF）によってその培地からエクソソームを分離した。分離したエクソソームを５％グリセリン水溶液に添加及び混合し、試験組成物Ｓ１を製造した。

（試験組成物Ｓ１の脱毛症等に対する治療効果の評価）
ＩＣＲマウスに対して、３００ｍｇ／ｋｇのトリブロモエタノールを腹腔内投与して麻酔し、仰臥位に固定した。そのマウスの背部の皮膚に、試験組成物Ｓ１を１回塗布し、その１週間後に皮膚の状態を観察した。なお、エクソソームを含まない５％グリセリン水溶液（対照組成物Ａ１）を塗布したＩＣＲマウス、及びスタチン封入ナノ粒子で処理されていないヒト脂肪由来細胞のエクソソームを含む５％グリセリン水溶液（対照組成物Ａ２）を塗布したＩＣＲマウスを対照として、皮膚の状態を比較した。その結果を図６に示す。

図６に示すように、対照組成物Ａ１を塗布したＩＣＲマウス（Control）では、全く発毛が認められなかった。対照組成物Ａ２を塗布したＩＣＲマウス（hAdSC）では、わずかに発毛が認められた。一方、試験組成物Ｓ１を塗布したＩＣＲマウス（SimNP-hAdSC）では、背部の全体的に発毛が認められた。

さらに、各組成物の発毛及び育毛効果を評価するために、第１４染色体のＨｒ遺伝子のイントロン６に変異を有し、体毛を有さないへアレスマウス（ＨＲ−１）を用いて上記試験と同様の試験を行った。具体的には、上記試験と同様に麻酔し、仰臥位に固定したＨＲ−１マウスの背部の皮膚に、上記試験と同様の試験組成物Ｓ１、対象組成物Ａ１またはＡ２を１回塗布した。その２週間後に皮膚の状態を観察し、比較した。その結果を図７に示す。

図７に示すように、対象組成物Ａ１を塗布したＨＲ−１マウス（Control）では、発毛が認められなかった。また、対象組成物Ａ２を塗布したＨＲ−１マウス（hAdSC）では、controlと比較してわずかに体毛の増大が認められた。一方、試験組成物Ｓ１を塗布したＨＲ−１マウス（SimNP-hAdSC）では、hAdSCと比較してさらに体毛の増大が認められ、すなわち発毛促進効果が認められた。

以上の結果から、スタチン封入ナノ粒子で処理された脂肪由来細胞のエクソソームには、高い発毛及び育毛効果が認められるため、脱毛症及び無毛症等に有効であるといえる。

［実施例２］スタチン（シンバスタチン）封入ナノ粒子またはエストロゲン（エストラジオール：Ｅ２）封入ナノ粒子を含有する脂肪由来幹細胞から分泌されたエクソソームを含む皮膚疾患（皮膚損傷等）治療用組成物

（試験組成物Ｅ１の製造）
シンバスタチン封入ＰＬＧＡナノ粒子（作製例１参照）の代わりにエストラジオール封入ＰＬＧＡナノ粒子（作製例２参照）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、ヒト脂肪由来幹細胞のエクソソームを得た。当該エクソソームを５％グリセリン水溶液に添加及び混合し、試験組成物Ｅ１を製造した。

（試験組成物Ｓ１およびＥ１の皮膚損傷等に対する治療効果の評価）
あらかじめ、麻酔下でＤＤＹマウスを腹臥位に保定し、背部の左右の腹壁を切開した後に両側卵巣を摘出し、２ヶ月通常飼育することにより卵巣摘出ＤＤＹマウスを作製した。卵巣を摘出されたＤＤＹマウスは皮膚組織の再生能が小さくなる特徴を有する。

卵巣摘出ＤＤＹマウスの皮膚に、実施例１と同様の試験組成物Ｓ１、または実施例２において上記のようにして新たに調製した試験組成物Ｅ１を、３回／週の頻度で塗布した。塗布開始２週間後に、マウスの皮膚の一部を採取して４％パラフォルムアルデヒド溶液で６時間固定した後に常法で薄切組織標本を作製し、光学顕微鏡で観察した。薄切組織標本中の皮膚組織は、マッソントリクローム染色により、コラーゲンを産生する繊維芽細胞が染色されている。なお、実施例１のときと同様、エクソソームを含まない５％グリセリン水溶液（対照組成物Ａ１）を塗布した卵巣摘出ＤＤＹマウス、及びスタチン封入ナノ粒子でもエストラジオール封入ＰＬＧＡナノ粒子でも処理されていないヒト脂肪由来細胞のエクソソームを含む５％グリセリン水溶液（対照組成物Ａ２）を塗布した卵巣摘出ＤＤＹマウスを対照として、皮膚の状態を比較した。その結果を図８に示す。

図８に示すように、対象組成物Ａ１を塗布した卵巣摘出ＤＤＹマウス（Control）では、皮膚全体が薄く、特に表皮側（図面上側）における繊維芽細胞の層（図の黒い部分）も薄かった。また、対象組成物Ａ２を塗布した卵巣摘出ＤＤＹマウス（hAdSC）でもcontrolと差はほとんど見られなかった。一方、試験組成物Ｓ１を塗布した卵巣摘出ＤＤＹマウス（SimNP-hAdSC）では、controlと比較して皮膚組織が厚くなり、さらに発毛も認められた。また、試験組成物Ｅ１を塗布した卵巣摘出ＤＤＹマウス（E2NP-hAdSC）では、controlと比較して皮膚組織が厚くなり、特にコラーゲンを産生する繊維芽細胞（図中の黒い部分）が多く認められた。

以上の結果から、薬物封入ナノ粒子を含有する幹細胞（脂肪由来幹細胞）から分泌されるエクソソームには皮膚再生効果が認められ、特に薬物としてエストラジオール（Ｅ２）を用いた場合に得られるエクソソームを使用することによって、皮膚再生に重要なコラーゲンを産生する繊維芽細胞を増大させることができることが分かる。このため、本発明に係るエクソソームを含む組成物は、皮膚損傷又は皮膚潰瘍の治療に有用であるといえる。

［実施例３］エストロゲン（エストラジオール：Ｅ２）封入ナノ粒子を含有する脂肪由来幹細胞から分泌されたエクソソームを含む皮膚疾患治療用組成物

７１歳の女性から採取した脂肪組織から、参考例１の「ヒト脂肪組織からの脂肪由来幹細胞の単離」と同様の手順で、ヒト脂肪由来幹細胞（ＡｄＳＣ）を単離し（初代培養細胞）、当該初代培養細胞を９回継代培養した後の細胞集団（本実施例において「Ｐ０」と呼ぶ。）を用意した。

DMEM F12（サーモフィッシャー製）：KBM ADSC2（コージンバイオ社製）＝１：１で混合した培地に、エストラジオール封入ＰＬＧＡナノ粒子（作製例２参照）を、２５、５０、１００、２００もしくは３００μｇ／５００００ＡｄＳＣの濃度となるよう添加した培地を調製した。調製された培地を用いて、３７℃のＣＯ_２インキュベーター中で、幹細胞集団Ｐ０を５日間培養した（当該継代培養により得られた幹細胞集団を「Ｐ１」と呼ぶ。）。当該継代培養後の培地を回収し、超遠心法（210,000 RCF）によって、幹細胞集団P1から分泌されたエクソソームを培地から分離した。分離したエクソソームを５％グリセリン水溶液に添加及び混合し、試験組成物を製造した。

上記の調製培地を用いて、上記と同様の培養条件により、幹細胞集団P1を５日間培養し（当該継代培養により得られた幹細胞集団を「P2」と呼ぶ。）、上記と同様の手順で幹細胞集団P2から分泌されたエクソソームを培地から分離し、試験組成物を製造した。以下、同様にして、５日間ずつの継代培養により作製された幹細胞集団P3、P4およびP5それぞれについて、分泌されたエクソソームを培地から分離し、試験組成物を製造した。

上記各試験組成物の製造に用いたエクソソームを分泌した各幹細胞手段（P1, P2, P3, P4およびP5）を試料として、参考例２における細胞内ｍＲＮＡ発現量の測定と同様の手順（定量ＰＣＲ法）で、ＶＥＧＦ−Ａ、ＨＧＦおよびＦＧＦ−２の細胞内ｍＲＮＡ発現量を測定した。ＶＥＧＦ−ＡおよびＦＧＦ−２の定量に用いたフォワードおよびリバースプライマーは参考例２と同じである。ＨＧＦの定量に用いたフォワードおよびリバースプライマーの塩基配列は下記の通りである。
HGF用フォワードプライマー：
5’- CCTCTATGAAAACAAAGACTAC -3’（配列番号７）
HGF用リバースプライマー：
5’- CTGTGTTCGTGTGGTATC -3’（配列番号８）

エストロゲン封入ナノ粒子を含有する脂肪由来幹細胞におけるＶＥＧＦ−ＡのｍＲＮＡ発現量の測定結果を図９に示す。この結果から、例えば、５０μｇ／５００００ＡｄＳＣの濃度となるようエストラジオール封入ＰＬＧＡナノ粒子が添加された培地で培養された、幹細胞集団P1から分泌されたエクソソームには、ｍＲＮＡから翻訳されたＶＥＧＦ−Ａタンパク質と、ナノ粒子に封入されていたエストラジオールとが豊富に含まれており、そのエクソソームを使用して製造された試験組成物は、皮膚疾患の治療（特に皮膚再生）における有効性に優れているものと推定される。

エストロゲン封入ナノ粒子を含有する脂肪由来幹細胞におけるＨＧＦのｍＲＮＡ発現量の測定結果を図１０に示す。この結果から、例えば、５０μｇ／５００００ＡｄＳＣの濃度となるようエストラジオール封入ＰＬＧＡナノ粒子が添加された培地で培養された、幹細胞集団P1から分泌されたエクソソームには、ｍＲＮＡから翻訳されたＨＧＦタンパク質と、ナノ粒子に封入されていたエストラジオールとが豊富に含まれており、そのエクソソームを使用して製造された試験組成物は、皮膚疾患の治療（特に皮膚再生）における有効性に優れているものと推定される。

エストロゲン封入ナノ粒子を含有する脂肪由来幹細胞におけるＦＧＦ−２のｍＲＮＡ発現量の測定結果を図１１に示す。この結果から、例えば、３００μｇ／５００００ＡｄＳＣの濃度となるようエストラジオール封入ＰＬＧＡナノ粒子が添加された培地で培養された、幹細胞集団Ｐ２から分泌されたエクソソームには、ｍＲＮＡから翻訳されたＦＧＦ−２タンパク質と、ナノ粒子に封入されていたエストラジオールとが豊富に含まれており、そのエクソソームを使用して製造された試験組成物は、皮膚疾患の治療（特に皮膚再生）における有効性に優れているものと推定される。

［実施例４］ビタミンＣ封入ナノ粒子を含有する脂肪由来幹細胞から分泌されたエクソソームを含む皮膚疾患治療用組成物

エストラジオール封入ＰＬＧＡナノ粒子（作製例２参照）の代わりにビタミンＣ封入ＰＬＧＡナノ粒子（作製例３参照）を用いたこと以外は実施例３と同様にして、５日間ずつの継代培養により作製された幹細胞集団Ｐ１〜Ｐ５それぞれについて、分泌されたエクソソームを培地から分離し、試験組成物を製造した。さらに、実施例３と同様にして、実施例４の幹細胞集団Ｐ１〜Ｐ５それぞれについて、ＶＥＧＦ−Ａ、ＨＧＦおよびＦＧＦ−２の細胞内ｍＲＮＡ発現量を測定した。

ビタミンＣ封入ナノ粒子を含有する脂肪由来幹細胞におけるＶＥＧＦ−ＡのｍＲＮＡ発現量の測定結果を図１２に示す。この結果から、例えば、３００μｇ／５００００ＡｄＳＣの濃度となるようエストラジオール封入ＰＬＧＡナノ粒子が添加された培地で培養された、幹細胞集団Ｐ２から分泌されたエクソソームには、ｍＲＮＡから翻訳されたＶＥＧＦ−Ａタンパク質と、ナノ粒子に封入されていたビタミンＣとが豊富に含まれており、そのエクソソームを使用して製造された試験組成物は、皮膚疾患の治療における有効性に優れているものと推定される。

ビタミンＣ封入ナノ粒子を含有する脂肪由来幹細胞におけるＨＧＦのｍＲＮＡ発現量の測定結果を図１３に示す。この結果から、例えば、５０μｇ／５００００ＡｄＳＣの濃度となるようエストラジオール封入ＰＬＧＡナノ粒子が添加された培地で培養された、幹細胞集団Ｐ２から分泌されたエクソソームには、ｍＲＮＡから翻訳されたＨＧＦタンパク質と、ナノ粒子に封入されていたビタミンＣとが豊富に含まれており、そのエクソソームを使用して製造された試験組成物は、皮膚疾患の治療（特に皮膚再生）における有効性に優れているものと推定される。

ビタミンＣ封入ナノ粒子を含有する脂肪由来幹細胞におけるＦＧＦ−２のｍＲＮＡ発現量の測定結果を図１４に示す。この結果から、例えば、２００μｇ／５００００ＡｄＳＣの濃度となるようエストラジオール封入ＰＬＧＡナノ粒子が添加された培地で培養された、幹細胞集団Ｐ３から分泌されたエクソソームには、ｍＲＮＡから翻訳されたＦＧＦ−２タンパク質と、ナノ粒子に封入されていたビタミンＣとが豊富に含まれており、そのエクソソームを使用して製造された試験組成物は、皮膚疾患の治療（特に皮膚再生）における有効性に優れているものと推定される。

［実施例５］レチノイン酸封入ナノ粒子を含有する脂肪由来幹細胞から分泌されたエクソソームを含む皮膚疾患治療用組成物

エストラジオール封入ＰＬＧＡナノ粒子（作製例２参照）の代わりにレチノイン酸封入ＰＬＧＡナノ粒子（作製例４参照）を用い、また薬物封入ナノ粒子の培地中の濃度を、２５、５０、１００、２００もしくは３００μｇ／５００００ＡｄＳＣの５段階から、２５、５０もしくは１００μｇ／５００００ＡｄＳＣの３段階に変更し、それ以外は実施例３と同様にして、５日間ずつの継代培養により作製された幹細胞集団Ｐ１〜Ｐ５それぞれについて、分泌されたエクソソームを培地から分離し、試験組成物を製造した。さらに、実施例３と同様にして、実施例５の幹細胞集団Ｐ１〜Ｐ５それぞれについて、ＶＥＧＦ−Ａ、ＨＧＦおよびＦＧＦ−２の細胞内ｍＲＮＡ発現量を測定した。

レチノイン酸封入ナノ粒子を含有する脂肪由来幹細胞におけるＶＥＧＦ−ＡのｍＲＮＡ発現量の測定結果を図１５に示す。この結果から、例えば、１００μｇ／５００００ＡｄＳＣの濃度となるようエストラジオール封入ＰＬＧＡナノ粒子が添加された培地で培養された、幹細胞集団Ｐ１から分泌されたエクソソームには、ｍＲＮＡから翻訳されたＶＥＧＦ−Ａタンパク質と、ナノ粒子に封入されていたレチノイン酸とが豊富に含まれており、そのエクソソームを使用して製造された試験組成物は、皮膚疾患の治療における有効性に優れているものと推定される。

レチノイン酸封入ナノ粒子を含有する脂肪由来幹細胞におけるＨＧＦのｍＲＮＡ発現量の測定結果を図１６に示す。この結果から、例えば、１００μｇ／５００００ＡｄＳＣの濃度となるようエストラジオール封入ＰＬＧＡナノ粒子が添加された培地で培養された、幹細胞集団Ｐ３から分泌されたエクソソームには、ｍＲＮＡから翻訳されたＨＧＦタンパク質と、ナノ粒子に封入されていたレチノイン酸とが豊富に含まれており、そのエクソソームを使用して製造された試験組成物は、皮膚疾患の治療（特に皮膚再生）における有効性に優れているものと推定される。

レチノイン酸封入ナノ粒子を含有する脂肪由来幹細胞におけるＦＧＦ−２のｍＲＮＡ発現量の測定結果を図１７に示す。この結果から、例えば、１００μｇ／５００００ＡｄＳＣの濃度となるようエストラジオール封入ＰＬＧＡナノ粒子が添加された培地で培養された、幹細胞集団Ｐ３から分泌されたエクソソームには、ｍＲＮＡから翻訳されたＦＧＦ−２タンパク質と、ナノ粒子に封入されていたレチノイン酸とが豊富に含まれており、そのエクソソームを使用して製造された試験組成物は、皮膚疾患の治療（特に皮膚再生）における有効性に優れているものと推定される。

Claims (11)

1. 幹細胞から分泌されたエクソソームを含む皮膚疾患治療用組成物であって、
   前記幹細胞は、薬物が生体吸収性ポリマーを含むナノ粒子に封入されてなる薬物封入ナノ粒子を含有する幹細胞である
   ことを特徴とする、皮膚疾患治療用組成物。
2. 前記幹細胞が脂肪由来幹細胞である、請求項１に記載の組成物。
3. 前記薬物が、皮膚疾患の治療に有効であるとともに、幹細胞が産生する皮膚疾患の治療に有効な因子の発現量を亢進する薬物である、請求項１または２に記載の組成物。
4. 前記薬物がスタチンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 前記薬物がエストロゲンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
6. 前記薬物がビタミンＡまたはその誘導体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
7. 前記薬物がビタミンＣまたはその誘導体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
8. 前記皮膚疾患が脱毛症又は無毛症である、請求項１〜４、６および７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 前記皮膚疾患が皮膚損傷又は皮膚潰瘍である、請求項１〜３、５および６のいずれか一項に記載の組成物。
10. 経皮投与用の剤形を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
11. 医薬品、医薬部外品または化粧品である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。

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