KR100841901B1

KR100841901B1 - 플라보노이드 계열 화합물 또는 이를 포함하는 강진향추출물을 함유한 매트릭스 메탈로프로테이나제 활성저해제 및 기능성 식품

Info

Publication number: KR100841901B1
Application number: KR1020020014588A
Authority: KR
Inventors: 이승택; 장진욱; 김주현; 장윤정; 정용호; 임문정; 성희진; 노양국; 신동혁; 장환봉
Original assignee: 동화약품공업주식회사; 이승택
Priority date: 2002-03-18
Filing date: 2002-03-18
Publication date: 2008-06-27
Also published as: KR20030075396A

Abstract

본 발명은 플라보노이드 계열 화합물 또는 이를 포함하는 강진향 추출물을 함유한 매트릭스 메탈로프로테이나제 활성 저해제 및 기능성 식품에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 강진향으로부터 추출 및 정제하여 얻은 피세틴, 3'-히드록시다이드제인 또는 그들을 함유한 강진향 추출물은 매트릭스 메탈로프로테이나제 활성을 저해시키는 효과를 나타내고, 또한 독성이 적어 매트릭스 메탈로프로테이나제 활성에 의해 야기되는 질병치료제 및 기능성 식품으로서 유용하게 사용될 수 있다.

강진향, 추출물, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 플라보노이드

Description

플라보노이드 계열 화합물 또는 이를 포함하는 강진향 추출물을 함유한 매트릭스 메탈로프로테이나제 활성 저해제 및 기능성 식품{MATRIX METALLOPROTEINASE ACTIVITY INHIBITOR AND FUNCTIONAL FOOD CONTAINING FLAVONOID DERIVATIVES OR EXTRACTS OF DALBERGIA ODORIFERA THEREWITH}

도 1은 본 발명의 화학식 1의 화합물의 HMQC 및 HMBC 스펙트럼에서 얻어진 C-H 상관관계를 나타낸 그래프이며,

도 2는 본 발명의 화학식 2의 화합물의 HMQC 및 HMBC 스펙트럼에서 얻어진 C-H 상관관계를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 피세틴, 3'-히드록시다이드제인 또는 이들을 포함하는 강진향 추출물을 함유한 매트릭스 메탈로프로테이나제 활성에 의해 야기되는 질병치료제 및 기능성 식품에 관한 것이다.

매트릭스 메탈로프로테이나제(matrix metalloproteinase, MMP)는 활성부위에 아연(Zn²⁺)을 함유하고 칼슘(Ca²⁺) 의존적인 프로테이나제로서, 스트로멜리신, 콜라 게나제 및 젤라티나제의 패밀리 등 약 18가지가 알려져 있다. 상기 매트릭스 메탈로프로테이나제는 생물학적 조건하에서 결합조직의 단백질 성분 즉, 콜라겐, 라미닌, 프로테오글리칸, 피브로넥틴, 엘라스틴, 젤라틴 등을 분해시켜, 관절조직, 골조직, 결합조직의 성장 및 조직의 리모델링을 야기시킨다. 이들 효소들은 공통적으로 활성부위에 아연을 함유하고 칼슘에 따라 활성이 달라지며, 불활성 전효소의 형태로 분비되어 세포의 외부에서 활성화되고, TIMP(tissue inhibitor of metalloproteinase)라는 천연 저해제와 함께 분비된다.

매트릭스 메탈로프로테이나제 저해제는 매트릭스 메탈로프로테이나제의 과발현 및 과도한 활성화에 의해서 유발되는 각종 질병의 예방 및 치료에 유용하다. 상기 질병의 예로는 류마토이드, 관절골염, 비정상 골흡수증, 골다공증, 치주염, 간질성 신염, 동맥경화증, 폐기종, 경변증, 각막손상, 종양세포의 전이, 침범, 또는 성장, 자가면역질병, 혈관유지, 또는 백혈구의 침범에 의해 유발되는 질병 등을 들 수 있다[Beeley et al., Curr. Opin. Ther. Patents, 4(1):7∼16, 1994]. 예를 들면, 합성한 매트릭스 메탈로프로테이나제 저해제가 난소암의 쥐 모델에서 기질의 리모델링의 저해작용과 함께 생체내(in vivo)에서 항암효과가 있음이 보고되었다[Cancer Res., 53:2087, 1993). 특히, 암세포 성장에 필수적으로 요구되는 신혈관생성(angiogenesis) 단계에서 위의 MMP효소 중 MMP-2와 MMP-9가 필수적으로 관여함이 알려져 있고[Biochim. Biophys. Acta, 695, 1983], 또한, 매트릭스 메탈로프로테이나제 중 MMP-1과 MMP-3는 류마티스성 관절염 환자의 활막(synovium)과 연골(cartilage)에서 정상치보다 아주 높은 농도로 발견되어, 상기한 MMP- 1/MMP-3가 관절염의 진행에 중요한 역할을 한다고 알려져 있으므로[Arthritis Rheum., 35:35∼42, 1992), MMP-1/MMP-3에의 선택성이 관절통증 등의 부작용을 줄이는데 중요한 역할을 할 것으로 여겨지고 있다.

따라서, 최근의 연구는 선택적인 저해제의 개발에 집중되고 있으며, 이러한 매트릭스 메탈로프로테이나제 저해제의 설계 및 합성에 대해서는 다각도로 연구되고 있다[J. Enzyme Inhibitor, 1∼22, 1987; Current Medicinal Chemistry, 743∼762, 1995; Progress inMedicinal Chemistry, 271∼334, 1992; Exp. Opin. Ther. Patents, 1287∼1296, 1995; Drug Discovery Today, 16∼-26, 1996; Chem. Rev. 2735∼2776, 1999]. 또한, 이러한 연구의 일환으로 인체내에 무해한 천연물 추출물을 이용하여 매트릭스 메탈로프로테이나제 활성을 저해하는 역할을 하는 물질을 찾는 연구가 진행되고 있다.

한편, 강진향(Dalbergia odorifera, Leguminosae)은 식물 분류학적으로 콩과(Leguminosae)에 속하는 강향단의 근부 심재이며, 낙엽 교본으로서 길이가 약 10 m까지 자라고 잎은 호생하는 식물이다. 또한, 근부 심재가 적갈색-자색으로 광택이 있고 단단하며, 약재는 근부를 취하여 외피를 제거한 후 사용한다. 한방에서는 진통, 통기, 행어, 지혈의 목적으로 사용되어 왔으며, 최근에는 소염, 항알러지 등에 효과가 있다는 보고가 있으나, 아직까지는 강진향이 매트릭스 메탈로프로테이나제(matrix metalloproteinase, MMP) 활성의 저해에 관한 생리활성은 보고 된 바가 없었다.

이에, 본 발명자들은 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)의 활성에 의해 야기 되는 질병치료제에 대한 연구를 하던 중, 플라보노이드계 화합물인 피세틴, 3'-히드록시다이드제인 및 이들을 포함하는 강진향 추출물이 매트릭스 메탈로프로테아제의 활성을 억제하고, 또한 독성이 적어 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성에 의해 야기되는 질병치료제 및 기능성 식품으로 사용할 수 있음을 알아내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 피세틴 및 3'-히드록시다이드제인을 함유한 강진향 추출물 및 그의 분획물 그리고 그들의 용도를 제공하는 것이다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 피세틴 및 3'-히드록시다이드제인을 함유한 강진향 추출물 및 그의 분획물 그리고 그들의 용도를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 강진향 추출물 및 그의 분획물을 포함한다.

구체적으로 강진향(Dalbergia odorifera, Leguminosae) 분쇄물을 메탄올, 메탄올과 물의 혼합용매 및 에틸아세테이트로 이루어진 그룹 중에서 선택된 용매에 용해시켜 추출한 후 여과하고 얻어진 여액을 감압농축시켜 얻어진 강진향 추출물을 포함한다.

또한, 강진향(Dalbergia odorifera, Leguminosae) 분쇄물을 메탄올, 메탄올과 물의 혼합용매에 용해시켜 추출한 후 여과하여 얻어진 강진향 메탄올 추출액에 에틸아세테이트 또는 부탄올을 첨가하여 추출한 후 여과하고, 얻어진 여액을 감압 농축시켜 얻어진 강진향 분획물을 포함한다.

상기 강진향 추출물 및 그의 분획물은 하기 화학식 1로 표시되는 피세틴(fisetin)과 하기 화학식 2로 표시되는 3'-히드록시다이드제인(3'-hydroxydaidzein)을 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 피세틴, 하기 화학식 2로 표시되는 3'-히드록시다이드제인, 본 발명의 강진향 추출물 또는 강진향 분획물을 유효성분으로 하는 매트릭스 메탈로프로테이나제 활성으로 인해 야기되는 질병치료제를 포함한다.

본 발명에서 얻어진 피세틴, 3'-히드록시다이드제인, 강진향 추출물 또는 강진향 분획물은 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성을 저해하는 효과를 나타낸다. 하기 실시예에서 보는 바와 같이, 효소원으로 MT₁-MMP(membrane type-1 MMP)을 사용하여 효소 활성의 저해활성을 분석한 결과, 강진향 메탄올 추출물의 50% 저해활성 농도(IC₅₀)는 4.90 ㎍이며, 강진향 에틸아세테이트 추출물의 IC₅₀는 2.87 ㎍이고, 강진향 메탄올로부터 분획된 강진향 에틸아세테이트 분획물은 1.51 ㎍이며, 강진향 부탄올 분획물은 1.82 ㎍이고, 또한 이로부터 분리된 피세틴은 1.82 ㎍이며, 3'-히드록시다이드제인은 7.08 ㎍으로 각각 나타났다.

매트릭스 메탈로프로테이나제는 활성부위에 아연을 갖는 효소군으로 세포사이에 존재하는 세포외 기질(extracellula matrix, ECM)을 분해함으로써 발생, 배란, 상처 재생 등의 정상적인 과정과 세포외 기질의 분해가 필수적인 암전이 및 성장, 관절염, 치주염, 골다공증, 심장병, 염증 등의 중요 질병에 관여한다. 구체적으로 관절염(골관절염 및 류마티스성 관절염 포함), 염증성 장 질환, 크론병(Crohn's disease), 기종, 급성 호흡 곤란 증후군, 천식, 만성 폐색성 폐 질환, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 장기 이식 독성, 악액질, 알레르기 반응, 알레르기성 접촉 과민증, 암, 조직 궤양, 재발협착증, 치주질환, 수포성 표피 박리증, 골다공증, 인공관절 이식편의 해체, 죽상경화증(죽상 경화성 플라크 파열 포함), 대동맥류(복대동맥류 및 뇌동맥류포함), 울혈성 심장부전, 심근경색, 발작, 대뇌 허혈증, 두부 외상, 척수 손상, 신경변성 장애(급성 및 만성 형태의 신경변성 포함), 자가면역 장애, 헌팅톤병(Huntington's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 편두통, 우울증, 말초신경병증, 동통, 대뇌 유전분 혈관병증, 노오트로픽(nootropic) 또는 인지력 상승, 근위축성 측삭 경화증, 다발성 경화증, 안구 혈관형성, 각막 손상, 황반변성, 비정상적 상처 치유, 화상, 당뇨병, 종양 침윤, 종 양 성장, 종양 전이, 각막 흉터생성, 공막염, 에이즈(AIDS), 패혈증, 패혈성 쇼크 등의 질병을 야기시키며, 이에 본 발명의 피세틴, 3'-히드록시다이드제인 그리고 강진향 추출물 및 그의 분획물은 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성을 억제하여 메탈로프로테이나제의 활성에 의해 야기되는 질병치료제로 이용할 수 있다.

본 발명의 피세틴, 3'-히드록시다이드제인 그리고 강진향 추출물 및 그의 분획물은 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 일반적인 의약품 제제의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 피세틴, 3'-히드록시다이드제인 그리고 이들을 포함한 강진향 추출물 및 그의 분획물은 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 피세틴, 3'-히드록시다이드제인 그리고 이들을 포함한 강진향 추출물 및 그의 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이크 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로 필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유효성분의 제제 내 함유량은 체내에서의 활성 성분의 흡수도, 불활성화율, 배설속도, 사용자의 연령, 성별 및 상태 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 본 발명에서는 강진향 추출물 및 그의 분획물의 경우, 10∼1000 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 100∼500 ㎎/㎏이다. 또한 상기 피세틴 및 3'-히드록시다이드제인의 경우, 1∼500 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 1∼100 ㎎/㎏이다. 상기 피세틴, 3'-히드록시다이드제인 그리고 이들을 포함한 강진향 추출물 및 그의 분획물은 하루 1∼3 회 투여할 수 있다.

본 발명의 강진향 추출물 및 그의 분획물, 그리고 피세틴 및 3'-히드록시다이드제인을 실험용 생쥐에 각각 1000 ㎎/㎏ 및 500 ㎎/㎏ 경구투여시 독성변화가 나타나지 않았으며, 경구 투여 최소치사량(LD₅₀)은 강진향 추출물 및 그의 분획물이 1000 ㎎/㎏이었으며, 피세틴 및 3'-히드록시다이드제인이 500 ㎎/㎏ 이상으로 생체 안정성이 매우 높다는 것을 알 수 있으며, 따라서 본 발명의 강진향 추출물 및 그의 분획물, 그리고 피세틴 및 3'-히드록시다이드제인은 생체에 대해 안정하게 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 피세틴, 3'-히드록시다이드제인 그리고 이들을 포함한 강진향 추출물 및 그의 분획물을 유효성분으로 하는 기능성 식품, 건강보조 식품 또는 특수영양식품을 제공한다.

본 명세서에서 '기능성 식품'이란, 일반 식품에 상기 피세틴, 3'-히드록시다이드제인 그리고 이들을 포함한 강진향 추출물 및 그의 분획물을 첨가함으로써 일반 식품의 기능성을 향상시킨 식품을 의미한다.

기능성 식품과 구별하여, 본 명세서에서 '건강보조식품' 또는 '특수영양식품'이란, 상기 피세틴, 3'-히드록시다이드제인 그리고 이들을 포함한 강진향 추출물 및 그의 분획물을 일반식품에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 건강식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하였기 때문에 약품의 장기복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

본 발명에 따른 피세틴, 3'-히드록시다이드제인 그리고 이들을 포함한 강진향 추출물 및 그의 분획물을 함유하는 기능성 식품, 건강보조식품 및 특수건강식품의 함량은 사용되는 식품군에 따라 다양하게 변화시킬 수 있으며, 그 함량은 상기 약학적 조성물로의 용도시 측정된 독성 범위내에서 수행한다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다.

단, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 강진향 메탄올 추출물의 제조

강진향(Dalbergia odorifera, Leguminosae) 심재 2 ㎏을 잘게 썰어 말린 후 냉각기가 달린 추출기를 사용하여 메탄올로 5회 연속 추출하였다. 얻어진 메탄올 추출액을 여과한 후 감압 농축기를 이용하여 40℃ 이하에서 농축하여 강진향 메탄올 추출물 410 g을 얻었다.

<실시예 2> 강진향 에틸아세테이트 추출물의 제조

강진향 심재 2 ㎏을 잘게 썰어 말린 후 냉각기가 달린 추출기를 사용하여 에틸아세테이트로 5회 연속 추출하였다. 얻어진 에틸아세테이트 추출액을 여과한 후 감압 농축기를 이용하여 40℃ 이하에서 농축하여 강진향 에틸아세테이트 추출물 250 g을 얻었다.

<실시예 3> 강진향 분획물의 제조

상기 실시예 1에서 얻어진 강진향 메탄올 추출물을 물에 현탁시킨 후 현탁액을 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 및 부탄올을 이용하여 순차적으로 용매 추출하였다. 얻어진 각각의 분획물을 여과한 후 감압농축하여 이 중 강진향 에틸아세테이트 분획물 30 g 및 강진향 부탄올 분획물 45 g을 얻었다.

<실시예 4> 피세틴 및 3'-히드록시다이드제인의 제조

상기 실시예 3에서 얻어진 에틸아세테이트 분획물을 실리카겔을 사용하여 컬럼크로마토그래피를 실시하여 9개로 일차 분획하였고 용출 용매는 농도 구배로 실시하였다(헥산:에틸아세테이트:메탄올 50:10:0→1:1:1). 이중 8번 분획을 중압액체크로마토그래피(Medium Pressure Liquid Chromatography, MPLC), 진공컬럼크로마토그래피(Vaccum Column Chromatography, VCC)를 사용하여 5개로 2차 분획하였다. 2차 분획으로 얻어진 분획중 4번 분획을 RP-18을 써서 MPLC, VCC 및 Prep HPLC를 이용하여 노란색의 결정성 고체의 피세틴 15 ㎎ 및 연한 노란색의 결정성 고체의 3'-히드록시다이드제인 30 ㎎을 얻었다.

<실험예 1> 피세틴 및 3'-히드록시다이드제인의 구조 결정

상기 실시예4에서 얻어진 피세틴 및 3'-히드록시다이드제인의 구조를 핵자기공명(NMR) 분석법(¹H NMR 400 ㎒; ¹³C NMR 100 ㎒)에 의해 결정하였다.

(1) 피세틴의 구조 결정

¹H NMR 및 ¹³C NMR 스펙트럼을 각각 측정하였고, 각 피크의 화학적 이동값(chemical shift)을 용매인 메탄올의 화학적 이동값(3.3 ppm, 49.8 ppm)에 대한 상대값으로 나타내었다. 결과는 하기 표 1, 표 2 및 도 1에 나타내었다. 하기 표 1은 ¹H NMR 결과를 나타낸 것이며, 표 2는 ¹³C NMR 결과를 나타낸 것이다. 본 발명의 피세틴의 전체적인 구조는 공지의 피세틴[Batterham, T.J. et al, Aust J. Chem., 1964, 17, 428]의 분석 결과와 ¹H NMR 및 ¹³C NMR과 2차원 NMR인 ¹H-¹H COSY, ¹H-¹³C HMQC, ¹H-¹³C HMBC 실험에 의해 결정되었다.

피세틴의¹H NMR 화학적 이동값

H의 위치	H의 화학적 이동(δ)	COSY
5	7.89	H-6
6	6.81	H-5
8	7.67
2'	6.80	H-6'
5'	7.57	H-6'
6'	6.79	H-5' H-2'

피세틴의¹³C NMR 화학적 이동값

C의 위치	C의 화학적 이동(δ)	DEPT	HMQC	HMBC
2	147.5	C		H-2' H-6'
3	138.6	C
4	174.4	C		H-5
5	127.4	CH	H-5
6	103.0	CH	H-6	H-8
7	158.6	C
8	116.1	CH	H-8	H-6
4a	124.4	C		H-6 H-8
8a	164.7	C		H-5 H-8
1'	115.3	C		H-5'
2'	115.9	CH	H-2'	H-6'
3'	146.2	C		H-2' H-5'
4'	148.7	C		H-2' H-5' H-6'
5'	116.1	CH	H-5'
6'	121.6	CH	H-6'	H-2'

상기 표 1 및 표 2에서 보는 바와 같이, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 피세틴은 ¹H NMR에서 6.80 ppm의 겹친 피크들은 COSY, HMBC, HMQC 실험으로부터 확인할 수 있었으며, 도 1로 나타낸 HMQC 및 HMBC에서 관찰된 모든 결과들와 잘 일치하였다.

(2) 3'-히드록시다이드제인의 구조 결정

¹H NMR 및 ¹³C NMR 스펙트럼을 각각 측정하였고, 각 피크의 화학적 이동값(chemical shift)을 용매인 메탄올의 화학적 이동값(3.3 ppm, 49.8 ppm)에 대한 상대값으로 나타내었다. 결과는 하기 표 3, 표 4 및 도 2에 나타내었다. 하기 표 3은 ¹H NMR 결과를 나타낸 것이며, 표 4는 ¹³C NMR 결과를 나타낸 것이다. 본 발명의 3'-히드록시다이드제인의 전체적인 구조는 공지의 3'-히드록시다이드제인[Chan, S. C et al., Planta Med., 1998, 64, 153]의 분석 결과와 ¹H NMR 및 ¹³C NMR과 2차원 NMR인 ¹H-¹H COSY, ¹H-¹³C HMQC, ¹H-¹³C HMBC 실험에 의해 결정되었다.

3'-히드록시다이드제인의¹H NMR 화학적 이동값

H의 위치	H의 화학적 이동(δ)	COSY
2	6.68
5	7.59	H-6
6	6.67	H-5
7	6.68
2'	7.51
5'	6.83	H-6'
6'	7.22	H-5

3'-히드록시다이드제인의¹³C NMR 화학적 이동값

C의 위치	C의 화학적 이동(δ)	DEPT	HMQC	HMBC
2	114.5	CH	H-2
3	114.6	C		H-2 H-2' H-6'
4	184.4	C		H-2' H-5
5	126.8	CH	H-5	H-6
6	114.3	CH	H-6	H-8
7	168.9	C		H-5 H-8
8	99.3	CH	H-8	H-6
4a	147.8	C		H-6 H-8
8a	169.9	C		H-5 H-8
1'	125.6	C		H-2 H-5'
2'	119.0	CH	H-2'	H-6'
3'	146.7	C		H-2' H-5'
4'	149.3	C		H-2' H-5' H-6'
5'	116.7	CH	H-5'
6'	126.3	CH	H-6'	H-2' H-5

상기 표 3 및 표 4에서 보는 바와 같이, 본 발명의 화학식 2로 표시되는 3'-히드록시다이드제인은 ¹H NMR에서 6.67 ppm과 6.68 ppm의 겹친 피크들은 HMBC, HMQC 실험으로부터 확인할 수 있었으며, 도 2에 나타낸 HMBC 스펙트럼으로부터 얻어진 상관된 C-H 결과와 잘 일치하였다.

<실험예 2> MMP 효소 저해 활성 측정

(1) MT ₁ -MMP 촉매 도메인(catalytic domain)의 제조

활성측정을 위한 효소원으로 MT₁-MMP(membrane type-1 MMP) 촉매 도메인(catalytic domain)을 사용하였으며 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

전사 개시 메티오닌(methionine), MT₁-MMP의 촉매 도메인과 힌지 도메인(hinge domain, Tyr112-Ile318), 그리고 6개의 히스티딘 태그(tag)를 갖는 재조합 단백질을 대장균에서 봉입체(Inclusion body) 형태로 발현시켰다.

상기 봉입체를 6M 우레아(urea)를 포함하는 완충용액에 녹여 Ni²⁺-NTA 수지 친화성 컬럼(resin affinity column; Oiagen, Germany)을 사용하여 정제하였다. 정제한 MT₁-MMP 단백질을 다일루션(dilution)방법으로 되접힘(refolding)하였고, 되접힘 과정 중에 자동촉매 분할(autocatalytic cleavage)에 의하여 힌지 도메인과 히스티딘 태그의 절단으로 활성을 갖는 22.5 Kda의 MT₁-MMP 촉매 도메인을 얻었다[국내특허출원 제2001-9899호].

(2) MT ₁ -MMP 효소 활성의 저해 활성분석

MT₁-MMP 활성 측정법은 퀀칭된 형광 올리고펩타이드 분할분석(quenched fluorescent oligopeptide cleavage assay)를 사용하였다. 기질로 사용된 퀀칭된 형광 올리고펩타이드(quenched fluorescent oligopeptide)는 (7-메톡시코우마린-4-일)-아세틸-Pro-Leu-Gly-Leu-(3-[2,4-디니트로페닐]-L-2,3-디아미노프로피오닐)-Ala-Arg-NH₂(Bachem California Inc., M-1895)이었다.

100% DMSO에 녹인 다양한 농도의 추출액 및 분획물(0, 0.1, 0.5, 1, 5 및 10 ㎍/10 ㎕) 및 1 uM 퀀칭된 형광 올리고펩타이드와 10 nM의 MT₁-MMP 촉매 도메인(catalytic domain)을 포함하는 100 ㎕의 MT₁-MMP 분석 완충용액(20 mM Tris-HCl, pH 7.%, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 0.1 mM ZnCl₂, 0.02% NaN₃)에서 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응을 정지시키기 위하여 0.2 M 초산나트륨(pH 4.0)을 최종농도 0.1 M이 되도록 첨가한 후 상온에서 KONTRON SFM25 형광측정기(fluoreometer)를 이용하여 들뜬 파장 328 ㎚, 방출 파장 393 ㎚에서 형광의 세기를 측정하였다. 모든 검체시료 농도별 반응은 중복으로 세번 수행하였다. 또한 MT₁-MMP 촉매 도메인이 없는 상태에서 각 시료의 농도별 자동형광(autofluorescence) 값을 측정하고, 시료가 없는 상태에서 MT₁-MMP의 반응을 수행한 후 농도별로 시료를 가하였을 때 감소하는 형광 퀀칭값을 측정하여 각 농도별로 형광 값을 보정하였다. 각 농도별로 보정된 % 활성도를 [(추출물이 포함된 상태의 형광값)/(추출물이 포함되지 않은 상태의 형광값)×100]의 식으로 구한 후 50% 저해활성농도(IC₅₀)를 결정하였다.

강진향 유기 용매 추출물, 유기 용매 분획물 및 순수 분리한 물질의 MT₁-MMP 효소 저해 활성은 표 5과 같다.

본 발명의 추출물 및 물질의 MT₁-MMP 효소 저해 활성

샘 플	50% 저해활성농도(IC₅₀)
강진향 메탄올 추출물	4.90 ㎍
강진향 에틸아세테이트 추출물	2.87 ㎍
강진향 에틸아세테이트 분획물	1.51 ㎍
강진향 부탄올 분획물	1.02 ㎍
피세틴	1.82 ㎍
3'-히드록시다이드제인	7.08 ㎍

상기 표 5에서 보는 바와 같이, 효소원으로 MT₁-MMP를 사용하여 효소 활성의 저해활성을 분석한 결과, 강진향 메탄올 추출물의 50% 저해활성농도(IC₅₀)는4.90 ㎍이며, 강진향 아세틸아세테이트 추출물의 IC₅₀는 2.87 ㎍이고, 강진향 메탄올로부터 분획된 강진향 에틸아세테이트 분획물은 1.51 ㎍이며, 강진향 부탄올 분획물은 1.82 ㎍이고, 또한 이로부터 분리된 피세틴이 1.82 ㎍이며, 3'-히드록시다이드제인은 7.08 ㎍으로서 각 샘플은 모두 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성 억제 효과를 나타내었다.

<실험예 3> 급성 독성 실험

6 주령의 특정병원체부재(specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 본 발명의 강진향 추출물 및 그의 분획물, 그리고 피세틴 및 3'-히드록시다이드제인을 각각 0.5 % 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 각각 1000 ㎎/㎏/㎖ 및 500 ㎎/㎏/㎖의 용량으로 1회 경구투여 하였다. 실험 물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 핼액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기 와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

그 결과, 실험 물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검 소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과, 본 발명의 강진향 추출물 및 그의 분획물, 그리고 피세틴 및 3'-히드록시다이드제인은 모두 랫트에서 각각 1000 ㎎/㎏, 500 ㎎/㎏까지도 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구투여 최소치사량(LD₅₀)은 강진향 추출물 및 그의 분획물은 1000 ㎎/㎏이상이며, 피세틴 및 3'-히드록시다이드제인은 500 ㎎/㎏이상인 안전한 물질로 판단되었다.

<제제예 1> 캡슐제의 제조방법

피세틴(또는 3'-히드록시다이드제인) 5 ㎎ 또는 강진향 추출물(또는 그의 분획물) 10 ㎎을 락토오스 14.8 ㎎, 폴리비닐 피롤리돈 10.0 ㎎, 마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎과 함께 섞었다. 혼합물을 적당한 장치를 사용하여 단단한 No. 5 젤라틴 캡슐에 채웠다.

상기 분말 및 캡슐제의 구성성분은 다음과 같다.

피세틴(또는 3'-히드록시다이드제인) ········· 5.0 ㎎

(강진향 추출물 또는 그의 분획물) ·········· 10 ㎎)

락토오스 ······················14.8 ㎎

폴리비닐 피롤리돈··················10.0 ㎎

마그네슘 스테아레이트 ··············· 0.2 ㎎

<제제예 2> 주사액제의 제조방법

피세틴(또는 3'-히드록시다이드제인) 10 ㎎ 또는 강진향 추출물(또는 그의 분획물) 20 ㎎, 만니톨 180 ㎎, Na₂HPO₄·12H₂O 26 ㎎ 및 증류수 2974 ㎎을 함유시켜 주사제를 제조하였다. 상기 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

상기 주사액제의 구성성분은 다음과 같다.

피세틴(또는 3'-히드록시다이드제인) ········· 10 ㎎

(강진향 추출물 또는 그의 분획물) ·········· 20 ㎎)

만니톨 ······················· 180 ㎎

Na₂HPO₄·12H₂O ····················26 ㎎

증류수 ······················ 0.2 ㎎

<제제예 3> 음료의 제조방법

피세틴(또는 3'-히드록시다이드제인) 0.1 g 또는 강진향 추출물(또는 그의 분획물) 0.2 g, 비타민 C, 분말비타민 E, 젓산철, 산화아연, 니코틴산 아미드, 비타민 A, 비타민 B₁및 비타민 B₂를 혼합하여 제조하였다.

상기 음료의 구성성분은 다음과 같다.

피세틴(또는 3'-히드록시다이드제인) ········· 0.1 g

(강진향 추출물 또는 그의 분획물) ·········· 0.2 g)

비타민 C ······················· 15 g

분말비타민 E ·····················7.5 g

젓산철 ······················ 19.75 g

산화아연 ······················ 3.5 g

니코틴산아미드···················· 3.5 g

비타민 A ······················ 0.2 g

비타민 B₁ ····················· 0.25 g

비타민 B₂ ····················· 0.3 g

물 ························· 적량

상술한 바와 같이, 본 발명의 피세틴, 3'-히드록시다이드제인 그리고 이들을 포함한 강진향 추출물 및 그의 분획물은 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성을 억제하며, 또한 독성실험 결과 독성이 적어 매트릭스 메탈로프로테이나제 활성에 의해 야기되는 질병치료제로 사용할 수 있으며, 이를 포함한 기능성 식품으로 사용할 수 있다.

Claims

강진향(Dalbergia odorifera, Leguminosae) 분쇄물을 메탄올, 메탄올과 물의 혼합용매 및 에틸아세테이트로 이루어진 그룹 중에서 선택된 용매에 용해시켜 추출한 후 여과하고 얻어진 여액을 감압농축하여 얻어진 것을 특징으로 하는 하기 화학식 1로 표시되는 피세틴 및 하기 화학식 2로 표시되는 3'-히드록시다이드제인를 포함하는 관절염, 치주염, 골다공증, 크론병, 천식, 알츠하이머, 암, 치주질환, 죽상경화증, 심근경색, 대뇌 허혈증, 헌팅톤병, 파킨슨병, 편두통, 우울증, 동통, 말초신경병증, 근위축성 측삭 경화증, 당뇨병, 공막염, 에이즈, 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 및 치료용 강진향 추출물.

화학식 1

화학식 2
강진향(Dalbergia odorifera, Leguminosae) 분쇄물을 메탄올 또는 메탄올과 물의 혼합용매에 용해시켜 추출한 후 여과하여 얻어진 강진향 메탄올 추출액에 에틸아세테이트 또는 부탄올을 첨가하여 추출한 후 여과하고, 얻어진 여액을 감압농축하여 얻어진 것을 특징으로 하는 피세틴 및 3'-히드록시다이드제인을 포함하는 관절염, 치주염, 골다공증, 크론병, 천식, 알츠하이머, 암, 치주질환, 죽상경화증, 심근경색, 대뇌 허혈증, 헌팅톤병, 파킨슨병, 편두통, 우울증, 동통, 말초신경병증, 근위축성 측삭 경화증, 당뇨병, 공막염, 에이즈, 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 및 치료용 강진향 분획물.
제 1항의 화학식 1로 표시되는 피세틴을 유효성분으로 하는 매트릭스 메탈로프로테이나제 효소활성으로 인해 야기되는 질병인 관절염, 치주염, 골다공증, 크론병, 천식, 알츠하이머, 암, 치주질환, 죽상경화증, 심근경색, 대뇌 허혈증, 헌팅톤병, 파킨슨병, 편두통, 우울증, 동통, 말초신경병증, 근위축성 측삭 경화증, 당뇨병, 공막염, 에이즈, 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 치료용 약학적 조성물.
제 1항의 화학식 2로 표시되는 3'-히드록시다이드제인 유효성분으로 하는 매트릭스 메탈로프로테이나제 효소활성으로 인해 야기되는 질병인 관절염, 치주염, 골다공증, 크론병, 천식, 알츠하이머, 암, 치주질환, 죽상경화증, 심근경색, 대뇌 허혈증, 헌팅톤병, 파킨슨병, 편두통, 우울증, 동통, 말초신경병증, 근위축성 측삭 경화증, 당뇨병, 공막염, 에이즈, 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 치료용 약학적 조성물.
제 1항의 강진향 추출물 또는 제 2항의 강진향 분획물을 유효성분으로 하는 매트릭스 메탈로프로테이나제 효소활성으로 인해 야기되는 질병인 관절염, 치주염, 골다공증, 크론병, 천식, 알츠하이머, 암, 치주질환, 죽상경화증, 심근경색, 대뇌 허혈증, 헌팅톤병, 파킨슨병, 편두통, 우울증, 동통, 말초신경병증, 근위축성 측삭 경화증, 당뇨병, 공막염, 에이즈, 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 치료용 약학적 조성물.
제 1항의 강진향 추출물 또는 제 2항의 강진향 분획물을 유효성분으로 하는 관절염, 치주염, 골다공증, 크론병, 천식, 알츠하이머, 암, 치주질환, 죽상경화증, 심근경색, 대뇌 허혈증, 헌팅톤병, 파킨슨병, 편두통, 우울증, 동통, 말초신경병증, 근위축성 측삭 경화증, 당뇨병, 공막염, 에이즈, 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 개선용 기능성 식품, 건강보조식품 또는 특수영양식품.