KR20220079491A

KR20220079491A - 폴리다이메틸실록세인을 활용한 인공 나노소포체 생산 방법

Info

Publication number: KR20220079491A
Application number: KR1020210173047A
Authority: KR
Inventors: 이재용; 안희진; 이예인; 이동열; 나규흠
Original assignee: 주식회사 프리모리스
Priority date: 2020-12-04
Filing date: 2021-12-06
Publication date: 2022-06-13

Abstract

본 발명에 따른 인공 나노소포체 생산 방법은
선택적으로(optionally), 줄기세포를 배양하는 제1단계;
채널 횡단면을 기준으로, 유연하고 신축 가능한 기계적 특성을 발휘하는 폴리다이메틸실록세인(polydimethylsiloxane, PDMS) 소재로 적어도 일부를 구성하는 제1 마이크로채널에 줄기세포를 1회 이상 통과시켜, 줄기세포의 압출 및/또는 분쇄를 통해 제1 인공 나노소포체를 생산하는 제2단계; 및
선택적으로(optionally), 채널 횡단면을 기준으로, 유연하고 신축 가능한 기계적 특성을 발휘하는 폴리다이메틸실록세인(PDMS) 소재로 적어도 일부를 구성하는 제2 마이크로채널에 제1 인공 나노소포체를 1회 이상 통과시켜, 인공 나노소포체의 지질 이중층 재구성을 통해 제2 인공 나노소포체를 생산하는 제3단계
를 포함한다.

Description

폴리다이메틸실록세인을 활용한 인공 나노소포체 생산 방법 {Method for producing artificial nano-vesicles using polydimethylsiloxane}

본 발명은 폴리다이메틸실록세인을 활용한 줄기세포 유래, 예컨대 제대혈 줄기세포 유래 인공 나노소포체 생산 방법에 관한 것이다.

줄기세포는 30년 이상 연구가 진행되었고 각종 치료에 광범위하게 사용되고 있다. 특히, 재생의학으로 알려진 조직 공학과 세포 및 유전자치료의 복합 치료로 인해 손상이나 질병 치료에 적용 가능성은 획기적이라 할 수 있다. 이러한 확장된 치료 의약품(Advanced Therapy Medical Products, ATMPs)들은 규제기관에서 엄격하며 과학적인 평가가 요구되고 있으며, 마케팅 허가는 제품의 품질, 안전 및 효능에 대한 엄격한 요구사항에 충족이 될 때 승인되고 있다. 지난 10년 동안 ATMPs와 관련된 임상 시험은 기하급수적으로 성장하였다.

줄기세포의 종류로는 배아줄기세포, 성체줄기세포, 역분화 줄기세포가 있으며, 이들 중 성체줄기세포는 혈액, 골수, 지방 등에서 추출하여 배아줄기세포와 달리 윤리적인 문제에서 자유롭다. 골수, 지방 유래 줄기세포의 경우 공여자로부터 침습적인 방법으로 추출되며 제대혈 줄기세포의 경우 출산 후 폐기되는 제대혈에서 추출하여 공여자에게 침습적인 방법을 사용하지 않으며 공여자 간의 제대혈 줄기세포 효능 차이가 작은 장점이 있다.

중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cell)는 표피세포성장인자(Epithelial growth factor), 섬유아세포성장인자(Fibroblast growth factor)와 같은 다양한 성장인자(growth factor)와 사이토카인을 분비하여 섬유아세포로부터 콜라겐의 생성을 촉진시켜 피부의 재생에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.

한편, 우리 몸의 신체를 구성하는 세포는 주변 세포와 소통을 위한 신호전달물질로 지질 이중층을 가진 다양한 크기의 세포외 소포체(Extracellular Vesicles)을 분비한다. 세포외 소포체(Extracellular Vesicles)는 살아 있는 다양한 세포에서 분비되는 30 ~ 150 nm 크기의 이중 지질 구조의 세포막으로 형성된 소포체로, 단백질 및 유전체 등 다양한 신호전달 물질을 포함하고 있으며 세포 간 의사소통 및 상호작용에 중요한 역할을 한다. 세포외 소포체는 크기에 따라 Exosome (30~200nm), Micro-vesicle (200~1000nm), Apoptotic Body(1um~5um)로 분류된다.

엑소좀의 경우 miRNA 와 같은 핵산과 단백질 등이 포함되어 있다. 성체줄기세포에서 분비되는 엑소좀은 주변 세포의 재생과 항염 효과에 우수한 효능을 보이는 많은 연구가 진행되어 있으며 이를 활용한 다양한 치료제를 개발하기 위한 연구가 진행되고 있다. 엑소좀을 분리하는 방법으로는 Ultracentrifuge, Ultrafiltration, Chromatography 등의 방법이 존재하며 분리 방법에 따라 엑소좀의 기능적 특성, 순도, 농도, 크기가 달라지게 된다.

엑소좀은 세포 스스로 분비하는 형태로 그 안의 유효 성분이 모세포 자체가 가지고 있는 함량에 비해 매우 적다. 따라서 세포 자체를 활용하는 것이 가장 효과적일 수 있으나 세포의 크기가 한계점으로 작용한다. 보통 작은 세포의 직경은 20 um 전후로 체내에서 이동이 제한적이다. 하지만 엑소좀의 경우 고유의 작은 크기의 특성으로 뇌혈관막까지 통과가 가능하여 내부 유효성분을 체내 모든 곳에 전달할 수 있는 장점을 가지고 있다. 따라서 세포 자체를 활용하여 엑소좀 크기로 분쇄하게 되면 세포 내 효능 성분을 고함량으로 포함하면서 체내 모든 부위에 도달할 수 있는 특장점을 확보할 수 있다.

한편, “생물학적 제제”는 질병의 예방, 진단 및 치료에 이용되는 물질로서, 살아있는 생명체에서 직접 얻어진 의약품 또는 그 생물이 가진 생물학적 특징을 이용하여 제조된 의약품일 수 있다. 1982년 유전자 재조합된 대장균으로부터 얻어진 사람 인슐린이 처음 시판된 후, 기존의 생물학적 제제(백신, 혈액제제 등)에 새로운 유전자 재조합 의약품이 추가되었다. 이후 생명공학기술의 발달로 인해 세포치료제와 유전자치료제가 도입되면서, 이들을 모두 총괄하여 “생물의약품”이라고 불리게 되었다.

현재 생물의약품의 주류를 형성하고 있는 유전자 재조합 의약품은 치료제를 지령하는 유전암호를 운반체에 삽입하여 도입한 미생물, 효모, 바이러스 및 포유동물 세포주들을 이용하여 생산되는 백신, 호르몬, 사이토카인, 항체, 효소 등의 단백질 의약품들이다.

단백질 의약품은 생물학적 세포기원과 제조방법에 따라 당화정도, 디설피드 결합, 입체구조 등에서 본질적으로 다른 성상을 지닐 수 있으며, 이러한 단백질의약품의 다양성은 유효성과 안전성에 영향을 줄 수 있다. 또한, 유전자재조합의약품은 보관, 조성 및 투여경로에 따라서도 영향을 받을 수 있다.

이와 같이, 비록 생물학적 동등성이 상응한다 하더라도, 생물의약품은 생산 세포주나 생산공정, 그리고 정제 공정 등에 따라 동일한 생물의약품으로 간주할 수 없다는 문제점을 지니고 있다.

본 발명은 엑소좀 및/또는 생물의약품 관련하여 전술한 다양한 문제점을 해결하기 위해 고안된 것이다.

또한, 본 발명은 세포에 치료 목적의 특정 단백질 및 유전체를 세포 내 과발현을 유도하여도 세포 밖으로 분비된 세포외 소포체 내 치료 물질 함유량이 낮은 문제점을 해결하기 위해 고안된 것이다.

본 발명의 제1양태는 선택적으로(optionally), 줄기세포를 배양하는 제1단계; 채널 횡단면을 기준으로, 유연하고 신축 가능한 기계적 특성을 발휘하는 폴리다이메틸실록세인(polydimethylsiloxane, PDMS) 소재로 적어도 일부를 구성하는 제1 마이크로채널에 줄기세포를 1회 이상 통과시켜, 줄기세포의 압출 및/또는 분쇄를 통해 제1 인공 나노소포체를 생산하는 제2단계; 및 선택적으로(optionally), 채널 횡단면을 기준으로, 유연하고 신축 가능한 기계적 특성을 발휘하는 폴리다이메틸실록세인(PDMS) 소재로 적어도 일부를 구성하는 제2 마이크로채널에 제1 인공 나노소포체를 1회 이상 통과시켜, 인공 나노소포체의 지질 이중층 재구성을 통해 제2 인공 나노소포체를 생산하는 제3단계를 포함하는 인공 나노소포체 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 제2양태는 제1양태의 방법으로 수득 된 제대혈 줄기세포 유래 인공 나노소포체를 유효성분으로 함유하는 피부 또는 생체 멤브레인(covering and lining membranes) 도포용 조성물을 제공한다.

상기 도포용 조성물의 예로, 화장료 조성물, 의약외품 조성물, 또는 약학 조성물이 있다. 예컨대, 상기 도포용 조성물은 고분자와 혼합하여 겔화된 제형으로, 체온 조건에서는 졸화되는 것일 수 있다.

이하, 본 발명을 설명한다.

본 발명은 고신축성 탄성중합체인 폴리다이메틸실록세인(polydimethylsiloxane)을 사용하여 제작된 마이크로채널에서, 줄기세포 그대로를 압출 또는 분쇄하여 나노소포체를 양산하는 기법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 인공 나노소포체 생산 방법은

선택적으로(optionally), 줄기세포를 배양하는 제1단계;

채널 횡단면을 기준으로, 유연하고 신축 가능한 기계적 특성을 발휘하는 폴리다이메틸실록세인(polydimethylsiloxane, PDMS) 소재로 적어도 일부를 구성하는 제1 마이크로채널에 줄기세포를 1회 이상 통과시켜, 줄기세포의 압출 및/또는 분쇄를 통해 제1 인공 나노소포체를 생산하는 제2단계; 및

선택적으로(optionally), 채널 횡단면을 기준으로, 유연하고 신축 가능한 기계적 특성을 발휘하는 폴리다이메틸실록세인(PDMS) 소재로 적어도 일부를 구성하는 제2 마이크로채널에 제1 인공 나노소포체를 1회 이상 통과시켜, 인공 나노소포체의 지질 이중층 재구성을 통해 제2 인공 나노소포체를 생산하는 제3단계

를 포함한다.

예컨대, 포토-리소그래피(Photolithography) 방식으로 석판(Litho)에 빛을 이용하여 마이크로채널 패턴을 제작한 후 폴리다이메틸실록세인 소재로 마이크로채널 몰딩을 제작하여 커버글라스(Coverglass)에 붙여 폴리다이메틸실록세인 마이크로채널을 제작할 수 있다. 따라서, 도 1의 마이크로채널 구조에 나타난 바와 같이, 제1 마이크로채널 및/또는 제2 마이크로채널은 사각형인 횡단면을 기준으로, 적어도 3 개의 모서리가 폴리다이메틸실록세인(PDMS)을 통해 유연하면서 신축가능한 것일 수 있다.

고신축성의 탄성중합체인 폴리다이메틸실록세인(polydimethylsiloxane)은 흔히 실리콘이라고 하는 고분자 유기규소화합물에 속하며, 불활성 물질로 화학적으로 매우 안정된 상태를 지니고 있어 다른 물질과 접촉 시 어떠한 반응도 발생하지 않아 안전한 물질이다. 또한, 제2단계에서 사용되는 폴리다이메틸실록세인(PDMS) 소재 및/또는 제3단계에서 사용되는 폴리다이메틸실록세인(PDMS) 소재는 생체 적합성인 것일 수 있다.

본 발명에 따라 생산되는 인공 나노소포체를 기능적으로 향상시키기 위한 방법으로는 인공 나노소포체 유래가 되는 줄기세포의 특성을 제1단계의 세포배양을 통해 조절하는 방법, 제2단계 및/또는 제3단계에서 줄기세포로부터 인공 나노소포체 형성 후 특정 물질을 탑재하는 방법, 또는 이의 병용 등이 있으며, 본 발명에 따라 생산되는 인공 나노소포체는 진단물질 및/또는 치료물질을 운송하는 목적으로 활용할 수 있다.

본 발명에 따라 줄기세포를 압출 혹은 분쇄하여 인공적으로 생성된 나노 소포체의 경우 줄기세포 내 존재하는 유효 물질(예, 재생 및 항염 성분)을 그대로 포함하고 있어 고효능 물질을 포함한 운송체 역할을 할 수 있다.

또한, 본 발명에 따라 생산 및 분리되는 인공 나노 소포체는, 나노 소포체 유래된 줄기세포와 별도로 준비된 약물(예, 화학의약품 또는 생물의약품)을 운반하는 약물 전달체(Drug Delivery)로써 유용하게 사용될 수 있다. 이때, 나노 소포체를 생산하는 동안 용매에 질병 치료의 다양한 물질(항암제, miRNA, siRNA, chemical etc.)을 첨가하여 소포체 생성 과정 중에 물질이 소포체 안에 함유될 수 있도록 유도할 수도 있다.

따라서, 본 발명에서 생산되는 인공 나노 소포체는 재생의료 및 항염증, 항암과 관련된 치료제로 사용될 수 있으며 인공 나노 소포체 표면에 암 특이적 마커 또는 이와 결합하는 단백질을 붙여 암 진단이나 항암제(예, 항암백신)로 활용하거나 특정 단백질 혹은 유전체, 핵산, 약물(Drug) 등을 탑재하여 운반체 역할로써 치료제로 사용될 수 있다.

[줄기세포 배양]

본 명세서에서, 줄기세포는 예컨대 성체줄기세포, 바람직하게는 제대혈 줄기세포일 수 있다.

유기체의 기본 구조 및 활동 단위인 세포는 체외(in vitro)에서 배양할 수 있으며, 약학, 조직공학, 치료제 개발에 사용될 수 있다. 세포는 주변 환경에 따라 적응하는 특성이 있기 때문에 동일한 세포 종이라 할지라도 배양 환경에 따라 세포의 접착력, 성장, 이동, 분화 등이 달라질 수 있다. 나아가, 재생의학(regenerative medicine) 분야와 관련하여 최근 큰 주목을 받고 있는 줄기 세포는 배양 시 적절한 자극을 인가함으로써 원하는 세포로의 분화(differentiation) 및 성장 촉진을 유도할 수 있다. 이를 위해, 줄기세포 배양시에도 후술할 마이크로채널 구조/장치를 응용하여 사용할 수 있다. 이때, 제1단계에서 사용되는 마이크로채널은 길이방향으로 마이크로채널의 적어도 일면을 구성하는 폴리다이메틸실록세인(PDMS)을 통해 세포 호흡을 위한 산소 및/또는 이산화탄소의 기체 통과가 가능한 것일 수 있다.

본 발명은 인공 나노소포체 유래가 되는 줄기세포의 특성을 제1단계의 세포배양 조절을 통해 조절함으로써, 이로부터 생산된 인공 나노소포체를 기능적으로 향상시킬 수 있다. 예컨대, 제1단계는 정적인(static) 환경 또는 순환기, 신경계, 근육 등 다양한 자극이 존재하는 체내의 환경을 모사하는 환경에서 배양할 수 있다.

또한, 제1단계에서 줄기세포에 치료 목적의 특정 단백질 및 유전체를 세포 내 과발현을 유도할 수 있다.

한편, 성체줄기세포는 필요한 때에 특정한 조직의 세포로 분화하게 되는 미분화상태의 세포이다. 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포, 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell) 또는 다분화능 줄기세포일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 성체줄기세포는 인간 배아에서 추출한 배아 줄기세포와 달리 골수나 뇌세포 등 이미 성장한 신체조직에서 추출하기 때문에 윤리논쟁을 피할 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 성체줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반으로부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

제대혈 유래 줄기세포는 지방 또는 골수 유래 성체줄기세포와는 달리 공여자의 임신주기(40주) 동안 형성된 제대혈을 사용하기 때문에 공여자의 상태에 따른 효능차이가 발생하지 않는다는 장점이 있다.

배지는 생체 외(in vitro)에서 세포의 성장과 증식에 필요한 필수성분을 포함하는 조성물을 의미하는 것으로, 제1단계에서 사용되는 배지는 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 줄기세포 배양용 배지를 모두 포함하며, 예를 들어 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium), KnockOut DMEM 등의 상업적으로 제조된 배지 또는 인위적으로 합성한 배지를 이용할 수 있고, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함하며, 아미노산, 항생제 외 다양한 성장인자 등을 더 포함할 수 있다. 예컨대, EGF, FGF2, TGF-β1, VEGF와 같은 성장인자를 제대혈 줄기세포 배양 시 배지에 첨가할 수 있다.

성장인자는 세포 분열이나 생장, 분화를 촉진하는 단백질성의 생리활성물질을 의미하는 것으로, 예를 들어, 뇌 유래 신경 성장인자(brain-derived neurotropic factor, BDNF), 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 신경 성장인자(nerve growth factor, NGF), 혈관상피 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 유사 인슐린 성장 인자(insulin-like growth factor, IGF), 형질전환 성장 인자(transforming growth factor, TGF), 혈소판 유래성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 뼈 유래 성장인자(bone-derived growth factor, BDF), 콜로니 자극 인자(colony stimulation factor, CSF), 표피 성장 인자(epidermal growth factor, EGF), 각질세포 성장인자(Keratinocyte growth factor, KGF) 등이 있다.

[인공 나노 소포체]

엑소좀은 세포막을 가로질러 물질을 전달할 수 있어 약물 전달을 위한 이상적인 소낭으로 평가되고 있는데, 이러한 지질 이중층 소낭 시스템은 피부 침투 문제점을 극복할 수 있으므로 약물을 피부 진피층까지 전달하기 위한 가장 효과적인 전략 중 하나로 평가되고 있다(Saahil Arora et al., Asian Journal of Pharmaceutics, 6, 4, 237-244, 2012).

본 발명은 줄기세포가 분비하는 엑소좀을 모사하는 인공 나노 소포체를, 본 발명에 따른 마이크로채널에 줄기세포를 통과시켜 압출 및/또는 분쇄하여 원하는 다양한 크기로 균일하게 대량생산 가능하게 하는 것이 특징이다.

본 발명에 따라 생산되는 인공 나노 소포체는 해당 인공 나노 소포체가 유래된 줄기세포 타입을 반영하는 RNA, 단백질, 지질 및 대사물질들을 함유한다.

인공 나노 소포체는 해당 인공 나노 소포체가 유래된 줄기세포의 다양한 분자 구성성분들(예, 단백질들 및 RNA)을 함유한다. 인공 나노 소포체 내 단백질 조성은 해당 인공 나노 소포체가 유래된 세포의 배양조건(예, 배양시 세포가 받은 분자 신호)에 따라 다양하게 조절할 수 있다.

제대혈 중간엽 줄기세포(UCB-MSC)는 EGF, VEGF, TGF, HGF, FGF, IGF 및 PDGF 등의 다양한 성장 인자들을 함유하고 있다. 따라서, 제대혈 중간엽 줄기세포에서 생산된 인공 나노 소포체에 담지되어 있는 EGF 등의 성장 인자는 피부 구성세포인 섬유아세포의 증식을 촉진하며, 세포의 이동 및 콜라겐 합성 등을 촉진하므로, 상기 UCB-MSC 유래 인공 나노 소포체는 피부 재생, 피부 탄력 개선, 피부 주름 방지 또는 개선, 피부 노화 방지 또는 개선, 모발 성장 또는 축소된 모낭 복원 등의 우수한 피부 상태 개선 효과 및 상처치유 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명에 따라 줄기세포로부터 생산된 인공 나노 소포체는 특유의 지질 이중층 구조에 의하여 피부 진피층까지 침투가능하고, 경우에 따라서는 도 5에 도시된 바와 같이 진피층 내 모세혈관 및 림프관에도 전달될 수 있는 나노사이즈의 인공 나노 소포체도 다량으로 제공할 수 있다. 또한, 인공 나노 소포체 내에 다양한 성장인자를 다량 함유하고 있기 때문에 피부 구성세포인 섬유아세포의 증식과 활성화를 통한 피부 재생 및 항노화 효과, 콜라겐합성 증가, 모발 성장, 축소된 모낭 복원 및 상처치유 효과를 발휘할 수 있다.

[미세 유체 플랫폼(Microfluidic platform) _ 마이크로채널]

본 발명에 따라 폴리다이메틸실록세인 마이크로채널을 활용한 인공 나노 소포체 생산 방법은, 채널을 통과하는 과정에서 압출 및 분쇄가 발생하고 이로 인하여 방출된 나노 소포체와, 압출 및 분쇄 과정에서 분리된 지질 이중층의 재결합으로 형성된 인공 나노 소포체를 생산하는 방법이다. 폴리다이메틸실록세인 마이크로채널의 디자인은 인공 나노 소포체를 생산하는 세포의 크기에 따라 달라질 수 있으며 채널 통과 횟수 또한 달라질 수 있다.

또한, 최근 반도체 제조 기술 중 하나인 포토리소그래피(photolithography)와 소프트 리소그래피(soft lithography) 기술의 발전으로 인하여 미세한 크기의 구조를 제작하는 것이 가능해졌고, 이에 따라 미세 채널을 형성하여 매우 적은 양의 액체 시료를 조작하는 것이 가능해졌다.

1. 미세 유체 플랫폼을 구성하는 물질

폴리다이메틸실록세인(poly(dimethylsiloxane, PDMS)로 제작된 미세 유체 채널 플랫폼은 PDMS가 유연성을 지니고 있기 때문에 다양한 구조를 구현하거나 밸브 및 펌프 등과 같은 장치와 연결하는 것이 용이하다. 또한, 강한 압력에 의한 채널 횡단면 크기의 변형 등도 야기할 수 있다.

제2단계에서 사용되는 폴리다이메틸실록세인(PDMS) 소재 및 제3단계에서 사용되는 폴리다이메틸실록세인(PDMS) 소재는 각각 독립적으로 유연성 및/또는 신축성 정도가 동일 또는 상이한 것일 수 있다.

현재까지 체외 실험에서 가장 많이 사용되고 있는 물질은 폴리스티렌 (polystyrene)으로, 생체 적합성 외에도 기계적, 화학적으로 안정적이며 또한 투명한 특성으로 인하여 세포의 관찰이 용이하다는 장점이 있다. 그러나, 폴리스티렌 제품의 경우 제조 과정이 다소 복잡하고 특히, 미세 유체 채널 등의 마이크로 레벨의 가공을 위해서는 레이저 커팅(laser cutting) 장비나 밀링 머신(milling machine) 등의 장비를 필요로 하는 어려움과 번거로움이 있다.

이에 비하여 실리콘 기반의 탄성 물질인 폴리다이메틸실록세인(poly(dimethylsiloxane, PDMS)는 폴리스티렌과 마찬가지로 세포독성(cytotoxicity)이 거의 없는 우수한 생체 적합성을 나타내는 동시에 유연하고 신축 가능한 기계적 특성을 지녔으며, 액상 기반의 공정을 통하여 미세 유체 채널을 포함하여 다양한 구조로 제작하는 것이 용이하다.

PDMS는 또한 세포 호흡을 위한 산소 및 이산화탄소 등의 기체 통과가 가능하며 광학적으로 투명하여 세포 관찰이 가능하다. 이와 같이, PDMS는 세포 배양 시스템으로서의 여러가지 이점을 지니고 있기 때문에, 본 발명에 따라 PDMS로 제조된 미세 유체 채널은 세포배양에도 사용 가능하다. 따라서, 미세 유체 플랫폼을 구성하는 물질은 세포가 성장할 수 있는 환경을 제공할 수 있는 생체 적합성을 지니고 있는 것이 바람직하다.

이밖에도 폴리우레탄(polyurethane), 폴리이미드(polyimide) 등 다양한 생체 적합성 물질이 미세 유체 채널을 구성하는 물질로 사용 또는 병용될 수 있다.

2. 미세 유체 플랫폼의 구조

미세 유체 채널의 횡단면 및/또는 길이 방향 크기는 목적으로 하는 바에 따라 수십 나노 크기에서 수 밀리 크기까지 다양한 크기로 제작할 수 있다.

제1 마이크로채널 및/또는 제2 마이크로채널은 각각 독립적으로 적어도 한 지점에서의 횡단면의 면적이 한 개의 줄기세포 또는 제1 인공 나노소포체의 횡단면 최대 면적 보다 작아 줄기세포 또는 제1 인공 나노소포체를 압출 및/또는 분쇄시킬 수 있다.

줄기세포 또는 제1 인공 나노소포체를 압출 및/또는 분쇄시킬 수 있는 마이크로채널 단면은 압출 및/또는 분쇄 대상인 줄기세포 또는 제1 인공 나노소포체의 최대 단면의 10 ~ 80 %, 바람직하게 10 ~ 50 % 일 수 있다.

따라서, 본 발명은 경피 투과가 용이한 작은 입자 크기 직경 100 nm ± 20 nm의 인공 나노 소포체를 대량생산할 수 있다.

미세 유체 채널의 횡단면 구조는 사각형 단면, 직사각형 일 수도 있으며, 소프트 리소그래피 방식을 통하여 원형 단면을 갖는 PDMS 기반의 미세 유체 채널을 구현할 수도 있다.

줄기세포를 압출 및/또는 분쇄하여 인공적으로 나노 소포체를 생산하기 위한 미세 유체 채널의 횡단면 구조 및/또는 크기는 압출 및/또는 분쇄 대상인 줄기세포 하나의 크기, 예컨대 수십 마이크로미터의 크기 보다 작다.

또한, 제1 마이크로채널 및/또는 제2 마이크로채널은 마이크로채널 길이방향으로 응집된 줄기세포들 및/또는 제1 인공 나노소포체들을 분리하기 위해 마이크로채널의 횡단면 크기가 작아지는 적어도 일정 구간을 구비하는 것일 수 있다.

3. 미세 유체 플랫폼의 밸브 및 펌프

미세 유체 플랫폼은 일반적인 관류(perfusion) 시스템과 마찬가지로 유체가 흐르도록 하거나 멈추거나 혹은 유체의 흐름의 정도를 조절하는 기술을 핵심으로 삼으며 이러한 특성은 밸브 및 펌프를 통하여 조절이 가능하다.

제1 마이크로채널 및/또는 제2 마이크로채널은 시린지 펌프(Syringe Pump)가 연결되어 작동하는 것일 수 있다.

제2단계 및/또는 제3단계는 시린지 펌프를 활용하여 줄기세포 또는 제1 인공 나노소포체를 마이크로채널에 통과시키고, 완전히 통과된 후 반대 방향으로 다시 통과시킬 수 있다.

시린지 펌프는 주입과 흡입의 비교적 간단한 메커니즘으로 작동한다. 펌프의 본체 안에 위치한 스텝모터가 주사기펌프가 설치되는 렉과 연결되어 있어 스텝모터의 회전운동이 시린지 펌프의 직선운동으로 바뀌게 된다. 이때, 주입(Infusion)은 시린지 펌프에 고정된 플런저가 전진하면서 시린지 내의 액체를 밀어내는 동작이고, 흡입(Withdraw)은 시린지 펌프에 고정된 플런저가 후진하면서 외부의 액체를 시린지 내로 흡입하는 동작이다. 시린지 펌프는 내부의 스텝 모터에 의해 미세 유량을 정밀하고 자유롭게 조절할 수 있다는 것이 가장 큰 장점이다. 스텝모터의 해상도(resolution)가 작을수록 유량을 미세하게 쪼개어 맥동을 줄일 수 있다.

장치를 구성하는 밸브 및 펌프는 수동 혹은 자동으로 구성이 가능하며, 수동으로 구현하는 경우는 조작의 간편함을, 자동으로 구성하는 경우 짧은 시간 내의 높은 처리량(throughput)을 나타낼 수 있다는 각각의 장점을 지닌다.

제2단계 또는 제3단계에서 줄기세포 또는 제1 인공 나노소포체가 제1 마이크로채널 또는 제2 마이크로채널을 통과시키게 하는 유체는 삼투압 조절을 통해 인공 나노소포체의 안정성을 유지할 수 있는 용매(예, 인산완충생리식염수 (PBS))일 수 있다.

인산완충생리식염수 (Phosphate-buffered saline, PBS)는 대부분의 세포에 등장성 및 무독성인 완충 용액이다. 완충액은 pH를 일정하게 유지하는데 도움이 되며, 용액의 삼투압과 이온농도는 인체의 삼투압 및 이온 농도와 일치한다(등장성). EDTA를 함유한 PBS는 마이크로채널 내부에 부착되고 응집된 줄기세포, 제1 인공 나노소포체 및/또는 제2 인공 나노소포체를 분리시키는데 사용될 수 있다.

제2단계 및/또는 제3단계는 탑재하고자 하는 물질이 존재하는 유체 존재 하에서 수행하여, 제1 인공 나노소포체 및/또는 제2 인공 나노소포체에 원하는 물질을 용이하게 탑재할 수 있다.

미세 유체 채널 플랫폼 기반의 시스템에서는 펌프를 통해서 유체가 주입되는 입구(inlet)와 방출되는 출구(outlet)이 존재하므로, 미세 유체 플랫폼에서 입/출구를 다수로 형성하여 단시간 내에 다양한 화학물질 및/또는 약물의 처리도 가능하다.

[인공 나노소포체에 탑재되는 물질]

인공 나노소포체에 탑재되는 물질의 비제한적인 예로는 화학의약품, 생물의약품이 있다. 본 발명의 인공 나노 소포체에, 나노 소포체가 유래된 줄기세포와 별도로 준비된 유효성분(예, 진단제, 약물 등)을 탑재하기 위해, 제2단계 및/또는 제3단계는 탑재하고자 하는 물질이 존재하는 유체 존재 하에서 수행할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 인공 나노소포체 생산 방법은 특히 하기와 같은 생물의약품의 품질관리상 문제를 해결할 수 있다.

생물의약품은 화학의약품에 비해 분자량이 매우 크고 구조가 복잡하기 때문에, 이의 품질관리는 일반 화학의약품에 비해 매우 까다로운 측면이 있다. 즉 단백질의 구조, 접힘상태, 당쇄구조 등이 생산 및 정제공정에 따라 변형이 일어날 수 있으며, 이러한 단백질 구조상 미세한 변화에도 임상효능이 떨어지거나 환자에게서 면역반응을 일으키는 등 부작용을 일으킬 수 있고, 따라서 치료유효성을 감소시킬 수 있다.

생물학적제제는 의약품의 특성화가 매우 어렵고 생산공정에 상당히 의존적이기 때문에 확인시험, 순도시험, 정량이 불가능한 반면, 유전자재조합의약품은 비록 구조상 복잡하더라도 일정한 화학구조를 가지고 있어서 특성화할 수가 있으며, 따라서 화학의약품처럼 확인시험, 순도시험, 정량이 가능한 의약품이다.

이외에도 생물의약품 내 불순물로는 숙주유래 불순물 (host-related impurity), 공정유래 불순물(process-related impurity), 그리고 제품유래 불순물(product-related impurity)들이 있다(표 1). 숙주유래 불순물로는 숙주세포 단백질 및 DNA, 숙주유래 내인성바이러스, 대장균 숙주인 경우의 엔도톡신 등을 들 수 있으며, 공정유래 불순물로는 세포배양 배지, 외래성 오염미생물 (마이코플라스마, 바이러스 등), 정제공정에서의 크로마토그래피 지지체 등을 들 수 있고, 제품유래 불순물로는 제조과정에서 발생한 단백질변성체 및 단백질응집체들이 있다. 이러한 생물의약품 내 불순물은 완전히 제거되어야 하며, 이들에 대한 허용한계를 충족시킬 필요가 있다.

예컨대, 생물학적 세포기원과 제조방법에 따라 당화정도, 디설피드 결합, 입체구조 등에서 본질적으로 다른 성상을 지닐 수 있는 기존의 단백질 의약품의 문제점을, 본 발명은 미리 대량생산 및 분리정제를 통해 품질관리된 단백질을 탑재함으로써, 해결할 수 있다.

[피부 또는 생체 멤브레인(covering and lining membranes) 도포용 조성물]

본 발명에 따라 줄기세포에서 생산되는 인공 나노소포체는 크기가 균일하고 고농도의 성장인자를 함유하므로, 피부(skin)와 같은 생체 멤브레인(covering and lining membranes) 도포용 조성물의 유효성분일 수 있다.

피부의 상위개념으로 생체 멤브레인(covering and lining membranes)가 있다. 생체 멤브레인(covering and lining membranes)은 결합 조직(connective tissue)의 하부층(underlying layer)에 결합된 상피조직(epithelium)으로 구성된 연속적인 다세포 시트(continuous multicellular sheets)이다. 생체 멤브레인(covering and lining membranes)에는 피부막(Cutaneous Membrane), 점막(Mucous Membranes), 장액막(Serous Membranes)이 있다.

피부는 표피층과 진피층으로 구성되어 있다.

표피(epidermis)를 채우는 세포는 각질 세포(keratinocytes), 멜라닌 세포(melanocytes), 수지상 세포(dendritic cells) 및 촉각 세포(tactile cells)를 포함한다. 대부분의 표피 세포는 각질 세포이다. 각질 세포의 주요 기능은 열, 자외선, 수분 손실, 병원성 박테리아, 곰팡이, 기생충 및 바이러스에 의한 환경 피해에 대한 장벽 형성이다. 다수의 구조 단백질 (filaggrin, keratin), 효소 (프로테아제), 지질 및 항균성 펩타이드 (defensins)는 피부의 중요한 장벽 기능을 유지하는 데 기여한다. 각질 형성은 각질 세포가 점점 더 많은 각질을 생성하고 말단 분화를 겪는 물리적 장벽 형성 (각질화)의 일부이다. 최외각층을 형성하는 완전히 각질화된 각질 세포는 지속적으로 제거되어 새로운 세포로 대체된다.

진피층은 표피층(0.04mm~1.6mm)의 15~40배의 두께를 보이며 피부의 대부분을 차지하고 피부의 탄력을 유지하는 층으로, 표피와 피하조직 사이의 결합조직(connective tissue)으로서 작용한다. 피부부속기, 혈관, 임파관, 근육, 신경 등이 있으며, 크게 유두 진피(papillary dermis)와 망상 진피(reticular dermis) 두 층으로 나뉜다.

유두 진피는 진피 전체의 두께에서 극히 일부분만 차지 하고 있으며 콜라겐, 혈관, 섬유세포(fibrocyte)로 구성되어 있다. 혈관이 없는(avascular) 표피의 기저층에 영양분을 공급해준다. 망상 진피는 진피의 대부분을 차지하는 층으로 엘라스틴과 콜라겐 섬유가 굵은 다발을 이루어 배열되어 있어 피부에 강도와 유연성을 부여하며 탄력섬유 및 다양한 기질 단백질로 이루어져 있다. 콜라겐은 결합조직 총 단백질의 25% 정도를 차지하며 진피층의 인장강도에 중요한 역할을 한다. 한편, matrix metalloprotease(MMP)는 세포외기질(extracellular matrix, ECM)을 가수분해하는 zinc-dependent endopeptidase이다. MMP는 ECM을 분해시켜 세포의 이동능을 증가시켜 피부조직을 순환시키지만 주름을 형성하여 피부노화를 촉진시키고 암세포의 전이를 촉진하며 자외선, 스트레스, 항생제 등에 의해 형성이 촉진된다. 피브로넥틴(Fibronectin)은 세포표면, 결합조직, 혈액 중에 존재하는 당 단백질이다. 세포는 직접적으로 콜라겐(collagen)과 연결되어 있지 않고 피브로넥틴 (fibronectin)을 통해 연결되어 있다.

섬유아세포(fibroblast)는 각질 세포(keratinocyte)가 필요로 하는 성장인자 및 사이토카인을 모두 생산 및 분비한다. 각질 세포(keratinocyte)는 표피세포로 환경에 가장 쉽게 노출되는 세포이다. 섬유아세포는 각질 세포(keratinocyte)를 통해 활성화할 수 있으며, 활성화를 통해 세포외기질을 재형성하여 피부층을 고르게 한다.

본 발명은 마이크로채널을 사용하여 줄기세포의 압출 또는 분쇄를 통해 경피를 투과하는 100 nm 내외 크기의 인공 나노소포체를 대량생산할 수 있을 뿐만 아니라, 본 발명에 따라 생산된 제대혈 줄기세포 유래 인공 나노소포체는 인간 섬유아세포의 이동능 및 증식능을 향상시킬 수 있어서 피부와 같은 생체 멤브레인(covering and lining membranes)의 투과도가 높고, 피브로넥틴 단백질 및/또는 콜라겐 단백질을 다량 함유하고 있으므로, 피부(skin)와 같은 생체 멤브레인(covering and lining membranes) 도포용 제형(예, 약학조성물, 화장료, 의약외품) 및/또는 상처치료제 또는 창상치료제와 같은 치료제에 바람직할 뿐만 아니라, 사용시 우수한 효능을 발휘할 수 있다.

[다양한 제형화]

본 발명에 따라 생산되는 제1 인공 나노소포체 또는 제2 인공 나노소포체는 사용 목적에 따라 다양하게 제형화 할 수 있다.

예컨대, 제1 인공 나노소포체 및/또는 제2 인공 나노소포체를 겔화(gelation)하거나; 동결 및/또는 건조하여 분말화 할 수 있다.

하이드로겔, 젤라틴 등의 성분과 혼합하여 성분의 함량비에 따른 점성 차이로 인한 젤화(gelation)과 졸화(solation)의 조절이 가능한 피부 또는 생체 멤브레인(covering and lining membranes) 도포용 조성물로 사용될 수 있으며, poloxamer 등의 성분과 혼합하여 4℃ 조건에서 겔화 되며 체온 조건에서 졸화 되게 제형을 설계할 수 있다.

화장료 조성물은 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 향수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패치 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 상기 화장료 조성물의 제형에 따라 다양하다.

제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실리케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하이드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제 등이 이용될 수 있으며, 예컨대 물, 글리세린, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 글리세린, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

제형이 비누인 경우에는, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

화장료 조성물에서, 상기 엑소좀은 상기 화장료 조성물 총 중량의 0.0001 내지 50 중량%로 포함될 수 있으며, 더욱 구체적으로 0.0005 내지 10 중량%로 포함될 수 있다. 엑소좀이 상기 범위 내로 포함될 때, 우수한 피부 상태 개선 효능을 나타내는 이점이 있으며, 조성물의 제형이 안정화되는 이점이 있다.

통상 의약외품은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중에서 의약품보다 작용이 경미하거나 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것을 의미한다. 사람이나 동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다.

의약외품 조성물은 바디 클렌저, 폼, 비누, 마스크, 연고제, 크림, 로션, 에센스 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명이 피부(skin)와 같은 생체 멤브레인(covering and lining membranes) 도포용 조성물 또는 예방 또는 치료용 약학 조성물인 경우, 제1 인공 나노소포체 및/또는 제2 인공 나노소포체을 유효성분으로 포함하는 것에 더하여, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.

"약학적으로 허용 가능"하다는 것은, 투여 시 생물체를 자극하지 않으면서, 투여되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는, 약학 분야에서 통상적으로 사용될 수 있는 것을 의미한다.

투여량은 피부 상태 개선을 위해 약학적으로 유효한 양일 수 있다. 상기 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질환의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 또한, 유효량은 당업자에게 인식되어 있듯이 처리의 경로, 부형제의 사용 및 다른 약제와 함께 사용할 수 있는 가능성에 따라 변할 수 있다.

담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 이에 제한되지 않으나 구체적인 예로, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 말토 덱스트린, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.

또한, 필요한 경우, 부형제, 희석제, 항산화제, 완충액 또는 정균제 등 기타 약학적으로 허용 가능한 첨가제들을 첨가하여 사용할 수 있으며, 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 분산제, 계면 활성제, 결합제 또는 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 사용할 수 있다.

상기 피부 또는 생체 멤브레인(covering and lining membranes) 도포용 조성물에서, 본 발명의 제1 인공 나노소포체 및/또는 제2 인공 나노소포체는 경피투과형 운반체로 사용될 수 있다.

한편, 경피 투여경로는 보통 경피 패치를 통하여 약물을 피부에 적용함으로써 전신효과를 얻기 위해 사용된다. 흡수 속도는 적용 부위 피부의 물리적 특성 뿐만 아니라 약물 지용성에 따라 매우 다양하다.

본 발명에 따른 피부 또는 생체 멤브레인(covering and lining membranes) 도포용 조성물은 경피용 패치 형태일 수 있다. 경피용 패치는 피부 부착시 제품을 보호하는 불투과성 지지체(backing film), 인공 나노소포체의 대부분을 저장하는 약물 저장층(drug reservoir), 약물 방출 멤브레인(drug-release membrane) 및 부착 점착제층(Contact adhesive)을 구비할 수 있다. 포장 시 제품을 보호하는 film으로서 사용시 제거하는 박리지(Release liner)를 더 구비할 수 있다.

약물 방출 멤브레인(drug-release membrane)은 약물이 투과될 때 그 흡수율을 조절하는 고분자막일 수 있다. 또한, 부착 점착제층(Contact adhesive)은 7일 동안 피부에 부착하도록 설계된 저자극 점착제층(PSA : Pressure Sensitive Adhesive) 일 수 있다.

본 발명에 따른 인공 나노소포체 생산 방법은, 엑소좀 분리 방법에 따라 엑소좀의 기능적 특성, 순도, 농도, 크기가 달라지게 되는 문제를 해결할 수 있다.

본 발명에서 생산되는 인공 나노 소포체의 경우 재생의료 및 항염증과 관련된 치료제로 사용될 수 있으며 인공 나노 소포체 표면에 암 특이적 마커 또는 이와 결합하는 단백질을 붙여 암 진단이나 항암제로 활용하거나 특정 단백질 혹은 유전체, Drug 등을 탑재하여 운반체 역할로써 치료제로 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일구체예에 따라 제작된 폴리다이메틸실록세인(PDMS) 마이크로채널 구조의 개략도이다.
도 2는 마이크로채널을 활용한 제대혈 줄기세포 압출 과정을 도시한 개념도이다.
도 3은 폴리다이메틸실록세인(PDMS) 마이크로채널을 사용하여 각 단계별로 각종 샘플을 준비하는 과정을 도시한 것이다.
도 4는 폴리다이메틸실록세인(PDMS) 마이크로채널을 사용하여 각 단계별로 준비된 샘플들 내 인공 나노소포체의 농도 및 크기 분석결과이다.
도 5는 피부에 거주하는 다양한 세포 유형의 개략도이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1. 마이크로채널

MSC의 직경이 20㎛ 점을 고려하여, 포토-리소그래피 방식으로 높이 20 ㎛, 폭 5 ㎛, 길이 400 ㎛의 마이크로채널 마스터 패턴을 형성한 후 폴리다이메틸실록세인 소재로 패턴을 몰딩하였고, 커버글라스에 O₂ 플라즈마 처리 방식으로 부착하여 마이크로채널을 제작하였다(도 1). 폴리다이메틸실록세인 마이크로채널 양 끝은 20G Pin으로 구멍을 만들어 Syringe tube를 연결하였다(도 1).

실시예 2. 인공 나노 소포체

2.1. 세포 배양

제대혈 줄기세포(Umbilical cord blood stem cell)는 10% 우태아 혈청(Fetal bovine serum) 및 1% 프리모신(Primocin)을 함유하는 KSB-3(Basal Culture Medium) 배지에 37℃ 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

2.2. 인공 나노 소포체 생산 및 분리 방법

2.2.1 세포 수거

10% 우태아 혈청(Fetal bovine serum) 및 1% 프리모신(Primocin)을 함유하는 KSB-3(Basal Culture Medium) 배지에 37℃ 5% CO₂ 배양기에서 배양된 제대혈 줄기세포를 수거하여 0.5~2x10^6/ml 농도로 PBS에 재현탁하였다.

2.2.2 인공 나노 소포체 생산

0.5~2x10^6/ml 농도로 인산완충생리식염수 (PBS)에 재현탁한 제대혈 줄기세포를 마이크로채널과 연결된 Syringe에 넣은 후 Syringe Pump(0.5~2 ml/min)를 활용하여 제대혈 줄기세포를 채널에 통과시키고, 완전히 통과된 후 반대 방향으로 다시 통과시켜 제대혈 줄기세포를 압출 및 분쇄하였다.

단계별 생산된 세포외소포체의 농도 및 크기를 분석하기 위해, 도 3에 도시된 바와 같이, 각 단계별로 각종 샘플을 준비하였다.

KSB-3 (샘플 1): 줄기세포 배양액 내 엑소좀

PBS washing (샘플 2): PBS Washing한 후 FBS내 세포외소포체

Microchannel (샘플 3): Microchannel 활용 세포파쇄로 생성된 인공 나노소포체

2.2.3. 인공 나노소포체 분리

인공 나노 소포체 생산 완료 후 원심분리(1000xg at 5min) 하여 세포 및 Debris를 제거한 후 Tangential Filter Flow 방법으로 인공 나노 소포체를 분리하였다, 각 단계로별 준비된 샘플들로부터 분리된 인공 나노 소포체는 Nano Tracking assay 방법을 통하여 크기 및 농도를 확인하여 정량하였다.

도 4는 제대혈 줄기세포를 배양 후 수거하여 PBS 세척 후 0.5~2x10^6/ml 농도로 재 현탁한 다음 Syringe Pump를 활용하여 1ml/min 속도로 마이크로채널에 1~5회 왕복 후 생성된 인공 나노 소포체를 분리하여 Nano Tracking Assay(NS300)로 인공 나노 소포체의 농도 및 크기를 분석한 결과로, 배양 배지 내 존재하는 나노 소포체를 PBS 세척으로 제거 후 인공 나노 소포체가 생성된 것을 확인할 수 있다.

Claims

선택적으로(optionally), 줄기세포를 배양하는 제1단계;
채널 횡단면을 기준으로, 유연하고 신축 가능한 기계적 특성을 발휘하는 폴리다이메틸실록세인(polydimethylsiloxane, PDMS) 소재로 적어도 일부를 구성하는 제1 마이크로채널에 줄기세포를 1회 이상 통과시켜, 줄기세포의 압출 및/또는 분쇄를 통해 제1 인공 나노소포체를 생산하는 제2단계; 및
선택적으로(optionally), 채널 횡단면을 기준으로, 유연하고 신축 가능한 기계적 특성을 발휘하는 폴리다이메틸실록세인(PDMS) 소재로 적어도 일부를 구성하는 제2 마이크로채널에 제1 인공 나노소포체를 1회 이상 통과시켜, 인공 나노소포체의 지질 이중층 재구성을 통해 제2 인공 나노소포체를 생산하는 제3단계
를 포함하는 인공 나노소포체 생산 방법.
제1항에 있어서, 제1 마이크로채널 및/또는 제2 마이크로채널은 시린지 펌프(Syringe Pump)가 연결되어 작동하는 것이 특징인 인공 나노소포체 생산 방법.
제1항에 있어서, 제2단계 및/또는 제3단계는 시린지 펌프를 활용하여 줄기세포 또는 제1 인공 나노소포체를 마이크로채널에 통과시키고, 완전히 통과된 후 반대 방향으로 다시 통과시키는 것이 특징인 인공 나노소포체 생산 방법.
제1항에 있어서, 제2단계 또는 제3단계에서 줄기세포 또는 제1 인공 나노소포체가 제1 마이크로채널 또는 제2 마이크로채널을 통과시키게 하는 유체는 삼투압 조절을 통해 인공 나노소포체의 안정성을 유지할 수 있는 용매인 것이 특징인 인공 나노소포체 생산 방법.
제1항에 있어서, 제2단계에서 사용되는 폴리다이메틸실록세인(PDMS) 소재 및 제3단계에서 사용되는 폴리다이메틸실록세인(PDMS) 소재는 각각 독립적으로 유연성 및/또는 신축성 정도가 동일 또는 상이한 것이 특징인 인공 나노소포체 생산 방법.
제1항에 있어서, 제1 마이크로채널 및/또는 제2 마이크로채널은 각각 독립적으로 적어도 한 지점에서의 횡단면의 면적이 한 개의 줄기세포 또는 제1 인공 나노소포체의 횡단면 최대 면적 보다 작아 줄기세포 또는 제1 인공 나노소포체를 압출 및/또는 분쇄시킬 수 있는 것이 특징인 인공 나노소포체 생산 방법.
제1항에 있어서, 줄기세포 또는 제1 인공 나노소포체를 압출 및/또는 분쇄시킬 수 있는 마이크로채널 단면은 압출 및/또는 분쇄 대상인 줄기세포 또는 제1 인공 나노소포체의 최대 단면의 10 ~ 80 % 인 것이 특징인 인공 나노소포체 생산 방법.
제1항에 있어서, 경피 투과가 용이한 작은 입자 크기 직경 100 nm ± 20 nm의 인공 나노 소포체를 대량생산하는 것이 특징인 인공 나노소포체 생산 방법.
제1항에 있어서, 마이크로채널 길이방향으로 응집된 제대혈 줄기세포들 및/또는 제1 인공 나노소포체들을 분리하기 위해 마이크로채널의 횡단면 크기가 작아지는 적어도 일정 구간을 구비하는 것이 특징인 인공 나노소포체 생산 방법.
제1항에 있어서, 제1단계는 길이방향으로 마이크로채널의 적어도 일면을 구성하는 폴리다이메틸실록세인(PDMS)을 통해 기체 통과가 가능한 마이크로채널에서 수행하는 것이 특징인 인공 나노소포체 생산 방법.
제1항에 있어서, 생산된 인공 나노소포체는 재생의료 관련 치료제 및/또는 항염제로 사용되는 것이 특징인 인공 나노소포체 생산 방법.
제1항에 있어서, 제2단계 또는 제3단계에서 생산한 제1 인공 나노소포체 또는 제2 인공 나노소포체는 인간 섬유아세포 및/또는 인간 각질형성세포의 이동능 및/또는 증식능을 향상시키는 것이 특징인, 인공 나노소포체 생산 방법.
제1항에 있어서, 제2단계 및/또는 제3단계는 인공 나노소포체에 탑재하고자 하는 물질이 존재하는 유체 존재 하에서 수행하는 것이 특징인 인공 나노소포체 생산 방법.
제13항에 있어서, 인공 나노소포체에 탑재하고자 하는 물질은 단백질, 유전체, 핵산, 약물, 및 마커로 구성된 군에서 하나 이상 선택된 것이 특징인 인공 나노소포체 생산 방법.
제13항에 있어서, 인공 나노소포체 표면에 탑재하고자 하는 물질은 암 특이적 마커 또는 이와 결합하는 단백질이고, 생산된 인공 나노소포체는 암 진단제 또는 항암제로 사용하는 것이 특징인 인공 나노소포체 생산 방법.
제1항에 있어서, 제2단계 또는 제3단계에서 생산한 제1 인공 나노소포체 또는 제2 인공 나노소포체를 사용 목적에 따라 제형화하는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 인공 나노소포체 생산 방법.
제16항에 있어서, 제2단계 또는 제3단계에서 생산한 제1 인공 나노소포체 또는 제2 인공 나노소포체를 겔화(gelation)하거나; 동결 또는 건조하여 분말화하는 것이 특징인 인공 나노소포체 생산 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기세포는 제대혈 줄기세포인 것이 특징인 인공 나노소포체 생산 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 수득된 제대혈 줄기세포 유래 인공 나노소포체를 유효성분으로 함유하는 피부 또는 생체 멤브레인(covering and lining membranes) 도포용 조성물.
제19항에 있어서, 화장료 조성물, 의약외품 조성물, 또는 약학 조성물인 것이 특징인 피부 또는 생체 멤브레인(covering and lining membranes) 도포용 조성물.