KR100975499B1

KR100975499B1 - 강진향 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 조성물

Info

Publication number: KR100975499B1
Application number: KR1020100018719A
Authority: KR
Inventors: 백경신; 이창권
Original assignee: 백경신
Priority date: 2010-03-02
Filing date: 2010-03-02
Publication date: 2010-08-11

Abstract

본 발명은 강진향 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 조성물, 이를 포함하는 약학적 조성물 및 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

강진향 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 조성물{A composition for anti-aging or wrinkle improvement of skin comprising Dalbergia odorifera extract or fractions thereof}

사람의 피부는 각질층을 포함하는 표피와 진피, 그리고 결합조직으로 구성되어 있는데 그 중 각질층은 표피(epidermis)의 기저세포인 케라티노사이트(keratinocyte)의 분화과정을 통해 형성되는 죽은 세포층으로 구성되어 있고 인체를 외부환경의 영향으로부터 보호해주는 역할을 담당하고 있다. 또한 피부의 내부에 존재하는 진피층은 섬유성 단백질인 콜라겐(collagen)과 엘라스틴(elastin)으로 구성되어 있어 피부의 탄력을 주어 피부가 처지지 않도록 지켜주는 역할을 담당하고 있다.

이러한 피부의 노화나 주름의 생성의 원인에 대해서는 크게 두 가지로 연구되고 있는데, 하나는 "내적 노화"로서 연령의 증가에 따른 피부의 구성단위인 세포의 기능변화에 기인한 것이고, 다른 하나는 "외적 노화"로서 외부 환경 즉 자외선, 공해, 스트레스 등에 의한 것으로 나눌 수 있다. 피부 노화의 원인 중에서도 가장 큰 부분을 차지하고 있는 광노화는 UV에 의한 지속적인 노출에 의해 피부암 등의 급성 및 만성적인 피부의 상해를 유발한다. 이것은 태양광에 존재하는 파장대에 따라 UVA (320-400 nm), UVB (290-320 nm) 그리고 UVC (200-290 nm) 3가지로 나뉘어지는데, 이 중 UVC는 오존층에 의해 거의 완벽히 흡수되는 반면, UVA와 UVB는 지구의 표면까지 도달하여 피부상해를 유발하는 치명적인 인자로 작용한다. UVA 보다 짧은 파장대이지만 더욱 강력한 UVB는 진피의 윗부분에 존재하는 표피를 관통하여 케라티노사이트에 상해를 입히고 콜라겐 섬유를 손상시켜 그 결과 광노화, 피부의 변색 그리고 피부암을 야기하는 것으로 알려져 있다.

또한, 피부의 노화 과정 중에 일어나는 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)의 변성은 피부의 주름을 생성시키고 피부의 탄력 감소를 유발한다. 현재까지 항 노화의 주요 타겟은 메탈로프로테아제(metalloproteases) 혹은 콜라겐이나 엘라스틴 같은 구조 단백질에 집중되어 있지만, 최근 세포와 세포외 기질 단백질(콜라겐, 피브릴린, 피브로넥틴) 간의 상호작용이 세포의 생존과 증식, 조직의 재건에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다.

한편, 퍼옥시좀 증식활성화 수용체(peroxisome proliferation-activated receptors: 이하, PPAR라 함)은 핵내호르몬 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 리간드 유도성 전사인자로서, 세포 분화와 증식, 지질 항상성 및 에너지 대사를 포함한, 많은 세포성 및 대사성 과정을 조절한다. 지금까지 3개의 PPAR 서브패밀리인 PPARα (NR1C1), PPARδ (NR1C2, 또한 PPARβ, FAAR 및 NUC1로도 알려짐) 및 PPAR γ (NR1C3)가 동정되었다. 상기 수용체는 RXR(retinoid X receptor)와 이량체를 형성하고 타겟 유전자의 조절 영역에 존재하는 PPRE(PPAR response elements)라고 하는 특이적인 염기서열에 결합함으로써 유전자 발현을 조절하는데, PPAR 타겟 유전자의 프로모터 영역은 하나 또는 두 개의 뉴클레오타이드에 의해 구별되는, 6개의 염기서열인 AGGTCA의 반복적인 염기서열로 구성되어 있다. 이러한 PPAR은 피부 구성세포에 전반적으로 존재하며 피부 장벽 기능의 항상성 유지 및 복원, 보습능력, 염증치유 과정의 발현에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀져 있다. 즉, PPAR은 에너지 항상성을 조절하는 인자로, 특히 PPAR이 다양한 기전을 통해 피부장벽의 투과성 조절, 표피층 증식억제, 표피층의 분화유도 등과 같은 피부상태 조절에 관여한다는 것이 알려져 있다. 이러한 특징때문에, PPAR은 피부조직을 구성하는 세포인 케라티노사이트와 피부 섬유아세포에서 풍부하게 발현되고 있는 것으로 알려져 있으며, 염증관련 피부질환뿐만 아니라 표피층의 과증식으로 인한 건선, 상처치유, 여드름 등 다양한 피부질환의 핵심조절자로 작용함이 알려져 있다. 따라서, 케라티노사이트와 피부 섬유아세포에서 상기와 같은 PPAR을 조절하여 세포외 기질 단백질의 발현을 촉진시킬 수 있다면 상기와 같은 피부노화의 개선을 가져올 수 있다.

한편, 강진향(Dalbergia odorifera T.CHEN)은 식물분류학적으로 콩과(豆科) 식물에 속하는 강향단의 근부 심재이며, 낙엽 교본으로서 길이가 약 10 m까지 자라고 잎은 호생하는 식물로서, 한방에서는 강향, 자등향, 번강, 계골향 등의 이름으로 불리기도 하며, 진통(鎭痛), 지혈(止血), 통기, 행어 등의 목적으로 사용되어 왔던 한약재이다. 또한, 근부 심재가 적갈색 또는 자색으로서 단단하여 약재는 근부를 취하여 외피를 제거한 후 사용한다. 최근에는 상기 강진향에 소염, 골다공증 치료, 면역반응과 관련된 항알러지 등에 효과가 있다는 보고가 있으나, 아직까지 강진향이 단독으로 사용되어 피부 노화를 억제하고 주름을 개선하는 효과가 있음은 보고된 바가 없었다.

이에, 본 발명자는 피부 노화 억제 및 주름 개선 효과가 우수한 천연물 유래 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 강진향 추출물 또는 이의 분획물이 피부세포에서 PPARδ을 활성화시켜 세포외기질 단백질인 타입 I 콜라겐, 타입 III 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴, 및 TGF-β1(Transforming Growth Factor - beta 1) 단백질 발현을 촉진하고, UV 조사에 의해 발생된 활성산소(ROS)의 생성을 저해함으로써, 피부 노화 억제 및 주름 개선에 탁월한 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 강진향 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 강진향 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 강진향 추출물은 강진향를 세척하고 건조시킨 후 분쇄하는 단계; 및 상기 분쇄된 강진향을 물, C₁~C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매로 추출하여 수득할 수 있다. 상기 강진향 추출물은 물, C₁~C₄의 저급 알콜 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올로 추출한 것을 포함하며 메탄올로 추출한 것이 더욱 바람직하다. 또한, 본 발명에 있어서, 상기 추출물에는, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물 중 어느 하나도 포함하는 것으로 한다.

추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명에서 강진향 추출물을 얻기 위한 방법은 다음과 같다. 건조 강진향을 건조 중량의 약 2 내지 20배, 바람직하게는 약 3 내지 5배에 달하는 부피의 물, 메탄올, 에탄올 및 부탄올 등과 같은 C₁~C₄의 저급 알콜의 극성 용매 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매를 용출 용매로써 사용하고, 추출 온도는 20 내지 100℃, 바람직하게는 25℃에서, 추출 기간은 약 5시간 내지 10일, 바람직하게는 5-10 시간 동안 진탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여 추출한다. 바람직하게는 진탕 추출로 25℃에서 120rpm으로 1시간 교반하여 진공여과로 상층액을 회수하고 이러한 과정을 3회 반복한 후 상층액을 회수한 후, 그 여과 추출물을 증류농축장치로 20 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서 감압농축 및 동결건조하여 물, 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매에 가용한 강진향 조추출물을 수득할 수 있다 (도 1 참조).

상기 강진향 추출물은 천연, 잡종, 변종 식물의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있고, 예를 들어 뿌리, 줄기, 잎, 및 꽃뿐만 아니라 식물 조직 배양물로부터 추출 가능하다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 강진향 추출물은 건조 강진향에 메탄올 또는 에탄올을 첨가하여 상층액으로부터 회수한 뒤 농축 및 동결건조시켜서 제조하였다.

또한, 상기 알콜 농축액에 물을 넣어 현탁시키고, n-헥산, 클로로포름 또는 에틸아세테이트와 같은 비극성 용매를 사용하여 분획함으로써 얻은 용매 분획물을 사용할 수도 있다.

또한, 상기 용매 분획물을 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 이소프로판올 등의 극성 용매 및 에틸아세테이트, n-헥산, 디클로로메탄 또는 클로로포름 등의 비극성 용매 중에서 선택된 2종 이상으로 이루어진 혼합용매를 이동상으로 하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여, 피부 노화 억제 및 주름 개선 효능이 있는 활성성분을 분리하여 사용할 수도 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "피부 노화 억제"는 강진향 추출물을 포함한 조성물을 사용하여 노화를 야기하는 원인을 불문하고 피부의 노화를 억제 또는 지연시키는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "피부 주름 개선"은 피부의 주름 및 탄력과 관련된 능력을 유지 또는 강화시키는 것을 의미한다. 피부의 구조 중에서 진피층에 존재하는 교원섬유인 콜라겐(collagen)과 탄력섬유인 엘라스틴(elastin)이 그러한 역할을 하는 주요 단백질로서 피부 탄력을 주관하는데, 콜라겐의 생합성은 피부의 내, 외적 영향을 받게 된다. 구체적으로, 피부세포는 자연 노화로 인하여 세포 활성이 감소되면 콜라겐 섬유의 감소가 일어나거나, 또는 외적요인으로서 자외선의 과량 조사되거나 스트레스 등에 의해 생성된 활성 산소가 단백질의 티올기(thiol: -SH)와 반응하여 효소 활성을 저해하거나, 콜라겐, 엘라스틴 등의 분해 효소의 발현을 증가시켜 피부의 주름을 증가시키고 탄력을 감소시키게 된다.

본 발명의 강진향 추출물 또는 이의 분획물은 이러한 피부 노화 및 주름의 생성에 대해 피부에서 세포외기질 단백질들의 발현을 증가시키고 케라티노사이트의 증식을 유도하며, 피부 탄력과 주름 개선 및 노화 억제를 효과적으로 조절한다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 강진향의 메탄올추출물을 피부세포에 처리한 결과, 케라티노사이트 및 피부섬유아세포 모두에서 타입 I 콜라겐, 타입 III 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴 및 TGF-β1의 단백질 발현이 유의하게 증가하는 것으로 나타나, 강진향 추출물이 세포외기질 단백질들의 발현을 촉진함을 확인하였다 (도 2 및 도 8참조).

그리고, 본 발명의 강진향 추출물 또는 이의 분획물은 피부 세포의 증식을 가속화하여 피부 표피 세포의 재생을 촉진시킴으로서 손상된 피부의 재생과 주름개선에 기여할 수 있다. 본 발명의 구체적 실시예에 따르면, 강진향 메탄올 추출물을 피부세포에 처리하여 피부세포의 증식에 대한 강진향 메탄올추출물의 효과를 조사한 결과, 사람 케라티노사이트 및 피부 섬유아세포에서 대조군에 비해 유의하게 세포증식이 증가함을 확인하였다 (도 3 참조).

또한, 본 발명의 강진향 추출물 또는 이의 분획물은 UV에 의해 발생되는 베타-갈락토시데이즈의 억제나 활성산소종을 제거하는 항산화 기능을 가지므로, 피부 탄력과 주름 개선 및 노화 억제를 효과적으로 조절할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 광노화에 대한 강진향 메탄올 추출물의 영향을 조사하기 위해 노화의 중요 지표인 베타-갈락토시데이즈 활성을 측정하여 분석한 결과, 강진향 메탄올 추출물에 의해 UVB에 의해 유도된 베타-갈락토시데이즈 활성이 농도의존적으로 유의하게 억제됨을 확인하였다(도 4 참조).

본 발명에서 사용되는 용어, "항산화"는 자외선의 영향으로 반응성이 높은 활성 산소와 자유 라디칼(free radical)에 의한 피부 구성 성분의 산화를 억제하는 기능을 의미한다. 활성 산소와 자유 라디칼은 피부를 구성하는 성분들을 산화시켜 과산화물을 생성하고, 그 결과 피부가 구조적 및 기능적으로 손상되어 노화가 촉진되는데, 본 발명의 항산화 기능은 이로부터 피부를 보호하는 기능을 수행한다. 본 발명의 강진향 추출물을 포함한 조성물은 상기 자유 라디칼을 불활성화시키는 기능을 수행할 수 있는데, 바람직하게는 UVB에 의해 생성된 활성산소 라디칼(superoxide radical)을 소거할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예로서, 강진향 메탄올 추출물의 UV 조사에 의해 발생되는 활성산소종의 생성을 억제하는 항산화 효과를 알아보기 위해, 강진향 메탄올추출물을 세포에 처리한 후 과산화수소에 특이적인 DCFH-DA를 사용하여 Confocal laser sanning microscopy로 측정한 결과, 사람 케라티노사이트에서 UVB 조사에 의해 생성된 ROS 생성유도가 현저하게 억제됨을 관찰함으로써 강진향 메탄올추출물이 피부 세포 내에서 활성산소종의 생성을 억제하여 항산화 기능을 가짐을 확인할 수 있었다(도 5 참조).

따라서, 본 발명에 따른 강진향 추출물 또는 이의 분획물은 세포외 기질 단백질의 발현을 촉진하고 세포를 증식하여 피부탄력을 유지하고, 특히 UV에 의한 피부 손상 및 노화를 효과적으로 억제하는 효과가 있다.

상기와 같은 강진향 추출물 또는 이의 분획물의 효능에 대해, 본 발명자는 정상 사람 케라티노사이트와 피부 섬유아세포에서 세포외 기질의 단백질의 발현을 조절하는 작용메커니즘에 대해 살펴보고자 하였다. 그 결과, 강진향 추출물의 성분이 핵내 중요 전사조절인자인 PPARδ의 리간드로서 작용하여 PPARδ을 활성화하여 세포외 기질 단백질의 발현을 유도함을 밝혔다.

본 발명에서, PPARδ는 핵내에서 특이 리간드의 결합에 의해 활성화되어 특정유전자의 프로모터영역에 존재하는 PPRE에 결합함으로써, 유전자의 발현을 전사단계에서 조절하는 전사인자를 말한다. 본 발명의 강진향 추출물 또는 이의 분획물은 상기 PPARδ를 특이적으로 활성화할 수 있는 성분을 포함하며, 이는 상기 강진향 추출물 또는 이의 분획물이 PPARδ에 특이적인 리간드를 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 정상 사람 케라티노사이트 및 피부 섬유아세포에서 세포외 기질인 타입 I 콜라겐 및 타입 III 콜라겐의 발현에 PPARδ가 관여하는지를 살펴보기 위하여 siRNA에 의해 PPARδ의 발현을 억제(knock-down)하여 실험한 결과, 강진향 메탄올추출물 처리에 의해 발현이 유도된 타입 I 콜라겐 및 타입 III 콜라겐의 발현이 PPARδ siRNA의 존재하에서 억제됨을 관찰할 수 있었으며(도 6 참조), 강진향 메탄올추출물이 PPARδ의 전사활성을 직접 조절할 수 있는지를 알아보기 위해 루시퍼라제를 이용한 실험결과는 PPARδ가 강진향 메탄올추출물에 포함되는 것으로 추정되는 리간드에 의해 활성되는 것을 지시하였다(도 7 참조).

따라서, 본 발명에 따른 강진향 추출물 또는 이의 분획물은 PPARδ을 활성화하여 세포외 기질 단백질의 발현을 유도함을 알 수 있었다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 강진향 추출물 또는 이의 분획물은 피부세포에서 PPARδ을 활성화시켜 세포외 기질 단백질의 발현을 촉진하고, UV 조사에 의해 발생된 활성산소(ROS)의 생성을 저해함으로써, 피부 노화 억제 및 주름 개선에 효과가 있으므로, 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명에 의하면, 강진향 추출물 또는 이의 분획물은 피부세포인 케라티노사이트 및 피부 섬유아세포에서 세포외 기질인 타입 I 콜라겐, 타입III 콜라겐, 피브로넥틴, 및 TGF-β1의 발현을 촉진하고, UV 조사에 의해 발생되는 활성산소의 생성을 저해하고, 피부 노화의 지표인 베타-갈락토시데이즈의 활성을 저해함으로써, 피부의 노화를 억제할 뿐만 아니라 피부 주름개선 등의 효과가 있으므로, 피부세포의 항상성을 개선할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 약학적 조성물의 처리량은 약학적으로 유효한 양이어야 한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 유효량은 당업자에게 인식되어 있듯이 처리의 경로, 부형제의 사용 및 다른 약제와 함께 사용할 수 있는 가능성에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 약학적 조성물의 약학적 처리 형태는 이들의 약제학적으로 허용되는 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 다른 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 약학적 제형으로 제조될 수 있다. 제형의 제조에 있어서, 활성 성분을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.

따라서, 본 발명의 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 약학적 조성물, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제 및 패치의 형태로 제형화하여 사용될 수 있고, 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어, "화장료 조성물"은 상기 강진향 추출물을 포함하는 조성물로서 그 제형은 어떠한 형태라도 가능하다. 이러한 제형의 예를 들면 상기 조성물을 이용하여 제조된 화장료는 크림류, 팩류, 로션류, 에센스류, 화장수류, 파운데이션류 및 메이크업 베이스류 등이고, 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 이러한 제형 중 어떠한 형태로도 제조되어 상용화될 수 있으며, 상기 예들에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물에는 통상의 화장료 제조 방법으로 제형화할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물에 일반 피부 화장료에 배합되는 보통의 성분을 필요한 만큼 적용 배합하는 것이 가능하다.

구체적으로, 본 발명의 조성물은 경피 침투 강화제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, “경피 침투 강화제”란 피부의 혈관세포 내로 원하는 성분이 높은 흡수율로 침투할 수 있게 해주는 조성물이다. 바람직하게는 레시틴 화장품에 사용되는 다른 인지질 성분, 리포좀 성분 등이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.

또한, 유상 성분으로서 주로 사용될 수 있는 오일로는 식물성 오일, 광물성 오일, 실리콘유 및 합성유 중에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 미네랄오일, 사이크로메치콘, 스쿠알란, 옥틸도데실 미리스테이트, 올리브오일, 비티스 비니페라 씨드 오일, 마카다미아너트오일, 글리세릴옥타노에이트, 캐스터오일, 에칠헥실 이소노나노에이트, 디메치콘, 사이크로펜타실록산, 선플라워씨드 오일 등을 사용할 수 있다.

또한, 유화 능력을 보강하기 위하여 계면활성제, 고급 알콜 등을 0.1 내지 5 중량% 첨가할 수 있다. 이러한 계면 활성제로는 비이온 계면활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제, 인지질 등과 같은 통상적인 계면활성제를 사용할 수 있으며, 구체적으로, 소르비탄세스퀴놀리에이트, 폴리솔베이트 60, 글리세릴 스테아레이트, 친유형 글리세릴스테아레이트, 소르비탄 올리에이트, 소르비탄 스테아레이트, 디이에이-세틸포스페이트, 소르비탄스테아레이트/슈크로스코코에이트, 글리세릴스테아레이트/폴리에틸렌글라이콜-100 스테아레이트, 세테아레스-6 올리베이트, 아라키딜알코올/베헤닐알코올/아라키딜 글루코사이드. 폴리프로필렌글라이콜-26-부테스-26/폴리에틸렌글라이콜-40 하이드로제네이티드 캐스터오일 등을 사용할 수 있다. 고급 알콜로는 탄소수가 12 내지 20인 알콜, 예컨대 세틸알코올, 스테아릴 알코올, 옥틸도데칸올, 이소스테아릴 알코올 등을 단독으로 또는 1종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.

수상 성분은 수상의 점도 또는 경도를 조절하기 위하여 카보머, 잔탄검, 벤토나이트, 마그네슘알루미늄실리케이트, 셀룰로오스검, 덱스트린 팔미테이트 등과 같은 1종 이상의 점증제를 0.001 내지 5 중량% 더 첨가할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물에는 필요에 따라 고급 지방산, 비타민 등의 약효 성분과 자외선 차단제, 산화 방지제(부틸히드록시아니솔,갈릭산프로필, 엘리소르빈산, 토코페릴아세테이드, 부틸레이티드하이드록시톨루엔 등), 방부제(메칠파라벤, 부틸파라벤, 프로필파라벤, 페녹시에탄올, 이미다졸리디닐우레아, 클로르페네신 등), 착색제, pH 조절제(트리에탄올아민, 씨트릭애씨드, 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등), 보습제(글리세린, 솔비톨, 프로필렌 글라이콜, 부틸렌 글라이콜, 헥실렌 글라이콜, 디글리세린, 베타인, 글리세레스-26, 메칠글루세스-20 등), 윤활제 등의 성분을 더 첨가할 수 있다.

또한 본 발명의 조성물은 피부에 필수 영양소를 보조적으로 제공할 수 있는 물질을 추가로 포함하는데, 바람직하게는 천연향, 화장품향, 또는 한약재가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 보조제를 함유할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명은 강진향 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선 효과가 뛰어나고, 합성된 화합물이 아니라 천연물 유래의 추출물 또는 이의 분획물을 사용하므로 안전하고 독성, 부작용이 거의 없어 장기간 피부에 사용할 수 있는 장점이 있으므로, 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 약학적 조성물, 화장료 조성물 등으로 사용할 수 있다.

도 1은 강진향으로부터 메탄올 혹은 에탄올 추출물을 분리해내는 과정을 보여주는 모식도이다.
도 2A는 정상 사람 케라티노사이트에 1 μg/ml의 강진향 메탄올추출물을 처리한 경우 TGF-β1, 타입 I 콜라겐, 타입 III 콜라겐, 피브로넥틴, 및 엘라스틴의 단백질 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 2B는 상기 도 2A에서 보여준 각각의 단백질 발현량을 정량한 것을 나타낸 도이다.
도 2C는 정상 사람 피부섬유아세포에 1 μg/ml의 강진향 메탄올추출물을 처리한 경우 TGF-β1, 타입 I 콜라겐, 타입 III 콜라겐, 피브로넥틴, 및 엘라스틴의 단백질 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 2D는 상기 도 2C에서 보여준 각각의 단백질 발현량을 정량한 것을 나타낸 도이다.
도 3은 정상 사람 케라티노사이트 및 피부섬유아세포에 1 μg/ml의 강진향 메탄올추출물을 처리한 후 시간 경과별로 세포의 증식 정도를 측정한 것이다: A는 케라티노사이트; B는 피부섬유아세포에 대한 것임.
도 4A는 정상 사람 케라티노사이트에서 UVB 조사에 따른 베타-갈락토시데이즈의 활성화에 대한 강진향 메탄올추출물의 효과를 나타낸 것이다.
도 4B는 상기 도 4A에서 보여준 베타-갈락토시데이즈의 염색 정도를 정량한 것을 나타낸 도이다.
도 5A는 정상 사람 케라티노사이트에서 UVB 조사에 따른 활성산소종의 생성에 대한 강진향 메탄올추출물의 효과를 나타낸 것이다.
도 5B는 상기 도 5A에서 보여준 DCFH-DA의 형광강도를 정량한 것을 나타낸 도이다.
도 6은 정상 사람 케라티노사이트 및 섬유아세포에서 강진향 메탄올추출물처리에 의한 타입 I 및 III 콜라겐의 발현유도에 있어서의 PPARδ siRNA의 효과를 나타낸 것이다: A는 케라티노사이트; B는 피부섬유아세포에 대한 것임.
도 7은 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포에서 강진향 메탄올추출물이 PPARδ의 전사활성화에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 정상 사람 케라티노사이트에 1 μg/ml의 강진향 유기용매추출물을 처리한 경우 타입 III 콜라겐의 단백질 발현 정도를 나타낸 것이다: A 및 B는 각각 메탄올 추출물 및 에탄올 추출물에 대한 결과이며, CTR는 대조군이며, GW는 GW501516임.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 재료 및 실험방법

재료

강진향(Dalbergia odorifera)은 경동 한약재상에서 구입하여 사용하였다. 2',7'-dichlorofluorescein diacetate (H₂DCF-DA)는 Calbiochem (La Jolla, CA, USA)으로부터 구입하였다. 대조군 siRNA 및 사람 PPARδ siRNA 는 Ambion (Austin, TX)으로부터 구입하였다. SuperFect 형질감염 시약은 Qiagen (Valencia, CA)으로부터 구입하였다. 루시퍼레이즈 및 베타-갈락토시데이즈 분석 시스템은 Promega Co.(Madison, WI)로부터 구입하였다. 폴리클론 래비트 항-콜라겐 타입 I, 래비트 항-피브로넥틴, 고오트 항-콜라겐 타입 III, 래비트 항-엘라스틴, 래비트 항-TGF-β1, 돈키 항-고오트 IgG-HRP 및 고오트 항-래비트 IgG-HRP는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다.

유기용매에 의한 강진향추출물의 추출

건조 강진향 100 g을 1000 ml의 70% 메탄올 혹은 60% 에탄올을 첨가하여 25℃에서 120rpm으로 1시간 교반하여, 진공여과로 상층액을 회수하였다. 이 과정을 3회 반복하여 상층액을 모은후, 감압농축 및 동결건조하여 강진향 메탄올 조추출물 10.12 g과 에탄올 조추출물 9.89 g을 수득하였다 (도 1).

세포배양

사람 초대배양 케라티노사이트(Welskin, Seoul, Korea)는 제조업자의 추천에 따라 케라티노사이트 성장 보충제를 함유한 케라티노사이트 성장 배지(Keratinocyte Growth Medium)에서 배양하였다. 사람 초대배양 피부 섬유아세포(Welskin, Seoul, Korea)는 10% 열로 불활성화시킨 소태아혈청이 보충된 100 U/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신을 함유한 DMEM(Dulbecco'smodified Eagle's medium)에서 37℃, 95% 공기와 5% CO₂의 대기 조건하에서 배양하였다.

웨스턴 블롯 분석

시약으로 처리된 세포를 차가운 PBS(phosphate-buffered saline)로 세척하고 PRO-PREP Protein Extraction Solution (iNtRON Biotechnology, Seoul, Korea)에서 용해하였다. 세포 용해물의 일부를 SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동한 후, Hybond-P⁺ polyvinylidene difluoride membrane (Amersham Biosciences UK Ltd, UK)로 이동시켰다. 멤브레인에서 일반적인 방법에 의해 특이적 항체를 사용하여 단백질을 검출하였다.

실시예 2: 정상 사람 케라티노사이트 및 사람 피부 섬유아세포에서 세포외 기질 단백질의 발현분석

강진향 메탄올추출물 1 μg/ml을 정상 사람 케라티노사이트 및 사람 피부 섬유아세포에 38시간 처리한 후, 웨스턴블롯에 의해 세포내에서의 세포외 기질인 타입 I 콜라겐, 타입 III 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴 및 TGF-β1의 단백질 발현에 미치는 영향을 분석하였다. 내부표준물질로서 β-actin을 사용하여 강진향의 메탄올추출물이 세포외 기질 단백질들의 발현에 미치는 영향을 검토한 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이, 2 종류의 정상 사람 유래 세포인 케라티노사이트 및 피부섬유아세포 모두에서 강진향의 메탄올 추출물에 의해 타입 I 콜라겐, 타입 III 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴 및 TGF-β1의 단백질 발현이 현저하게 증가함을 확인하였다.

실시예 3: 피부세포의 증식능 측정

피부세포의 증식에 대한 강진향 메탄올추출물의 효과를 조사하기 위해, 24-well 배양 디쉬에 1× 10⁴ cells/well 밀도로 접종된 세포를 18-24 시간 동안 배양한 후, 1 μg/ml의 강진향 메탄올추출물 또는 대조구(Vehicle)를 정해진 시간별로 사람 케라티노사이트 및 피부 섬유아세포에 처리하였다. 그런 다음, 100㎕의 세포 현탁액을 100㎕의 0.4% 트립판 블루 염료(Sigma, Korea)와 혼합한 것을 처리한 후, 살아있는 세포 즉, 트립판 블루가 차단된 생세포만을 Neubauer chamber(MARIENFELD, Germany)를 사용하여 계측하였다.

그 결과, 사람 케라티노사이트에서 대조군(Vehicle)과 비교하여 강진향 메탄올추출물 처리군에서 처리 후 12시간째부터 유의하게 세포증식이 증가함을 확인하였으며, 피부 섬유아세포에서도 강진향 메탄올추출물을 처리한 지 6시간째부터 유의하게 세포증식이 증가함을 확인하였다 (도 3 참조).

실시예 4: 강진향메탄올 추출물의 UV 에 의해 유도되는 세포노화 억제효과 분석

사람 케라티노사이트의 UV 조사에 의해 유도되는 광노화에 대한 강진향 메탄올추출물의 영향을 조사하기 위해 노화의 중요 지표인 베타-갈락토시데이즈 활성을 측정하여 분석하였다. 베타-갈락토시데이즈의 활성을 측정하는 키트는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다.

강진향 메탄올추출물을 38시간 배양된 세포에 전처리한 후, UVB (40 mJ/cm²)를 조사하여 24시간 동안 배양한 후에, 1× PBS로 수세하여 1× 고정액(2% formaldehyde, 0.2% glutaraldehyde) 에서 7분 동안 고정하였다. 고정액이 제거된 세포는 다시 1× PBS로 3번 수세한 후, 염색 혼합물(10× Staining solution, Reagent B, Reagent C, X-gal solution)과 이산화탄소가 제거된 상태의 37℃ 암실에서 17시간 동안 반응시킴으로써 베타-갈락토시데이즈 활성을 측정하였다.

그 결과, UVB조사에 의한 베타-갈락토시데이즈 활성의 유의한 증가가, 강진향 메탄올추출물 처리에 의해 농도의존적으로 유의하게 억제됨을 관찰하였다 (도 4A 및 4B 참조).

실시예 5: 강진향메탄올 추출물의 UVB 에 의해 유도되는 활성산소종의 생성 억제효과 분석

UVB에 의해 발생되는 활성산소종(Reactive oxygen species, ROS)은 세포를 서서히 파괴시켜 노화를 진행시킨다. 이러한 활성산소종의 생성에 미치는 강진향 메탄올추출물의 영향을 과산화수소에 특이적으로 반응하는 색소인 DCFH-DA을 사용하여 Confocal laser scanning microscopy로 측정하였다.

6 cm 배양 디쉬에 2× 10⁵ cells 밀도로 접종된 세포는 강진향 메탄올추출물로 38시간 동안 전처리한 후, 40 mJ/cm²의 UVB를 조사하여 30분간 배양하였다. 상기 세포를 10 μM H₂DCF-DA(DCF-DA, Calbiochem, San Diego, CA)로 처리하여 30분 동안 배양한 후, 차가운 PBS로 2번 수세 후 Confocal laser scanning microscope (Model 1X70, Olympus, Japan)로 측정하였다.

그 결과, UVB (40 mL/cm²)조사 30분 후에 사람 케라티노사이트에서 ROS의 생성이 유의하게 증가하였으나, 강진향 메탄올추출물을 처리한 경우 UVB조사에 의한 ROS 생성유도가 현저하게 억제됨을 관찰하였다 (도 5A 및 5B 참조). 이러한 결과로부터 강진향 메탄올추출물은 세포내에서 UVB조사에 의해 유도된 활성산소종의 생성을 저해함으로써 세포노화를 억제하는 것을 알 수 있었다.

실시예 6: 강진향 메탄올추출물에 의한 콜라겐 발현유도과정에 있어서의 PPARδ의 관여 확인

정상 사람 케라티노사이트 및 사람 피부 섬유아세포에서 강진향 메탄올추출물에 의한 세포외 기질인 타입 I 및 III 콜라겐의 발현에 PPARδ가 관여하는지를 살펴보기 위하여 siRNA에 의해 PPARδ의 발현을 억제(knock-down)하여 실험을 수행하였다.

세포를 100 mm 배양 디쉬에 접종하고 18-24시간 후에 Welfect-Q (WelGENE, Daegu, Korea)를 이용하여 무혈청 배지에서 사람 PPARδ siRNA (Ambion, Austin, TX, USA)로 형질감염하여 6시간 동안 배양한 후, 세포에 혈청함유 신선한 배지를 공급하여 추가로 48시간 동안 더 배양하고 강진향 메탄올추출물 1 μg/ml을 38시간 동안 처리하였다. 유전자 발현억제 효과는 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인하였다.

그리하여, 타입 I 및 III 콜라겐의 발현에 미치는 영향을 살펴본 결과, 강진향 메탄올추출물 처리에 의해 발현이 유도된 타입 I 및 III 콜라겐의 발현이 PPARδ siRNA의 존재하에서 억제됨을 관찰할 수 있었다 (도 6 참조). 이러한 결과로부터, 강진향 메탄올추출물의 성분이 핵내 전사인자인 PPARδ을 활성화함으로써 정상 사람 케라티노사이트 및 사람 피부 섬유아세포에서 콜라겐과 같은 세포외 기질 단백질의 발현을 유도함을 확인할 수 있었다.

실시예 7: 강진향 메탄올추출물에 의한 PPAR δ의 전사활성화 실험

따라서, 강진향 메탄올추출물이 이러한 PPARδ의 전사활성을 직접 조절할 수 있는지를 알아보기 위하여, PPARδ 리간드 결합 부위와 Gal4-DNA 결합 부위가 결합된 키메라 플라스미드와 Gal4-DNA 결합 부위를 인식하는 배열인 UAS가 루시퍼라제에 연결되어 있는 [(UAS × 3)-tk- 루시퍼라제]플라스미드 및 pSV β-Gal (SV40 β-galactosidase expression vector, Promega, Madison, WI)를 동시에 CHO 세포에 SuperFect 제제 (Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 형질감염시켰다. 그런 다음, 강진향 메탄올추출물을 농도별로 처리한 후, 세포들을 루시퍼라제 리포터 용해 완충액으로 용해하여 루시퍼라제 활성을 측정함으로써 PPARδ의 리간드에 의한 활성화능을 측정하였다.

그 결과, 강진향 메탄올추출물 0.25 μg/ml농도에서부터 루시퍼라제 활성이 증가하기 시작하여 5 μg/ml농도까지 지속적으로 유의하게 증가하고 있음을 확인하였다. 한편, positive control로서, PPARδ리간드로써 알려진 GW501516 (GW)을 50 nM 처리한 결과 (Oliver WR Jr etal., A selective peroxisome proliferator-activated receptor delta agonist promotes reverse cholesterol transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001, 98(9):5306-5311), 강진향 메탄올추출물 1 μg/ml을 처리한 것과 유사한 루시퍼라제 활성이 관찰되었다 (도 7 참조). 이러한 결과로부터 강진향 메탄올추출물에 PPARδ을 활성화할 수 있는 리간드 성분이 포함되어 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 8: 강진향 메탄올 및 에탄올 추출물의 타입 III 콜라겐발현에 대한 효과

강진향 메탄올 및 에탄올추출물 1 μg/ml을 정상 사람 케라티노사이트에 38시간 처리한 후, 웨스턴블롯에 의해 세포외 기질인 타입 III 콜라겐의 단백질발현에 미치는 영향을 추출용매별로 분석하였다. 내부표준물질로서 β-actin을 사용하여 강진향의 유기용매추출물이 타입 III 콜라겐 단백질들의 발현에 미치는 영향을 조사하였다.

그 결과, 메탄올 및 에탄올의 유기용매추출물 모두에서 타입 III 콜라겐의 단백질발현이 유도되고 있음을 확인하였다. 이러한 강진향 유기용매추출물에 의한 타입 III 콜라겐의 단백질발현 유도가 잘 알려진 PPARδ 리간드인 GW501516 (GW)에 의한 타입 III 콜라겐의 단백질발현이 유도와 유사하게 나타난 결과로부터, 강진향의 유기용매추출물이 PPARδ을 활성화시켜 콜라겐과 같은 세포외 기질의 발현을 조절하고 있음을 다시 한번 더 확인할 수 있었다 (도 8 참조).

Claims

강진향(Dalbergia odorifera) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, C1 ~ C4의 저급 알콜 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 추출한 것인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 저급 알콜 용매는 메탄올인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 분획물은 물 분획물, 에틸 아세테이트 분획물, n-헥산 분획물 또는 클로로포름 분획물인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 강진향 추출물 또는 이의 분획물은 피부세포에서 PPAR δ를 활성화시켜 세포외 기질 단백질의 발현을 촉진하는 것인 조성물.
제5항에 있어서, 상기 세포외 기질 단백질은 타입 I 콜라겐, 타입 III 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴, 또는 TGF-β1인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 강진향 추출물 또는 이의 분획물은 UV 조사에 의해 발생되는 활성산소종(ROS)의 생성을 억제하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 강진향 추출물 또는 이의 분획물은 베타-갈락토시데이즈 활성을 억제하는 것인 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 피부 노화 억제 또한 피부 주름 개선용 약학 조성물.
제9항에 있어서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 피부 노화 억제 또한 피부 주름 개선용 화장료 조성물.