CN117917964A

CN117917964A - 包含源自曲的细胞外囊泡的皮肤用组合物

Info

Publication number: CN117917964A
Application number: CN202280060892.7A
Authority: CN
Inventors: 落谷孝广; 村中麻生
Original assignee: Asahi Wine Manufacturing Co ltd; Da Vinci Global Ltd
Current assignee: Asahi Wine Manufacturing Co ltd; Da Vinci Global Ltd
Priority date: 2021-09-09
Filing date: 2022-09-09
Publication date: 2024-04-23
Also published as: JPWO2023038118A1; WO2023038118A1

Abstract

本发明提供一种皮肤用组合物，其包含源自曲的细胞外囊泡。

Description

包含源自曲的细胞外囊泡的皮肤用组合物

技术领域

本发明涉及包含源自曲的细胞外囊泡，特别是源自曲的外泌体的皮肤用组合物。

背景技术

外泌体是由细胞分泌的膜小泡，其表面由脂质双层膜构成。外泌体通过将细胞内的蛋白质、遗传信息(mRNA,microRNA等)搬运至细胞外，负责了局部或全身中的细胞间的信息传达。所述外泌体的功能涉及许多方面，例如，已经报告革兰氏阴性的细菌来源的细胞外囊泡具有有抗癌症作用等的功能(非专利文献1：Kim OY et al.,Nat Commun,626,2017)。

也认为外泌体的功能根据其来源的细胞而不同。例如，已知在脂肪来源干细胞等间充质干细胞来源外泌体的情况下，有抑制炎症的功能、治疗认知障碍症的功能等(非专利文献2：Katsuda et al.,Methods Mol Biol.,1212,2015)。

因此，认为可以通过使用由各种细胞分泌的外泌体，带来各种生理的功能，适用于各种疾病的治疗。

然而，外泌体对皮肤的效果，例如对皮肤的黑色素细胞的效果没有明确。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Kim OY et al.,Nat Commun,626,2017

非专利文献2：Katsuda et al.,Methods Mol Biol.,1212,2015

发明内容

发明所解决的技术问题

在所述的情况下，有需求开发作为皮肤用剂的有用的外泌体。

解决问题的技术手段

本发明人为了解决所述问题而进行了深入研究的结果，发现源自曲的外泌体抑制黑色素细胞，并完成了本发明。

即，本发明如下：

(1)一种皮肤用组合物，其包含源自曲的细胞外囊泡。

(2)根据(1)所述的组合物，其中，

细胞外囊泡为外泌体。

(3)根据(1)或(2)所述的组合物，其中，

曲为米曲、麦曲或豆曲。

(4)根据(1)～(3)中任一项所述的组合物，其作为药品、医药部外品或化妆品来使用。

(5)根据(1)～(4)中任一项所述的组合物，其用于皮肤的美白、抗皱、皮肤再生、皮肤创伤治愈或皮炎。

(6)一种源自曲的细胞外囊泡的制造方法，其中，

培养曲霉菌，从得到的培养物中采集细胞外囊泡。

(7)根据(6)所述的方法，其中，

曲霉菌为黄曲霉菌、白曲霉菌、黑曲霉菌或红曲霉菌。

(8)根据(6)或(7)所述的方法，其中，

细胞外囊泡为外泌体。

发明的效果

通过本发明，提供源自曲的细胞外囊泡。本发明的细胞外囊泡(特别是源自曲的外泌体)抑制黑色素细胞的活性、增殖、涉及黑色素色素的分泌的基因等，因此作为皮肤外用剂、化妆品是有用的。

附图说明

[图1]是表示獭祭甘酒(米曲)来源的细胞外囊泡的黑色素细胞抑制效果的图。

[图2]是表示使用了B16细胞(小鼠B16黑色素瘤4A5)的黑色素合成抑制试验结果的图。

具体实施方式

1.源自曲的细胞外囊泡

本发明涉及包含源自曲的细胞外囊泡的皮肤用组合物。本发明的组合物可以作为用于药品、医药部外品或化妆品的组合物来使用。

本发明中使用的细胞外囊泡可以为外泌体、微囊泡(microvesicle)、凋亡小体中的任一种，优选为外泌体。外泌体是内体来源的小泡，微囊泡是由细胞直接分泌的小泡，凋亡小体是通过细胞死亡而产生的细胞片段。

对本发明的源自曲的细胞外囊泡的制造方法，特别是外泌体举例进行说明。

(1)曲

曲是在米、麦、大豆等谷物中使曲霉等对食品发酵有效的微生物繁殖了的物质。因此，作为曲的原料可举出米、麦、大豆等。

使用曲霉菌来发酵所述曲的原料。

本发明中使用的曲霉菌为自古用于日本酒、味噌、酱油等酿造的微生物。曲霉菌具有在1升的培养液中分泌几克这样的较高的蛋白质的能力，因此也利用于酶等有用蛋白质生产。

在本发明中，可以使用例如以下的曲霉菌

黄曲霉菌：Aspergillus oryzae(米曲霉菌)、Aspergillus sojae(酱油曲霉菌)等

黑曲霉菌：Aspergillus nigar(黑曲霉菌)等

白曲霉菌：Aspergillus kawachii(河内白曲霉菌)等

红曲霉菌：Monascus属(红曲霉属)所属的菌

(2)培养

首先，水洗米直至变得没有白色浑浊。废弃了水洗后的水后，添加新的水将米进行浸渍直至完全浸泡。水中浸泡的大致时间没有特别限定，可以根据例如季节而调节。例如夏季为3-5小时，春秋为6-12小时，冬季为15-20小时。浸渍后，将米放入竹篓中进行2～4小时左右沥水，并且以使得1小时1～2次左右交替米的上下部分的方式进行混合。然后，将米转移到蒸锅中蒸。蒸熟的米迅速铺在用酒精(或者烧酒)灭菌后的托盘等上，以使用饭勺等来切米的方式快速蒸发米表面的水分和热气。

在蒸熟的米的温度变为了大约36度的阶段撒上种曲。就种曲的使用量而言，例如对于1kg的米而种曲为2g。快速收集混和了曲的米，并用干净的布包入。

以使得布中包好的米变为温度为30～32度左右的方式进行保温。从在蒸米上撒上种曲起45～48小时后曲已经制成。曲出现强烈的栗子这样的味道，菌丝伸出并且米彼此粘附而形成板状，大致制成容易松开的程度。对于所述米曲(原材料)，添加水(对于100克的米曲，1L的水)，在4℃下放置8～16小时时得到包含细胞外囊泡的曲水。或者，在30度到37度下放置一晚，完成包含细胞外囊泡的米曲。

(3)回收

就从培养物(米曲等发酵物)中的外泌体的回收法而言，可举出超离心分离法、免疫沉淀法、通过磁珠的亲和法、密度梯度离心法等。可以采用市售的用于外泌体分离的试剂，分离外泌体，并回收。

在超离心分离法的情况下，例如，可以通过预先以100g～10000g左右的离心力进行几个阶段，接下来，以120000g左右的离心力进行超离心分离70分钟，由此得到高纯度的外泌体。但是，若是本领域技术人员，则可以适宜设定离心分离方法和条件。

就回收得到的外泌体为目标物质的确认而言，可以通过基于透射型电子显微镜的形态观察、基于纳米颗粒跟踪系统(Nanoparticle Tracking System)的粒子数、粒径测量、利用了PCR的基因解析、免疫学的方法(ELISA、FACS等)、蛋白质印迹等而进行。

此外，将被识别为外泌体标志物的蛋白质作为指标而确定目标外泌体。例如，可以将CD9、CD63等作为标志物而用于检测。

2.皮肤用组合物

本发明提供包含源自曲的细胞外囊泡，特别是源自曲的外泌体的皮肤用组合物。本发明的皮肤用组合物作为化妆品、药品或医药部外品而使用。

作为本发明的皮肤用组合物的使用的对象的障碍或疾病，没有特别限定。

本发明的皮肤用组合物只要在其含有有效量的作为有效成分的外泌体且不失去其活性的情况下，就可以根据使用方式而包含药学(医药)上可允许的各种载体。例如，作为稀释剂、赋形剂等，可以适用通常使用的载体。

例如，可举出水、生理盐水(PBS等)、各种有机溶剂。作为有机溶剂，可举出醇(乙醇等)水溶液、甘油、橄榄油等。此外，可以添加各种填充剂、增量剂、结合剂、表面活化剂、色素、香料等。

在将本发明的源自曲的细胞外囊泡作为药物组合物来使用的情况下，可以为液剂、悬浮剂、乳剂、软膏、水性凝胶、片、微针等非口服制剂的方式或颗粒剂、粉末剂、片剂、胶囊等口服制剂的方式。

此外，为了用于注射等，可以是用于在即将使用前溶解于生理盐水或适当的缓冲液(例如PBS)等来制备药液的冷冻干燥物、造粒物。

本发明的组合物可以以对应治疗目的、患者的方式、方法、用量而使用。

就添加量和添加的次数而言，预测除了皮肤疾病或障碍的种类以外，还由于直到得到外泌体的培养条件、培养基的种类等条件而不同。因此，本领域技术人员可以适宜设定用法和用量。

例如，作为外泌体的有效量，培养基中的浓度为1×10⁹个/mL以上，优选为5μg/mL～20μg/mL。

本发明的皮肤用组合物可以根据化妆品或作为定位于化妆品和药品的中间位置的医药部外品(药用化妆品)等分类，作为各种组合物来制造。

本发明的皮肤用组合物的效能可举出，例如，美白、抗皱、皮肤粗糙、粗糙性、汗疹、冻疮、裂口、龟裂、痤疮、油性皮肤、须疮、日晒引起的斑点/雀斑、日晒或雪晒后的潮热、紧致皮肤、清洁皮肤、调理皮肤、保持皮肤健康、滋润皮肤、保护皮肤、防止皮肤的干燥、使干燥引起的小褶皱变得不明显等。此外本发明的皮肤用组合物可以用于皮肤癌、皮肤外伤、火伤、皮肤的再生医疗、皮肤创伤治愈、特应性皮炎等。

优选地，可举出美白、抗皱、皮肤再生、皮肤创伤治愈、特应性皮炎等。

作为皮肤用组合物的剂型，例如，可举出液体剂、喷涂剂、软膏剂、霜剂、凝胶剂、贴附剂。此外，在将皮肤用组合物作为皮肤外用剂或化妆品来使用的情况下，例如，可举出基础化妆品(化妆水、霜、乳液、美容液、洗面奶等)、彩妆化妆品(粉底等)、头发护理制品(洗发水、护发素、美发用品等)、其他化妆用品(美白剂、脱毛剂等)。

此外，也可以作为如上所述颗粒剂、粉末剂、片剂、胶囊等口服制剂的方式。

本发明的皮肤用组合物可以根据其分类(化妆品、医药部外品等)、剂型，包含外泌体以外的成分。作为外泌体以外的成分，可举出在化妆品或医药部外品(特别是皮肤外用剂、经皮给药用组合物)等制造中通常使用的添加剂，例如稳定剂、保存剂、缓冲剂、pH调节剂、赋形剂等。就这样的外泌体以外的成分的含量而言，若是本领域技术人员则可以适宜调节。

根据需要，不是作为内包于外泌体的成分，而是作为在不内包于外泌体的状态下配合于皮肤外用剂中的成分，也可以使用已知配合于化妆品、医药部外品等中的药物。作为这样的药物，例如，可举出维生素A，C，B，E和其衍生物，雌激素等。

实施例

以下，通过实施例对本发明进一步具体地进行说明。但是，本发明的范围不通过这些实施例进行限定。

实施例1

(1)米源自曲的细胞外囊泡引起的黑色素细胞的基因表达变动

作为人/黑色素细胞，使用了正常人表皮黑色素细胞(Human EpidermalMelanocyte,Normal，Cryopreserved<NHEM-c>，FUNAKOSHI，C-12400，来源：未成年包皮)。

在黑色素细胞的培养中，使用Melanocyte Growth Medium Kit(FUNAKOSHI，C-24110)，培养方法遵循附加的程序手册。

作为用于培养的锥形瓶，使用T-25(Nunc用于细胞培养的处理完成EasYFlask156367)，使细胞增殖至80％汇合后，添加了米源自曲的细胞外囊泡。添加后的浓度为每细胞100个～1000个。

将米源自曲的细胞外囊泡添加至细胞培养培养基后，在CO₂培养箱中培养了72小时。培养后，用细胞刮刀来回收细胞，用Qiagen公司的mRNA纯化试剂盒来回收了mRNA(RNAeasy mini kit)。

基于该mRNA，通过定量的PCR对酪氨酸酶(Tyrosinase)、ROS、EPR、ETBR和Mc1r的各个基因表达量进行定量(QuantiTect Probe PCR Kit(200)，Qiagen公司)，将细胞外囊泡的添加前的细胞的各个基因表达量作为100，得到了72小时后的相对的表达量。

其结果，明确了抑制涉及全部的黑色素合成的基因的表达(图1)。图中，用N＝2的平均值来表示。

(2)使用了B16细胞(小鼠B16黑色素瘤4A5)的黑色素合成抑制试验

就细胞而言，使用了小鼠来源B16黑色素瘤4A5细胞株(MERCK公司：94042254)。

就培养基而言，使用了Gibco公司的DMEM+2mM谷氨酰胺+10％胎牛血清(FBS)。

将B16细胞在6孔板(康宁公司)中培养，在变成了85％汇合的时间点，添加了米源自曲的细胞外囊泡。

添加后的浓度为每细胞10个～1000个，在所述范围内进行了比较研究。将细胞外囊泡添加至细胞培养培养基后，在CO₂培养箱中培养了72小时。培养后，提取细胞中包含的黑色素(溶解于1M NaOH(和光纯药工业))，用吸光度计进行了吸光度测定(OD420nm)。就测定结果而言，将未处理的B16细胞的黑色素量作为100，用相对值来表示。表示了N＝3的平均值。

作为对照，使用了PBS(-)、维生素C(10mg/ml)添加群。

其结果，在添加米源自曲的细胞外囊泡时，根据其添加量，黑色素色素量减弱了(图2)。

Claims

1.一种皮肤用组合物，其包含：源自曲的细胞外囊泡。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，

细胞外囊泡为外泌体。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，

曲为米曲、麦曲或豆曲。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的组合物，其作为药品、医药部外品或化妆品来使用。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的组合物，其用于皮肤的美白、抗皱、皮肤再生、皮肤创伤治愈或皮炎。

6.一种源自曲的细胞外囊泡的制造方法，其中，

培养曲霉菌，从得到的培养物中采集细胞外囊泡。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，

曲霉菌为黄曲霉菌、白曲霉菌、黑曲霉菌或红曲霉菌。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，

细胞外囊泡为外泌体。