KR20200113225A - 피부 질환 치료용 조성물 - Google Patents

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마사아키 이이
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노바셀라 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 우수한 피부 질환 치료용 조성물(의약품, 의약부외품, 화장품 등)을 제공한다. 본 발명에 관한 피부 질환 치료용 조성물은, 줄기 세포(예를 들어 지방 유래 줄기 세포)로부터 분비된 엑소솜을 포함하는 것이며, 상기 줄기 세포는, 약물(예를 들어 스타틴, 에스트로겐, 레티노산, 아스코르브산)이 생체 흡수성 폴리머를 포함하는 나노 입자에 봉입되어 이루어지는 약물 봉입 나노 입자를 함유하는 것인 것을 특징으로 한다.

Description

피부 질환 치료용 조성물
본 발명은, 피부 질환을 치료하기 위한 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은, 약물 봉입 나노 입자를 포합하는 지방 유래 줄기 세포를 포함하거나, 또는 지방 유래 줄기 세포로부터 분비된 엑소솜을 포함하는, 피부 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.
근년, 다능성을 갖는 줄기 세포를 사용하여, 각종 질환을 치료하는 연구가 행해지고 있다. 줄기 세포는, 일반적으로 배아 줄기 세포(ES 세포)나, 골수 유래 줄기 세포 및 지방 유래 줄기 세포 등의 간엽계의 체성 줄기 세포 외에도, 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포) 등이 알려져 있고, 각종 연구에 사용되고 있다. 예를 들어, 체성 줄기 세포를 사용한 자가 세포 이식은, 염증성 질환, 허혈성 질환, 알레르기성 질환, 신경 변성 질환 등의 다수의 질환에 대한 치료 응용을 향한 기초 연구 및 임상 시험이 구미 제국을 비롯하여 일본에서도 활발히 행해지고 있다. 그 중에서도, 취급이 간편한 지방 유래 줄기 세포에 관한 연구가 급속하게 발전하여, 각종 질환에 대한 재생 의료의 임상 시험이 널리 행해지고 있다. 또한, 지방 유래 줄기 세포는 재생 의료뿐만 아니라, 약제 유발성 장염 마우스 모델에 있어서 장염 억제 효과를 나타내는 것도 보고되어 있다(예를 들어 비특허문헌 1을 참조).
상기와 같은 지방 유래 줄기 세포에 의한 질환의 치료 효과를 향상시키기 위한 수단으로서, 예를 들어 특허문헌 1에는, 스타틴이 봉입된 나노 입자를 지방 유래 줄기 세포에 도입시킴으로써, 줄기 세포의 증식능이나 사이토카인 합성능 등의 세포 기능을 증강시키는 방법이 개시되어 있다.
한편, 지방 유래 줄기 세포 자체를 질환 치료에 사용하는 것이 아니라, 지방 유래 줄기 세포의 배양 상청이나, 지방 유래 줄기 세포로부터 방출되는 엑소솜을 질환 치료약에 사용하는 연구도 이루어지고 있다.
예를 들어, 특허문헌 2에는, 말의 간엽계 줄기 세포(지방 유래 줄기 세포 등)의 배양 상청을 배합한, 화장품이나 피부 질환 치료제(항알레르기 치료용 조성물, 발모 또는 육모용 조성물 등)가 개시되어 있다.
또한, 엑소솜이란 세포로부터 분비되는 막 소포이며, 세포 내의 단백질이나 유전 정보(mRNA, microRNA 등)를 세포 외로 운반함으로써, 국소나 전신에 있어서의 세포간의 정보 전달을 담당하고 있다. 그 기능은 여러 분야에 걸쳐, 예를 들어 감염성 병원체나 종양에 대한 적응 면역 응답의 매개, 조직 수복, 신경 전달이나 병원성 단백질의 운반 등의 기능을 갖는 것이 보고되어 있다. 엑소솜의 기능은, 그의 유래하는 세포에 따라서 다른 것도 시사되어 있다. 예를 들어, 지방 유래 줄기 세포 등의 간엽계 줄기 세포 유래 엑소솜이면, 심근 허혈 재관류 장애의 경감 기능이나 저산소 시의 폐고혈압의 경감 기능을 갖는 것이 보고되어 있으며, 심근 전구 세포 유래 엑소솜이면, 심근의 아포토시스의 억제 기능을 갖는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 2 내지 5 등을 참조). 이 때문에, 각종 세포로부터 분비되는 엑소솜을 사용함으로써, 각종 생리적 기능을 초래하거나, 각종 질환의 치료에 연결되거나 할 수 있다고 생각된다.
일본 특허 제6110578호 공보(WO2016/076227호) 일본 특허 제6152205호 공보(일본 특허 공개 제2018-24595호 공보
Gonzalez, MA et al. Gastroenterology136(2009), 978-989. Ruenn Chai Lai et al. Stem Cell Research (2010) 4, 214-222. Fatiharslan et al. Stem Cell Research (2013)10, 301-312. Changjin Lee et al. Circulation. 2012; 126:2601-2611. Lucio Barile et al. Cardiovascular Research(2014) 103, 530-541.
상술한 선행 기술 문헌의 개시에도 불구하고, 현재 시점에서, 피부 질환 치료용 조성물로서 충분한 유효성을 나타내는 것은 없다. 또한 편리성의 관점에서는, 외용제로서 이용하였을 때에도 높은 유효성을 나타내는 피부 질환 치료용 조성물이 요망되고 있다.
본 발명은, 우수한 치료 효과를 발휘하는 피부 질환 치료용 조성물을 제공하는 것을 과제로 한다.
상기 과제를 해결하기 위해서, 본 발명자는 예의 연구한 결과, 약물이 나노 입자에 봉입되어 이루어지는 약물 봉입 나노 입자를 줄기 세포에 함유시키면, 당해 줄기 세포로부터 분비된 엑소솜에는, 각종 피부 질환의 치료에 있어서 유용한 성분, 즉, 나노 입자에 봉입되어 있던 약물과 혈관 신생 인자 등의 줄기 세포의 세포 내에서 산생되는 각종 인자가 풍부하게 포함되어 있는 것, 그러한 엑소솜을 유효 성분으로서 사용함으로써, 피부 질환에 대하여 현저하게 우수한 치료 효과를 발휘하는, 외용제로서 사용할 수 있는 피부 질환 치료용 조성물을 조제할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은, 일 측면에 있어서 하기 사항을 제공한다.
[항 1]
줄기 세포로부터 분비된 엑소솜을 포함하는 피부 질환 치료용 조성물이며,
상기 줄기 세포는, 약물이 생체 흡수성 폴리머를 포함하는 나노 입자에 봉입되어 이루어지는 약물 봉입 나노 입자를 함유하는 줄기 세포인
것을 특징으로 하는, 피부 질환 치료용 조성물.
[항 2]
상기 줄기 세포가 지방 유래 줄기 세포인, 항 1에 기재된 조성물.
[항 3]
상기 약물이, 피부 질환의 치료에 유효함과 함께, 줄기 세포가 산생하는 피부 질환의 치료에 유효한 인자의 발현량을 항진하는 약물인, 항 1 또는 2에 기재된 조성물.
[항 4]
상기 약물이 스타틴인, 항 1 내지 3 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
[항 5]
상기 약물이 에스트로겐인, 항 1 내지 3 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
[항 6]
상기 약물이 비타민 A 또는 그의 유도체인, 항 1 내지 3 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
[항 7]
상기 약물이 비타민 C 또는 그의 유도체인, 항 1 내지 3 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
[항 8]
상기 피부 질환이 탈모증 또는 무모증인, 항 1 내지 4, 6 및 7 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
[항 9]
상기 피부 질환이 피부 손상 또는 피부 궤양인, 항 1 내지 3, 5 및 6 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
[항 10]
경피 투여용의 제형을 갖는, 항 1 내지 9 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
[항 11]
의약품, 의약부외품 또는 화장품인, 항 1 내지 10 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
또한, 상기 「약물 봉입 나노 입자를 함유하는 줄기 세포」로부터 「분비된 엑소솜」의 성상, 특히 당해 엑소솜의 내포물의 조성(성분 및 각 성분의 양)은, 본 명세서에 있어서 후술하는 바와 같이, 예를 들어 나노 입자에 봉입한 약물의 종류, 줄기 세포 중의 약물 봉입 나노 입자의 양(줄기 세포의 배지 중의 약물 봉입 나노 입자의 농도), 줄기 세포가 약물 봉입 나노 입자를 함유하고 나서 엑소솜을 회수할 때까지의 시간(계대수) 등에 의해 변동될 수 있는 것이며, 일률적으로 결정할 수 있는 것은 아니다. 일반적으로는, 상기 「약물 봉입 나노 입자를 함유하는 줄기 세포」로부터 「분비된 엑소솜」에는, 피부 질환 치료에 있어서 유효한 양의, 약물 봉입 나노 입자에 봉입되어 있던 약물과, 엑소솜을 분비하는 줄기 세포가 발현된 인자(단백질, 핵산 등)가 내포되어 있다. 또한, 바람직하게는 약제 봉입 나노 입자를 함유하는 줄기 세포로부터 분비된 엑소솜 중의 인자(단백질, 핵산 등)의 양은, 약제 봉입 나노 입자를 함유하지 않는 줄기 세포(컨트롤)로부터 분비된 엑소솜 중의 인자의 양과 비교하여, 증가하고 있다. 바꿔 말하면, 본 발명의 피부 질환 치료용 조성물을 제조할 때의, 약제 봉입 나노 입자를 함유하는 줄기 세포로부터 분비된 엑소솜의 사용량은, 바람직하게는 약제 봉입 나노 입자를 함유하지 않는 줄기 세포로부터 분비된 엑소솜의 사용량보다도, 동등한 치료 효과를 달성함에 있어서, 적어진다.
본 발명은 다른 측면에 있어서, 「약물이 생체 흡수성 폴리머를 포함하는 나노 입자에 봉입되어 이루어지는 약물 봉입 나노 입자를 함유하는 줄기 세포로부터 분비된 엑소솜의 유효량을 투여하는(접촉시키는, 도포하는 등) 것을 포함하는, 피부 질환의 치료 방법」을 제공한다. 당해 「피부 질환의 치료 방법」에 관한 발명은, 상기 항 1 등에 기재한 「피부 질환 치료용 조성물」에 관한 발명으로부터, 당업자라면 전환 가능하다. 본 명세서 중에서 상세하게 설명하는 「피부 질환 치료용 조성물」에 관한 사항은, 상기 「피부 질환의 치료 방법」에 대해서도 마찬가지로 적용할 수 있다.
본 발명은 다른 측면에 있어서, 「약물이 생체 흡수성 폴리머를 포함하는 나노 입자에 봉입되어 이루어지는 약물 봉입 나노 입자를 함유하는 줄기 세포로부터 분비된 엑소솜의, 피부 질환 치료용 조성물의 제조에 있어서의 사용」을 제공한다. 당해 「사용」에 관한 발명은, 상기 항 1 등에 기재한 「피부 질환 치료용 조성물」에 관한 발명으로부터, 당업자라면 전환 가능하다. 본 명세서 중에서 상세하게 설명하는 「피부 질환 치료용 조성물」에 관한 사항은, 상기 「피부 질환의 치료 방법」에 대해서도 마찬가지로 적용할 수 있다.
본 발명은 추가의 측면에 있어서, 「약물이 생체 흡수성 폴리머를 포함하는 나노 입자에 봉입되어 이루어지는 약물 봉입 나노 입자를 줄기 세포에 함유시키는 공정, 및 당해 줄기 세포로부터 분비된 엑소솜을 회수하는 공정을 포함하는, 피부 질환 치료용 조성물의 제조 방법」을 제공한다. 당해 「피부 질환 치료용 조성물의 제조 방법」에 관한 발명은, 상기 항 1 등에 기재한 「피부 질환 치료용 조성물」에 관한 발명에 기초하여, 또한 본 명세서 중에서 상세하게 설명하는 「피부 질환 치료용 조성물」에 관한 사항을 참조하면서, 당업자라면 도출 가능하다. 제1 실시자가 「약물이 생체 흡수성 폴리머를 포함하는 나노 입자에 봉입되어 이루어지는 약물 봉입 나노 입자를 줄기 세포에 함유시키는 공정」을 행하고, 제1 실시자로부터 당해 줄기 세포를 수취한 제2 실시자가 「당해 줄기 세포로부터 분비된 엑소솜을 회수하는 공정」을 행하는 실시 형태도, 상기 「피부 질환 치료용 조성물의 제조 방법」의 일 실시 형태이다.
본 발명에 관한 피부 질환 치료용 조성물은 종래의 것에 비해 현저하게 우수한 치료 효과를 발휘하고, 탈모증 또는 무모증, 피부 손상 또는 피부 궤양 등, 다양한 피부 질환의 치료에 있어서 매우 유용하다. 또한, 본 발명에 관한 피부 질환 치료용 조성물은, 경피 흡수성이 높은 엑소솜을 유효 성분으로서 이용하고 있기 때문에, 외용제로서 (경피 투여에 의해) 사용할 수 있는 의약품, 의약부외품 또는 화장품의 형태로 할 수 있다.
도 1은, 인간 지방 유래 줄기 세포의 배양 배지 중에 로다민 적색 형광 색소 봉입 PLA 나노 입자를 그의 최종 농도가 20μg/mL, 50μg/mL, 80μg/mL 또는 100μg/mL가 되게 첨가하고, 그 1시간 후 또는 2시간 후에 줄기 세포를 공초점 레이저 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2는, 마우스 지방 유래 줄기 세포의 배양 배지 중에 로다민 적색 형광 색소 봉입 PLGA 나노 입자를 그의 최종 농도가 20μg/mL, 50μg/mL, 75μg/mL 또는 100μg/mL가 되게 첨가하고, 그 30분 후에 줄기 세포에 있어서의 로다민 적색 형광 색소 봉입 PLGA 나노 입자의 도입량을 FACS에서 측정한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은, 인간 지방 유래 줄기 세포에 대하여 100μg/mL의 농도로 심바스타틴 봉입 PLA 나노 입자를 1시간 처리한 후에, 지방 유래 줄기 세포로부터 배지 중에 방출된 심바스타틴의 양을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는, 마우스 지방 유래 줄기 세포에 대하여 50μg/mL의 농도로 심바스타틴 봉입 PLA 나노 입자를 30분 처리한 후에, 지방 유래 줄기 세포로부터 배지 중에 방출된 심바스타틴의 양을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는, 스타틴 봉입 나노 입자로 처리된 지방 유래 줄기 세포에 있어서의 혈관 신생 인자의 mRNA 발현을, 정량 PCR법을 사용하여 측정한 결과를 나타내는 그래프이며, 혈관 신생 인자로서 (a)는 VEGF-A, (b)는 VEGF-C, (c)는 FGF-2의 RNA 발현을 측정한 결과를 나타내고 있다.
도 6은, 스타틴 봉입 나노 입자로 처리된 지방 유래 줄기 세포로부터 분비된 엑소솜의 발모 및 육모 효과를 나타내는 사진이다.
도 7은, 헤어리스 마우스를 사용하여, 스타틴 봉입 나노 입자로 처리된 지방 유래 줄기 세포로부터 분비된 엑소솜의 발모 및 육모 효과를 나타내는 사진이다.
도 8은, 스타틴 봉입 나노 입자 또는 에스트라디올 봉입 나노 입자로 처리된 지방 유래 줄기 세포로부터 분비된 엑소솜의 피부 재생 효과를 나타내는 광학 현미경 사진이다.
도 9는, 에스트라디올 봉입 PLGA 나노 입자를 작용시킨 71세 여성의 지방 유래 줄기 세포에 있어서의 VEGF(-A) 유전자 발현을 나타내는 그래프이다.
도 10은, 에스트라디올 봉입 PLGA 나노 입자를 작용시킨 71세 여성의 지방 유래 줄기 세포에 있어서의 HGF 유전자 발현을 나타내는 그래프이다.
도 11은, 에스트라디올 봉입 PLGA 나노 입자를 작용시킨 71세 여성의 지방 유래 줄기 세포에 있어서의 FGF2 유전자 발현을 나타내는 그래프이다.
도 12는, 비타민 C 봉입 PLGA 나노 입자를 작용시킨 71세 여성의 지방 유래 줄기 세포에 있어서의 VEGF(-A) 유전자 발현을 나타내는 그래프이다.
도 13은, 비타민 C 봉입 PLGA 나노 입자를 작용시킨 71세 여성의 지방 유래 줄기 세포에 있어서의 HGF 유전자 발현을 나타내는 그래프이다.
도 14는, 비타민 C 봉입 PLGA 나노 입자를 작용시킨 71세 여성의 지방 유래 줄기 세포에 있어서의 FGF2 유전자 발현을 나타내는 그래프이다.
도 15는, 레티노산 봉입 PLGA 나노 입자를 작용시킨 71세 여성의 지방 유래 줄기 세포에 있어서의 VEGF(-A) 유전자 발현을 나타내는 그래프이다.
도 16은, 레티노산 봉입 PLGA 나노 입자를 작용시킨 71세 여성의 지방 유래 줄기 세포에 있어서의 HGF 유전자 발현을 나타내는 그래프이다.
도 17은, 레티노산 봉입 PLGA 나노 입자를 작용시킨 71세 여성의 지방 유래 줄기 세포에 있어서의 FGF2 유전자 발현을 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시하기 위한 형태에 대하여 상세하게 설명한다. 이하의 상세한 설명에 있어서, 필요에 따라서 바람직한 실시 형태나 도면, 실시예 등에 의해 개시되어 있는 실시 형태로 언급하지만, 그들 실시 형태는 본질적으로 예시에 지나지 않고, 본 발명의 기술적 범위를 불필요하게 제한하는 것을 의도하는 것은 아니다.
본 발명에 관한 피부 질환 치료용 조성물은, 약물이 생체 흡수성 폴리머를 포함하는 나노 입자에 봉입되어 이루어지는 약물 봉입 나노 입자를 함유하는 줄기 세포(본 명세서에 있어서 「나노 입자 함유 줄기 세포」라고 칭하는 경우가 있다.)로부터 분비된 엑소솜을 포함한다.
<약물 봉입 나노 입자>
본 발명에 있어서, 엑소솜을 회수하기 위한 줄기 세포에 함유시키는, 나노 입자에 봉입하는 「약물」은, 인체에 대하여 작용을 미치는 효능을 갖는, 보다 구체적으로는, 줄기 세포로부터 분비되는 엑소솜에 내포되는 성분에 영향을 미치고, 그 엑소솜을 사용하였을 때에 피부 질환의 치료 용도에 관한 본 발명의 작용 효과를 발휘시킬 수 있는, 각종 물질로부터 선택할 수 있다. 「줄기 세포로부터 분비되는 엑소솜에 내포되는 성분」에는, 엑소솜에 봉입되어 있던 「약물」과, 줄기 세포에 의해 산생되는 각종 인자(특히 피부 질환의 치료에 유효한 혈관 신생 인자 등의 인자)가 포함되고, 「약물」은, 그 자체가 엑소솜의 내포 성분에 가해질 수 있고, 바람직하게는 줄기 세포가 산생하는 인자의 발현량을 더욱 항진할 수 있는 의미에서, 엑소솜의 내포 성분에 「영향을 미치는」 것이다. 그러한 「약물」로서는, 예를 들어 펩티드(펩티드 호르몬 등을 포함함) 또는 그의 유도체, 단백질, 핵산, 다당류, 백신, 아쥬반트, 수용성 또는 지용성 저분자 화합물에 속하는 화합물로부터 선택할 수 있고, 의약품, 의약부외품 또는 화장품의 성분으로서 공지되어 있는 약물, 특히 피부 질환의 치료에 있어서 유효한 의약품, 의약부외품 또는 화장품의 성분으로서 공지되어 있는 약물이어도 된다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 나노 입자에 봉입하는 약물(저분자 화합물)은 「스타틴」이다. 본 발명에 있어서의 「스타틴」은, HMG-CoA(3-히드록시-3-메틸글루타릴-코엔자임 A) 환원 효소 저해제인 화합물을 모두 포함하는 용어이다. 본 발명에서 사용할 수 있는 스타틴으로서는, 예를 들어 심바스타틴, 로수바스타틴, 피타바스타틴, 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 프라바스타틴, 로바스타틴 및 메바스타틴을 들 수 있다. 또한, 스타틴은 혈관 내피 세포나 골수 유래의 혈관 내피 전구 세포에 작용하여, 그들 세포를 통한 혈관 신생 촉진 작용을 이끌어내는 것에 대해서도 많이 보고가 이루어져 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 나노 입자에 봉입하는 약물(펩티드 호르몬)은 「에스트로겐」이다. 본 발명에 있어서의 「에스트로겐」은, 일반적으로 난포 호르몬류 등이라 불리는 경우도 있는, 스테로이드 골격을 갖는 모든 여성 호르몬, 그의 대사물 및 그의 화학적 유도체(호모에스트론, 도와지놀 등)을 포함하는 용어이다. 본 발명에서 사용할 수 있는 에스트로겐으로서는, 예를 들어 17β-에스트라디올, 에스트론, 에스트리올, 17α-에티닐에스트라디올, 에퀼린, 에퀼레닌 및 그의 대사물을 들 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 나노 입자에 봉입하는 약물(저분자 화합물)은 「비타민 A 또는 그의 유도체」이며, 바람직하게는 「레티노산」이다. 레티노산은 비타민 A(레티놀)의 유도체이며, 생리 활성은 비타민 A와 마찬가지이지만, 생리 활성의 강도는 비타민 A보다도 현저하게 높다. 레티노산은, 기미, 여드름, 주름, 켈로이드 등의 치료(미백, 피부 재생 등)를 위해 이용할 수 있는 것이 알려져 있다. 또한, 레티노산에 의한 미백 작용은, 멜라닌 색소의 억제가 아니라 피부의 턴오버 촉진에 의해 초래되는 것으로 추정되고 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 나노 입자에 봉입하는 약물(저분자 화합물)은 「비타민 C(아스코르브산) 또는 그의 유도체」이다. 비타민 C는 피부, 건, 연골 등의 결합 조직을 구성하는 콜라겐의 합성에 불가결한 비타민이며, 또한 멜라닌 색소 합성 효소인 티로시나아제의 활성 저해, 즉, 멜라닌 색소의 합성 억제(혹은 생성된 멜라닌 색소의 희박화), 활성 산소의 제거, 혈행의 촉진, 과잉의 피지 분비의 억제 등의 작용도 갖고 있다. 그 때문에, 비타민 C는 미백(기미의 예방 등)과 함께, 피부의 건강을 유지하고, 창상을 치유하는 등, 피부 질환의 치료 위해 이용할 수 있는 것이 알려져 있다. 비타민 C의 유도체에는, 비타민 C의 수용성 또는 지용성을 향상시키기 위한 유도체가 있고, 발명의 작용 효과를 고려하여 선택할 수 있지만, 예를 들어 팔미트산아스코르빌, 테트라헥실데칸산아스코르빌 등의 지용성 비타민 C를 이용할 수 있다.
나노 입자에 봉입하는 약물은, 비타민 C와 마찬가지로 미백제로서 사용되고 있는 성분, 예를 들어 멜라닌 색소의 합성 억제 작용을 갖는 히드로퀴논, 알부틴, 코지산, 트라넥삼산, 레조르시놀, 리놀레산, 엘라그산, 아젤라산, 풀러렌 등; 턴오버 촉진 작용을 갖는 케미컬 필링제(글리콜산, 살리실산, 락트산, 트리클로로아세트산 등을 포함하고 있어도 됨) 등이어도 된다.
또한, 나노 입자에 봉입하는 약물은, 비타민 B, 비타민 E, 기타 비타민류여도 된다. 이들 비타민류에는, 피부를 통한 말초 신경 상해나 말초 순환 장애에 효과가 있다. 비타민 B, 비타민 E, 플라센타 및 카모밀라 ET(카모마일꽃에서 스쿠알란으로 추출하여 얻어지는 추출물)를 함유하는 조성물은, 미백제로서도 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 약물은 1종류만을 사용해도 되고, 2종류 이상을 조합하여 사용해도 된다. 즉, 엑소솜을 회수하기 위한 줄기 세포에 함유시키는 약물 내포 나노 입자는, 1종류만의 약물을 봉입한 것이어도 되고, 2종류 이상의 약물을 조합하여 봉입한 것이어도 된다. 혹은, 본 발명에서 사용하는 엑소솜은, 단일의 약물 내포 나노 입자를 함유하는 줄기 세포로부터 분비된 엑소솜이어도 되고, 각각 다른 약물을 봉입한 약물 내포 나노 입자를 함유하는 줄기 세포로부터 분비된 엑소솜의 혼합물이어도 된다. 상기와 같은 실시 형태에 있어서, 약물의 조합은, 예를 들어 스타틴, 에스트로겐, 비타민 A 및 그의 유도체, 그리고 비타민 C 및 그의 유도체로 이루어지는 군에서 선택되는 2종류 이상의 약물을 포함하는 조합이다.
본 발명에 있어서, 나노 입자의 재료로서 사용할 수 있는 「생체 흡수성 폴리머」는, 약물을 봉입한 나노 입자를 제작할 수 있는 각종 화합물로부터 선택할 수 있다. 그러한 생체 흡수성 폴리머의 대표예로서는, 폴리락트산 중합체(poly lactic acid: PLA) 및 폴리락트산글리콜산 공중합체(poly(lactic-co-glycolicacid): PLGA)를 들 수 있다. PLA는 체 내에서 가수 분해되어 락트산으로 분해되고, PLGA는 체 내에서 가수 분해되어 락트산과 글리콜로 분해되어, 각각 최종적으로 물과 탄산 가스가 되므로, 무해한(생체 독성이 확인되지 않는) 재료로서 바람직하다.
본 발명에 있어서, 약물 봉입 나노 입자는, 줄기 세포의 도입 효율의 관점에서, 광산란법으로 측정하였을 때의 개수 평균 입경이, 통상 1000nm 미만, 바람직하게는 100nm 내지 400nm, 보다 바람직하게는 200nm 내지 400nm가 되도록 제작된다.
약물 봉입 나노 입자는, 상기와 같은 개수 평균 입자 직경을 갖는 것이 얻어지는 방법이면, 어떠한 방법에 의해 제조해도 되지만, 바람직하게는 구형 정석법을 사용하여 제조한다. 구형 정석법은, 화합물 합성의 최종 프로세스에 있어서의 결정의 생성·성장 프로세스를 제어함으로써, 구상의 결정 입자를 설계하고, 그 물성을 직접 제어하여 가공할 수 있는 방법으로서 주지되어 있다. 이 구형 정석법의 하나로, 주지의 에멀션 용매 확산법(ESD법)이 있다.
에멀션 용매 확산법은, 약물을 봉입하기 위한 PLA 또는 PLGA 등의 생체 흡수성 폴리머를 용해 가능한 양용매와, 폴리머를 용해하지 않는 빈용매의 2종의 유기 용매를 사용하여 행해진다. 먼저, 양용매 중에 PLA 또는 PLGA 등의 폴리머를 용해시키고, 이 폴리머가 석출되지 않도록, 약물 용해액을 양용매에 첨가하여 혼합한다. 이 혼합액을 교반되고 있는 빈용매 중에 적하하면, 급속하게 양용매가 빈용매에, 또한 빈용매는 양용매에 상호 확산되기 때문에, 유기 용매상과 수상의 계면이 흐트러져, 양용매가 자기 유화되고, 서브마이크론 사이즈의 에멀션 방울이 형성된다. 그 후, 양용매 및 빈용매의 상호 확산이 더 진행되어, 에멀션 방울 내의 PLA 또는 PLGA 등의 폴리머 및 약물의 용해도가 저하되고, 그 결과, 약물을 포함한 구형 결정 입자의 폴리머 나노 입자가 생성된다.
<줄기 세포>
본 발명에 있어서 「줄기 세포」는, 자기 복제능 및 전능성, 다능성 또는 다분화능을 갖는 세포를 가리키고, 당업자가 이해하는 여러 종류의 줄기 세포가 포함된다. 줄기 세포로서는, 예를 들어 배아 줄기 세포(ES 세포), 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포) 및 간엽계 줄기 세포 등의 체성 줄기 세포를 들 수 있다. 줄기 세포는, 전형적으로는 소정의 1종 또는 2종 이상의 유전자 또는 단백질(소위 마커 유전자 또는 마커 단백질)의 발현이 양성 또는 음성인 것을 가지고, 다른 세포와 구별할 수 있다.
본 발명에 있어서는, 많은 줄기 세포를 보다 간편하면서 대량으로 얻는다는 관점에서, 골수 조직이나 지방 조직 등으로부터 얻어지는 간엽계 줄기 세포, 특히 지방 조직으로부터 얻어지는 간엽계 줄기 세포인 「지방 유래 줄기 세포」를 사용하는 것이 바람직하다. 지방 유래 줄기 세포는, 세포 단독으로 투여되는 것은 이미 임상에서 행해지고 있고, 지방을 비롯하여, 뼈, 간장, 심장 등으로 분화되는 것이 알려져 있다. 지방 유래 줄기 세포는, 지방 흡입 등의 저침습 기술에 의해 얻어지는 피하 지방 등으로부터, 용이하면서 대량으로 추출, 분리할 수 있다. 예를 들어, 채취한 지방 조직을 콜라게나아제 처리한 후에, 원심 비중법에 의해 단핵구 세포만을 회수하고, 회수한 단핵구 세포를 배양 플레이트에서 4일간 정도 배양하고, 접착된 세포를 지방 유래 줄기 세포로서 선택 및 단리할 수 있다. 또한, 지방 유래 줄기 세포는, 채취한 지방 조직으로부터, 셀루션 시스템(사이토리사제)과 같은 전자동형 지방 조직 유래 줄기 세포 추출 기기를 이용하여 추출 및 분리할 수도 있다. 이러한 효율성(경제성)의 관점에서도, 본 발명에 관한 줄기 세포로서 지방 유래 줄기 세포를 사용하는 것은 매우 유리하다.
줄기 세포는, 채취된 조직에 포함되어 있는 세포(초대 배양 세포)여도 되고, 초대 배양 세포를 소정의 횟수, 계대 배양하여 얻어진 세포(계대 배양 세포)여도 된다.
줄기 세포(를 단리하기 위한 조직)의 도너는 인간이어도, 인간 이외의 포유 동물(마우스 등)이어도 되지만, 본 발명에 관한 피부 질환 치료용 조성물을 사용하는 대상과 동일한 생물종인 것이 바람직하다. 특히, 본 발명에 관한 피부 질환 치료용 조성물을 인간(환자)에 대하여 사용하기 위한 의약품, 화장품 등으로서 제조하는 경우에는, 도너는 인간인 것이 바람직하다. 도너는, 피부 질환 치료용 조성물을 사용하는 대상과 동일하여도(자가), 달라도(타가) 된다. 또한, 도너의 성별이나 연령은 특별히 제한되지 않는다.
약물 봉입 나노 입자를 함유하는 줄기 세포는, 예를 들어 줄기 세포가 배양되고 있는 배지 중에 약물 봉입 나노 입자를 첨가한다고 하는, 간편한 처리에 의해 조제할 수 있다. 배지 중의 약물 봉입 나노 입자는, 특별한 시약 등을 사용하지 않아도 용이하게, 파고사이토시스에 의해 줄기 세포의 세포 내에 도입된다. 배지 중의 약물 봉입 나노 입자의 농도, 또는 소정의 수의 줄기 세포에 대한 약물 봉입 나노 입자의 중량은, 사용하는 줄기 세포의 종류나 상태(계대의 횟수 등), 약물 봉입 나노 입자의 성상(약물의 종류, 일정량의 약물 봉입 나노 입자에 포함되어 있는 약물의 중량 등) 등에 따라서, 또한 분비된 엑소솜을 배합한 조성물에 의해 원하는 피부 질환의 치료 효과가 발휘되도록, 적절히 조절할 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에 있어서, 배지 중의 약물 봉입 나노 입자의 농도는, 예를 들어 5 내지 500μg/mL, 바람직하게는 10 내지 200μg/mL, 보다 바람직하게는 20 내지 100μg/mL이다. 본 발명의 일 실시 형태에 있어서, 50000개의 줄기 세포(대표적으로는 지방 유래 줄기 세포)당 배지 중의 약물 봉입 나노 입자의 중량은, 예를 들어 5 내지 1000μg, 바람직하게는 10 내지 500μg, 보다 바람직하게는 25 내지 300μg이다. 약물 봉입 나노 입자에의 약물의 봉입율(일정 중량의 약물 봉입 나노 입자에 대한, 거기에 봉입되어 있는 약물의 중량 비율)을 상기 약물 봉입 나노 입자의 중량에 곱하면, 약물 봉입 나노 입자의 수치 범위는, 봉입되어 있는 약물의 수치 범위로 환산할 수 있다.
약물 봉입 나노 입자를 함유하는 줄기 세포는, 유주능, 증식능 및 면역 제어능 등의 기능이 증강됨과 함께, 혈관 신생에 관여하는 인자(예를 들어, FGF-2 등의 FGF(섬유아세포 증식 인자); VEGF-A, VEGF-C 등의 VEGF(혈관 내피 증식 인자); HGF(줄기 세포 증식 인자) 등)와 같이, 피부 질환의 치료에 있어서 유용한 인자의 산생능이 증강되고 있다. 본 발명에 있어서 사용되는, 그렇게 하여 증강된 줄기 세포로부터 분비된 엑소솜에는, 나노 입자에 봉입되어 있던 약물과 함께, 줄기 세포에 의해 산생되는 각종 인자, 특히 피부 질환의 치료에 있어서 유용한 혈관 신생 인자가 내포되어 있다. 또한, 생체 흡수성 폴리머를 포함하는 나노 입자는, 통상은 세포 내에서 분해되기 때문에, 세포 외에 분비되는 엑소솜에는 내포되어 있지 않다.
엑소솜은, 예를 들어 약물 봉입 나노 입자가 첨가된 배지 중에서 줄기 세포를 소정의 기간 배양하고, 필요에 따라서 소정의 횟수 계대 배양한 후, 배지로부터 공지된 방법을 사용하여 회수할 수 있다. 약물 봉입 나노 입자가 첨가된 배지 중에서의 줄기 세포의 배양 기간은 적절하게 조절할 수 있지만, 통상은 4 내지 5일간 정도이다. 또한, 약물 봉입 나노 입자가 첨가된 배지 중에서 줄기 세포를 배양하였을 때의 배지로부터 회수되는 엑소솜보다도, 그 줄기 세포를 (약물 봉입 나노 입자가 첨가되지 않은 통상의 배지 중에서) 1대 더, 2대 더, 또는 그 이상, 계대 배양 하였을 때의 배지로부터 회수되는 엑소솜쪽이, 줄기 세포에 의해 산생된 각종 인자(혈관 신생 인자 등) 및/또는 나노 입자에 봉입되어 있던 약물을 고농도로 포함하는 경우가 있다. 목적으로 하는 엑소솜이 그러한 성질의 것일 때는, 필요한 횟수, 계대 배양을 행한 후에, 엑소솜을 회수하는 것이 바람직하다. 엑소솜의 회수는, 예를 들어 원심 분리 등, 공지된 수단을 사용하여 행할 수 있다.
<피부 질환 치료용 조성물>
본 발명에 있어서 「피부 질환」이란, 피부에 있어서의 이상이나 손상을 발생하는 질환 또는 피부에 발생한 이상이나 손상 등의 증상, 상태 등을 말하고, 피부 그 자체의 이상이나 손상에 관한 것뿐만 아니라, 피부에 있어서의 모발에 관한 이상 등도 포함한다. 그러한 피부 질환(증상, 상태 등)으로서는, 예를 들어 중증 화상 등에 의한 피부 손상, 욕창 등의 난치성 피부 궤양, 방사선 궤양, 원형 탈모증이나 항암제의 부작용에 의한 탈모 등의 탈모증 및 무모증 등을 들 수 있다. 또한, 상기 피부나 모발의 이상이나 손상(증상, 상태 등)에는, 노화에 의한 것도 포함된다.
본 발명에 있어서 「치료」란, 피부 질환(질환 자체 또는 질환에 수반하는 증상, 상태 등)에 대하여 완전히 또는 부분적으로 치유하는 것, 경감 혹은 개선하는 것, 진행을 감속시키는 것, 발생을 지연시키거나 혹은 예방하는 것, 발생의 리스크를 저감하는 것 등의 효과, 또는 그들의 조합을 포함한다. 상기와 같은 광범위한 개념을 포함하는 관점에서, 「치료」[therapeutical treatment]라는 용어는, 협의의 치유[cure] 등과 동일한 의미로 해석되어서는 안되고, 「처치」[treatment]라는 용어로 치환할 수도 있다.
스타틴은, 그 자체가 혈관 신생을 촉구하는 효과를 가짐과 함께, 줄기 세포에 작용하여 각종 기능을 증강하고, 특히 혈관 신생 인자의 생성 능력을 향상시킬 수 있다. 따라서, 스타틴 봉입 나노 입자를 함유하는 줄기 세포로부터 분비되는 엑소솜에는, 스타틴 자체를 포함하고, 혈관 신생을 촉진시키는 인자 및 물질을 풍부하게 포함시킬 수 있다. 그러한 엑소솜의 유효량을 배합함으로써, 탈모증, 무모증, 기타 혈관 신생이 치료상 유효한 질환에 대한 효과가 우수한 피부 질환 치료용 조성물을 조제할 수 있다.
또한, 에스트로겐은, 섬유아세포로부터 콜라겐의 산생을 재촉하거나, 혈관 신생을 촉진시키는 효과를 갖이다. 따라서, 에스트로겐 봉입 나노 입자를 함유하는 줄기 세포로부터 분비되는 엑소솜에는, 에스트로겐 자체를 포함하여, 혈관 신생이나 진피의 재생을 재촉시킬 수 있는 인자 및 물질을 풍부하게 내포시킬 수 있다. 그러한 엑소솜의 유효량을 배합함으로써, 피부 손상, 피부 궤양, 기타 혈관 신생이나 진피의 재생이 치료상 유효한 질환에 대한 효과가 우수한 피부 질환 치료용 조성물을 조제할 수 있다.
그 밖에도, 비타민 A 또는 그의 유도체(레티노산 등)나, 비타민 C 또는 그의 유도체(팔미트산아스코르빌 등)를 봉입한 나노 입자를 줄기 세포에 함유시킨 경우에도, 분비되는 엑소솜에는, 그들의 화합물과 함께, 혈관 신생 및/또는 진피 재생을 촉진시키는 작용을 갖는 인자 등이 풍부하게 내포되어 있으며, 그 엑소솜을 사용함으로써 상술한 스타틴 및/또는 에스트로겐과 마찬가지의 질환에 대한 효과가 우수한 피부 질환 치료용 조성물을 조제할 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에 있어서, 피부 질환으로서 탈모증 또는 무모증을 치료하기 위한 조성물에 대하여, 약제 봉입 나노 입자에 봉입하는 약물은, 스타틴, 비타민 A 및 그의 유도체, 그리고 비타민 C 및 그의 유도체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 약물을 포함한다. 본 발명의 일 실시 형태에 있어서, 피부 질환으로서 피부 손상 또는 피부 궤양을 치료하기 위한 조성물에 대하여, 약제 봉입 나노 입자에 봉입하는 약물은, 에스트로겐, 그리고 비타민 A 및 그의 유도체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종류의 약물을 포함한다.
본 발명에 관한 피부 질환 치료용 조성물은, 각국의 법제도에 따라서, 의약품, 화장품, 또는 그들의 중간적인 위치 부여인 의약부외품(약용 화장품) 등의 분류에 따른, 또한 각종 피부 질환을 치료 대상으로 하여 표방한, 각종 조성물로서 제조할 수 있다. (약용) 화장품으로서의 피부 질환 치료용 조성물은, 예를 들어 가령(加齡)에 의한 피부의 노화를 예방하는 것 등, 소위 안티에이징을 목적으로 한 제품으로 해도 된다.
본 발명에 관한 피부 질환 치료용 조성물의 제형 또는 투여 경로는 적절히 선택할 수 있지만, 환부의 피부에 직접적으로 도포하는 외용제, 바꿔 말하면 경피 투여에 사용되는 제형으로 하는 것이 적합하다. 피부 질환 치료용 조성물을 외용제(경피 투여용)로 함으로써, 엑소솜에 내포되어 있는 각종 성분을 환부 주위에 국소적으로 작용시킬 수 있는, 즉, 비교적 낮은 농도로 치료 효과를 발휘시킬 수 있기 때문에, 당해 성분을 고농도에서 함유하는 전신 투여용의 제형으로 한 경우에 염려되는 부작용을 회피할 수 있다. 그러나, 그러한 문제가 없으면, 본 발명에 관한 피부 질환 치료용 조성물을, 예를 들어 주사제(정맥 내 투여용)로서 제조하는 것도 가능하다.
또한, 본 출원의 우선권 서류에 기재되어 있는 피부 질환 치료용의 「의약 조성물」[a pharmaceutical composition]은, 상기한 바와 같이 의약품[a drug], 의약부외품[a quasi-drug], 화장품[a cosmetic] 등으로서 제조할 수 있는, 본 발명의 피부 질환 치료용의 「조성물」[a composition]에 상당하는 개념이다.
피부 외용제의 제형으로서는, 예를 들어 액제, 스프레이제, 연고제, 크림제, 겔제, 첩부제 등을 들 수 있다. 또한, 피부 외용제가 (약용) 화장품인 경우에는, 예를 들어 화장수, 크림, 유액, 미용액, 세안료 등의 기초 화장품; 화장 기초 등의 메이크업 화장품; 샴푸, 컨디셔너, 정발제 등의 헤어 케어 제품, 미백제, 탈모제 등의 기타 화장료를 들 수 있다.
본 발명에 관한 피부 질환 치료용 조성물은, 그의 분류(의약품, 의약부외품, 화장품 등)나 제형에 따라서, 약물 봉입 나노 입자를 함유하는 줄기 세포(나노 입자 함유 줄기 세포)로부터 분비된 엑소솜과, 그 이외의 성분을 포함할 수 있다. 피부 질환 치료용 조성물 중의 엑소솜의 함유량은, 사용하는 엑소솜의 성상(특히, 엑소솜에 내포되어 있는 성분의 종류나 농도) 등을 고려하면서, 의약품, 의약부외품 또는 화장품 등으로서 기대되는 효과를 발휘하는 데 유효한 양이면 되고, 당업자라면 일반적으로 행해지고 있는 시험을 통해 적절하게 조절할 수 있다.
엑소솜 이외의 성분으로서는, 예를 들어 안정화제, 보존제, 완충제, pH 조정제, 부형제 등, 의약품, 의약부외품, 화장품 등의 제조에 일반적으로 사용되는 첨가제(바람직하게는 외용제(경피 투여용 조성물)의 제조에 사용되고 있는 첨가제)를 들 수 있다. 그러한 엑소솜 이외의 성분의 함유량도, 당업자라면 적절히 조절할 수 있다.
본 발명에 관한 피부 질환 치료용 조성물은, 약물이 생체 흡수성 폴리머를 포함하는 나노 입자에 봉입되어 이루어지는 약물 봉입 나노 입자를 줄기 세포에 함유시키는 공정, 및 당해 줄기 세포로부터 분비된 엑소솜을 회수하는 공정을 포함하는 제조 방법에 의해 제조할 수 있다. 피부 질환 치료용 조성물의 제조 방법에 관한 일반적인 사항, 예를 들어 상기 이외의 공정이나, 각 공정에 사용되는 기기, 제조 조건 등은, 공지된 엑소솜을 함유하는 피부 질환 또는 기타 치료용 조성물의 제조 방법에 준한 것으로 할 수 있다.
실시예
이하에, 본 발명에서 사용되는 약물 봉입 나노 입자 및 그것을 함유하는 줄기 세포의 조제나, 당해 나노 입자 함유 줄기 세포로부터 분비된 엑소솜을 배합한 피부 질환 치료용 조성물의 제조 및 치료 효과 등을 상세하게 설명하기 위한 실시예를 나타낸다.
[제작예 1] 스타틴(심바스타틴) 봉입 나노 입자의 제작
약물로서 스타틴(심바스타틴)을 사용하고, 나노 입자의 재료로서 폴리락트산 중합체(PLA) 또는 폴리락트산·글리콜산 공중합체(PLGA)를 사용한, 스타틴 봉입 나노 입자를 이하의 수순으로 제작하였다.
PLA(중량 평균 분자량 10000) 50mg 및 심바스타틴 10mg을, 아세톤 2mL 및 에탄올 0.5mL의 혼합액에 용해시켜 폴리머 용액으로 하였다. 얻어진 폴리머 용액을, 실온, 500rpm으로 교반되고 있는 2wt％ PVA 용액 25mL 중에 적하하고, 심바스타틴 봉입 PLA 나노 입자 현탁액을 얻었다. 계속해서 실온, 500rpm으로 약 16시간(16 내지 24시간 동안), 교반을 계속하면서, 유기 용매(아세톤, 에탄올)를 증류 제거하였다. 용매 증류 제거 후, 현탁액을 4℃, 60000g으로 30분간 원심 분리하고, 침전물을 회수하여 증류수에 재현탁시켰다. 이 원심 분리와 증류수의 재현탁의 조작은 합계 3회 행하였다. 그 후, 현탁액을 밤새 동결 건조시켜, 심바스타틴 봉입 PLA 나노 입자를 얻었다. 심바스타틴은 1mg의 PLA 나노 입자 중에 24.94μg 봉입되었다.
또한, 나노 입자의 재료로서 PLA 대신에 동량의 PLGA(중량 평균 분자량 6500)를 사용하고, 그 이외에는 상기 심바스타틴 봉입 PLA 나노 입자와 마찬가지의 제작 방법에 의해, 심바스타틴 봉입 PLGA 나노 입자도 제작하였다.
[제작예 2] 에스트로겐(에스트라디올: E2) 봉입 나노 입자의 제작
약물로서 심바스타틴 10mg 대신에 에스트라디올(E2) 10mg을 사용하고, 그 이외에는 제작예 1의 심바스타틴 봉입 PLGA 나노 입자와 마찬가지의 제작 방법에 의해, 에스트라디올 봉입 PLGA 나노 입자를 제작하였다.
[제작예 3] 비타민 C 봉입 나노 입자의 제작
약물로서 심바스타틴 10mg 대신에 비타민 C(팔미트산아스코르빌) 10mg을 사용하고, 그 이외에는 제작예 1의 심바스타틴 봉입 PLGA 나노 입자와 마찬가지의 제작 방법에 의해, 비타민 C 봉입 PLGA 나노 입자를 제작하였다.
[제작예 4] 레티노산 봉입 나노 입자의 제작
약물로서 심바스타틴 10mg 대신에 레티노산 10mg을 사용하고, 그 이외에는 제작예 1의 심바스타틴 봉입 PLGA 나노 입자와 마찬가지의 제작 방법에 의해, 레티노산 봉입 PLGA 나노 입자를 제작하였다.
[제작예 5] 로다민 봉입 나노 입자의 제작
모의 약물로서 심바스타틴 10mg 대신에 로다민(적색 형광 색소) 10mg을 사용하고, 그 이외에는 제작예 1의 심바스타틴 봉입 PLA 나노 입자 및 심바스타틴 봉입 PLGA 나노 입자와 마찬가지의 제작 방법에 의해, 로다민 봉입 PLA 나노 입자 및 로다민 봉입 PLGA 나노 입자를 제작하였다.
[참고예 1] 로다민 봉입 PLA 나노 입자를 사용한 지방 유래 줄기 세포의 처리
후기 참고예 2(스타틴(심바스타틴) 봉입 나노 입자를 사용한 지방 유래 줄기 세포의 처리)의 예비 시험으로서, 지방 유래 줄기 세포를 약물(스타틴) 봉입 나노 입자를 처리할 때의 최적인 처리 농도를 검토하기 위해서, 모의 약물로서 로다민을 봉입한, 제작예 5에 의해 얻어진 로다민 봉입 나노 입자를 사용하여, 이하의 시험을 행하였다.
당해 시험을 행하기 위해서, 먼저, 콜라게나아제 처리 및 원심 비중법을 이용한 주지의 방법을 사용하여, 구체적으로는 이하의 수순에 의해, 인간 지방 조직 및 마우스 지방 조직 각각으로부터 지방 유래 줄기 세포(Adipose derived Stem Cell: AdSC)를 얻었다.
(인간 지방 조직으로부터의 지방 유래 줄기 세포의 단리)
미리, LiberaseTM RG(0.5mg/mL=0.47WU/mL, Sigma5401127001 50mg/vial)/HBSS(ThermoFisher14175095) 용액, 및 10×용혈 용액(NH4Cl 8.3g, NaHCO3 1.2g, 0.5M EDTA 용액 200μL/100mL)을 준비하였다. 50mL 흡인 주사기 내의 지방 3개(150mL, 65세 여성으로부터 채취)를 노즐 구비 플라스틱 보틀(애즈원 #1-4640-03 광구 세정병 1000ml)에 옮기고, 등량의 PBS(-)로 세정·폐액을 4, 5회 반복하였다. 상기 Liberase TM RG 용액(50mg/vial을 20mL의 HBSS로 용해시키고, 절반량 10mL를 HBSS 40mL(합계 50mL)로 희석한 후에 약 150mL의 지방 조직에 사용하였다.)을 지방 용액의 보틀에 넣어, 가볍게 Vortex하고 나서 셰이커 구비 항온조를 사용하여 37℃에서 20분간 진탕 인큐베이션하였다. 그 후, 20％ FBS/DMEM F12 50mL를 해당 보틀 내에 첨가하여, 효소 반응을 정지시켰다. 보틀의 노즐로부터 액층(지방의 하층)을 셀 스트레이너(100㎛, BD)에 통과시키면서 복수의 새로운 50mL 튜브에 나누어 회수하였다. 1200rpm(300g)×5min으로 원심(브레이크 있음)하고, 상청을 버렸다. 1mM EDTA/PBS 40mL/튜브로 세포 펠릿을 현탁시키고, 셀 스트레이너(40㎛, BD)에 통과시키면서 동일수의 새로운 50mL 튜브에 옮겼다. 1200rpm(300g)×5min으로 원심(브레이크 있음)하고, 상청을 버렸다. 1mM EDTA/PBS 2ml로 세포를 현탁시켜 1개의 튜브에 모으고, 용혈 용액 8mL를 첨가하여 혼화 후 10분간 냉소(OnIce) 보존하였다(용혈 조작). 1mM EDTA/PBS를 45mL 부근까지 첨가한 후, 1200rpm(300g)×5min으로 원심하고, 상청을 버렸다. 세포 펠릿을 PBS(-) 또는 10％ DMEM F12로 현탁시키고, 5％ CO2 인큐베이터에서 10％ DMEMF12와 함께 3, 4일간 배양하고, 접착 세포를 지방 유래 줄기 세포(AdSC)로서 실험에 사용하였다(P0). 계대 배양하는 경우에는, 1:3 내지 4의 비율(3000-4000/cm2의 밀도)로 3, 4일간 더 계대 배양하였다.
(마우스 지방 조직으로부터의 지방 유래 줄기 세포의 단리)
미리, 콜라게나아제 VIII형(2mg/mL, Sigma #C2139)/1％ BSA HBSS 용액을 셰이커 구비 항온조 37℃에서 해동하였다. 또한, 1mM EDTA/PBS는, EDTA(0.5M EDTA, pH 8.0, LifeTechnologies, AM9260G), 10X DPBS, Ca(-), Mg(-)(GIBCO, 14200-166)를 희석하여 제작하였다. 그 후, 2, 3마리의 마우스를 마취 후에 심와부로부터 26 내지 29G 바늘 구비 시린지(인슐린 시린지 등)로 탈혈사(脫血死)시켰다. 피하 지방(서경부(鼠徑部) 내지 배부(背部)를 채취하여 3.5cm 배양 접시(생리 식염수를 중앙에 1방울 적하하여 지방 조직이 취출되기 쉽게 하여 둠)에 모아 두었다. 지방 조직을 덮개 상에 올려놓은 채 가위로 소편(20 내지 30회 정도)이 되게 커트한 후, 지방 조직을 지방과 동일한 체적의 콜라게나아제 용액과 함께 15mL 튜브에 넣었다. 캡을 닫고, 튜브를 전도 혼화 후에 셰이커 구비 항온조를 사용하여 37℃에서 30분간 인큐베이션하였이다. 10％ FBS/DMEM F12 배지를 동량 첨가하여 효소 반응을 정지시켰다. 최상부의 지방층을 흡인 제거한 후에, 상청을 셀 스트레이너(40㎛, BD, 352340)에 통과시켜 새로운 50mL 튜브에 회수하였다. 1200rpm(250g)×5min으로 원심(브레이크 있음)하고, 상청을 버렸다. 1mM EDTA/PBS(-)를 10ml까지 튜브에 첨가하여 세포 펠릿을 현탁하였다. 1200rpm(250g)×5min으로 원심(브레이크 있음)하고, 상청을 버렸다. 세포 펠릿을 10％ FBS/DMEM F12 배지로 현탁시키고 나서 배양 접시에 파종하였다(P0). 5％ CO2 인큐베이터에서 3, 4일간 배양하고, 접착 세포를 AdSC로 하여 1:1로 계대(P1)하였다. 5％ CO2 인큐베이터에서 4, 5일간 배양하고, 접착 세포를 AdSC로 하여 1:3으로 계대(P2)하였다. 80 내지 90％ 정도까지 세포 밀도가 증가한 시점에서 실험에 사용하였다.
(로다민 봉입 나노 입자의 도입)
상기 방법에 의해 얻어진 인간 지방 유래 줄기 세포의 배지에, 제작예 5에 의해 얻어진 로다민 봉입 PLA 나노 입자를, 그의 최종 농도가 20μg/mL, 50μg/mL, 80μg/mL 또는 100μg/mL가 되게 첨가하였다. 첨가로부터 1시간 후(1h) 또는 2시간 후(2h)에, 로다민 봉입 PLA 나노 입자의 도입에 대하여 공초점 레이저 형광 현미경을 사용하여 관찰하였다. 또한, 핵의 염색은 DAPI를 사용하여 통상의 방법으로 염색하였다. 그 결과를 도 1에 도시한다.
한편, 상기 방법에 의해 얻어진 마우스 지방 유래 줄기 세포의 배지에, 제작예 5에 의해 얻어진 로다민 봉입 PLGA 나노 입자를, 그의 최종 농도가 20μg/mL, 50μg/mL, 75μg/mL 또는 100μg/mL가 되게 첨가하였다. 첨가로부터 30분 후에 FACS 장치(BD FACSAria, BD Biosceinces) 및 해당 장치에 부속된 해석 소프트웨어를 사용하여, 플로우 사이토메트리 해석을 하였다. 그 결과를 도 2에 도시한다.
도 1에 도시한 바와 같이, 로다민 봉입 PLA 나노 입자는, 어느 농도에서도 인간 지방 유래 줄기 세포에 도입된 것을 알 수 있다. 단, 인간 지방 유래 줄기 세포의 로다민 봉입 PLA 나노 입자의 도입량은 처리 농도 의존적으로 증대되고 있으며, 특히 100μg/mL의 농도에 있어서 다량의 로다민 봉입 PLA 나노 입자가 인간 지방 유래 줄기 세포에 도입되어 있는 것이 확인되었다. 또한, 처리 시간이 1시간인 경우보다도 2시간인 경우쪽이, 인간 지방 유래 줄기 세포의 로다민 봉입 PLA 나노 입자의 도입량이 많은 것도 알 수 있다.
마찬가지로, 도 2에 도시한 바와 같이, 로다민 봉입 PLGA 나노 입자는, 어느 농도에서도 마우스 지방 유래 줄기 세포에 도입되지만, 그 도입량은 처리 농도 의존적으로 증대된 것을 알 수 있다.
[참고예 2] 스타틴(심바스타틴) 봉입 나노 입자를 사용한 지방 유래 줄기 세포의 처리
(지방 유래 줄기 세포로부터 배지 중으로의 스타틴의 방출)
스타틴(심바스타틴) 봉입 나노 입자를 도입한 지방 유래 줄기 세포로부터, 심바스타틴이 어떻게 방출되는지를 검토하기 위해서, 배지 중에 방출된 심바스타틴의 양을 경시적으로 측정하였다. 구체적인 수순은 다음과 같다. 참고예 1과 마찬가지로, 인간 지방 유래 줄기 세포의 배지에, 100μg/mL의 농도로 심바스타틴 봉입 PLA 나노 입자를 첨가하여 1시간 배양하였다. 그 후, 배지를 교환하고, 배지 교환으로부터 6시간 후, 18시간 후, 24시간, 48시간, 72시간, 120시간, 168시간 및 336시간 후에, 심바스타틴 봉입 PLA 나노 입자를 함유하는 인간 지방 유래 줄기 세포로부터 배지 중에 방출된 심바스타틴의 양을 HPLC(High-pressure Liquid Chromatography)법에 의해 측정하였다. 결과를 도 3에 도시한다.
또한, 마우스 지방 유래 줄기 세포의 배지에, 50μg/mL의 농도로 심바스타틴 봉입 PLGA 나노 입자를 첨가하여 30분간 배양하고, 그 이외에는 상기와 마찬가지의 방법으로, 심바스타틴 봉입 PLGA 나노 입자를 함유하는 마우스 지방 유래 줄기 세포로부터 배지 중에 방출된 심바스타틴의 양을 측정하였다. 결과를 도 4에 도시한다.
도 3에 도시한 바와 같이, 배지 교환으로부터 24시간 후까지의 사이에 약 60％ 정도의 심바스타틴이 인간 지방 유래 줄기 세포로부터 방출되고, 약 336시간 후에는 거의 모든 심바스타틴이 방출되었다. 이 결과로부터, 인간 지방 유래 줄기 세포에 도입된 심바스타틴 봉입 PLGA 나노 입자에 봉입되어 있던 심바스타틴은, 완만하게 서방되어, 그의 거의 모두가 방출되는 것을 알 수 있다.
한편, 마우스 지방 유래 세포에 있어서도, 도 4에 도시한 바와 같이, 인간 지방 유래 줄기 세포의 경우와 마찬가지로, 배지 교환으로부터 24시간 후까지의 사이에 약 60％ 정도의 심바스타틴이 마우스 지방 유래 줄기 세포로부터 방출되고, 약 336시간 후에는 거의 모든 심바스타틴이 방출되었다. 이 결과로부터, 마우스 지방 유래 줄기 세포에 도입된 심바스타틴 봉입 PLA 나노 입자에 봉입되어 있던 심바스타틴도, 완만하게 서방되어, 그의 거의 모두가 방출되는 것을 알 수 있다.
(지방 유래 줄기 세포의 혈관 신생 인자 산생능에 대한 효과)
이어서, 심바스타틴 봉입 나노 입자에 의한 지방 유래 줄기 세포의 혈관 신생 인자 산생능에 대한 효과에 대하여 검토하기 위해서, 하기 수순으로, 지방 유래 줄기 세포 내에 있어서의 혈관 신생 인자의 mRNA 발현량에 대하여 정량 PCR법을 사용하여 해석하였다. 본 해석에서는, 혈관 신생 인자로서 VEGF-A, VEGF-C 및 FGF-2의 세포 내 mRNA 발현량을 측정하였다.
먼저, 지방 유래 줄기 세포를 배양하는 배양 배지 중에 심바스타틴 봉입 PLA 나노 입자를 20μg/mL, 50μg/mL 또는 100μg/mL의 농도가 되도록 첨가하였다. 24시간 후에 각 농도로 처리된 세포를 회수하고, NucleoSpinRNA 키트(다카라 바이오)를 사용하여, 그들 세포에 포함되는 전체 RNA를 추출하였다. ReverTra Ace qPCR RT 키트(TOYOBO)를 사용하여, 추출된 RNA로부터 cDNA를 합성한 후, 각 혈관 신생 인자(VEGF-A, VEGF-C 및 FGF-2)의 DNA 서열에 대응한 프라이머를 사용하여, 정량 PCR법에 의해 각 세포 집단에 있어서의 VEGF-A, VEGF-C 및 FGF-2의 mRNA 발현량을 측정하였다. 정량 PCR법은, cDNA 용액에 SsoFastEvaGreen Mastermix 시약(바이오래드)과 각 혈관 신생 인자에 대응한 정방향 및 역방향 프라이머를 첨가하고, 서멀 사이클러(CFXConnect 바이오래드)를 사용하여 PCR 반응(95℃ 30초를 1 사이클, 95℃ 5초/56℃ 5초를 40 사이클)시켜 행하였다. 그 측정 결과를 도 5에 도시한다. 또한, 결과는, GAPDH의 mRNA 발현량을 기준으로 한 상기 각 인자의 발현량의 비율을 나타내고 있다. VEGF-A, VEGF-C 및 FGF-2의 정량에 사용한 정방향 및 역방향 프라이머의 염기 서열은 하기와 같다.
VEGF-A용 정방향 프라이머:
5'-TTACTCTCACCTGCTTCT-3'(서열 번호 1)
VEGF-A용 역방향 프라이머:
5'-CTGCTTCTTCCAACAATG-3'(서열 번호 2)
VEGF-C용 정방향 프라이머:
5'-TCAAGGACAGAAGAGACTA-3'(서열 번호 3)
VEGF-C용 역방향 프라이머:
5'-CCACATCTATACACACCTC-3'(서열 번호 4)
FGF-2용 정방향 프라이머:
5'-TTCTTCCAATGTCTGCTAA-3'(서열 번호 5)
FGF-2용 역방향 프라이머:
5'-RGACCAATTATCCAAACTGAG-3'(서열 번호 6)
도 5의 (a)에 나타내는 바와 같이, VEGF-A의 mRNA 발현량은, 심바스타틴 봉입 나노 입자를 20μg/mL(Statin20), 50μg/mL(Statin50) 및 100μg/mL(Statin100)의 어느 농도로 처리한 경우에도, 미처리인 컨트롤군(Control)과 비교하여 증대되고, 특히 심바스타틴 봉입 나노 입자를 100μg/mL의 농도로 처리한 경우에 현저한 증대가 확인되었다.
또한, 도 5의 (b)에 나타내는 바와 같이, VEGF-C의 mRNA 발현량은, 심바스타틴 봉입 나노 입자를 20μg/mL(Statin20), 50μg/mL(Statin50) 및 100μg/mL(Statin100)의 어느 농도로 처리한 경우에도, 미처리인 컨트롤군(Control)과 비교하여 증대되고, 특히 심바스타틴 봉입 나노 입자를 50μg/mL 또는 100μg/mL의 농도로 처리한 경우에 현저한 증대가 확인되었다.
마찬가지로, 도 5의 (c)에 나타내는 바와 같이, FGF-2의 mRNA 발현량도, 심바스타틴 봉입 나노 입자를 20μg/mL(Statin20), 50μg/mL(Statin50) 및 100μg/mL(Statin100)의 어느 농도로 처리한 경우에도, 미처리인 컨트롤군(Control)과 비교하여 증대되고, 특히 심바스타틴 봉입 나노 입자를 50μg/mL 또는 100μg/mL의 농도로 처리한 경우에 현저한 증대가 확인되었다. 이들 결과로 심바스타틴 봉입 PLA 나노 입자에 의해, 지방 유래 줄기 세포의 혈관 신생 인자 산생능이 항진되는 것이 나타났다.
이상과 같이, 스타틴 봉입 나노 입자로 처리함으로써, 지방 유래 줄기 세포의 혈관 신생 인자의 산생능을 증강시킬 수 있고, 또한 지방 유래 줄기 세포에 도입된(스타틴 봉입 나노 입자에 봉입되어 있었던) 스타틴은 경시적으로 당해 세포로부터 방출되는 것이 확인되었다. 이 참고예 2의 결과로부터, 스타틴 봉입 나노 입자를 함유하는 지방 유래 줄기 세포는, 나노 입자에 봉입되어 있는 약제와 함께 피부 질환의 치료에 유효한 성분을 많이 함유하는, 피부 질환 치료용 조성물을 제조하기 위해 이용할 수 있는 것을 나타내고 있다.
[실시예 1] 스타틴(심바스타틴) 봉입 나노 입자를 함유하는 지방 유래 줄기 세포로부터 분비된 엑소솜을 포함하는 피부 질환(탈모증 등) 치료용 조성물
이하의 수순으로, 스타틴 봉입 나노 입자를 도입한 지방 유래 줄기 세포로부터 분비된 엑소솜을 포함하는 피부 질환 치료용 조성물을 제조하고, 그 피부 질환(탈모증 등)에 대한 치료 효과에 대하여 평가하였다.
(시험 조성물 S1의 제조)
1×106개의 인간 지방 유래 줄기 세포(참고예 1 참조)를, 심바스타틴을 PLGA 나노 입자에 봉입한 스타틴 봉입 나노 입자(심바스타틴 봉입 PLGA 나노 입자, 제작예 1 참조) 2mg과 1시간 공배양하였다. 그 후, 그 인간 지방 유래 세포를 72시간 배양하여, 배지를 회수하고, 초원심법(210,000 RCF)에 의해 그 배지로부터 엑소솜을 분리하였다. 분리한 엑소솜을 5％ 글리세린 수용액에 첨가 및 혼합하여, 시험 조성물 S1을 제조하였다.
(시험 조성물 S1의 탈모증 등에 대한 치료 효과의 평가)
ICR 마우스에 대하여, 300mg/kg의 트리브로모에탄올을 복강 내 투여하여 마취하고, 앙와위에 고정하였다. 그 마우스의 배부의 피부에, 시험 조성물 S1을 1회 도포하고, 그 1주일 후에 피부의 상태를 관찰하였다. 또한, 엑소솜을 포함하지 않는 5％ 글리세린 수용액(대조 조성물 A1)을 도포한 ICR 마우스, 및 스타틴 봉입 나노 입자로 처리되지 않은 인간 지방 유래 세포의 엑소솜을 포함하는 5％ 글리세린 수용액(대조 조성물 A2)을 도포한 ICR 마우스를 대조로 하여, 피부의 상태를 비교하였다. 그 결과를 도 6에 나타낸다.
도 6에 나타내는 바와 같이, 대조 조성물 A1을 도포한 ICR 마우스(Control)에서는, 전혀 발모가 확인되지 않았다. 대조 조성물 A2를 도포한 ICR 마우스(hAdSC)에서는, 약간 발모가 확인되었다. 한편, 시험 조성물 S1을 도포한 ICR 마우스(SimNP-hAdSC)에서는, 배부의 전체적으로 발모가 확인되었다.
또한, 각 조성물의 발모 및 육모 효과를 평가하기 위해서, 제14 염색체의 Hr 유전자의 인트론 6에 변이를 갖고, 체모를 갖지 않는 헤어리스 마우스(HR-1)를 사용하여 상기 시험과 마찬가지의 시험을 행하였다. 구체적으로는, 상기 시험과 마찬가지로 마취하고, 앙와위에 고정한 HR-1 마우스의 배부의 피부에, 상기 시험과 마찬가지의 시험 조성물 S1, 대상 조성물 A1 또는 A2를 1회 도포하였다. 그의 2주일 후에 피부의 상태를 관찰하고, 비교하였다. 그 결과를 도 7에 나타낸다.
도 7에 나타내는 바와 같이, 대상 조성물 A1을 도포한 HR-1 마우스(Control)에서는, 발모가 확인되지 않았다. 또한, 대상 조성물 A2를 도포한 HR-1 마우스(hAdSC)에서는, control과 비교하여 약간 체모의 증대가 확인되었다. 한편, 시험 조성물 S1을 도포한 HR-1 마우스(SimNP-hAdSC)에서는, hAdSC와 비교하여 더욱 체모의 증대가 확인되고, 즉, 발모 촉진 효과가 확인되었다.
이상의 결과로부터, 스타틴 봉입 나노 입자로 처리된 지방 유래 세포의 엑소솜에는, 높은 발모 및 육모 효과가 확인되기 때문에, 탈모증 및 무모증 등에 유효하다고 할 수 있다.
[실시예 2] 스타틴(심바스타틴) 봉입 나노 입자 또는 에스트로겐(에스트라디올: E2) 봉입 나노 입자를 함유하는 지방 유래 줄기 세포로부터 분비된 엑소솜을 포함하는 피부 질환(피부 손상 등) 치료용 조성물
(시험 조성물 E1의 제조)
심바스타틴 봉입 PLGA 나노 입자(제작예 1 참조) 대신에 에스트라디올 봉입 PLGA 나노 입자(제작예 2 참조)를 사용한 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 하여, 인간 지방 유래 줄기 세포의 엑소솜을 얻었다. 당해 엑소솜을 5％ 글리세린 수용액에 첨가 및 혼합하여, 시험 조성물 E1을 제조하였다.
(시험 조성물 S1 및 E1의 피부 손상 등에 대한 치료 효과의 평가)
미리, 마취 하에서 DDY 마우스를 복와위로 유지하고, 배부의 좌우의 복벽을 절개한 후에 양측 난소를 적출하고, 2개월 통상 사육함으로써 난소 적출 DDY 마우스를 제작하였다. 난소를 적출된 DDY 마우스는 피부 조직의 재생능이 적아지는 특징을 갖는다.
난소 적출 DDY 마우스의 피부에, 실시예 1과 마찬가지의 시험 조성물 S1 또는 실시예 2에 있어서 상기와 같이 하여 새롭게 조제한 시험 조성물 E1을, 3회/주의 빈도로 도포하였다. 도포 개시 2주일 후에, 마우스의 피부의 일부를 채취하여 4％ 파라포름알데히드 용액으로 6시간 고정한 후에 통상의 방법으로 박절 조직 표본을 제작하고, 광학 현미경으로 관찰하였다. 박절 조직 표본 중의 피부 조직은, 맛손 트리크롬 염색에 의해, 콜라겐을 산생하는 섬유아세포가 염색되어 있다. 또한, 실시예 1의 경우와 마찬가지로, 엑소솜을 포함하지 않는 5％ 글리세린 수용액(대조 조성물 A1)을 도포한 난소 적출 DDY 마우스, 및 스타틴 봉입 나노 입자로도 에스트라디올 봉입 PLGA 나노 입자로도 처리되지 않은 인간 지방 유래 세포의 엑소솜을 포함하는 5％ 글리세린 수용액(대조 조성물 A2)을 도포한 난소 적출 DDY 마우스를 대조로 하여, 피부의 상태를 비교하였다. 그 결과를 도 8에 나타낸다.
도 8에 나타내는 바와 같이, 대상 조성물 A1을 도포한 난소 적출 DDY 마우스(Control)에서는, 피부 전체가 얇고, 특히 표피측(도면 상측)에 있어서의 섬유아세포의 층(도면의 검은 부분)도 얇았다. 또한, 대상 조성물 A2를 도포한 난소 적출 DDY 마우스(hAdSC)에서도 control과 차는 거의 보이지 않았다. 한편, 시험 조성물 S1을 도포한 난소 적출 DDY 마우스(SimNP-hAdSC)에서는, control과 비교하여 피부 조직이 두꺼워지고, 또한 발모도 확인되었다. 또한, 시험 조성물 E1을 도포한 난소 적출 DDY 마우스(E2NP-hAdSC)에서는, control과 비교하여 피부 조직이 두꺼워지고, 특히 콜라겐을 산생하는 섬유아세포(도면 중의 검은 부분)가 많이 확인되었다.
이상의 결과로부터, 약물 봉입 나노 입자를 함유하는 줄기 세포(지방 유래 줄기 세포)로부터 분비되는 엑소솜에는 피부 재생 효과가 확인되고, 특히 약물로서 에스트라디올(E2)을 사용한 경우에 얻어지는 엑소솜을 사용함으로써, 피부 재생에 중요한 콜라겐을 산생하는 섬유아세포를 증대시킬 수 있는 것을 알았다. 이 때문에, 본 발명에 관한 엑소솜을 포함하는 조성물은, 피부 손상 또는 피부 궤양의 치료에 유용하다고 할 수 있다.
[실시예 3] 에스트로겐(에스트라디올: E2) 봉입 나노 입자를 함유하는 지방 유래 줄기 세포로부터 분비된 엑소솜을 포함하는 피부 질환 치료용 조성물
71세의 여성에서 채취한 지방 조직으로부터, 참고예 1의 「인간 지방 조직으로부터의 지방 유래 줄기 세포의 단리」와 마찬가지의 수순으로, 인간 지방 유래 줄기 세포(AdSC)를 단리하고(초대 배양 세포), 당해 초대 배양 세포를 9회 계대 배양한 후의 세포 집단(본 실시예에 있어서 「P0」이라 칭한다.)을 준비하였다.
DMEM F12(서모 피셔제): KBM ADSC2(고진 바이오사제)=1:1로 혼합한 배지에, 에스트라디올 봉입 PLGA 나노 입자(제작예 2 참조)를 25, 50, 100, 200 혹은 300μg/50000AdSC의 농도가 되도록 첨가한 배지를 조제하였다. 조제된 배지를 사용하여, 37℃의 CO2 인큐베이터 중에서, 줄기 세포 집단 P0을 5일간 배양하였다(당해 계대 배양에 의해 얻어진 줄기 세포 집단을 「P1」이라 칭한다.). 당해 계대 배양 후의 배지를 회수하고, 초원심법(210,000 RCF)에 의해, 줄기 세포 집단 P1로부터 분비된 엑소솜을 배지로부터 분리하였다. 분리한 엑소솜을 5％ 글리세린 수용액에 첨가 및 혼합하여, 시험 조성물을 제조하였다.
상기 조제 배지를 사용하여, 상기와 마찬가지의 배양 조건에 의해, 줄기 세포 집단 P1을 5일간 배양하고(당해 계대 배양에 의해 얻어진 줄기 세포 집단을 「P2」라고 칭한다.), 상기와 마찬가지의 수순으로 줄기 세포 집단 P2로부터 분비된 엑소솜을 배지로부터 분리하여, 시험 조성물을 제조하였다. 이하, 마찬가지로 하여, 5일간씩의 계대 배양에 의해 제작된 줄기 세포 집단 P3, P4 및 P5 각각에 대하여, 분비된 엑소솜을 배지로부터 분리하여, 시험 조성물을 제조하였다.
상기 각 시험 조성물의 제조에 사용한 엑소솜을 분비된 각 줄기 세포 수단(P1, P2, P3, P4 및 P5)을 시료로 하여, 참고예 2에 있어서의 세포 내 mRNA 발현량의 측정과 마찬가지의 수순(정량 PCR법)으로, VEGF-A, HGF 및 FGF-2의 세포 내 mRNA 발현량을 측정하였다. VEGF-A 및 FGF-2의 정량에 사용한 정방향 및 역방향 프라이머는 참고예 2와 동일하였다. HGF의 정량에 사용한 정방향 및 역방향 프라이머의 염기 서열은 하기와 같다.
HGF용 정방향 프라이머:
5'-CCTCTATGAAAACAAAGACTAC-3'(서열 번호 7)
HGF용 역방향 프라이머:
5'-CTGTGTTCGTGTGGTATC-3'(서열 번호 8)
에스트로겐 봉입 나노 입자를 함유하는 지방 유래 줄기 세포에 있어서의 VEGF-A의 mRNA 발현량의 측정 결과를 도 9에 나타낸다. 이 결과로, 예를 들어 50μg/50000AdSC의 농도가 되도록 에스트라디올 봉입 PLGA 나노 입자가 첨가된 배지에서 배양된, 줄기 세포 집단 P1로부터 분비된 엑소솜에는, mRNA로부터 번역된 VEGF-A 단백질과, 나노 입자에 봉입되어 있던 에스트라디올이 풍부하게 포함되어 있고, 그 엑소솜을 사용하여 제조된 시험 조성물은, 피부 질환의 치료(특히 피부 재생)에 있어서의 유효성이 우수한 것으로 추정된다.
에스트로겐 봉입 나노 입자를 함유하는 지방 유래 줄기 세포에 있어서의 HGF의 mRNA 발현량의 측정 결과를 도 10에 도시한다. 이 결과로, 예를 들어 50μg/50000AdSC의 농도가 되도록 에스트라디올 봉입 PLGA 나노 입자가 첨가된 배지에서 배양된, 줄기 세포 집단 P1로부터 분비된 엑소솜에는, mRNA로부터 번역된 HGF 단백질과, 나노 입자에 봉입되어 있던 에스트라디올이 풍부하게 포함되어 있고, 그 엑소솜을 사용하여 제조된 시험 조성물은, 피부 질환의 치료(특히 피부 재생)에 있어서의 유효성이 우수한 것으로 추정된다.
에스트로겐 봉입 나노 입자를 함유하는 지방 유래 줄기 세포에 있어서의 FGF-2의 mRNA 발현량의 측정 결과를 도 11에 도시한다. 이 결과로, 예를 들어 300μg/50000AdSC의 농도가 되도록 에스트라디올 봉입 PLGA 나노 입자가 첨가된 배지에서 배양된, 줄기 세포 집단 P2로부터 분비된 엑소솜에는, mRNA로부터 번역된 FGF-2 단백질과, 나노 입자에 봉입되어 있던 에스트라디올이 풍부하게 포함되어 있고, 그 엑소솜을 사용하여 제조된 시험 조성물은, 피부 질환의 치료(특히 피부 재생)에 있어서의 유효성이 우수한 것으로 추정된다.
[실시예 4] 비타민 C 봉입 나노 입자를 함유하는 지방 유래 줄기 세포로부터 분비된 엑소솜을 포함하는 피부 질환 치료용 조성물
에스트라디올 봉입 PLGA 나노 입자(제작예 2 참조) 대신에 비타민 C 봉입 PLGA 나노 입자(제작예 3 참조)를 사용한 것 이외에는 실시예 3과 마찬가지로 하여, 5일간씩의 계대 배양에 의해 제작된 줄기 세포 집단 P1 내지 P5 각각에 대하여, 분비된 엑소솜을 배지로부터 분리하여, 시험 조성물을 제조하였다. 또한, 실시예 3과 마찬가지로 하여, 실시예 4의 줄기 세포 집단 P1 내지 P5 각각에 대하여, VEGF-A, HGF 및 FGF-2의 세포 내 mRNA 발현량을 측정하였다.
비타민 C 봉입 나노 입자를 함유하는 지방 유래 줄기 세포에 있어서의 VEGF-A의 mRNA 발현량의 측정 결과를 도 12에 나타낸다. 이 결과로, 예를 들어 300μg/50000AdSC의 농도가 되도록 에스트라디올 봉입 PLGA 나노 입자가 첨가된 배지에서 배양된, 줄기 세포 집단 P2로부터 분비된 엑소솜에는, mRNA로부터 번역된 VEGF-A 단백질과, 나노 입자에 봉입되어 있던 비타민 C이 풍부하게 포함되어 있고, 그 엑소솜을 사용하여 제조된 시험 조성물은, 피부 질환의 치료에 있어서의 유효성이 우수한 것으로 추정된다.
비타민 C 봉입 나노 입자를 함유하는 지방 유래 줄기 세포에 있어서의 HGF의 mRNA 발현량의 측정 결과를 도 13에 나타낸다. 이 결과로, 예를 들어 50μg/50000AdSC의 농도가 되도록 에스트라디올 봉입 PLGA 나노 입자가 첨가된 배지에서 배양된, 줄기 세포 집단 P2로부터 분비된 엑소솜에는, mRNA로부터 번역된 HGF 단백질과, 나노 입자에 봉입되어 있던 비타민 C이 풍부하게 포함되어 있고, 그 엑소솜을 사용하여 제조된 시험 조성물은, 피부 질환의 치료(특히 피부 재생)에 있어서의 유효성이 우수한 것으로 추정된다.
비타민 C 봉입 나노 입자를 함유하는 지방 유래 줄기 세포에 있어서의 FGF-2의 mRNA 발현량의 측정 결과를 도 14에 도시한다. 이 결과로, 예를 들어 200μg/50000AdSC의 농도가 되도록 에스트라디올 봉입 PLGA 나노 입자가 첨가된 배지에서 배양된, 줄기 세포 집단 P3으로부터 분비된 엑소솜에는, mRNA로부터 번역된 FGF-2 단백질과, 나노 입자에 봉입되어 있던 비타민 C가 풍부하게 포함되어 있고, 그 엑소솜을 사용하여 제조된 시험 조성물은, 피부 질환의 치료(특히 피부 재생)에 있어서의 유효성이 우수한 것으로 추정된다.
[실시예 5] 레티노산 봉입 나노 입자를 함유하는 지방 유래 줄기 세포로부터 분비된 엑소솜을 포함하는 피부 질환 치료용 조성물
에스트라디올 봉입 PLGA 나노 입자(제작예 2 참조) 대신에 레티노산 봉입 PLGA 나노 입자(제작예 4 참조)를 사용하고, 또한 약물 봉입 나노 입자의 배지 중의 농도를, 25, 50, 100, 200 혹은 300μg/50000AdSC의 5단계로부터, 25, 50 혹은 100μg/50000AdSC의 3단계로 변경하고, 그 이외에는 실시예 3과 마찬가지로 하여, 5일간씩의 계대 배양에 의해 제작된 줄기 세포 집단 P1 내지 P5 각각에 대하여, 분비된 엑소솜을 배지로부터 분리하여, 시험 조성물을 제조하였다. 또한, 실시예 3과 마찬가지로 하여, 실시예 5의 줄기 세포 집단 P1 내지 P5 각각에 대하여, VEGF-A, HGF 및 FGF-2의 세포 내 mRNA 발현량을 측정하였다.
레티노산 봉입 나노 입자를 함유하는 지방 유래 줄기 세포에 있어서의 VEGF-A의 mRNA 발현량의 측정 결과를 도 15에 도시한다. 이 결과로, 예를 들어 100μg/50000AdSC의 농도가 되도록 에스트라디올 봉입 PLGA 나노 입자가 첨가된 배지에서 배양된, 줄기 세포 집단 P1로부터 분비된 엑소솜에는, mRNA로부터 번역된 VEGF-A 단백질과, 나노 입자에 봉입되어 있던 레티노산이 풍부하게 포함되어 있고, 그 엑소솜을 사용하여 제조된 시험 조성물은, 피부 질환의 치료에 있어서의 유효성이 우수한 것으로 추정된다.
레티노산 봉입 나노 입자를 함유하는 지방 유래 줄기 세포에 있어서의 HGF의 mRNA 발현량의 측정 결과를 도 16에 나타낸다. 이 결과로, 예를 들어 100μg/50000AdSC의 농도가 되도록 에스트라디올 봉입 PLGA 나노 입자가 첨가된 배지에서 배양된, 줄기 세포 집단 P3으로부터 분비된 엑소솜에는, mRNA로부터 번역된 HGF 단백질과, 나노 입자에 봉입되어 있던 레티노산이 풍부하게 포함되어 있고, 그 엑소솜을 사용하여 제조된 시험 조성물은, 피부 질환의 치료(특히 피부 재생)에 있어서의 유효성이 우수한 것으로 추정된다.
레티노산 봉입 나노 입자를 함유하는 지방 유래 줄기 세포에 있어서의 FGF-2의 mRNA 발현량의 측정 결과를 도 17에 나타낸다. 이 결과로, 예를 들어 100μg/50000AdSC의 농도가 되도록 에스트라디올 봉입 PLGA 나노 입자가 첨가된 배지에서 배양된, 줄기 세포 집단 P3으로부터 분비된 엑소솜에는, mRNA로부터 번역된 FGF-2 단백질과, 나노 입자에 봉입되어 있던 레티노산이 풍부하게 포함되어 있고, 그 엑소솜을 사용하여 제조된 시험 조성물은, 피부 질환의 치료(특히 피부 재생)에 있어서의 유효성이 우수한 것으로 추정된다.
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Claims (11)

  1. 줄기 세포로부터 분비된 엑소솜을 포함하는 피부 질환 치료용 조성물이며,
    상기 줄기 세포는, 약물이 생체 흡수성 폴리머를 포함하는 나노 입자에 봉입되어 이루어지는 약물 봉입 나노 입자를 함유하는 줄기 세포인
    것을 특징으로 하는 피부 질환 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포가 지방 유래 줄기 세포인 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 약물이, 피부 질환의 치료에 유효함과 함께, 줄기 세포가 산생하는 피부 질환의 치료에 유효한 인자의 발현량을 항진하는 약물인 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물이 스타틴인 조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물이 에스트로겐인 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물이 비타민 A 또는 그의 유도체인 조성물.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물이 비타민 C 또는 그의 유도체인 조성물.
  8. 제1항 내지 제4항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부 질환이 탈모증 또는 무모증인 조성물.
  9. 제1항 내지 제3항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부 질환이 피부 손상 또는 피부 궤양인 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 경피 투여용의 제형을 갖는 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 의약품, 의약부외품 또는 화장품인 조성물.
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