WO2011108821A2 - 강진향 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 조성물 - Google Patents

강진향 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 조성물 Download PDF

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    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations

Definitions

  • the present invention relates to a composition for inhibiting skin aging or skin wrinkling, comprising a gangjinhyang extract, a fraction thereof or a compound separated therefrom as an active ingredient, specifically, a gangjinhyang extract, fractions thereof, isolated from the extract At least one compound selected from the group consisting of sativanone, medicarpin, dalbergin, and isoliquiritigenin, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention relates to a composition for inhibiting skin aging or improving skin wrinkles, and a pharmaceutical composition and a cosmetic composition comprising the same.
  • Human skin consists of the epidermis, the dermis, and connective tissue including the stratum corneum, of which the dead layer consists of dead cell layers formed through the differentiation of keratinocytes, the basal cells of the epidermis. It plays a role of protecting the human body from the influence of the external environment.
  • the dermal layer existing inside the skin is composed of the fibrous proteins collagen (collagen) and elastin (elastin) to play a role in protecting the skin from sagging to give elasticity.
  • UVA and UVB reach the surface of the earth and act as lethal factors that cause skin damage. Although shorter than UVA, UVB is known to penetrate the epidermis in the upper part of the dermis, injuring keratinocytes and damaging collagen fibers, resulting in photoaging, skin discoloration and skin cancer.
  • ECM extracellular matrix
  • PPARs peroxisome proliferation-activated receptors
  • PPARs are ligand-induced transcription factors belonging to the intranuclear hormone receptor superfamily, which include cell differentiation and proliferation, lipid homeostasis and energy metabolism. Regulates cellular and metabolic processes
  • PPAR subfamily PPAR ⁇ PPAR ⁇
  • PPAR ⁇ PPAR ⁇
  • FAAR and NUC1 PPAR ⁇
  • PPAR ⁇ PPAR ⁇
  • the receptor regulates gene expression by forming a dimer with a retinoid X receptor (RXR) and binding to a specific sequence called PPAR response elements (PPRE) present in the regulatory region of the target gene, wherein the promoter region of the PPAR target gene is regulated.
  • RXR retinoid X receptor
  • PPRE PPAR response elements
  • PPAR is a factor that regulates energy homeostasis, and in particular, it is known that PPAR is involved in skin condition control such as permeability control of the skin barrier, epidermal growth inhibition, and induction of epidermal layer through various mechanisms. Due to these characteristics, PPAR is known to be abundantly expressed in keratinocytes and skin fibroblasts, which make up the skin tissue, and various skin such as psoriasis, wound healing and acne due to overgrowth of epidermal layer as well as inflammation-related skin diseases. It is known to act as a key regulator of disease. Therefore, if keratinocytes and skin fibroblasts can regulate the PPAR as described above to promote the expression of extracellular matrix protein, it can bring about the improvement of skin aging.
  • Dalbergia odorifera T.CHEN is a plant-based taxonomy root of the cultivar belonging to the legume plant, and it is a deciduous textbook that grows up to about 10 m in length and leaves are regenerated.
  • Kang Hyang Jagyeonghyang, Bungang, Gyegol incense, etc.
  • ⁇ pain relief
  • ⁇ hemostasis
  • hangers etc.
  • the root core material is hard as reddish brown or purple, so the medicine is used after removing the outer skin by taking the root part.
  • the anti-inflammatory effect is effective for anti-inflammatory, osteoporosis treatment, anti-allergic related to immune response, etc., but it has not been reported that the anti-inflammatory effect is used alone to suppress skin aging and improve wrinkles. .
  • the present inventors have made intensive efforts to develop a natural-derived composition excellent in inhibiting skin aging and improving wrinkles.
  • a composition containing tigenin activates PPAR ⁇ in skin cells to promote the expression of extracellular matrix proteins Type I collagen, Type III collagen, fibronectin, elastin, and TGF- ⁇ 1 (Transforming Growth Factor-beta 1) protein, UV
  • ROS free radicals
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for inhibiting skin aging or skin wrinkles including the composition.
  • Another object of the present invention to provide a cosmetic composition for inhibiting skin aging or skin wrinkles comprising the composition.
  • An object of the present invention is one or more compounds selected from the group consisting of sativanon, medicarpine, dalbergin, and isoriquirigeninin excellent in anti-aging of skin or improving skin wrinkles, or a pharmaceutically acceptable thereof. It is to provide a composition for inhibiting skin aging or skin wrinkle improvement comprising a salt as an active ingredient.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for inhibiting skin aging or skin wrinkles including the composition.
  • Another object of the present invention to provide a cosmetic composition for inhibiting skin aging or skin wrinkles comprising the composition.
  • the present invention provides a composition for inhibiting skin aging or skin wrinkle improvement comprising a strong extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the strong jinhyang extract is pulverized after washing and drying the strong scent; And the pulverized strong flavor may be obtained by extracting with a solvent selected from water, C 1 to C 4 lower alcohols, or a mixed solvent thereof.
  • the Kangjinhyang extract includes water, a lower alcohol of C 1 ⁇ C 4 and a solvent selected from the group consisting of mixed solvents thereof, preferably extracted with methanol or ethanol, more preferably extracted with methanol.
  • the said extract shall contain the extract obtained by an extraction process, the dilution or concentrate of an extract, the dried material obtained by drying an extract, or any of these modifiers or refined products.
  • the gangjinhyang ( Dalbergia odorifera T.CHEN) is a plant core, a root core of the cultivated end belonging to the legume ( ⁇ ) plant, as a deciduous textbook grows up to about 10 m in length and leaves rejuvenate, It is also called by the name of Kanghyang, Jaengdeunghyang, Bungang, Gyegol incense, etc., and it has been used for the purpose of pain relief ( ⁇ ), hemostasis ( ⁇ ), aeration, hangers.
  • the root core material is hard as reddish brown or purple, and the medicine is used after removing the outer skin by taking the root part.
  • the extraction method is not particularly limited and may be extracted at room temperature or warmed under conditions where the active ingredient is not destroyed or minimized. More specifically, the method for obtaining the Gangjinhyang extract in the present invention is as follows.
  • the dry strong aroma is about 2 to 20 times the dry weight, preferably about 3 to 5 times the volume of water, polar solvents of C 1 to C 4 lower alcohols such as methanol, ethanol and butanol or the like or about 1
  • a mixed solvent having a mixing ratio of: 0.1 to 1:10 is used as the elution solvent
  • the extraction temperature is 20 to 100 ° C, preferably 25 ° C
  • the extraction period is about 5 hours to 10 days, preferably 5-10
  • Extraction is performed by using extraction methods such as shaking extraction, hot water extraction, cold extraction, reflux cooling extraction or ultrasonic extraction.
  • the mixture is stirred for 1 hour at 120 ° C. at 25 ° C. with shaking extraction to recover the supernatant by vacuum filtration. The process is repeated three times, and the supernatant is recovered. Concentration under reduced pressure and lyophilization, preferably at room temperature, to obtain a strong extract of crude insoluble in water, lower alcohols or mixed solvents thereof.
  • the strong extract may be extracted from various organs of natural, hybrid, and variegated plants, for example from roots, stems, leaves, and flowers, as well as plant tissue cultures.
  • Kangjinhyang extract was prepared by adding methanol or ethanol to dry Kangjinhyang, recovered from the supernatant, and concentrated and lyophilized.
  • a solvent fraction obtained by adding water to the alcohol concentrate and suspending and fractionating using a nonpolar solvent such as n -hexane, chloroform or ethyl acetate may be used.
  • the solvent fraction is a silica gel column chromatography using a mixed solvent consisting of a polar solvent such as methanol, ethanol, propanol or isopropanol, and a mixed solvent selected from a non-polar solvent such as ethyl acetate, n -hexane, dichloromethane or chloroform as a mobile phase.
  • a mixed solvent consisting of a polar solvent such as methanol, ethanol, propanol or isopropanol
  • a mixed solvent selected from a non-polar solvent such as ethyl acetate, n -hexane, dichloromethane or chloroform
  • skin aging inhibition refers to the use of a composition containing a strong extract of Gangjin flavor to inhibit or delay aging of the skin regardless of the cause causing aging.
  • the term "improvement of skin wrinkles” means maintaining or enhancing the capacity associated with wrinkles and elasticity of the skin.
  • Collagen (collagen) and elastic fiber (elastin), the collagen fibers present in the dermal layer, are the major proteins that play a role in the skin structure. Collagen biosynthesis is influenced internally and externally. . Specifically, the skin cells are reduced in cell activity due to natural aging, the collagen fibers are reduced, or the active oxygen produced by excessive irradiation of ultraviolet rays or stress as an external factor, the thiol group of the protein (thiol: -SH) In addition to inhibiting the enzyme activity or to increase the expression of degradation enzymes such as collagen, elastin to increase the wrinkles of the skin and reduce the elasticity.
  • thiol group of the protein thiol: -SH
  • Kangjinhyang extract of the present invention or a fraction thereof increases the expression of extracellular matrix proteins in the skin and induces the proliferation of keratinocytes for the skin aging and the generation of wrinkles, and effectively regulates skin elasticity and wrinkle improvement and aging inhibition do.
  • protein expression of type I collagen, type III collagen, fibronectin, elastin and TGF- ⁇ 1 in both keratinocytes and fibroblasts It was shown to increase significantly, it was confirmed that the strong extract extract promotes the expression of extracellular matrix proteins.
  • the Gangjinhyang extract of the present invention or a fraction thereof may accelerate the proliferation of skin cells to promote the regeneration of skin epidermal cells, thereby contributing to regeneration of the damaged skin and wrinkle improvement.
  • the Gangjinhyang extract of the present invention as a result of investigating the effect of Kangjin-hyang methanol extract on the proliferation of skin cells by treating Kangjin-hyang methanol extract to the skin cells, cells in human keratinocytes and skin fibroblasts significantly compared to the control group It was confirmed that proliferation was increased.
  • the kangjinhyang extract or fractions thereof of the present invention has an antioxidant function of inhibiting beta-galactosidase or active oxygen species generated by UV, thereby effectively controlling skin elasticity, wrinkle improvement and aging inhibition. have.
  • beta-galactosidase activity which is an important indicator of aging, was analyzed to investigate the effect of strong ethanol methanol extract on photoaging. It was confirmed that induced beta-galactosidase activity was significantly dependent on concentration.
  • antioxidant means a function of inhibiting oxidation of skin components by highly reactive free radicals and free radicals under the influence of ultraviolet rays. Free radicals and free radicals oxidize the constituents of the skin to produce peroxides, resulting in structural and functional damage to the skin to promote aging, and the antioxidant function of the present invention serves to protect the skin from it. .
  • the composition comprising the strong extract of the present invention can perform the function of inactivating the free radicals, preferably can eliminate the superoxide radicals (superoxide radical) generated by UVB.
  • the strong extract according to the present invention or fractions thereof promotes the expression of extracellular matrix protein and maintains skin elasticity by proliferating cells, and particularly, effectively inhibits skin damage and aging caused by UV.
  • the present inventors tried to look at the mechanism of action to regulate the expression of the protein of the extracellular matrix in normal human keratinocytes and skin fibroblasts.
  • the components of Gangjinhyang extract act as ligands of PPAR ⁇ , which is an important transcriptional regulator in the nucleus, to activate PPAR ⁇ to induce the expression of extracellular matrix protein.
  • PPAR ⁇ refers to a transcription factor that is activated by binding of a specific ligand in the nucleus and binds to PPRE present in the promoter region of a specific gene, thereby controlling the expression of the gene in the transcriptional stage.
  • the strong extract or fractions thereof of the present invention include a component capable of specifically activating the PPAR ⁇ , which means that the strong extract or a fraction thereof contains a ligand specific for PPAR ⁇ .
  • siRNA siRNA
  • the strong extract or a fraction thereof according to the present invention activates PPAR ⁇ to induce the expression of extracellular matrix protein.
  • the present invention is one or more compounds selected from the group consisting of sativanone, medicarpin, dalbergin, and isoriquirigeninine, or a pharmaceutically acceptable salt thereof It provides a composition for inhibiting skin aging or improving skin wrinkles comprising as an active ingredient.
  • the chemical formula of the compound is the same as the following formula 1 to 4, sativanon (3- (2,4-dimethoxyphenyl) -7-hydroxychroman-4-one) is represented by the formula 1, medicarpin (9-methoxy-6a, 11a -dihydro-6H-benzofuro [3,2-c] chromen-3-ol) is represented by Formula 2, and dalbergin (6-hydroxy-7-methoxy-4-phenyl-2H-chromen-2-one) is represented by Formula 3 , Isoriquirigeninine ((E) -1- (2,4-dihydroxyphenyl) -3- (4-hydroxyphenyl) prop-2 -en-1-one) may be represented by the formula (4).
  • the sativanon, medicarpine, dalbergin, or isoriquirigeninin may be obtained by extracting, separating and purifying from various plants including the compound, but are not limited thereto. Can be obtained by extraction, separation and purification, or can also be synthesized by known synthetic methods well known in the art (Herbert O. House: Modern Synthetic Reactions , 2nd Ed., The Benjamin / Cummings Publishing Co., 1972). .
  • the strong extract of the strong incense of the present invention is the step of washing and drying the strong incense;
  • the pulverized strong flavor may be obtained by extracting with a solvent selected from water, C 1 to C 4 lower alcohols, or a mixed solvent thereof.
  • the strong extract crude extract includes a solvent selected from the group consisting of water, lower alcohols of C 1 ⁇ C 4 and mixed solvents thereof, preferably extracted with methanol or ethanol, and more preferably extracted with methanol.
  • the method is not particularly limited and may be extracted at room temperature or warmed under conditions where the active ingredient is not destroyed or minimized.
  • the coarse extract is a polar solvent of C 1 to C 4 lower alcohols such as water, methanol, ethanol and butanol in volumes of up to about 3 to 5 times the dry weight.
  • the medicinal herb extract can be extracted from various organs of natural, hybrid, and mutant plants, and can be extracted from plant tissue cultures as well as roots, stems, leaves, and flowers, for example.
  • a solvent fraction obtained by fractionation using a non-polar solvent such as n -hexane, chloroform or ethyl acetate.
  • the solvent fraction was subjected to silica gel column chromatography using a mixed solvent comprising at least two selected from a polar solvent such as methanol, ethanol, propanol or isopropanol and a non-polar solvent such as ethyl acetate, n -hexane, dichloromethane or chloroform as a mobile phase.
  • a polar solvent such as methanol, ethanol, propanol or isopropanol
  • a non-polar solvent such as ethyl acetate, n -hexane, dichloromethane or chloroform as a mobile phase.
  • the active fractions can be developed with reverse phase 18-column chromatography to 60-100% methanol to obtain the active fractions again in 70% methanol, which can then be concentrated and re-concentrated in chloroform: hexane: methanol in Sephadex LH-20 chromatography.
  • the final fractionation is carried out in HPLC, whereby the compound of the present invention having the effect of inhibiting skin aging or improving skin wrinkles can be obtained.
  • the compounds of the present invention can be used in the form of pharmaceutically acceptable salts.
  • the compounds of the invention can also be used alone or in combination or in combination with other pharmaceutically active compounds.
  • the term "pharmaceutically acceptable salts” refers to salts prepared according to methods conventional in the art, and such methods are known to those skilled in the art. Specifically, the pharmaceutically acceptable salts include, but are not limited to, salts derived from the following pharmacologically or physiologically acceptable inorganic and organic acids and bases.
  • suitable acids include hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid, nitric acid, perchloric acid, fumaric acid, maleic acid, phosphoric acid, glycolic acid, lactic acid, salicylic acid, succinic acid, toluene-p-sulfonic acid, tartaric acid, acetic acid, citric acid, methanesulfonic acid, formic acid , Benzoic acid, malonic acid, naphthalene-2-sulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like.
  • Salts derived from suitable bases may include alkali metals such as sodium, or potassium, alkaline earth metals such as magnesium.
  • the term "inhibiting skin aging” means preventing or delaying degeneration of skin tissue due to physiological changes of the body over time.
  • the skin In order to prevent skin aging, the skin must be protected from the harmful environment as well as moisture is properly supplied to the skin, and the skin cells are activated to promote the synthesis of biosynthetic proteins such as collagen and elastin. The formation of wrinkles should be suppressed as much as possible.
  • the dermal layer of collagen and elastic fibers elastin form a network structure in the dermal layer. As the network structure is broken, the elastin is degraded by the enzyme elastase, which degrades the skin and wrinkles. As a result, endogenous skin aging occurs.
  • the degradation of elastin which is one of the main causes of skin aging, can be suppressed to inhibit skin aging.
  • the term "improvement of skin wrinkles” means maintaining or enhancing the capacity associated with wrinkles and elasticity of the skin.
  • Collagen (collagen) and elastic fiber elastin (collagen) in the dermal layer of the skin is the main protein that plays a role in the skin elasticity, collagen biosynthesis is affected by the internal and external skin.
  • the skin cells are reduced in cell activity due to natural aging, the collagen fibers are reduced, or the active oxygen produced by excessive irradiation of ultraviolet rays or stress as an external factor, the thiol group of the protein (thiol: -SH)
  • the thiol group of the protein thiol: -SH
  • the enzyme activity or by increasing the expression of degradation enzymes, such as collagen, elastin, increase the wrinkles of the skin and decrease the elasticity to progress the skin aging.
  • the compounds of the present invention sativanon, medicarpine, dalbergin, or isoriquirigeninin inhibit the generation of free radical species in the skin against the skin aging and wrinkle formation of the skin, while inhibiting the expression of extracellular matrix proteins. Increasingly, it is effective in inhibiting skin aging and improving skin wrinkles.
  • the compound of the present invention may promote skin wrinkle improvement by promoting expression of type I collagen or type III collagen, which is an extracellular matrix protein.
  • type III collagen which is an extracellular matrix protein.
  • beta-galactosidase activity was dependent on the treatment concentration of the compound. This significantly decreased, the amount of reactive oxygen species production also appeared to decrease, confirming that the compound has an effect of inhibiting skin aging.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting skin aging or skin wrinkle improvement comprising the composition.
  • Kangjinhyang extract of the present invention or fractions thereof activates PPAR ⁇ in skin cells to promote the expression of extracellular matrix protein and inhibits the production of free radicals (ROS) generated by UV irradiation, thereby inhibiting skin aging and improving wrinkles Since it is effective in, it can be used as a pharmaceutical composition for inhibiting skin aging or improving skin wrinkles.
  • ROS free radicals
  • the Kangjin-hyang extract or a fraction thereof promotes expression of extracellular matrix type I collagen, type III collagen, fibronectin, and TGF- ⁇ 1 in skin cells, keratinocytes and skin fibroblasts, By inhibiting the production of free radicals generated by the activity and inhibiting the activity of beta-galactosidase, which is an indicator of skin aging, it not only suppresses aging of the skin but also has an effect such as improving skin wrinkles. It can be improved.
  • the compound of the present invention has a skin aging inhibitory effect by inhibiting the cellular aging and the generation of reactive oxygen species by UV, and by promoting the expression of extracellular matrix protein in the skin cells, it is effective in improving wrinkles of the skin, thereby inhibiting skin aging. Or it may be used as a pharmaceutical composition for improving skin wrinkles.
  • the throughput of the pharmaceutical composition for inhibiting skin aging or improving skin wrinkles used in the present invention should be a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount refers to an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and an effective dose level may refer to an individual type and severity, age, sex, It can be determined according to the type of virus infected, the activity of the drug, the sensitivity to the drug, the time of administration, the route of administration and the rate of release, the duration of treatment, factors including the drug used concurrently, and other factors well known in the medical arts. Effective amounts may vary depending on the route of treatment, the use of excipients, and the possibility of use with other agents, as will be appreciated by those skilled in the art.
  • compositions for inhibiting skin aging or improving skin wrinkles of the present invention may be prepared in pharmaceutical formulations using methods well known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal. Can be.
  • the active ingredient is mixed or diluted with the carrier or enclosed in a carrier in the form of a container.
  • the pharmaceutical composition for inhibiting skin aging or skin wrinkle improvement of the present invention is in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, oral formulations, external preparations and patches according to conventional methods. It may be formulated and used further and may further comprise suitable carriers, excipients or diluents commonly used in the manufacture of compositions.
  • carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical compositions of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium Phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants are usually used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be added and used in the manufacture of quasi-drugs for the purpose of inhibiting skin aging or skin wrinkle improvement.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is used as an quasi-drug additive, the compound may be added as it is or used with other quasi-drug or quasi-drug components, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixed amount of the active ingredient may be suitably determined depending on the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • the quasi-drug may be a disinfectant cleaner, shower foam, gagreen, wet tissue, detergent soap, hand wash, humidifier filler, mask, ointment, coating agent or filter filler.
  • the present invention provides a cosmetic composition for inhibiting skin aging or skin wrinkle improvement comprising the composition.
  • the term "cosmetic composition” is a composition comprising the compound, the formulation may be in any form.
  • formulations include cosmetics prepared using the composition, such as nutrition creams, eye creams, massage creams, creams such as cleansing creams, packs, lotions such as nutrient lotions, essences, soft cosmetics, and nutrient cosmetics.
  • powders, foundations, makeup bases, and the like and may be prepared and commercialized in any of these forms to achieve the object of the present invention, and are not limited to the above examples.
  • the cosmetic composition according to the present invention can be formulated by a conventional cosmetic preparation method.
  • the cosmetic composition of the present invention may further include a transdermal penetration enhancer.
  • transdermal penetration enhancer is a composition that allows a desired component to penetrate into the blood vessel cells of the skin at a high absorption rate.
  • phospholipid components, liposome components and the like used in lecithin cosmetics are included, but are not limited to these.
  • oil which can be mainly used as an oil phase component
  • one or more selected from vegetable oil, mineral oil, silicone oil and synthetic oil can be used. More specifically, mineral oil, cyclomethicone, squalane, octyldodecyl myristate, olive oil, Vitis binifera seed oil, macadamia nut oil, glyceryl octanoate, castor oil, ethylhexyl isononanoate, dimethicone Chicon, cyclopentasiloxane, sunflower seed oil and the like can be used.
  • a surfactant may be added to reinforce the emulsifying ability.
  • surfactants may be used conventional surfactants such as nonionic surfactants, anionic surfactants, cationic surfactants, amphoteric surfactants, phospholipids, and the like, specifically, sorbitan sesquinolate, polysorbate 60 , Glyceryl stearate, lipophilic glyceryl stearate, sorbitan oleate, sorbitan stearate, die-cetyl phosphate, sorbitan stearate / sucrosecoate, glyceryl stearate / polyethylene glycol-100 Stearate, ceteareth-6 oleate, arachidyl alcohol / behenyl alcohol / arachidyl glucoside.
  • Polypropylene glycol-26-butes-26 / polyethylene glycol-40 hydrogenated castor oil and the like can be used.
  • alcohols having 12 to 20 carbon atoms such as cetyl alcohol, stearyl alcohol, octyldodecanol, isostearyl alcohol, etc. may be used alone or in combination of one or more thereof.
  • the aqueous phase component may further add 0.001 to 5% by weight of one or more thickeners such as carbomer, xanthan gum, bentonite, magnesium aluminum silicate, cellulose gum, dextrin palmitate and the like to adjust the viscosity or hardness of the aqueous phase.
  • thickeners such as carbomer, xanthan gum, bentonite, magnesium aluminum silicate, cellulose gum, dextrin palmitate and the like to adjust the viscosity or hardness of the aqueous phase.
  • the cosmetic composition of the present invention if necessary, active ingredients such as higher fatty acids, vitamins, sunscreens, antioxidants (butylhydroxyanisole, propyl gallic acid, elixolic acid, tocopheryl acetate, butylated hydroxy) Toluene, etc.), preservatives (methylparaben, butylparaben, propylparaben, phenoxyethanol, imidazolidinylurea, chlorphenesin, etc.), colorants, pH regulators (triethanolamine, citric acid, citric acid, sodium citrate, malic acid, Sodium malic acid, pmaric acid, sodium pramate, succinic acid, sodium succinate, sodium hydroxide, sodium monohydrogen phosphate, etc., moisturizer (glycerine, sorbitol, propylene glycol, butylene glycol, hexylene glycol, diglycerin , Betaine, glycerin-26, methylgluse-20 and the like),
  • active ingredients
  • the cosmetic composition of the present invention further includes a substance capable of auxiliaryly providing essential nutrients to the skin, and may preferably contain auxiliary agents including, but not limited to, natural, cosmetic, or herbal medicines. .
  • the cosmetic composition of the present invention has little toxicity and side effects, it can be used for a long time with confidence.
  • the present invention relates to a wound treatment and skin regeneration treatment method comprising the step of administering a pharmaceutical composition comprising a strong extract or a fraction thereof as an active ingredient to the damaged skin.
  • treatment refers to any action that the wound or skin regeneration is improved or beneficially changed by administration of the composition.
  • the method of treatment using the Gangjin flavor extract or fractions thereof of the present invention comprises administering the Gangjin flavor extract or fractions thereof to the damaged skin. It will be apparent to those skilled in the art that a suitable total daily dose may be determined by the practitioner within the correct medical judgment. It may also be administered once or in divided doses.
  • the specific therapeutically effective amount for a particular patient is determined by the specific composition, including the type and extent of the reaction to be achieved, whether or not other agents are used in some cases, the age, weight, general health of the patient, It is desirable to apply differently depending on various factors and similar factors well known in the medical field, including sex and diet, time of administration, route of administration and rate of composition, duration of treatment, drugs used with or co-specific with the specific composition.
  • compositions of the present invention include, but are not limited to, mammals including humans, for example cattle, pigs, horses, rabbits, mice, and humans.
  • the term "administration" means introducing a pharmaceutical composition of the present invention to a patient in any suitable manner, and the route of administration of the composition of the present invention is not particularly limited, but reaches the desired damaged skin tissue. Administration may be via a variety of routes to do so.
  • the present invention is a group consisting of sativanone, medicarpin, dalbergin, and isoliquiritigenin derived from Gangjinhyang extract or fractions thereof. It relates to a wound treatment and skin regeneration treatment comprising administering to the damaged skin a composition comprising at least one compound selected from, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a use of a strong extract or a fraction thereof for the production of a composition for inhibiting skin aging or skin wrinkle improvement.
  • the composition for inhibiting skin aging or for improving skin wrinkles is not particularly limited thereto, but is preferably a pharmaceutical composition or cosmetic composition for inhibiting skin aging and for improving skin wrinkles.
  • the present invention is derived from a strong scent extract or fractions thereof for the preparation of a composition for inhibiting skin aging or skin wrinkle improvement, sativanone, medicarpin, dalbergin ( dalbergin), and at least one compound selected from the group consisting of isoliquiritigenin, or pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • the present invention is an extract of Kang Jin-hyang extract, fractions thereof, or at least one compound selected from the group consisting of sativanon, medicarpine, dalbergin, and isoriquirigeninine, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. Since the composition is excellent in inhibiting skin aging or improving skin wrinkles and using an extract or a fraction thereof derived from natural products instead of a synthesized compound, it is safe, has no toxicity, and has no side effects. It can be used as a pharmaceutical composition for preventing or improving wrinkles, cosmetic composition and the like.
  • Figure 1 is a photograph showing the Western blot results of each extracellular matrix protein expressed in keratinocytes treated with a strong methanol extract.
  • Figure 2 is a graph showing the result of quantifying the expression level of each extracellular matrix protein expressed in keratinocytes treated with a strong methanol extract.
  • Figure 3 is a photograph showing the Western blot results of each extracellular matrix protein expressed in the skin fibroblasts treated with a strong methanol extract.
  • Figure 4 is a graph showing the result of quantifying the expression level of each extracellular matrix protein expressed in the skin fibroblasts treated with the Kangjin-hyang methanol extract.
  • FIG. 5 is a photograph and a graph showing the effect of strong-acting methanol extract and PPAR ⁇ siRNA on the expression of type I and III collagen in keratinocytes.
  • FIG. 6 is a photograph and a graph showing the effect of strong-acting methanol extract and PPAR ⁇ siRNA on the expression of type I and III collagen in dermal fibroblasts.
  • Figure 7 is a graph showing the change in activity of luciferase linked to ligand binding sites of PPAR ⁇ , depending on the concentration of the strong methanol extract.
  • Figure 8 is a photograph showing the type III collagen expressed in keratinocytes treated with GW and Kangjin-hyang methanol extract.
  • Figure 9 is a photograph showing the type III collagen expressed in keratinocytes treated with GW and Kangjin ethanol extract.
  • FIG. 10 is a graph showing the degree of proliferation of cells over time of keratinocytes treated with a strong methanol extract.
  • Figure 11 is a graph showing the degree of proliferation of cells over time of skin fibroblasts treated with a strong methanol extract.
  • FIG. 12 is a micrograph showing beta-galactosidase activated in keratinocytes treated with control and Kangjin methanol extract and UVB.
  • Figure 13 is a graph showing the results of quantifying the stained beta-galactosidase activity in the micrograph.
  • 15 is a graph showing the results of quantifying the fluorescence value shown in the confocal micrograph.
  • FIG. 16 is a graph showing the results of quantifying the expression level of type I collagen expressed in 40% strong ethanol extract treated skin fibroblasts and Western blot of type I collagen.
  • 17 is a graph showing the results of quantifying the expression level of type I collagen expressed in skin fibroblasts treated with 60% strong ethanol extract and Western blot results of type I collagen.
  • 18 is a graph showing the results of quantifying the expression level of type I collagen expressed in skin fibroblasts treated with 80% strong ethanol extract and Western blot results of type I collagen.
  • FIG. 19 is a graph showing the results of quantifying the expression level of type I collagen expressed in skin fibroblasts treated with 100% strong ethanol extract, and a picture showing Western blot results of type I collagen.
  • 20 is a photograph showing Western blot results of each extracellular matrix protein expressed in keratinocytes treated with 60% strong ethanol extract and a graph showing the results of quantifying the expression level of each extracellular matrix protein.
  • 21 is a photograph showing Western blot results of each extracellular matrix protein expressed in skin fibroblasts treated with 60% strong ethanol extract and a graph showing the result of quantifying the expression level of each extracellular matrix protein.
  • Figure 22 is a micrograph showing beta-galactosidase activated in control and 60% strong ethanol extract and UVB treated keratinocytes.
  • Figure 23 is a graph showing the results of quantifying the beta-galactosidase activity stained in the micrograph.
  • 24 is a confocal micrograph showing the degree of generation of reactive oxygen species in the control group and each experimental group.
  • 25 is a graph showing the results of quantifying the fluorescence value shown in the confocal micrograph.
  • FIG. 26 is a graph showing the results of quantifying the expression level of type I collagen expressed in skin tissue of alopecia mice treated with 60% strong ethanol extract, and a photograph showing Western blot results.
  • FIG. 27 is a graph showing the results of quantifying the expression level of TGF- ⁇ 1 expressed in skin tissue of alopecia mice treated with 60% strong ethanol extract, and a photograph showing Western blot results.
  • FIG. 28 is a graph showing the results of quantifying the expression amount of elastin expressed in skin tissue of alopecia mice treated with 60% strong ethanol extract, and a photograph showing Western blot results.
  • 29 is a graph showing the results of quantifying the expression level of TIMP-1 expressed in skin tissue of alopecia mice treated with 60% strong ethanol extract, and a photograph showing Western blot results.
  • FIG. 30 is a graph showing the results of quantifying the expression level of TIMP-2 expressed in the skin tissue of alopecia mice treated with 60% strong ethanol extract and pictures showing Western blot results.
  • FIG. 31 is a graph showing the results of quantifying the expression level of MMP-2 expressed in skin tissue of alopecia mice treated with 60% strong ethanol extract, and a photograph showing Western blot results.
  • 35 is a Massons trichrome staining photograph showing the effect of UVB irradiation and 60% strong ethanol extract on the production of reactive oxygen species in the skin tissue of alopecia mice.
  • FIG. 37 shows the HPLC results (top) for 0.5 mg / ml Kangjin Hyang 70% methanol extract (top) and the HPLC results (bottom) confirming that the compound indicated by the arrow among those HPLC results is sativanone.
  • FIG. 38 shows the HPLC results (top) for 0.5 mg / ml Kangjin-Hyang 70% methanol extract (top) and the HPLC results (bottom) confirming that the compound indicated by the arrow in those HPLC results is medicarpin.
  • FIG. 39 shows the HPLC results (top) for 0.5 mg / ml Kangjin Hyang 70% methanol extract (top) and the HPLC results (bottom) confirming that the compound indicated by the arrow in those HPLC results is dalbergin.
  • FIG. 40 shows the HPLC results (upper) for 0.5 mg / ml of Kangjin-hyang 70% methanol extract and the HPLC results (lower) confirming that the compound indicated by the arrow in the HPLC results is isoliquiritigenin. .
  • FIG. 41 is a Western blot photograph showing the degree of expression of type III collagen protein when treated with sativanon at 1 ⁇ M and 5 ⁇ M in keratinocytes.
  • FIG. 41 is a Western blot photograph showing the degree of expression of type III collagen protein when treated with sativanon at 1 ⁇ M and 5 ⁇ M in keratinocytes.
  • FIG. 42 is a Western blot photograph showing the degree of expression of type III collagen protein when treated with dalbergin at 1 ⁇ M and 5 ⁇ M on keratinocytes.
  • FIG. 42 is a Western blot photograph showing the degree of expression of type III collagen protein when treated with dalbergin at 1 ⁇ M and 5 ⁇ M on keratinocytes.
  • FIG. 43 is a Western blot photograph showing the degree of expression of type III collagen protein when keratinocytes were treated with 5 ⁇ M and 10 ⁇ M of Isoriquirigenin.
  • FIG. 43 is a Western blot photograph showing the degree of expression of type III collagen protein when keratinocytes were treated with 5 ⁇ M and 10 ⁇ M of Isoriquirigenin.
  • Figure 44 is a Western blot photograph showing the degree of expression of type III collagen protein when treated with medicarpine at keratinocytes 1 ⁇ M and 5 ⁇ M.
  • FIG. 45 is a Western blot photograph showing the expression level of type I collagen protein when treated with satibanone in dermal fibroblasts.
  • 46 is a Western blot photograph showing the expression level of type I collagen protein when dermal fibroblasts were treated with dalbergin.
  • FIG. 47 is a Western blot photograph showing the expression level of type I collagen protein when fibroblasts were treated with isoriquirigenin.
  • FIG. 48 is a Western blot photograph showing the expression level of type I collagen protein when treated with medicarpine on dermal fibroblasts.
  • FIG. 49 shows micrographs and micrographs showing activated beta-galactosidase in keratinocytes treated with four compounds (satibanone, dalbergin, isoriquitigenin, and medicarpine) and UVB. It is a graph showing the result of quantifying beta-galactosidase activity stained at.
  • FIG. 50 is a confocal microscope photograph showing the generation of reactive oxygen species in the control group and each experimental group, and a graph showing the result of quantifying the fluorescence value shown in the confocal microscope photograph.
  • 100 g of dried Kangjin fragrance was added to 1000 ml of 70% methanol, stirred at 120 ° C. for 1 hour at 25 ° C., and then vacuum filtered to obtain a liquid component and a solid component, respectively.
  • the obtained solid component was added to 1000 ml of 70% methanol again, and the method of stirring and vacuum filtration was repeated twice to obtain each liquid component, which was then combined and applied to a vacuum concentration and freeze drying method. 10.12 g of a strong methanol extract was prepared.
  • the purpose of this study was to determine the effect of the Kangjin-hyang methanol extract prepared on the expression of extracellular matrix protein in keratinocytes and dermal fibroblasts.
  • keratinocyte growth medium containing keratinocyte growth supplement (Keratinocyte Growth Medium) of 37 °C, 5% CO 2
  • Keratinocyte Growth Medium keratinocyte Growth Medium
  • the strong methanol extract was added at a concentration of 1 ⁇ g / ml, and further cultured for 38 hours, and then cultured using Western blot.
  • ⁇ -actin was used as the internal standard.
  • FIG. 1 is a photograph showing the results of Western blot of each extracellular matrix protein expressed in keratinocytes treated with strong methanol extract
  • FIG. 2 is an extracellular matrix expressed in keratinocytes treated with strong methanol extract. It is a graph which shows the result of having quantified the expression amount of a protein.
  • protein expression of various extracellular matrix proteins (type I collagen, type III collagen, fibronectin, elastin, and TGF- ⁇ 1) is markedly enhanced by methanol extracts of strong odor in human keratinocytes. It was found to increase.
  • Figure 3 is a photograph showing the Western blot results of each extracellular matrix protein expressed in the skin fibroblasts treated with Kangjin-hyang methanol extract
  • Figure 4 is each extracellular matrix expressed in the skin fibroblasts treated with Kangjin-hyang methanol extract It is a graph which shows the result of having quantified the expression amount of a protein.
  • protein expression of various extracellular matrix proteins (type I collagen, type III collagen, fibronectin, elastin and TGF- ⁇ 1) was markedly induced by strong methanol extracts. It was found to increase.
  • the strong methanol extract significantly increased the expression of extracellular matrix proteins in keratinocytes and dermal fibroblasts, and thus, the direct expression of type I and III collagen in the extracellular matrix proteins.
  • a transcription factor that affects the genes it was analyzed using siRNA that inhibits the expression of PPAR ⁇ .
  • the introduction of PPAR ⁇ siRNA is performed by introducing PPAR ⁇ siRNA (Ambion, Austin, TX, USA) into each of the cultured cells using Welfect-Q (WelGENE, Daegu, Korea) in serum-free medium and incubating for 6 hours. It was done; Treatment of the strong-methanol methanol extract was performed by adding strong-methanol methanol extract to each cultured cell at a concentration of 1 ⁇ g / ml and incubating again for 38 hours; ⁇ -actin was used as an internal standard.
  • FIG. 5 is a photograph and graph showing the effect of methanol extract and PPAR ⁇ siRNA on the expression of type I and III collagen in keratinocytes
  • FIG. 6 is the effect on the expression of type I and III collagen in dermal fibroblasts.
  • FIGS. 5 and 6 it was confirmed that the expression of type I and III collagen induced by strong-induced methanol extract treatment was suppressed in the presence of PPAR ⁇ siRNA, and thus, the component of the strong-induced methanol extract activated PPAR ⁇ , a transcription factor. It was found that induction of expression of extracellular matrix proteins such as collagen in keratinocytes and dermal fibroblasts.
  • the chimeric plasmid in which the PPAR ⁇ ligand binding site and the Gal4-DNA binding site are bound, and the UAS, an arrangement for recognizing the Gal4-DNA binding site, are linked to the luciferase [(UAS ⁇ 3) -tk-luciferase] plasmid And pSV ⁇ -Gal (SV40 ⁇ -galactosidase expression vector, Promega, Madison, Wis.)
  • pSV ⁇ -Gal SV40 ⁇ -galactosidase expression vector, Promega, Madison, Wis.
  • GW501516 (Oliver WR Jr et al., A selective peroxisome, known as strong-entry methanol extract or 50 nM PPAR ⁇ ligand, at concentrations of 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1 or 5 ⁇ g / ml in the transformants. proliferator-activated receptor delta agonist promotes reverse cholesterol transport.Proc Natl Acad Sci US A.
  • Figure 7 is a graph showing the change in activity of luciferase linked to ligand binding sites of PPAR ⁇ , depending on the concentration of the strong methanol extract.
  • the luciferase activity started to increase significantly from the case of 0.25 ⁇ g / ml strong ethanol extract and continuously increased to 5 ⁇ g / ml.
  • GW known as PPAR ⁇ ligand
  • the strong methanol extract contains a ligand component capable of activating PPAR ⁇ , it was intended to determine whether the redid component is also included in the strong ethanol extract.
  • a strong ethanol extract and a strong ethanol extract were prepared. At this time. Strong ethanol extract was prepared in the same manner as in Example 1 except for using 60% ethanol instead of 70% methanol.
  • Figure 8 is a picture showing the type III collagen expressed in the keratinocytes treated with GW and strong ethanol extract
  • Figure 9 is a picture showing the type III collagen expressed in keratinocytes treated with GW and strong ethanol extract.
  • protein expression of type III collagen is induced in both strong and methanol-ethanol organic solvent extracts, which is similar to the expression induction of type III collagen by the PPAR ⁇ ligand GW501516 (GW). It was found that the strong solvent of organic solvent extract regulates the expression of extracellular matrix such as collagen by activating PPAR ⁇ .
  • the purpose of this study was to determine the effect of the Kangjin-hyang methanol extract prepared on the proliferation of keratinocytes and dermal fibroblasts.
  • FIG. 10 is a graph showing the degree of proliferation of cells over time of keratinocytes treated with a strong methanol extract. As shown in Figure 10, keratinocytes were treated with a strong methanol extract 12 hours after the treatment was confirmed that the cells proliferated significantly.
  • Figure 11 is a graph showing the degree of proliferation of the cells of the fibroblasts treated with Kangjin-hyang methanol extract over time. As shown in Figure 11, the dermal fibroblasts were treated with a strong methanol extract 6 hours after the time was confirmed that the cells proliferated significantly.
  • keratinocytes inoculated at a density of 2 ⁇ 10 5 cells in a 6 cm culture dish were incubated for 38 hours, and the strength of methanol extracts of 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, or 5 ⁇ g / ml, respectively.
  • UVB 40 mJ / cm 2
  • Each cultured keratinocytes were washed with PBS and fixed for 7 minutes by addition of fixative (2% formaldehyde, 0.2% glutaraldehyde). The fixer was removed, washed three times with PBS, and then stained with a mixture (10 ⁇ ).
  • FIG. 12 is a micrograph showing activated beta-galactosidase in keratinocytes treated with a control and a strong methanol extract and UVB treatment
  • Figure 13 is a quantified staining beta-galactosidase in the micrograph A graph showing the results. As shown in Figure 12 and 13, it was confirmed that the significant increase of beta-galactosidase activity by UVB irradiation was significantly inhibited in a concentration-dependent manner by the strong extract methanol extract.
  • ROS Reactive oxygen species
  • the keratinocytes inoculated at a density of 2 ⁇ 10 5 cells in a 6 cm culture dish, UVB (40 mJ / cm 2 ) was irradiated to the control, the cells not treated with the strong methanol extract and UVB, Experiment group 1, which was incubated for another 30 minutes, was added to the cells with a strong methanol extract at a concentration of 1 ⁇ g / ml and incubated for 38 hours, followed by irradiation with UVB (40 mJ / cm 2 ), followed by another 30 minutes of incubation.
  • Experimental Group 2 and Experimental Group 3 in which strong-strength methanol extracts were added at a concentration of 1 ⁇ g / ml and incubated for 38 hours, were set up. Then, the cells of each control group and the experimental group were treated with 10 ⁇ M H 2 DCF-DA (DCF-DA, Calbiochem, San Diego, CA), incubated for another 30 minutes, washed twice with cold PBS, Photographs were taken with a confocal microscope (Model 1X70, Olympus, Japan), and fluorescence values taken on the confocal microscope were quantified (see FIGS. 14 and 15).
  • FIGS. 14 and 15 are a confocal micrograph showing the generation of reactive oxygen species in the control group and each experimental group
  • Figure 15 is a graph showing the result of quantifying the fluorescence value shown in the confocal micrograph.
  • the production of ROS was significantly increased in keratinocytes after UVB (40 mL / cm 2 ) irradiation.
  • the treatment of strong ethanol extract significantly increased the production of ROS induced by UVB irradiation. Since it was confirmed that it is suppressed, it can be seen that the strong ethanol methanol extract can inhibit cell aging by inhibiting the generation of reactive oxygen species induced by UVB irradiation in cells.
  • FIG. 16 is a graph showing the results of quantifying the expression level of type I collagen expressed in 40% strong ethanol extract treated skin fibroblasts, and a picture showing Western blot results of type I collagen
  • Figure 18 is the 80% strong ethanol extract treated
  • Figure 19 is expressed in skin fibroblasts treated with 100% strong ethanol extract
  • a graph showing the results of quantifying the expression level of type I collagen and Western blot results of type I collagen are shown.
  • Photo As shown in Figures 16 to 19, the amount of type I collagen expression was increased in a concentration-dependent manner, and all ethanol extracts were treated with concentrations of 5 and 10 ⁇ g / ml. It was confirmed that it is expressed.
  • Example 10 Effect of 60% Strong-Acid Ethanol Extracts on the Expression of Extracellular Matrix Proteins in Keratinocytes and Dermal Fibroblasts
  • the 60% strong ethanol extract prepared above was intended to confirm the effect on the expression of extracellular matrix protein in keratinocytes and dermal fibroblasts.
  • the 60% strong ethanol extract was added to cultured keratinocytes and dermal fibroblasts at a concentration of 5 ⁇ g / ml, further cultured for 38 hours, and then expressed in the cultured keratinocytes by Western blotting.
  • FIG. 20 is a photograph showing Western blot results of each extracellular matrix protein expressed in keratinocytes treated with 60% strong ethanol extract, and a graph showing the result of quantifying the expression level of each extracellular matrix protein
  • FIG. 21 Is a photograph showing the Western blot result of each extracellular matrix protein expressed in 60% strong ethanol extract treated skin fibroblasts and a graph showing the result of quantifying the expression level of each extracellular matrix protein. As shown in FIGS. 20 and 21, it was confirmed that the protein expression of type I collagen and TGF- ⁇ 1 was significantly increased by 60% strong ethanol extract.
  • Example 7 the same method as in Example 7 was carried out except that 60% strong ethanol extract was treated at a concentration of 0, 0.1, 0.5, 1, 5 or 10 ⁇ g / ml instead of the strong methanol extract.
  • Beta-galactosidase activity was measured in keratinocytes (FIGS. 22 and 23).
  • FIGS. 22 and 23 are micrograph showing the beta-galactosidase activated in the control and 60% strong ethanol extract and UVB treated keratinocytes
  • Figure 23 is a beta-galactosidase stained in the micrograph It is a graph showing the result of quantification. As shown in FIGS. 22 and 23, it was confirmed that the significant increase of beta-galactosidase activity by UVB irradiation was significantly inhibited in a concentration dependent manner by treatment with 60% strong ethanol extract.
  • Example 12 Effect of 60% Strong-Acid Ethanol Extracts on the Production of Reactive Oxygen Species in Keratinocytes Induced by UVB Irradiation
  • the purpose of this study was to determine the effect of the Kangjin-hyang methanol extract prepared on the production of ROS in keratinocytes induced by UVB irradiation.
  • Example 8 except for treating the 60% strong ethanol extract in a concentration of 5 ⁇ g / ml instead of the strong ethanol extract, the same method as in Example 8 was carried out to confirm the production of ROS in keratinocytes (See FIGS. 24 and 25).
  • FIGS. 24 and 25 are a confocal micrograph showing the generation of reactive oxygen species in the control group and each experimental group
  • Figure 25 is a graph showing the result of quantifying the fluorescence value shown in the confocal micrograph.
  • the production of ROS was significantly increased in keratinocytes after UVB irradiation, but when 60% strong ethanol extracts were treated, the production of ROS induced by UVB irradiation was significantly suppressed.
  • 60% strong ethanol extract was able to inhibit cell aging by inhibiting the production of reactive oxygen species induced by UVB irradiation in cells.
  • Example 13 Effect of 60% Strong Aqueous Ethanol Extracts on the Expression of Extracellular Matrix Proteins in Skin Tissues of Hairless Mice
  • Example 13-1 Confirmation of the Effect of 60% Gangjin Ethanol Extract on the Expression of Extracellular Matrix Protein in Skin Tissues of Hairless Mice Using Western Blot Method
  • mice were sacrified to detect extracellular matrix-associated proteins in skin tissues such as type I collagen (A), TGF- ⁇ 1 (B), elastin (C), and Tissue Inhibitor of metalloproteinase (TIMP) -1 (D) and 2 (E), and the effect on the expression of Matrix metalloproteinase (MMP) -2 (F) were analyzed (see FIGS. 26-31).
  • ⁇ -actin was used as the internal standard.
  • FIG. 26 is a graph showing the results of quantifying the expression level of type I collagen expressed in the skin tissue of alopecia mice treated with 60% strong ethanol extract
  • FIG. 27 is a picture showing the Western blot result.
  • FIG. 28 is a skin of alopecia mice treated with 60% strong ethanol extract.
  • FIG. 29 is the expression amount of TIMP-1 expressed in the skin tissue of alopecia mice treated with 60% strong ethanol extract Is a graph showing the result of quantification and a photograph showing the Western blot result
  • FIG. 30 is treated with 60% strong ethanol extract.
  • Figure 31 is expressed in the skin tissue of alopecia mice treated with 60% strong ethanol extract It is a graph which shows the result which quantified the expression level of MMP-2, and the photograph which shows a Western blot result.
  • FIGS. 26 to 31 it was confirmed that type I collagen, elastin and TGF- ⁇ 1 protein expression inhibited by UVB were increased again in the group treated with 60% ethanol extract.
  • Example 13-2 Confirmation of the Effect of 60% Kangjin-Hyang Ethanol Extracts on the Expression of Extracellular Matrix Protein in Skin Tissues of Hairless Mice Using Immunohistochemical Analysis
  • Immunohistochemical methods were used to analyze the expression of TGF- ⁇ 1, type I and III collagen, elastin, MMP-1, MMP-2, TIMP-1 and TIMP-2 in skin tissue.
  • each skin tissue was obtained from an experimental group irradiated with UVB (100 mJ / cm 2 ) after 30 minutes after applying 5 ⁇ g / ml of 60% ethanol extract in the same manner. Subsequently, each of the obtained skin tissues was fixed with 4% paraformaldehyde, immersed in OCT solution, and rapidly frozen in liquid nitrogen to prepare 10 ⁇ m-thick tissue frozen slices continuously.
  • the frozen sections were fixed to the surface of the gelatin-coated slide glass, immersed in 10 mM Sodium Citrate solution, and then heated for 3 minutes. Each heated tissue section was blocked with 0.1 M TBS containing 1% BSA at room temperature, for TGF- ⁇ 1, type I and III collagen, elastin, MMP-1, MMP-2, TIMP-1 and TIMP-2. Each antibody was added and then reacted overnight at 4 ° C. After the reaction, each tissue section was washed with PBS three times, and red fluorescent light was observed under a fluorescence microscope using a secondary antibody conjugated with Alexa Flour 594 (see FIGS. 32 and 33).
  • FIGS. 32 and 33 are photographs showing the effect of UVB irradiation and 60% strong ethanol extract on the expression of TGF- ⁇ 1, type I collagen, III collagen and elastin
  • Figure 33 is MMP-1, MMP-2, TIMP-1 and Photograph showing the effect of UVB irradiation and 60% Kangjin ethanol extract on TIMP-2 expression.
  • FIGS. 32 and 33 similar to the results disclosed in Example 13-1, expression of TGF- ⁇ 1, type I and III collagen, and TIMP-1, which were reduced by UVB irradiation, was also detected by immunohistochemical analysis.
  • the obtained sections of skin tissue were washed with PBS, immersed in PBS solution containing 5-10 ⁇ M DHE, and then reacted in the dark at 37 ° C. for 30 minutes. After the reaction was completed, the red fluorescence generated by the reaction of the superoxide and DHE produced in the tissue was observed under a fluorescence microscope and quantified (see FIG. 34).
  • FIG. 34 is a DHE staining photograph showing the effect of UVB irradiation and 60% strong ethanol extract on the production of reactive oxygen species in the skin tissue of alopecia mice. As shown in FIG. 34, it was confirmed that the production of reactive oxygen species by UVB irradiation was suppressed by 60% strong ethanol extract.
  • Example 14-2 Analysis of the Extracellular Matrix Synthesis Modulation Effect of 60% Gangjin Ethanol Extracts in Mouse Skin Tissues Using Masson's trichrome Staining
  • the sections of the skin tissues were washed with distilled water and immersed in a hematoxylin solution for 10 minutes and then stained first. Then, the primary dyed skin tissue sections were washed with warm distilled water for 10 minutes, and then immersed in Biebrich sacrlet-acid fuchsin solution for 10-15 minutes for secondary staining. The secondary dyed skin sections were washed with distilled water, immersed in phosphomolybdic-phosphotungstic acid solution for 10-15 minutes, and immediately immersed in aniline blue solution for third staining for 5-10 minutes. Subsequently, the tertiary dyed skin tissue sections were washed with distilled water and immersed in 1% acetic acid solution for 2-5 minutes. After the reaction was completed, the skin tissue sections were washed with distilled water, rapidly dehydrated by addition of 95% ethyl alcohol, and fixed with xylene solution to observe the stained tissue under a microscope (see FIG. 35).
  • FIG. 35 is a Masson's trichrome staining photograph showing the effect of UVB irradiation and 60% strong ethanol extract on extracellular matrix synthesis in skin tissues of alopecia mice. As shown in Figure 35, the expression of the extracellular matrix inhibited by UVB was confirmed to increase again in the group treated with 60% strong ethanol extract.
  • Example 14-3 Confirmation of Mutation of Mouse Skin Tissues of 60% Strong-Edge Ethanol Extracts Using HE Staining
  • FIG. 36 is a HE staining photograph showing the effect of UVB irradiation and 60% strong ethanol extract on the production of reactive oxygen species in the skin tissue of alopecia mice. As shown in FIG. 36, even when irradiated with UVB 100 mJ / cm 2 , the 60% strong ethanol extract treatment group was morphologically inherent in maintaining skin morphology.
  • the strong-methanol extracts and four standard compounds (medicarpin, dalbergin, and isoliquiritigenin) (ChromaDex, Irvine, CA) , USA) was dissolved in 100% methanol and filtered through a 0.45 ⁇ m syringe filter and the filter liquid was injected into the (20 ⁇ l) analyzer.
  • the column was C18 (250 mm ⁇ 4.6 mm, 5 ⁇ m) and the fluid phase was acetonitrile (solvent A) and 0.3% acetic acid (solvent B).
  • FIG. 37 shows the HPLC results (top) for 0.5 mg / ml of Kangjin-hyang 70% methanol extract (top) and the HPLC results (bottom) confirming that the compound indicated by the arrow in those HPLC results is sativanone.
  • 38 shows the HPLC results (top) for 0.5 mg / ml Kangjin-hyang 70% methanol extract (top) and the HPLC results (bottom) confirming that the compound indicated by the arrow is medicarpin
  • FIG. 39 shows the HPLC results (upper) for 0.5 mg / ml Kangjin Hyang 70% methanol extract (top) and the HPLC results (bottom) confirming that the compound indicated by the arrow among those HPLC results is dalbergin
  • FIG. 40 shows the HPLC results (top) for 0.5 mg / ml of Kangjin-hyang 70% methanol extract and the HPLC results (bottom) confirming that the compound indicated by the arrow in the HPLC results is isoliquiritigen
  • the compounds included in the kangjinhyang extract is sativanone, medicarpin, dalbergin, and isoliquiritigenin.
  • the chemical formulas of these compounds are as follows, and sativanon (3- (2,4-dimethoxyphenyl) -7-hydroxychroman-4-one) is represented by Formula I, medicarpine (9-methoxy-6a, 11a-dihydro-6H).
  • Example 16 Effect analysis of the expression of type III collagen, an extracellular matrix protein, in normal human keratinocytes of a compound of the present invention
  • the compounds of the present invention After treatment with keratinocytes at concentrations of 1 ⁇ M, 5 ⁇ M and 10 ⁇ M, the compounds of the present invention, sativanone, dalbergin, isosuriquitinenin, and medicarpine were subjected to 38-hour treatment, followed by Western blot. The effect on the protein expression of type III collagen, one of the extracellular matrix proteins, was analyzed (see FIGS. 41-44). At this time, ⁇ -actin was used as an internal standard.
  • FIG. 41 is a Western blot photograph showing the degree of expression of type III collagen protein when sativanon is treated with keratinocytes at 1 ⁇ M and 5 ⁇ M.
  • FIG. 42 is a type III when keratinocytes are treated with 1 ⁇ M and 5 ⁇ M.
  • Western blot picture showing the expression level of collagen protein
  • Figure 43 is a Western blot picture showing the degree of expression of type III collagen protein when treated with 5-M and 10- ⁇ M isoriquirigenin keratinocytes
  • Figure 44 is a keratinocyte Western blot image showing the degree of type III collagen protein expression when treated with medicarpine at 1 ⁇ M and 5 ⁇ M. As shown in FIGS.
  • Example 17 Effect of Compounds of the Invention on Expression of Type I Collagen, an Extracellular Matrix Protein in Normal Human Fibroblasts
  • the compound of the present invention After treatment with dermal fibroblasts at different concentrations of 0, 0.1, 0.5, 1, 5, 10 mg / ml, the compound of the present invention, sativanone, dalbergin, isoriquirigeninine, and medicarpine for 38 hours.
  • FIG. 45 is a Western blot photograph showing the expression level of type I collagen protein when treated with sativanon on dermal fibroblasts
  • FIG. 46 shows the expression level of type I collagen protein when treated with dalbergin on dermal fibroblasts.
  • Western blot picture Figure 47 is a Western blot picture showing the degree of expression of type I collagen protein when treated with dermal fibroblasts isosuriquirigenin
  • Figure 48 is a type I when treated with medicarpin to skin fibroblasts Western blot photograph showing the expression level of collagen protein. As shown in FIGS.
  • beta- is an important indicator of cell aging.
  • Galactosidase activity was measured and analyzed.
  • keratinocytes inoculated at a density of 2 ⁇ 10 5 cells in a 6 cm culture dish were incubated for 38 hours, and the four compounds (satibanone, dalbergin, isoriquiriticenin, and medicarpine). After addition at a concentration of 1 ⁇ M, UVB (40 mJ / cm 2 ) was irradiated and incubated for another 24 hours. Each cultured keratinocytes were washed with PBS and fixed for 7 minutes by addition of fixative (2% formaldehyde, 0.2% glutaraldehyde). The fixer was removed, washed three times with PBS, and then stained with a mixture (10 ⁇ ).
  • fixative 2% formaldehyde, 0.2% glutaraldehyde
  • FIG. 49 shows micrographs and micrographs showing activated beta-galactosidase in keratinocytes treated with four compounds (satibanone, dalbergin, isoriquitigenin, and medicarpine) and UVB. It is a graph showing the result of quantifying the beta-galactosidase stained in. As shown in FIG. 49, it was confirmed that significant increase of beta-galactosidase activity by UVB irradiation was significantly inhibited by sativanon, dalbergin, isoriquithygeninine, and medicarpin treatment.
  • FIG. 50 is a confocal microscope photograph showing the generation of reactive oxygen species in the control group and each experimental group, and a graph showing the result of quantifying the fluorescence value shown in the confocal microscope photograph.
  • FIG. 50 ROS production was significantly increased in normal human keratinocytes after 30 minutes of UVB irradiation.
  • sativanon, dalbergin, isoriquitigenin, and medicarpine Since the induction of ROS production was markedly suppressed, the major components of Gangjin-hyang sativanon, dalbergin, isoriquirigeninine, and medicarpine were found to inhibit the production of reactive oxygen species induced by UVB irradiation in cells. It was found that cell aging was inhibited by inhibition.

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Abstract

본 발명은 강진향 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는, 강진향 추출물, 이의 분획물, 상기 추출물로부터 분리된 사티바논(sativanone), 메디카르핀(medicarpin), 달베르긴(dalbergin), 및 이소리퀴리티제닌(isoliquiritigenin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 조성물, 이를 포함하는 약학적 조성물 및 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 강진향 추출물, 이의 분획물 또는 사티바논, 메디카르핀, 달베르긴, 및 이소리퀴리티제닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물은 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선 효과가 뛰어나고, 합성된 화합물이 아니라 천연물 유래의 추출물 또는 이의 분획물을 사용하므로 안전하고 독성, 부작용이 거의 없어 장기간 피부에 사용할 수 있는 장점이 있으므로, 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 약학적 조성물, 화장료 조성물 등으로 사용할 수 있다.

Description

강진향 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 조성물
본 발명은 강진향 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는, 강진향 추출물, 이의 분획물, 상기 추출물로부터 분리된 사티바논(sativanone), 메디카르핀(medicarpin), 달베르긴(dalbergin), 및 이소리퀴리티제닌(isoliquiritigenin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 조성물, 이를 포함하는 약학적 조성물 및 화장료 조성물에 관한 것이다.
사람의 피부는 각질층을 포함하는 표피와 진피, 그리고 결합조직으로 구성되어 있는데 그 중 각질층은 표피(epidermis)의 기저세포인 케라티노사이트(keratinocyte)의 분화과정을 통해 형성되는 죽은 세포층으로 구성되어 있고 인체를 외부환경의 영향으로부터 보호해주는 역할을 담당하고 있다. 또한 피부의 내부에 존재하는 진피층은 섬유성 단백질인 콜라겐(collagen)과 엘라스틴(elastin)으로 구성되어 있어 피부의 탄력을 주어 피부가 처지지 않도록 지켜주는 역할을 담당하고 있다.
이러한 피부의 노화나 주름의 생성의 원인에 대해서는 크게 두 가지로 연구되고 있는데, 하나는 "내적 노화"로서 연령의 증가에 따른 피부의 구성단위인 세포의 기능변화에 기인한 것이고, 다른 하나는 "외적 노화"로서 외부 환경 즉 자외선, 공해, 스트레스 등에 의한 것으로 나눌 수 있다. 피부 노화의 원인 중에서도 가장 큰 부분을 차지하고 있는 광노화는 UV에 의한 지속적인 노출에 의해 피부암 등의 급성 및 만성적인 피부의 상해를 유발한다. 이것은 태양광에 존재하는 파장대에 따라 UVA (320-400 nm), UVB (290-320 nm) 그리고 UVC (200-290 nm) 3가지로 나뉘어지는데, 이 중 UVC는 오존층에 의해 거의 완벽히 흡수되는 반면, UVA와 UVB는 지구의 표면까지 도달하여 피부상해를 유발하는 치명적인 인자로 작용한다. UVA 보다 짧은 파장대이지만 더욱 강력한 UVB는 진피의 윗부분에 존재하는 표피를 관통하여 케라티노사이트에 상해를 입히고 콜라겐 섬유를 손상시켜 그 결과 광노화, 피부의 변색 그리고 피부암을 야기하는 것으로 알려져 있다.
또한, 피부의 노화 과정 중에 일어나는 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)의 변성은 피부의 주름을 생성시키고 피부의 탄력 감소를 유발한다. 현재까지 항 노화의 주요 타겟은 메탈로프로테아제(metalloproteases) 혹은 콜라겐이나 엘라스틴 같은 구조 단백질에 집중되어 있지만, 최근 세포와 세포외 기질 단백질(콜라겐, 피브릴린, 피브로넥틴) 간의 상호작용이 세포의 생존과 증식, 조직의 재건에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다.
한편, 퍼옥시좀 증식활성화 수용체(peroxisome proliferation-activated receptors: 이하, PPAR라 함)은 핵내호르몬 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 리간드 유도성 전사인자로서, 세포 분화와 증식, 지질 항상성 및 에너지 대사를 포함한, 많은 세포성 및 대사성 과정을 조절한다. 지금까지 3개의 PPAR 서브패밀리인 PPARα (NR1C1), PPARδ (NR1C2, 또한 PPARβ, FAAR 및 NUC1로도 알려짐) 및 PPAR γ (NR1C3)가 동정되었다. 상기 수용체는 RXR(retinoid X receptor)와 이량체를 형성하고 타겟 유전자의 조절 영역에 존재하는 PPRE(PPAR response elements)라고 하는 특이적인 염기서열에 결합함으로써 유전자 발현을 조절하는데, PPAR 타겟 유전자의 프로모터 영역은 하나 또는 두 개의 뉴클레오타이드에 의해 구별되는, 6개의 염기서열인 AGGTCA의 반복적인 염기서열로 구성되어 있다. 이러한 PPAR은 피부 구성세포에 전반적으로 존재하며 피부 장벽 기능의 항상성 유지 및 복원, 보습능력, 염증치유 과정의 발현에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀져 있다. 즉, PPAR은 에너지 항상성을 조절하는 인자로, 특히 PPAR이 다양한 기전을 통해 피부장벽의 투과성 조절, 표피층 증식억제, 표피층의 분화유도 등과 같은 피부상태 조절에 관여한다는 것이 알려져 있다. 이러한 특징때문에, PPAR은 피부조직을 구성하는 세포인 케라티노사이트와 피부 섬유아세포에서 풍부하게 발현되고 있는 것으로 알려져 있으며, 염증관련 피부질환뿐만 아니라 표피층의 과증식으로 인한 건선, 상처치유, 여드름 등 다양한 피부질환의 핵심조절자로 작용함이 알려져 있다. 따라서, 케라티노사이트와 피부 섬유아세포에서 상기와 같은 PPAR을 조절하여 세포외 기질 단백질의 발현을 촉진시킬 수 있다면 상기와 같은 피부노화의 개선을 가져올 수 있다.
한편, 강진향(Dalbergia odorifera T.CHEN)은 식물분류학적으로 콩과(豆科) 식물에 속하는 강향단의 근부 심재이며, 낙엽 교본으로서 길이가 약 10 m까지 자라고 잎은 호생하는 식물로서, 한방에서는 강향, 자등향, 번강, 계골향 등의 이름으로 불리기도 하며, 진통(鎭痛), 지혈(止血), 통기, 행어 등의 목적으로 사용되어 왔던 한약재이다. 또한, 근부 심재가 적갈색 또는 자색으로서 단단하여 약재는 근부를 취하여 외피를 제거한 후 사용한다. 최근에는 상기 강진향에 소염, 골다공증 치료, 면역반응과 관련된 항알러지 등에 효과가 있다는 보고가 있으나, 아직까지 강진향이 단독으로 사용되어 피부 노화를 억제하고 주름을 개선하는 효과가 있음은 보고된 바가 없었다.
이에, 본 발명자는 피부 노화 억제 및 주름 개선 효과가 우수한 천연물 유래 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 강진향 추출물, 이의 분획물 또는 상기 추출물에 포함된 사티바논, 메디카르핀, 달베르긴, 또는 이소리퀴리티제닌을 함유한 조성물이 피부세포에서 PPARδ을 활성화시켜 세포외기질 단백질인 타입 I 콜라겐, 타입 III 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴, 및 TGF-β1(Transforming Growth Factor - beta 1) 단백질 발현을 촉진하고, UV 조사에 의해 발생된 활성산소(ROS)의 생성을 저해함으로써, 피부 노화 억제 및 주름 개선에 탁월한 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 강진향 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선효과가 뛰어난 사티바논, 메디카르핀, 달베르긴, 및 이소리퀴리티제닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 강진향 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 강진향 추출물은 강진향를 세척하고 건조시킨 후 분쇄하는 단계; 및 상기 분쇄된 강진향을 물, C1~C4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매로 추출하여 수득할 수 있다. 상기 강진향 추출물은 물, C1~C4의 저급 알콜 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올로 추출한 것을 포함하며 메탄올로 추출한 것이 더욱 바람직하다. 또한, 본 발명에 있어서, 상기 추출물에는, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물 중 어느 하나도 포함하는 것으로 한다.
상기 강진향(Dalbergia odorifera T.CHEN)은 식물분류학적으로 콩과(豆科) 식물에 속하는 강향단의 근부 심재이며, 낙엽 교본으로서 길이가 약 10 m까지 자라고 잎은 호생하는 식물로서, 한방에서는 강향, 자등향, 번강, 계골향 등의 이름으로 불리기도 하며, 진통(鎭痛), 지혈(止血), 통기, 행어 등의 목적으로 사용되어 왔던 한약재이다. 또한, 근부 심재가 적갈색 또는 자색으로서 단단하여 약재는 근부를 취하여 외피를 제거한 후 사용한다. 최근에는 상기 강진향에 소염, 골다공증 치료, 면역반응과 관련된 항알러지 등에 효과가 있다는 보고가 있으나, 아직까지 강진향으로부터 분리한 플라보노이드 화합물이 단독으로 사용되어 피부노화 억제 또는 주름을 개선하는 효과가 있음은 보고된 바가 없다.
추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명에서 강진향 추출물을 얻기 위한 방법은 다음과 같다. 건조 강진향을 건조 중량의 약 2 내지 20배, 바람직하게는 약 3 내지 5배에 달하는 부피의 물, 메탄올, 에탄올 및 부탄올 등과 같은 C1~C4의 저급 알콜의 극성 용매 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매를 용출 용매로써 사용하고, 추출 온도는 20 내지 100℃, 바람직하게는 25℃에서, 추출 기간은 약 5시간 내지 10일, 바람직하게는 5-10 시간 동안 진탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여 추출한다. 바람직하게는 진탕 추출로 25℃에서 120rpm으로 1시간 교반하여 진공여과로 상층액을 회수하고 이러한 과정을 3회 반복한 후 상층액을 회수한 후, 그 여과 추출물을 증류농축장치로 20 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서 감압농축 및 동결건조하여 물, 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매에 가용한 강진향 조추출물을 수득할 수 있다.
상기 강진향 추출물은 천연, 잡종, 변종 식물의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있고, 예를 들어 뿌리, 줄기, 잎, 및 꽃뿐만 아니라 식물 조직 배양물로부터 추출 가능하다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 강진향 추출물은 건조 강진향에 메탄올 또는 에탄올을 첨가하여 상층액으로부터 회수한 뒤 농축 및 동결건조시켜서 제조하였다.
또한, 상기 알콜 농축액에 물을 넣어 현탁시키고, n-헥산, 클로로포름 또는 에틸아세테이트와 같은 비극성 용매를 사용하여 분획함으로써 얻은 용매 분획물을 사용할 수도 있다.
또한, 상기 용매 분획물을 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 이소프로판올 등의 극성 용매 및 에틸아세테이트, n-헥산, 디클로로메탄 또는 클로로포름 등의 비극성 용매 중에서 선택된 2종 이상으로 이루어진 혼합용매를 이동상으로 하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여, 피부 노화 억제 및 주름 개선 효능이 있는 활성성분을 분리하여 사용할 수도 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "피부 노화 억제"는 강진향 추출물을 포함한 조성물을 사용하여 노화를 야기하는 원인을 불문하고 피부의 노화를 억제 또는 지연시키는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "피부 주름 개선"은 피부의 주름 및 탄력과 관련된 능력을 유지 또는 강화시키는 것을 의미한다. 피부의 구조 중에서 진피층에 존재하는 교원섬유인 콜라겐(collagen)과 탄력섬유인 엘라스틴(elastin)이 그러한 역할을 하는 주요 단백질로서 피부 탄력을 주관하는데, 콜라겐의 생합성은 피부의 내, 외적 영향을 받게 된다. 구체적으로, 피부세포는 자연 노화로 인하여 세포 활성이 감소되면 콜라겐 섬유의 감소가 일어나거나, 또는 외적요인으로서 자외선의 과량 조사되거나 스트레스 등에 의해 생성된 활성 산소가 단백질의 티올기(thiol: -SH)와 반응하여 효소 활성을 저해하거나, 콜라겐, 엘라스틴 등의 분해 효소의 발현을 증가시켜 피부의 주름을 증가시키고 탄력을 감소시키게 된다.
본 발명의 강진향 추출물 또는 이의 분획물은 이러한 피부 노화 및 주름의 생성에 대해 피부에서 세포외기질 단백질들의 발현을 증가시키고 케라티노사이트의 증식을 유도하며, 피부 탄력과 주름 개선 및 노화 억제를 효과적으로 조절한다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 강진향의 메탄올추출물을 피부세포에 처리한 결과, 케라티노사이트 및 피부섬유아세포 모두에서 타입 I 콜라겐, 타입 III 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴 및 TGF-β1의 단백질 발현이 유의하게 증가하는 것으로 나타나, 강진향 추출물이 세포외기질 단백질들의 발현을 촉진함을 확인하였다.
그리고, 본 발명의 강진향 추출물 또는 이의 분획물은 피부 세포의 증식을 가속화하여 피부 표피 세포의 재생을 촉진시킴으로서 손상된 피부의 재생과 주름개선에 기여할 수 있다. 본 발명의 구체적 실시예에 따르면, 강진향 메탄올 추출물을 피부세포에 처리하여 피부세포의 증식에 대한 강진향 메탄올추출물의 효과를 조사한 결과, 사람 케라티노사이트 및 피부 섬유아세포에서 대조군에 비해 유의하게 세포증식이 증가함을 확인하였다.
또한, 본 발명의 강진향 추출물 또는 이의 분획물은 UV에 의해 발생되는 베타-갈락토시데이즈의 억제나 활성산소종을 제거하는 항산화 기능을 가지므로, 피부 탄력과 주름 개선 및 노화 억제를 효과적으로 조절할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 광노화에 대한 강진향 메탄올 추출물의 영향을 조사하기 위해 노화의 중요 지표인 베타-갈락토시데이즈 활성을 측정하여 분석한 결과, 강진향 메탄올 추출물에 의해 UVB에 의해 유도된 베타-갈락토시데이즈 활성이 농도의존적으로 유의하게 억제됨을 확인하였다.
본 발명에서 사용되는 용어, "항산화"는 자외선의 영향으로 반응성이 높은 활성 산소와 자유 라디칼(free radical)에 의한 피부 구성 성분의 산화를 억제하는 기능을 의미한다. 활성 산소와 자유 라디칼은 피부를 구성하는 성분들을 산화시켜 과산화물을 생성하고, 그 결과 피부가 구조적 및 기능적으로 손상되어 노화가 촉진되는데, 본 발명의 항산화 기능은 이로부터 피부를 보호하는 기능을 수행한다. 본 발명의 강진향 추출물을 포함한 조성물은 상기 자유 라디칼을 불활성화시키는 기능을 수행할 수 있는데, 바람직하게는 UVB에 의해 생성된 활성산소 라디칼(superoxide radical)을 소거할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예로서, 강진향 메탄올 추출물의 UV 조사에 의해 발생되는 활성산소종의 생성을 억제하는 항산화 효과를 알아보기 위해, 강진향 메탄올추출물을 세포에 처리한 후 과산화수소에 특이적인 DCFH-DA를 사용하여 Confocal laser sanning microscopy로 측정한 결과, 사람 케라티노사이트에서 UVB 조사에 의해 생성된 ROS 생성유도가 현저하게 억제됨을 관찰함으로써 강진향 메탄올추출물이 피부 세포 내에서 활성산소종의 생성을 억제하여 항산화 기능을 가짐을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명에 따른 강진향 추출물 또는 이의 분획물은 세포외 기질 단백질의 발현을 촉진하고 세포를 증식하여 피부탄력을 유지하고, 특히 UV에 의한 피부 손상 및 노화를 효과적으로 억제하는 효과가 있다.
상기와 같은 강진향 추출물 또는 이의 분획물의 효능에 대해, 본 발명자는 정상 사람 케라티노사이트와 피부 섬유아세포에서 세포외 기질의 단백질의 발현을 조절하는 작용메커니즘에 대해 살펴보고자 하였다. 그 결과, 강진향 추출물의 성분이 핵내 중요 전사조절인자인 PPARδ의 리간드로서 작용하여 PPARδ을 활성화하여 세포외 기질 단백질의 발현을 유도함을 밝혔다.
본 발명에서, PPARδ는 핵내에서 특이 리간드의 결합에 의해 활성화되어 특정유전자의 프로모터영역에 존재하는 PPRE에 결합함으로써, 유전자의 발현을 전사단계에서 조절하는 전사인자를 말한다. 본 발명의 강진향 추출물 또는 이의 분획물은 상기 PPARδ를 특이적으로 활성화할 수 있는 성분을 포함하며, 이는 상기 강진향 추출물 또는 이의 분획물이 PPARδ에 특이적인 리간드를 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 정상 사람 케라티노사이트 및 피부 섬유아세포에서 세포외 기질인 타입 I 콜라겐 및 타입 III 콜라겐의 발현에 PPARδ가 관여하는지를 살펴보기 위하여 siRNA에 의해 PPARδ의 발현을 억제(knock-down)하여 실험한 결과, 강진향 메탄올추출물 처리에 의해 발현이 유도된 타입 I 콜라겐 및 타입 III 콜라겐의 발현이 PPARδ siRNA의 존재하에서 억제됨을 관찰할 수 있었으며, 강진향 메탄올추출물이 PPARδ의 전사활성을 직접 조절할 수 있는지를 알아보기 위해 루시퍼라제를 이용한 실험결과는 PPARδ가 강진향 메탄올추출물에 포함되는 것으로 추정되는 리간드에 의해 활성되는 것을 지시하였다.
따라서, 본 발명에 따른 강진향 추출물 또는 이의 분획물은 PPARδ을 활성화하여 세포외 기질 단백질의 발현을 유도함을 알 수 있었다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 사티바논, 메디카르핀, 달베르긴, 및 이소리퀴리티제닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 조성물을 제공한다.
상기 화합물의 화학식은 하기 화학식 1 내지 4와 같으며, 사티바논(3-(2,4-dimethoxyphenyl)-7-hydroxychroman-4-one)은 화학식 1, 메디카르핀(9-methoxy-6a,11a-dihydro-6H-benzofuro[3,2-c]chromen-3-ol)은 화학식 2, 달베르긴(6-hydroxy-7-methoxy-4-phenyl-2H-chromen-2-one)은 화학식 3, 이소리퀴리티제닌((E)-1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2 -en-1-one)은 화학식 4로 나타낼 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2011001258-appb-I000001
[화학식 2]
Figure PCTKR2011001258-appb-I000002
[화학식 3]
Figure PCTKR2011001258-appb-I000003
[화학식 4]
Figure PCTKR2011001258-appb-I000004
본 발명에서 상기 사티바논, 메디카르핀, 달베르긴, 또는 이소리퀴리티제닌은 상기 화합물을 포함하는 다양한 식물로부터 추출, 분리 및 정제하여 얻을 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니나, 그 예로 강진향으로부터 추출, 분리 및 정제하여 얻을 수 있고, 또는 당업계에서 잘 알려진 공지의 합성방법에 의해 합성할 수도 있다 (Herbert O. House: Modern Synthetic Reactions, 2nd Ed., The Benjamin/Cummings Publishing Co., 1972).
구체적으로 본 발명의 화합물을 강진향으로부터 분리하는 과정을 살펴보면, 먼저, 본 발명의 강진향 조추출물은 강진향을 세척하고 건조시킨 후 분쇄하는 단계; 및 상기 분쇄된 강진향을 물, C1~C4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매로 추출하여 수득할 수 있다. 상기 강진향 조추출물은 물, C1~C4의 저급 알콜 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올로 추출한 것을 포함하며 메탄올로 추출한 것이 더욱 바람직하나, 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예로서, 강진향 조추출물은 건조 강진향을 건조 중량의 약 3 내지 5배에 달하는 부피의 물, 메탄올, 에탄올 및 부탄올 등과 같은 C1~C4의 저급 알콜의 극성 용매 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매를 용출 용매로써 사용하고, 25℃에서 약 5시간 내지 10일, 바람직하게는 5-10 시간 동안 진탕 추출로 25℃에서 120rpm으로 1시간 교반하여 진공여과로 상층액을 회수하고 이러한 과정을 2 ~ 3회 반복하여 상층액을 회수한 후, 이를 통상의 방법으로 농축 및 동결건조하여 수득할 수 있다 (도 1).
상기 강진향 조추출물은 천연, 잡종, 변종 식물의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있고, 예를 들어 뿌리, 줄기, 잎, 및 꽃뿐만 아니라 식물 조직 배양물로부터 추출 가능하다.
상기 강진향 조추출물을 증류수에 넣어 현탁한 후, n-헥산, 클로로포름 또는 에틸아세테이트와 같은 비극성 용매를 사용하여 분획함으로써 얻은 용매 분획물을 제조할 수 있다. 상기 용매 분획물을 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 이소프로판올 등의 극성 용매 및 에틸아세테이트, n-헥산, 디클로로메탄 또는 클로로포름 등의 비극성 용매 중에서 선택된 2종 이상으로 이루어진 혼합용매를 이동상으로 하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 수 개의 활성 분획물을 수득할 수 있다. 상기 활성 분획물을 역상 18-컬럼크로마토그래피에서 60~100% 메탄올로 전개시켜 70% 메탄올에서 다시 활성 분획물을 수득할 수 있고, 이를 다시 농축한 후 세파덱스 LH-20 크로마토그래피에서 클로로포름:헥산:메탄올로 분획한 후 HPLC에서 최종 분획을 수행함으로써, 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선 효능을 갖는 본 발명의 화합물을 수득할 수 있다.
본 발명의 화합물은 약학적으로 허용되는 염의 형태로 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 화합물은 단독으로 또는 다른 약학적 활성 화합물과 결합하거나 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 염"은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 제조한 염을 의미하며, 이러한 제조방법은 당업자에게 공지되어 있다. 구체적으로, 상기 약제학적으로 허용 가능한 염은 약리학적 또는 생리학적으로 허용되는 다음 무기산과 유기산 및 염기로부터 유도된 염을 포함하지만 이것으로 한정되지는 않는다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 포함할 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 알칼리 금속, 예를 들어, 나트륨, 또는 칼륨, 알칼리 토금속, 예를 들어, 마그네슘을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "피부 노화 억제"는 시간이 흐름에 따라 신체의 생리적 변화가 발생하여 피부 조직이 퇴화하는 것을 예방 또는 지연시키는 것을 의미한다. 피부 노화를 억제하기 위해서는 피부를 외부의 유해환경으로부터 보호해야 함은 물론 피부에 수분을 적절히 공급하고, 피부세포를 활성화시켜 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin) 등의 생체 합성 단백질의 합성을 촉진함으로써 주름의 형성을 최대한 억제시켜야 한다. 특히 피부의 구조 중에서 진피층에는 교원섬유인 콜라겐과 탄력섬유인 엘라스틴이 그물망 구조를 형성하고 있는데, 이러한 그물망 구조가 깨어지면서 엘라스틴이 분해효소인 엘라스타아제(elastase)에 의해 분해되면서 피부가 처지고 주름이 생기므로 내인성 피부노화가 발생한다. 따라서, 피부노화의 주 원인중 하나인 엘라스틴의 분해를 억제하여 피부노화를 억제할 수 있다. 또한 피부 노화의 한 원인인 광노화와 관련하여 베타-갈락토시데이즈 활성 및 활성 산소종의 생성을 저해하여 피부 노화를 억제할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "피부 주름 개선"은 피부의 주름 및 탄력과 관련된 능력을 유지 또는 강화시키는 것을 의미한다. 피부 진피층의 교원섬유인 콜라겐(collagen)과 탄력섬유인 엘라스틴(elastin)이 그러한 역할을 하는 주요 단백질로서 피부 탄력을 주관하는데, 콜라겐의 생합성은 피부의 내, 외적 영향을 받게 된다. 구체적으로, 피부세포는 자연 노화로 인하여 세포 활성이 감소되면 콜라겐 섬유의 감소가 일어나거나, 또는 외적요인으로서 자외선의 과량 조사되거나 스트레스 등에 의해 생성된 활성 산소가 단백질의 티올기(thiol: -SH)와 반응하여 효소 활성을 저해하거나, 콜라겐, 엘라스틴 등의 분해 효소의 발현을 증가시켜 피부의 주름을 증가시키고 탄력을 감소시켜 피부 노화가 진행된다.
본 발명의 화합물인 사티바논, 메디카르핀, 달베르긴, 또는 이소리퀴리티제닌은 이러한 피부 노화 및 피부의 주름 생성에 대해 피부에서 활성 산소종 생성을 저해하는 한편, 세포외기질 단백질들의 발현을 증가시켜서, 피부 노화 억제와 피부 주름 개선에 효과적이다. 바람직하게는 본 발명의 화합물은 세포외 기질 단백질인 타입 Ⅰ 콜라겐 또는 타입 Ⅲ 콜라겐의 발현을 촉진하여 피부주름 개선을 수행할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 화합물을 각각 인간 케라티노사이트에 처리한 결과, 모든 경우에 타입 III 콜라겐 단백질 발현이 증가하는 것으로 나타났고, 인간 섬유아세포에 처리한 결과에서도 타입 I 콜라겐 단백질의 발현이 증가하는 것으로부터, 상기 화합물이 세포외기질 단백질의 발현을 촉진함을 확인하였다. 또한, 상기 화합물을 각각 처리한 케라티노사이트에서 노화의 지표가 되는 베타-갈락토시데이즈의 활성 및 활성 산소 생성량의 변화를 확인한 결과, 화합물의 처리농도에 의존적으로 베타-갈락토시데이즈의 활성이 유의적으로 감소하였으며, 활성 산소종 생성량도 감소하는 것으로 나타나, 상기 화합물이 피부 노화를 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 강진향 추출물 또는 이의 분획물은 피부세포에서 PPARδ을 활성화시켜 세포외 기질 단백질의 발현을 촉진하고, UV 조사에 의해 발생된 활성산소(ROS)의 생성을 저해함으로써, 피부 노화 억제 및 주름 개선에 효과가 있으므로, 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명에 의하면, 강진향 추출물 또는 이의 분획물은 피부세포인 케라티노사이트 및 피부 섬유아세포에서 세포외 기질인 타입 I 콜라겐, 타입III 콜라겐, 피브로넥틴, 및 TGF-β1의 발현을 촉진하고, UV 조사에 의해 발생되는 활성산소의 생성을 저해하고, 피부 노화의 지표인 베타-갈락토시데이즈의 활성을 저해함으로써, 피부의 노화를 억제할 뿐만 아니라 피부 주름개선 등의 효과가 있으므로, 피부세포의 항상성을 개선할 수 있다.
본 발명의 화합물은 UV에 의한 세포 노화 억제 및 활성 산소종의 생성 억제로 피부 노화 억제 효과가 있으며, 피부세포에서 세포외 기질 단백질의 발현을 촉진함으로써 피부의 주름 개선에 효과가 있으므로, 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 약학적 조성물의 처리량은 약학적으로 유효한 양이어야 한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 유효량은 당업자에게 인식되어 있듯이 처리의 경로, 부형제의 사용 및 다른 약제와 함께 사용할 수 있는 가능성에 따라 변할 수 있다.
본 발명의 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 약학적 제형으로 제조될 수 있다. 제형의 제조에 있어서, 활성 성분을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제 및 패치의 형태로 제형화하여 사용될 수 있고, 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
또한, 본 발명의 상기 약학 조성물은 피부 노화 억제 또는 피부 주름개선을 목적으로 의약외품 제조시 첨가되어 사용될 수 있다. 본 발명의 상기 약학 조성물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 화합물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 바람직하게는, 상기 의약외품은 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제, 코팅제 또는 필터충진제일 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "화장료 조성물"은 상기 화합물을 포함하는 조성물로서 그 제형은 어떠한 형태라도 가능하다. 이러한 제형의 예를 들면 상기 조성물을 이용하여 제조된 화장료는 영양크림, 아이크림, 마사지크림, 클렌징크림과 같은 크림류, 팩류, 영양로션과 같은 로션류, 에센스류, 유연화장수, 영양화장수와 같은 화장수류, 파우다류, 파운데이션류 및 메이크업 베이스류 등이고, 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 이러한 제형 중 어떠한 형태로도 제조되어 상용화될 수 있으며, 상기 예들에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물에는 통상의 화장료 제조 방법으로 제형화할 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물에는 일반 피부 화장료에 배합되는 보통의 성분을 필요한 만큼 적용 배합하는 것이 가능하다.
구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 경피 침투 강화제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, 경피 침투 강화제란 피부의 혈관세포 내로 원하는 성분이 높은 흡수율로 침투할 수 있게 해주는 조성물이다. 바람직하게는 레시틴 화장품에 사용되는 다른 인지질 성분, 리포좀 성분 등이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.
또한, 유상 성분으로서 주로 사용될 수 있는 오일로는 식물성 오일, 광물성 오일, 실리콘유 및 합성유 중에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 미네랄오일, 사이크로메치콘, 스쿠알란, 옥틸도데실 미리스테이트, 올리브오일, 비티스 비니페라 씨드 오일, 마카다미아너트오일, 글리세릴옥타노에이트, 캐스터오일, 에칠헥실 이소노나노에이트, 디메치콘, 사이크로펜타실록산 및 선플라워씨드 오일 등을 사용할 수 있다.
또한, 유화 능력을 보강하기 위하여 계면활성제, 고급 알콜 등을 0.1 내지 5 중량% 첨가할 수 있다. 이러한 계면 활성제로는 비이온 계면활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제, 인지질 등과 같은 통상적인 계면활성제를 사용할 수 있으며, 구체적으로, 소르비탄세스퀴놀리에이트, 폴리솔베이트 60, 글리세릴 스테아레이트, 친유형 글리세릴스테아레이트, 소르비탄 올리에이트, 소르비탄 스테아레이트, 디이에이-세틸포스페이트, 소르비탄스테아레이트/슈크로스코코에이트, 글리세릴스테아레이트/폴리에틸렌글라이콜-100 스테아레이트, 세테아레스-6 올리베이트, 아라키딜알코올/베헤닐알코올/아라키딜 글루코사이드. 폴리프로필렌글라이콜-26-부테스-26/폴리에틸렌글라이콜-40 하이드로제네이티드 캐스터오일 등을 사용할 수 있다. 고급 알콜로는 탄소수가 12 내지 20인 알콜, 예컨대 세틸알코올, 스테아릴 알코올, 옥틸도데칸올, 이소스테아릴 알코올 등을 단독으로 또는 1종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.
수상 성분은 수상의 점도 또는 경도를 조절하기 위하여 카보머, 잔탄검, 벤토나이트, 마그네슘알루미늄실리케이트, 셀룰로오스검, 덱스트린 팔미테이트 등과 같은 1종 이상의 점증제를 0.001 내지 5 중량% 더 첨가할 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물에는 필요에 따라 고급 지방산, 비타민 등의 약효 성분과 자외선 차단제, 산화 방지제(부틸히드록시아니솔,갈릭산프로필, 엘리소르빈산, 토코페릴아세테이드, 부틸레이티드하이드록시톨루엔 등), 방부제(메칠파라벤, 부틸파라벤, 프로필파라벤, 페녹시에탄올, 이미다졸리디닐우레아, 클로르페네신 등), 착색제, pH 조절제(트리에탄올아민, 씨트릭애씨드, 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등), 보습제(글리세린, 솔비톨, 프로필렌 글라이콜, 부틸렌 글라이콜, 헥실렌 글라이콜, 디글리세린, 베타인, 글리세레스-26, 메칠글루세스-20 등), 윤활제 등의 성분을 더 첨가할 수 있다.
또한 본 발명의 화장료 조성물은 피부에 필수 영양소를 보조적으로 제공할 수 있는 물질을 추가로 포함하는데, 바람직하게는 천연향, 화장품향, 또는 한약재가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 보조제를 함유할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 안심하고 장기 사용이 가능하다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 강진향 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 손상된 피부에 투여하는 단계를 포함하는 상처치료 및 피부 재생 치료방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 용어, '치료'란, 조성물의 투여로 상기 상처나 피부 재생이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하는 것이다.
본 발명의 강진향 추출물 또는 이의 분획물을 이용한 치료 방법은 강진향 추출물 또는 이의 분획물을 손상된 피부에 투여하는 단계를 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 또한, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 상기 조성물을 투여하는 개체는 인간을 포함한 포유동물을 제한 없이 포함하나, 그 예로 소, 돼지, 말, 토끼, 쥐, 인간 일 수 있다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약제학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 목적하는 손상된 피부 조직에 도달할 수 있도록 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 강진향 추출물 또는 이의 분획물로부터 유래된 사티바논(sativanone), 메디카르핀(medicarpin), 달베르긴(dalbergin), 및 이소리퀴리티제닌(isoliquiritigenin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물을 손상된 피부에 투여하는 단계를 포함하는 상처치료 및 피부 재생 치료방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 조성물의 제조를 위한 강진향 추출물 또는 이의 분획물의 용도를 제공한다. 상기 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 피부 노화 억제 또한 피부 주름 개선용 약학적 조성물 또는 화장료 조성물임이 바람직하다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 조성물의 제조를 위한 강진향 추출물 또는 이의 분획물로부터 유래된 사티바논(sativanone), 메디카르핀(medicarpin), 달베르긴(dalbergin), 및 이소리퀴리티제닌(isoliquiritigenin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
본 발명은 강진향 추출물, 이의 분획물 또는 사티바논, 메디카르핀, 달베르긴, 및 이소리퀴리티제닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물은 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선 효과가 뛰어나고, 합성된 화합물이 아니라 천연물 유래의 추출물 또는 이의 분획물을 사용하므로 안전하고 독성, 부작용이 거의 없어 장기간 피부에 사용할 수 있는 장점이 있으므로, 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 약학적 조성물, 화장료 조성물 등으로 사용할 수 있다.
도 1은 강진향 메탄올추출물이 처리된 케라틴형성세포에서 발현되는 각 세포외기질 단백질의 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진이다.
도 2는 강진향 메탄올추출물이 처리된 케라틴형성세포에서 발현되는 각 세포외기질 단백질의 발현량을 정량한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 강진향 메탄올추출물이 처리된 피부섬유아세포에서 발현되는 각 세포외기질 단백질의 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진이다.
도 4는 강진향 메탄올추출물이 처리된 피부섬유아세포에서 발현되는 각 세포외기질 단백질의 발현량을 정량한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 케라틴형성세포에서 타입 I 및 III 콜라겐의 발현에 대한 강진향 메탄올추출물과 PPARδ siRNA의 효과를 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 6은 피부섬유아세포에서 타입 I 및 III 콜라겐의 발현에 대한 강진향 메탄올추출물과 PPARδ siRNA의 효과를 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 7은 강진향 메탄올추출물의 농도에 의한, PPARδ의 리간드 결합부위에 연결된 루시퍼라제의 활성변화를 나타내는 그래프이다.
도 8은 GW와 강진향 메탄올추출물이 처리된 케라틴형성세포에서 발현되는 타입 III 콜라겐을 나타내는 사진이다.
도 9는 GW와 강진향 에탄올추출물이 처리된 케라틴형성세포에서 발현되는 타입 III 콜라겐을 나타내는 사진이다.
도 10은 강진향 메탄올추출물이 처리된 케라틴형성세포의 시간의 경과에 따른 세포의 증식정도를 나타내는 그래프이다.
도 11은 강진향 메탄올추출물이 처리된 피부섬유아세포의 시간의 경과에 따른 세포의 증식정도를 나타내는 그래프이다.
도 12는 대조구 및 강진향 메탄올추출물과 UVB가 처리된 케라틴형성세포에서 활성화된 베타-갈락토시데이즈를 나타내는 현미경사진이다.
도 13은 상기 현미경사진에서 염색된 베타-갈락토시데이즈활성을 정량한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14는 대조구 및 각 실험군의 활성산소종의 생성정도를 나타내는 공초점현미경 사진이다.
도 15는 상기 공초점현미경사진에서 나타나는 형광값을 정량한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 16은 40% 강진향 에탄올추출물이 처리된 피부섬유아세포에서 발현되는 타입 I 콜라겐의 발현량을 정량한 결과를 나타내는 그래프와 타입 I 콜라겐의 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진이다.
도 17은 60% 강진향 에탄올추출물이 처리된 피부섬유아세포에서 발현되는 타입 I 콜라겐의 발현량을 정량한 결과를 나타내는 그래프와 타입 I 콜라겐의 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진이다.
도 18은 80% 강진향 에탄올추출물이 처리된 피부섬유아세포에서 발현되는 타입 I 콜라겐의 발현량을 정량한 결과를 나타내는 그래프와 타입 I 콜라겐의 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진이다.
도 19은 100% 강진향 에탄올추출물이 처리된 피부섬유아세포에서 발현되는 타입 I 콜라겐의 발현량을 정량한 결과를 나타내는 그래프와 타입 I 콜라겐의 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진이다.
도 20은 60% 강진향 에탄올추출물이 처리된 케라틴형성세포에서 발현되는 각 세포외기질 단백질의 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진과 각 세포외기질 단백질의 발현량을 정량한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 21은 60% 강진향 에탄올추출물이 처리된 피부섬유아세포에서 발현되는 각 세포외기질 단백질의 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진과 각 세포외기질 단백질의 발현량을 정량한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 22는 대조구 및 60% 강진향 에탄올추출물과 UVB가 처리된 케라틴형성세포에서 활성화된 베타-갈락토시데이즈를 나타내는 현미경사진이다.
도 23은 상기 현미경사진에서 염색된 베타-갈락토시데이즈활성을 정량한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 24는 대조구 및 각 실험군의 활성산소종의 생성정도를 나타내는 공초점현미경 사진이다.
도 25는 상기 공초점현미경사진에서 나타나는 형광값을 정량한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 26은 60% 강진향 에탄올추출물이 처리된 무모증 생쥐의 피부조직에서 발현되는 타입 I 콜라겐의 발현량을 정량한 결과를 나타내는 그래프와 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진이다.
도 27은 60% 강진향 에탄올추출물이 처리된 무모증 생쥐의 피부조직에서 발현되는 TGF-β1의 발현량을 정량한 결과를 나타내는 그래프와 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진이다.
도 28은 60% 강진향 에탄올추출물이 처리된 무모증 생쥐의 피부조직에서 발현되는 엘라스틴의 발현량을 정량한 결과를 나타내는 그래프와 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진이다.
도 29는 60% 강진향 에탄올추출물이 처리된 무모증 생쥐의 피부조직에서 발현되는 TIMP-1의 발현량을 정량한 결과를 나타내는 그래프와 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진이다.
도 30은 60% 강진향 에탄올추출물이 처리된 무모증 생쥐의 피부조직에서 발현되는 TIMP-2의 발현량을 정량한 결과를 나타내는 그래프와 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진이다.
도 31은 60% 강진향 에탄올추출물이 처리된 무모증 생쥐의 피부조직에서 발현되는 MMP-2의 발현량을 정량한 결과를 나타내는 그래프와 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진이다.
도 32는 TGF-β1, 타입 I 콜라겐, III 콜라겐 및 엘라스틴의 발현에 미치는 UVB조사와 60% 강진향 에탄올 추출물의 영향을 나타내는 사진이다.
도 33는 MMP-1, MMP-2, TIMP-1 및 TIMP-2의 발현에 미치는 UVB조사와 60% 강진향 에탄올 추출물의 영향을 나타내는 사진이다.
도 34는 무모증 생쥐의 피부조직에서 활성산소종의 생성에 미치는 UVB 조사와 60% 강진향 에탄올추출물의 영향을 DHE로 염색한 사진이다.
도 35는 무모증 생쥐의 피부조직에서 활성산소종의 생성에 미치는 UVB 조사와 60% 강진향 에탄올추출물의 영향을 나타내는 Massons trichrome 염색 사진이다.
도 36은 무모증 생쥐의 피부조직에서 UVB 조사와 60% 강진향 에탄올추출물의 영향을 나타내는 H&E 염색 사진이다.
도 37은 강진향 70% 메탄올 추출물 0.5mg/ml에 대한 HPLC 결과(상단)와 그러한 HPLC 결과 중 화살표로 표시한 화합물이 사티바논(sativanone)임을 확인하는 HPLC 결과(하단)를 도시한 것이다.
도 38은 강진향 70% 메탄올 추출물 0.5mg/ml에 대한 HPLC 결과(상단)와 그러한 HPLC 결과 중 화살표로 표시한 화합물이 메디카르핀(medicarpin)임을 확인하는 HPLC 결과(하단)를 도시한 것이다.
도 39는 강진향 70% 메탄올 추출물 0.5mg/ml에 대한 HPLC 결과(상단)와 그러한 HPLC 결과 중 화살표로 표시한 화합물이 달베르긴(dalbergin)임을 확인하는 HPLC 결과(하단)를 도시한 것이다.
도 40은 강진향 70% 메탄올 추출물 0.5mg/ml에 대한 HPLC 결과(상단)와 상기 HPLC 결과 중 화살표로 표시한 화합물이 이소리퀴리티제닌(isoliquiritigenin)임을 확인하는 HPLC 결과(하단)를 도시한 것이다.
도 41은 케라틴형성세포에 1μM 및 5μM으로 사티바논을 처리한 경우 타입 III 콜라겐 단백질 발현 정도를 나타낸 웨스턴 블럿 사진이다.
도 42는 케라틴형성세포에 1μM 및 5μM으로 달베르긴을 처리한 경우 타입 III 콜라겐 단백질 발현 정도를 나타낸 웨스턴 블럿 사진이다.
도 43은 케라틴형성세포에 5μM 및 10μM으로 이소리퀴리티제닌을 처리한 경우 타입 III 콜라겐 단백질 발현 정도를 나타낸 웨스턴 블럿 사진이다.
도 44는 케라틴형성세포에 1μM 및 5μM으로 메디카르핀을 처리한 경우 타입 III 콜라겐 단백질 발현 정도를 나타낸 웨스턴 블럿 사진이다.
도 45는 피부섬유아세포에 사티바논을 처리한 경우 타입 I 콜라겐 단백질의 발현 정도를 나타낸 웨스턴 블럿 사진이다.
도 46은 피부섬유아세포에 달베르긴을 처리한 경우 타입 I 콜라겐 단백질의 발현 정도를 나타낸 웨스턴 블럿 사진이다.
도 47은 피부섬유아세포에 이소리퀴리티제닌을 처리한 경우 타입 I 콜라겐 단백질의 발현 정도를 나타낸 웨스턴 블럿 사진이다.
도 48은 피부섬유아세포에 메디카르핀을 처리한 경우 타입 I 콜라겐 단백질의 발현 정도를 나타낸 웨스턴 블럿 사진이다.
도 49는 4종의 화합물(사티바논, 달베르긴, 이소리퀴리티제닌, 및 메디카르핀)과 UVB가 처리된 케라틴형성세포에서 활성화된 베타-갈락토시데이즈를 나타내는 현미경사진과 상기 현미경사진에서 염색된 베타-갈락토시데이즈활성을 정량한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 50은 대조구 및 각 실험군의 활성산소종의 생성정도를 나타내는 공초점현미경 사진과, 상기 공초점현미경사진에서 나타나는 형광값을 정량한 결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 강진향의 메탄올 추출물의 제조
건조 강진향 100g을 1000㎖의 70% 메탄올에 가하고, 25℃에서 120rpm으로 1시간동안 교반한 다음, 진공여과하여 액상성분과 고형성분을 각각 수득하였다. 상기 수득한 고형성분을 다시 1000㎖의 70% 메탄올에 가하고, 교반 및 진공여과의 방법을 2회 반복 수행하여, 각각의 액상성분을 수득한 다음, 이를 취합하고, 감압농축 및 동결건조방법에 적용하여 강진향 메탄올 조추출물 10.12g을 제조하였다.
실시예 2: 케라틴형성세포 및 피부섬유아세포에서 세포외 기질 단백질의 발현에 미치는 강진향 메탄올추출물의 영향
상기 제조된 강진향 메탄올추출물이 케라틴형성세포와 피부섬유아세포에서의 세포외기질 단백질의 발현에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
먼저, 상기 추출물이 케라틴형성세포에서의 세포외기질 단백질의 발현에 미치는 영향을 확인하고자, 케라틴형성세포 성장 보충제를 포함하는 케라틴형성세포 성장 배지(Keratinocyte Growth Medium)에서 37℃, 5% CO2의 대기 조건하에서 배양된 사람의 케라틴형성세포(Welskin, Seoul, Korea)에 상기 강진향 메탄올추출물을 1㎍/㎖의 농도로 가하고, 38시간 동안 추가로 배양한 다음, 웨스턴 블럿 방법을 이용하여 상기 배양된 케라틴형성세포에서 발현되는 세포외기질 단백질인 타입 I 콜라겐, 타입 III 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴 및 TGF-β1의 함량을 측정하였다(참조: 도 1 및 2). 이때, 내부표준물질로서는 β-액틴을 사용하였다.
도 1은 강진향 메탄올추출물이 처리된 케라틴형성세포에서 발현되는 각 세포외기질 단백질의 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진이고, 도 2는 강진향 메탄올추출물이 처리된 케라틴형성세포에서 발현되는 각 세포외기질 단백질의 발현량을 정량한 결과를 나타내는 그래프이다. 상기 도 1 및 2에서 보듯이, 사람의 케라틴형성세포에서는 강진향의 메탄올추출물에 의하여 다양한 세포외기질 단백질(타입 I 콜라겐, 타입 III 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴 및 TGF-β1)의 단백질 발현이 현저하게 증가함을 알 수 있었다.
한편, 상기 추출물이 피부섬유아세포에서의 세포외기질 단백질의 발현에 미치는 영향을 확인하고자, 케라틴형성세포 대신에, 10% 우태아혈청, 100U/㎖ 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에서 37℃, 5% CO2의 대기 조건하에서 배양된 사람의 피부섬유아세포(Welskin, Seoul, Korea)를 사용하는 것을 제외하고는, 상술한 방법과 동일한 방법을 이용하여, 상기 배양된 피부섬유아세포에서 발현되는 세포외기질 단백질인 타입 I 콜라겐, 타입 III 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴 및 TGF-β1의 함량을 측정하였다(참조: 도 3 및 4).
도 3은 강진향 메탄올추출물이 처리된 피부섬유아세포에서 발현되는 각 세포외기질 단백질의 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진이고, 도 4는 강진향 메탄올추출물이 처리된 피부섬유아세포에서 발현되는 각 세포외기질 단백질의 발현량을 정량한 결과를 나타내는 그래프이다. 상기 도 3 및 4에서 보듯이, 사람의 피부섬유아세포에서도 강진향의 메탄올추출물에 의하여 다양한 세포외기질 단백질(타입 I 콜라겐, 타입 III 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴 및 TGF-β1)의 단백질 발현이 현저하게 증가함을 알 수 있었다.
실시예 3: 케라틴형성세포 및 피부섬유아세포에서 세포외 기질 단백질의 발현에 미치는 전사인자 및 강진향 메탄올추출물의 영향
상기 실시예의 결과로부터, 강진향 메탄올추출물이 케라틴형성세포와 피부섬유아세포에서의 세포외기질 단백질의 발현을 현저하기 증가시킴을 확인하였으므로, 상기 세포외기질 단백질 중 타입 I 및 III 콜라겐의 발현에 직접적으로 영향을 미치는 전사인자인 PPARδ의 활성화에 강진향 메탄올추출물이 미치는 영향을 확인하기 위하여 PPARδ의 발현을 억제(knock-down)하는 siRNA를 사용하여 분석하였다.
케라틴형성세포와 피부섬유아세포를 각각 100mm 배양 디쉬에 접종하고 24시간 동안 배양한 다음, PPARδ siRNA가 도입되지 않고 강진향 메탄올추출물이 처리되지도 않은 대조군, PPARδ siRNA(Ambion, Austin, TX)가 도입되지 않고 강진향 메탄올추출물이 처리된 실험군 11, PPARδ siRNA가 도입되고 강진향 메탄올추출물이 처리된 실험군 12, 및 PPARδ siRNA가 도입되고 강진향 메탄올추출물이 처리되지 않은 실험군 13을 각각 설정하고, 상기 각 대조군 및 실험군의 세포에서 발현되는 타입 I 및 III 콜라겐의 발현량을 웨스턴 블럿 방법에 의하여 비교하였다(참조: 도 5 및 6). 이때, PPARδ siRNA의 도입은 무혈청 배지에서 Welfect-Q(WelGENE, Daegu, Korea)를 이용하여 PPARδ siRNA(Ambion, Austin, TX, USA)를 상기 배양된 각 세포에 도입시키고 6시간 동안 배양하여 수행하였고; 강진향 메탄올추출물의 처리는 상기 배양된 각 세포에 강진향 메탄올추출물을 1㎍/㎖의 농도로 가하고 38시간동안 다시 배양하여 수행하였으며; 내부표준물질로서는 β-액틴을 사용하였다.
도 5는 케라틴형성세포에서 타입 I 및 III 콜라겐의 발현에 대한 강진향 메탄올추출물과 PPARδ siRNA의 효과를 나타내는 사진 및 그래프이고, 도 6은 피부섬유아세포에서 타입 I 및 III 콜라겐의 발현에 대한 강진향 메탄올추출물과 PPARδ siRNA의 효과를 나타내는 사진 및 그래프이다. 도 5 및 6에서 보듯이, 강진향 메탄올추출물 처리에 의해 발현이 유도된 타입 I 및 III 콜라겐의 발현이 PPARδ siRNA의 존재하에서 억제됨을 확인하였으므로, 강진향 메탄올추출물의 성분이 전사인자인 PPARδ을 활성화시켜서 케라티노사이트 및 피부 섬유아세포에서 콜라겐과 같은 세포외 기질 단백질의 발현을 유도함을 알 수 있었다.
실시예 4: 전사인자 PPARδ의 활성화에 미치는 강진향 메탄올추출물의 영향
상기 실시예의 결과로부터, 강진향 메탄올추출물에 의한 케라틴형성세포와 피부섬유아세포에서의 세포외기질 단백질의 발현에 전사인자인 PPARδ의 활성화가 관여됨을 확인하였으므로, 상기 강진향 메탄올추출물이 전사인자인 PPARδ의 활성화를 조절할 수 있는지의 여부를 확인하고자 하였다.
구체적으로, PPARδ 리간드 결합 부위와 Gal4-DNA 결합 부위가 결합된 키메라 플라스미드와 Gal4-DNA 결합 부위를 인식하는 배열인 UAS가 루시퍼라제에 연결되어 있는[(UAS × 3)-tk-루시퍼라제]플라스미드 및 pSV β-Gal(SV40 β-galactosidase expression vector, Promega, Madison, WI)를 동시에 CHO 세포에 SuperFect 제제 (Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 도입시킴으로써, 형질전환체를 작제하였다. 그런 다음, 상기 형질전환체에 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1 또는 5㎍/㎖의 농도로 강진향 메탄올추출물 또는 50nM의 PPARδ리간드로써 알려진 GW501516(GW)(Oliver WR Jr etal., A selective peroxisome proliferator-activated receptor delta agonist promotes reverse cholesterol transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001, 98(9):5306-5311)을 가하여 배양한 다음, 배양된 각 세포를 루시퍼라제 리포터 용해 완충액으로 용해시키고, 루시퍼레이즈 분석 시스템(Promega Co., Madison, WI)에 적용하여 루시퍼라제 활성을 측정함으로써 PPARδ의 리간드에 의한 활성화능을 측정하였다(참조: 도 7).
도 7은 강진향 메탄올추출물의 농도에 의한, PPARδ의 리간드 결합부위에 연결된 루시퍼라제의 활성변화를 나타내는 그래프이다. 도 7에서 보듯이, 0.25㎍/㎖의 강진향 메탄올추출물을 처리한 경우부터 루시퍼라제 활성이 유의하게 증가하기 시작하여 5㎍/㎖까지 지속적으로 증가함을 확인하였다. 또한, PPARδ리간드로써 알려진 GW를 처리한 경우에도, 1㎍/㎖의 강진향 메탄올추출물을 처리한 것과 유사한 수준의 루시퍼라제 활성이 나타남을 확인하였으므로, 강진향 메탄올추출물에 PPARδ을 활성화할 수 있는 리간드 성분이 포함되어 있음을 알 수 있었다.
실시예 5: 전사인자 PPARδ의 활성화를 통한 세포외 기질 단백질의 발현에 미치는 강진향 메탄올추출물 및 강진향 에탄올추출물의 영향
상기 실시예의 결과로부터, 강진향 메탄올추출물에 PPARδ을 활성화할 수 있는 리간드 성분이 포함되어 있음을 확인하였으므로, 상기 리단드 성분이 강진향의 에탄올추출물에도 포함되어 있는지의 여부를 확인하고자 하였다.
먼저, 강진향 메탄올추출물과 강진향 에탄올추출물을 준비하였다. 이때. 강진향 에탄올추출물은 70% 메탄올 대신에 60% 에탄올을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
다음으로, 상기 준비된 각각 1, 5 또는 10㎍/㎖의 강진향 메탄올추출물, 강진향 에탄올추출물 또는 50nM의 GW를 각각 케라틴형성세포에 가하고, 38시간동안 배양한 다음, 웨스턴 블럿방법을 이용하여, 각 세포에서 발현되는 타입 III 콜라겐을 검출하였다(참조: 도 8 및 9). 이때, 대조군으로는 강진향 메탄올추출물, 강진향 에탄올추출물 및 GW가 전혀 처리되지 않은 세포를 사용하였고, 내부표준물질로서는 β-actin을 사용하였다.
도 8은 GW와 강진향 메탄올추출물이 처리된 케라틴형성세포에서 발현되는 타입 III 콜라겐을 나타내는 사진이고 도 9는 GW와 강진향 에탄올추출물이 처리된 케라틴형성세포에서 발현되는 타입 III 콜라겐을 나타내는 사진이다. 도 8 및 9에서 보듯이, 강진향의 메탄올 및 에탄올의 유기용매추출물 모두에서 타입 III 콜라겐의 단백질발현이 유도되며, 이는 PPARδ 리간드인 GW501516 (GW)에 의한 타입 III 콜라겐의 발현유도와 유사한 수준이므로, 강진향의 유기용매추출물이 PPARδ을 활성화시켜 콜라겐과 같은 세포외 기질의 발현을 조절하고 있음을 알 수 있었다.
실시예 6: 케라틴형성세포 및 피부섬유아세포의 증식능에 미치는 강진향 메탄올추출물의 영향
상기 제조된 강진향 메탄올추출물이 케라틴형성세포와 피부섬유아세포의 증식에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
구체적으로, 24-well 배양 디쉬에 1× 104 cells/well 밀도로 접종된 케라틴형성세포와 피부섬유아세포를 24시간 동안 배양한 후, 1㎍/㎖의 강진향 메탄올추출물 또는 대조구(Vehicle)를 처리하고 배양하면서, 각각 0, 6, 12, 24, 38 또는 48시간에 100㎕의 배양물을 시료로서 분취하였다. 그런 다음, 분취된 100㎕의 배양물을 100㎕의 0.4% 트립판 블루 염료(Sigma, Korea)와 혼합하고, 살아있는 세포 즉, 트립판 블루가 차단된 생세포만을 Neubauer chamber(MARIENFELD, Germany)를 사용하여 계수하였다(참조: 도 10 및 11).
도 10은 강진향 메탄올추출물이 처리된 케라틴형성세포의 시간의 경과에 따른 세포의 증식정도를 나타내는 그래프이다. 도 10에서 보듯이, 케라틴형성세포는 강진향 메탄올추출물을 처리하고 12시간이 경과한 시점부터 세포가 유의하게 증식함을 확인할 수 있었다.
또한, 도 11은 강진향 메탄올추출물이 처리된 피부섬유아세포의 시간의 경과에 따른 세포의 증식정도를 나타내는 그래프이다. 도 11에서 보듯이, 피부섬유아세포는 강진향 메탄올추출물을 처리하고 6시간이 경과한 시점부터 세포가 유의하게 증식함을 확인할 수 있었다.
실시예 7: UVB 조사에 의해 유도된 케라틴형성세포의 노화에 미치는 강진향 메탄올추출물의 영향
상기 제조된 강진향 메탄올추출물이 UVB 조사에 의해 유도된 케라틴형성세포의 노화에 미치는 영향을 확인하고자, 세포노화의 중요 지표인 베타-갈락토시데이즈 활성을 측정하여 분석하였다.
구체적으로, 6 cm 배양 디쉬에 2× 105 cells 밀도로 접종된 케라틴형성세포를 38시간동안 배양하고, 상기 강진향 메탄올추출물을 각각 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1 또는 5㎍/㎖의 농도로 가한 후에, UVB(40 mJ/cm2)를 조사하고, 다시 24시간 동안 배양하였다. 상기 각 배양된 케라틴형성세포를 PBS로 세척하고 고정액(2% formaldehyde, 0.2% glutaraldehyde)을 가하여 7분 동안 고정하였으며, 상기 고정액을 제거하고, 다시 PBS로 3번 세척한 다음, 염색 혼합물(10× Staining solution, Reagent B, Reagent C, X-gal solution)과 이산화탄소가 제거된 상태의 37℃ 암실에서 17시간 동안 반응시키고, 베타-갈락토시데이즈의 활성을 측정하는 키트(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 상기 각 세포에서 베타-갈락토시데이즈 활성을 측정하였다(참조: 도 12 및 13). 이때, 대조구로서 UVB 및 강진향 메탄올추출물이 처리되지 않은 케라틴형성세포를 사용하였다.
도 12는 대조구 및 강진향 메탄올추출물과 UVB가 처리된 케라틴형성세포에서 활성화된 베타-갈락토시데이즈를 나타내는 현미경사진이고, 도 13은 상기 현미경사진에서 염색된 베타-갈락토시데이즈를 정량한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 12 및 13에서 보듯이, UVB조사에 의한 베타-갈락토시데이즈 활성의 유의한 증가가, 강진향 메탄올추출물 처리에 의해 농도의존적으로 유의하게 억제됨을 확인할 수 있었다.
실시예 8: UVB 조사에 의해 유도된 케라틴형성세포에서의 활성산소종의 생성에 미치는 강진향 메탄올추출물의 영향
UVB에 의해 발생되는 활성산소종(Reactive oxygen species, ROS)은 세포를 서서히 파괴시켜 노화를 진행시킨다. 상기 제조된 강진향 메탄올추출물이 UVB 조사에 의해 유도된 케라틴형성세포에서 ROS의 생성에 미치는 영향을 확인하고자, 과산화수소에 특이적으로 반응하는 색소인 H2DCF-DA(2',7'-dichlorofluorescein diacetate)을 사용하여 Confocal laser scanning microscopy로 측정하여 분석하였다.
구체적으로, 6 cm 배양 디쉬에 2× 105 cells 밀도로 접종된 케라틴형성세포에, 상기 강진향 메탄올추출물과 UVB를 처리하지 않은 대조군, 상기 세포에 UVB(40 mJ/cm2)를 조사하고, 다시 30분 동안 배양한 실험군 1, 상기 세포에 강진향 메탄올추출물을 1㎍/㎖의 농도로 가하고 38시간동안 배양한 다음, UVB(40 mJ/cm2)를 조사하고, 다시 30분 동안 배양한 실험군 2 및 상기 세포에 강진향 메탄올추출물을 1㎍/㎖의 농도로 가하고 38시간동안 배양한 실험군 3을 각각 설정하였다. 그런 다음, 상기 각 대조군 및 실험군의 세포를 10 μM H2DCF-DA(DCF-DA, Calbiochem, San Diego, CA)로 처리하고, 다시 30분 동안 배양한 후, 차가운 PBS로 2번 세척하였으며, 공초점현미경(Confocal laser scanning microscope, Model 1X70, Olympus, Japan)으로 촬영하고, 공초점현미경상에서 촬영된 형광값을 정량하였다(참조: 도 14 및 15).
도 14는 대조구 및 각 실험군의 활성산소종의 생성정도를 나타내는 공초점현미경 사진이고, 도 15는 상기 공초점현미경사진에서 나타나는 형광값을 정량한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 14 및 15에서 보듯이, UVB (40 mL/cm2)조사 후에 케라틴형성세포에서 ROS의 생성이 유의하게 증가하였으나, 강진향 메탄올추출물을 처리한 경우 UVB조사에 의하여 유도된 ROS의 생성이 현저하게 억제됨을 확인하였으므로, 강진향 메탄올추출물은 세포내에서 UVB조사에 의해 유도된 활성산소종의 생성을 저해함으로써 세포노화를 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 9: 피부섬유아세포에서 세포외 기질 단백질의 발현에 미치는 강진향 에탄올추출물의 영향
먼저, 70% 메탄올 대신에 40, 60, 80 또는 100% 에탄올을 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 40, 60, 80 또는 100% 강진향 에탄올추출물을 각각 제조하였다.
그런 다음, 배양된 피부섬유아세포에 40, 60, 80 또는 100% 강진향 에탄올추출물을 각각 0, 0.1, 0.5, 1, 5 또는 10㎍/㎖의 농도로 처리하고, 38시간 동안 배양한 다음, 웨스턴 블럿방법을 이용하여, 각 세포에서 발현되는 타입 I 콜라겐을 검출하였다(참조: 도 16 내지 19). 이때, 내부표준물질로서는 β-actin을 사용하였다.
도 16은 40% 강진향 에탄올추출물이 처리된 피부섬유아세포에서 발현되는 타입 I 콜라겐의 발현량을 정량한 결과를 나타내는 그래프와 타입 I 콜라겐의 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진이고, 도 17은 60% 강진향 에탄올추출물이 처리된 피부섬유아세포에서 발현되는 타입 I 콜라겐의 발현량을 정량한 결과를 나타내는 그래프와 타입 I 콜라겐의 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진이며, 도 18은 80% 강진향 에탄올추출물이 처리된 피부섬유아세포에서 발현되는 타입 I 콜라겐의 발현량을 정량한 결과를 나타내는 그래프와 타입 I 콜라겐의 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진이고, 도 19은 100% 강진향 에탄올추출물이 처리된 피부섬유아세포에서 발현되는 타입 I 콜라겐의 발현량을 정량한 결과를 나타내는 그래프와 타입 I 콜라겐의 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진이다. 도 16 내지 19에서 보듯이, 타입 I 콜라겐의 발현량이 강진향 에탄올추출물의 농도 의존적으로 증가하였고, 모든 에탄올 추출물이 5 및 10㎍/㎖의 농도로 처리될 경우, 가장 높은 수준으로 타입 I 콜라겐이 발현됨을 확인하였다.
실시예 10: 케라틴형성세포 및 피부섬유아세포에서 세포외 기질 단백질의 발현에 미치는 60% 강진향 에탄올추출물의 영향
상기 제조된 60% 강진향 에탄올추출물이 케라틴형성세포와 피부섬유아세포에서의 세포외기질 단백질의 발현에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
배양된 케라틴형성세포와 피부섬유아세포에 상기 60% 강진향 에탄올추출물을 5㎍/㎖의 농도로 가하고, 38시간 동안 추가로 배양한 다음, 웨스턴 블럿 방법을 이용하여 상기 배양된 케라틴형성세포에서 발현되는 세포외기질 단백질인 타입 I 콜라겐, 엘라스틴 및 TGF-β1의 함량을 측정하였다(참조: 도 20 및 21). 이때, 내부표준물질로서는 β-액틴을 사용하였다.
도 20은 60% 강진향 에탄올추출물이 처리된 케라틴형성세포에서 발현되는 각 세포외기질 단백질의 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진과 각 세포외기질 단백질의 발현량을 정량한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 21은 60% 강진향 에탄올추출물이 처리된 피부섬유아세포에서 발현되는 각 세포외기질 단백질의 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진과 각 세포외기질 단백질의 발현량을 정량한 결과를 나타내는 그래프이다. 상기 도 20 및 21에서 보듯이, 60% 강진향 에탄올추출물에 의해 타입 I 콜라겐 및 TGF-β1의 단백질 발현이 현저하게 증가함을 확인하였다.
실시예 11: UVB 조사에 의해 유도된 케라틴형성세포의 노화에 미치는 60% 강진향 에탄올추출물의 영향
상기 제조된 60% 강진향 에탄올추출물이 UVB 조사에 의해 유도된 케라틴형성세포의 노화에 미치는 영향을 확인하고자, 세포노화의 중요 지표인 베타-갈락토시데이즈 활성을 측정하여 분석하였다.
구체적으로, 강진향 메탄올추출물 대신에 60% 강진향 에탄올추출물을 0, 0.1, 0.5, 1, 5 또는 10㎍/㎖의 농도로 처리하는 것을 제외하고는, 실시예 7과 동일한 방법을 수행하여, 케라틴형성세포에서 베타-갈락토시데이즈 활성을 측정하였다(참조: 도 22 및 23).
도 22는 대조구 및 60% 강진향 에탄올추출물과 UVB가 처리된 케라틴형성세포에서 활성화된 베타-갈락토시데이즈를 나타내는 현미경사진이고, 도 23은 상기 현미경사진에서 염색된 베타-갈락토시데이즈를 정량한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 22 및 23에서 보듯이, UVB조사에 의한 베타-갈락토시데이즈 활성의 유의한 증가가, 60% 강진향 에탄올추출물 처리에 의해 농도 의존적으로 유의하게 억제됨을 확인하였다.
실시예 12: UVB 조사에 의해 유도된 케라틴형성세포에서의 활성산소종의 생성에 미치는 60% 강진향 에탄올추출물의 영향
상기 제조된 강진향 메탄올추출물이 UVB 조사에 의해 유도된 케라틴형성세포에서 ROS의 생성에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
구체적으로, 강진향 메탄올추출물 대신에 60% 강진향 에탄올추출물을 5㎍/㎖의 농도로 처리하는 것을 제외하고는, 실시예 8과 동일한 방법을 수행하여, 케라틴형성세포에서 ROS의 생성정도를 확인하였다(참조: 도 24 및 25).
도 24는 대조구 및 각 실험군의 활성산소종의 생성정도를 나타내는 공초점현미경 사진이고, 도 25는 상기 공초점현미경사진에서 나타나는 형광값을 정량한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 24 및 25에서 보듯이, UVB조사 후에 케라틴형성세포에서 ROS의 생성이 유의하게 증가하였으나, 60% 강진향 에탄올추출물을 처리한 경우 UVB조사에 의하여 유도된 ROS의 생성이 현저하게 억제됨을 확인하였으므로, 60% 강진향 에탄올추출물은 세포내에서 UVB조사에 의해 유도된 활성산소종의 생성을 저해함으로써 세포노화를 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 13: 무모증 생쥐의 피부조직에서 세포외 기질 단백질의 발현에 미치는 60% 강진향 에탄올추출물의 영향
실시예 13-1: 웨스턴 블럿 방법을 이용하여 60% 강진향 에탄올추출물이 무모증 생쥐의 피부조직에서 세포외 기질 단백질의 발현에 미치는 영향 확인
무모증 생쥐의 등에 60% 에탄올추출물 5㎍/㎖을 cm2당 0.25 ml씩 도포하여 24 시간 후에 다시 60% 에탄올추출물을 5㎍/㎖을 동일한 방법으로 도포한 다음 30분 후에 UVB(100 mJ/cm2)를 조사하였다.
24시간 후에 생쥐를 sacrify하여 피부조직에서의 세포외기질 관련 단백질인 타입 I 콜라겐 (A), TGF-β1 (B), 엘라스틴 (C), Tissue Inhibitor of metalloproteinase (TIMP)-1 (D) 과 2 (E), 및 Matrix metalloproteinase (MMP)-2 (F)의 발현에 미치는 영향을 분석하였다(참조: 도 26 내지 31). 이때, 내부표준물질로서는 β-actin을 사용하였다.
도 26은 60% 강진향 에탄올추출물이 처리된 무모증 생쥐의 피부조직에서 발현되는 타입 I 콜라겐의 발현량을 정량한 결과를 나타내는 그래프와 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진이고, 도 27은 60% 강진향 에탄올추출물이 처리된 무모증 생쥐의 피부조직에서 발현되는 TGF-β1의 발현량을 정량한 결과를 나타내는 그래프와 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진이며, 도 28은 60% 강진향 에탄올추출물이 처리된 무모증 생쥐의 피부조직에서 발현되는 엘라스틴의 발현량을 정량한 결과를 나타내는 그래프와 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진이고, 도 29는 60% 강진향 에탄올추출물이 처리된 무모증 생쥐의 피부조직에서 발현되는 TIMP-1의 발현량을 정량한 결과를 나타내는 그래프와 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진이며, 도 30은 60% 강진향 에탄올추출물이 처리된 무모증 생쥐의 피부조직에서 발현되는 TIMP-2의 발현량을 정량한 결과를 나타내는 그래프와 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진이고, 도 31은 60% 강진향 에탄올추출물이 처리된 무모증 생쥐의 피부조직에서 발현되는 MMP-2의 발현량을 정량한 결과를 나타내는 그래프와 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 사진이다. 도 26 내지 31에서 보듯이, UVB에 의해 억제된 타입 I 콜라겐, 엘라스틴 및 TGF-β1단백질 발현이 60% 에탄올추출물을 처리한 그룹에서 다시 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 세포외기질을 분해하는 효소로 잘 알려진 MMP-2의 경우 UVB에 의해 약간 증가되었던 발현이 60% 에탄올추출물에 의해 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, MMP활성을 억제하는 생체내 저해제로 알려진 TIMP의 경우 타입 1, 2 모두가 UVB에 의해서 억제되었던 발현이 60% 강진향 에탄올 추출물에 의해 발현이 증가함을 확인하였다.
실시예 13-2: 면역조직화학적 분석방법을 이용하여 60% 강진향 에탄올추출물이 무모증 생쥐의 피부조직에서 세포외 기질 단백질의 발현에 미치는 영향 확인
면역조직화학적 방법을 이용하여, TGF-β1, 타입 I 및 III 콜라겐, 엘라스틴, MMP-1, MMP-2, TIMP-1 및 TIMP-2의 피부조직에서의 발현을 분석하였다.
구체적으로, 무모증 생쥐의 등에 에탄올추출물을 도포하지 않고 UVB(100 mJ/cm2)를 조사한 대조군과 무모증 생쥐의 등에 60% 에탄올추출물 5㎍/㎖을 cm2당 0.25 ml씩 도포하여 24 시간 후에 다시 60% 에탄올추출물을 5㎍/㎖을 동일한 방법으로 도포한 다음 30분 후에 UVB(100 mJ/cm2)를 조사한 실험군으로부터 각각의 피부조직을 수득하였다. 이어, 상기 수득한 각 피부조직을 4% 파라포름알데하이드로 고정하고, OCT용액에 침지하였으며, 액체질소에서 급속냉동하여 연속으로 10μm 두께의 조직냉동절편을 준비하였다. 상기 냉동절편을 젤라틴이 코팅된 슬라이드 글라스의 표면에 고정시키고, 10mM Sodium Citrate용액에 침지시킨 다음, 3분간 가열하였다. 가열된 각 조직절편을 상온에서 1% BSA을 포함하는 0.1 M TBS로 blocking시키고, TGF-β1, 타입 I 및 III 콜라겐, 엘라스틴, MMP-1, MMP-2, TIMP-1 및 TIMP-2에 대한 각각의 항체를 가한 다음, 4 oC에서 하룻밤동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 상기 각 조직절편을 3번 PBS로 세척하고, Alexa Flour 594가 결합된 2차항체를 사용하여 붉은색형광을 형광현미경하에서 관찰하였다(참조: 도 32 및 도 33).
도 32는 TGF-β1, 타입 I 콜라겐, III 콜라겐 및 엘라스틴의 발현에 미치는 UVB조사와 60% 강진향 에탄올 추출물의 영향을 나타내는 사진이고, 도 33는 MMP-1, MMP-2, TIMP-1 및 TIMP-2의 발현에 미치는 UVB조사와 60% 강진향 에탄올 추출물의 영향을 나타내는 사진이다. 도 32 및 도 33에서 보듯이, 상기 실시예 13-1에 개시된 결과와 유사하게 면역조직화학적인 분석에 의해서도 UVB조사에 의해 감소되었던 TGF-β1, 타입 I 및 III 콜라겐, TIMP-1의 발현이 60% 강진향 에탄올 추출물에 의해 증가함을 확인할 수 있었고, 반대로 UVB조사에 의해 증가된 MMP-과 2는 60% 강진향 에탄올 추출물에 의해 감소되었으나, 엘라스틴 및 TIMP-2의 발현에는 60% 강진향 에탄올 추출물처리가 영향을 주지 않음을 확인하였다.
실시예 14: 60% 강진향 에탄올추출물의 생쥐 피부조직에서 활성산소종 생성 및 세포외기질합성 조절효과 분석
실시예 14-1: DHE(dihydroethidium) 염색법을 이용한 60% 강진향 에탄올추출물의 생쥐 피부조직에서 활성산소종 생성 조절효과 분석
무모증 생쥐의 등에 60% 강진향 에탄올추출물 5 mg/ml을 cm2당 0.25 ml씩 도포하여 24 시간 후에 다시 60% 에탄올추출물을 5 mg/ml을 동일한 방법으로 도포하였다. 30분 후에 UVB 100 mJ/cm2을 조사하였다. 24시간 후에 상기 무모증 생쥐로부터 얻어진 피부조직에서의 활성산소종 생성에 미치는 영향을 조직세포내에서 생성된 superoxide의 생성을 측정하기 위하여 형광물질인 DHE(dihydroethidium)를 이용하여 분석하였다.
즉, 상기 얻어진 피부조직의 절편을 PBS로 세척하고, 5-10μM의 DHE를 포함하는 PBS용액에 침지한 다음, 37oC에서 30분간 암소에서 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 조직내에서 생성된 superoxide와 DHE가 반응하여 생성된 붉은색 형광을 형광현미경하에서 관찰하고 정량하였다(참조: 도 34).
도 34는 무모증 생쥐의 피부조직에서 활성산소종의 생성에 미치는 UVB 조사와 60% 강진향 에탄올추출물의 영향을 나타내는 DHE 염색 사진이다. 도 34에서 보듯이, UVB조사에 의한 활성산소종의 생성증가가 60% 강진향 에탄올추출물에 의해 억제됨을 확인할 수 있었다
실시예 14-2: Masson’s trichrome 염색법을 이용한 60% 강진향 에탄올추출물의 생쥐 피부조직에서 세포외기질합성 조절효과 분석
무모증 생쥐의 등에 60% 강진향 에탄올추출물 5 mg/ml을 cm2당 0.25 ml씩 도포하여 24 시간 후에 다시 60% 에탄올추출물을 5 mg/ml을 동일한 방법으로 도포하였다. 30분 후에 UVB 100 mJ/cm2을 조사하였다. 24시간 후에 상기 무모증 생쥐로부터 얻어진 피부조직에서의 세포외기질의 합성에 미치는 영향을 조직세포내에서 합성된 콜라겐과 같은 세포외기질을 염색하는 방법인 Masson’s trichrome 염색법를 이용하여 분석하였다.
즉, 상기 피부조직의 절편을 증류수로 세척하고, hematoxylin 용액에 10분 동안 침지하여 1차 염색하였다. 그런 다음, 가온된 증류수을 사용하여 상기 1차 염색된 피부조직 절편을 10분 동안 세척하고, Biebrich sacrlet-acid fuchsin 용액에 10-15분 동안 침지하여 2차 염색하였다. 상기 2차 염색된 피부조직절편을 증류수로 세척하고, phosphomolybdic-phosphotungstic acid 용액에 10-15분간 침지시킨 다음, 바로 aniline blue 용액에 침지하여 5-10분 동안 3차 염색하였다. 이어, 상기 3차 염색된 피부조직 절편을 증류수로 세척하고, 1% acetic acid 용액에 침지하여 2-5분간 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 상기 피부조직 절편을 증류수로 세척하고, 95% ethyl alcohol을 가하여 빠르게 탈수시킨 다음, xylene 용액으로 고정하여 염색된 조직을 현미경하에서 관찰하였다(참조: 도 35).
도 35는 무모증 생쥐의 피부조직에서 세포외기질합성에 미치는 UVB 조사와 60% 강진향 에탄올추출물의 영향을 나타내는 Masson’s trichrome 염색 사진이다. 도 35에서 보듯이, UVB에 의해 억제된 세포외기질의 발현이 60% 강진향 에탄올추출물을 처리한 그룹에서 다시 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 14-3: HE 염색법을 이용한 60% 강진향 에탄올추출물의 생쥐 피부조직의 변이 여부 확인
무모증 생쥐의 등에 60% 강진향 에탄올추출물 5 mg/ml을 cm2당 0.25 ml씩 도포하여 24 시간 후에 다시 60% 에탄올추출물을 5 mg/ml을 동일한 방법으로 도포하였다. 30분 후에 UVB 100 mJ/cm2을 조사하였다. 24시간 후에 상기 무모증 생쥐로부터 얻어진 피부조직의 핵과 세포질을 hematoxylin과 eosin을 이용하여 염색하고, 현미경으로 관찰하였다(참조: 도 36).
도 36은 무모증 생쥐의 피부조직에서 활성산소종의 생성에 미치는 UVB 조사와 60% 강진향 에탄올추출물의 영향을 나타내는 HE 염색 사진이다. 도 36에서 보듯이, UVB 100 mJ/cm2을 조사하여도 60% 강진향 에탄올추출물 처리군은 형태학적으로 피부 고유의 형태유지가 가능하였다.
실시예 15: 강진향 메탄올추출물의 성분 분석
강진향 메탄올추출물의 HPLC 분석을 위해, 상기 강진향 메탄올추출물과 4가지 표준 화합물(메디카르핀(medicarpin), 달베르긴(dalbergin), 및 이소리퀴리티제닌(isoliquiritigenin))(ChromaDex, Irvine, CA, USA)을 100% 메탄올에 용해시키고 0.45 μm 실린지 필터(syringe filter)를 통해 필터링하였고 그 필터액을 (20 ㎕) 분석기 안에 주입하였다. 컬럼은 C18 (250mm X 4.6mm, 5μm)이고, 유동상은 아세토나이트릴 (용매 A) 및 0.3% 아세트산 (용매 B)이었다. Gradient system은 다음과 같다: 0-18 분, 25% A : 75% B; 18-55 분, 25-46% A : 75-54% B; 55-60 분, 46-80% A : 54-20% B; 60-70 분, wash. 크로마토그래피는 0.8 mL/min의 유속율로 시행하였다. UV detector는 275 nm에 고정하였다. 추출물은 회귀방정식(regression equations)의 R2 값이 0.990 이상이 된 후에 HPLC로 분석하였다(도 37 내지 40).
도 37은 강진향 70% 메탄올 추출물 0.5mg/ml에 대한 HPLC 결과(상단)와 그러한 HPLC 결과 중 화살표로 표시한 화합물이 사티바논(sativanone)임을 확인하는 HPLC 결과(하단)를 도시한 것이고, 도 38은 강진향 70% 메탄올 추출물 0.5mg/ml에 대한 HPLC 결과(상단)와 그러한 HPLC 결과 중 화살표로 표시한 화합물이 메디카르핀(medicarpin)임을 확인하는 HPLC 결과(하단)를 도시한 것이며, 도 39는 강진향 70% 메탄올 추출물 0.5mg/ml에 대한 HPLC 결과(상단)와 그러한 HPLC 결과 중 화살표로 표시한 화합물이 달베르긴(dalbergin)임을 확인하는 HPLC 결과(하단)를 도시한 것이고, 도 40은 강진향 70% 메탄올 추출물 0.5mg/ml에 대한 HPLC 결과(상단)와 상기 HPLC 결과 중 화살표로 표시한 화합물이 이소리퀴리티제닌(isoliquiritigenin)임을 확인하는 HPLC 결과(하단)를 도시한 것이다.
도 37 내지 40에서 보듯이, 강진향 추출물에 포함된 화합물이 사티바논(sativanone), 메디카르핀(medicarpin), 달베르긴(dalbergin), 및 이소리퀴리티제닌(isoliquiritigenin)임을 확인하였다. 이들 화합물의 화학식은 하기와 같으며, 사티바논(3-(2,4-dimethoxyphenyl)-7-hydroxychroman-4-one)은 화학식 I, 메디카르핀(9-methoxy-6a,11a-dihydro-6H-benzofuro[3,2-c]chromen-3-ol)은 화학식 II, 달베르긴(6-hydroxy-7-methoxy-4-phenyl-2H-chromen-2-one)은 화학식 III, 이소리퀴리티제닌((E)-1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-en-1-one)은 화학식 IV로 나타내었다. 또한, 도 37 내지 40의 상단에서 보듯이, 강진향 추출물에는 사티바논이 가장 높은 비율로 포함되어 있는 것을 알 수 있었다.
화학식 1
Figure PCTKR2011001258-appb-C000001
화학식 2
Figure PCTKR2011001258-appb-C000002
화학식 3
Figure PCTKR2011001258-appb-C000003
화학식 4
Figure PCTKR2011001258-appb-C000004
실시예 16: 본 발명의 화합물의 정상 사람 케라틴형성세포에서 세포외 기질 단백질인 타입 Ⅲ 콜라겐의 발현에 대한 효과 분석
케라틴형성세포에 1 μM, 5 μM 및 10 μM으로 농도를 달리하여 본 발명의 화합물, 사티바논, 달베르긴, 이소리퀴리티제닌, 및 메디카르핀을 38시간 처리한 후, 웨스턴블롯에 의해 세포외 기질 단백질 중의 하나인 타입 III 콜라겐의 단백질 발현에 미치는 영향을 분석하였다(참조: 도 41 내지 44). 이때, 내부표준물질로서 β-actin을 사용하였다.
도 41은 케라틴형성세포에 1μM 및 5μM으로 사티바논을 처리한 경우 타입 III 콜라겐 단백질 발현 정도를 나타낸 웨스턴 블럿 사진이고, 도 42는 케라틴형성세포에 1μM 및 5μM으로 달베르긴을 처리한 경우 타입 III 콜라겐 단백질 발현 정도를 나타낸 웨스턴 블럿 사진이며, 도 43은 케라틴형성세포에 5μM 및 10μM으로 이소리퀴리티제닌을 처리한 경우 타입 III 콜라겐 단백질 발현 정도를 나타낸 웨스턴 블럿 사진이고, 도 44는 케라틴형성세포에 1μM 및 5μM으로 메디카르핀을 처리한 경우 타입 III 콜라겐 단백질 발현 정도를 나타낸 웨스턴 블럿 사진이다. 도 41 내지 44에서 보듯이, 케라틴형성세포에서 타입 III 콜라겐의 발현이 대조구(vehicle)와 비교하여 현저하게 증가함을 확인하였으므로, 본 발명의 화합물이 콜라겐과 같은 세포외 기질의 발현을 조절하여 주름 개선 효과가 있음을 알 수 있었다.
실시예 17: 본 발명의 화합물의 정상 사람 섬유아세포에서 세포외 기질 단백질인 타입 Ⅰ 콜라겐의 발현에 대한 효과 분석
피부섬유아세포에 0, 0.1, 0.5, 1, 5, 10 mg/ml 로 농도를 달리하여 본 발명의 화합물, 사티바논, 달베르긴, 이소리퀴리티제닌, 및 메디카르핀을 38시간 처리한 후, 웨스턴블롯에 의해 세포외 기질 단백질 중의 하나인 타입 I 콜라겐의 단백질 발현에 미치는 영향을 분석하였다(참조: 도 45 내지 48). 이때, 내부표준물질로서 β-actin을 사용하였다.
도 45는 피부섬유아세포에 사티바논을 처리한 경우 타입 I 콜라겐 단백질의 발현 정도를 나타낸 웨스턴 블럿 사진이고, 도 46은 피부섬유아세포에 달베르긴을 처리한 경우 타입 I 콜라겐 단백질의 발현 정도를 나타낸 웨스턴 블럿 사진이며, 도 47은 피부섬유아세포에 이소리퀴리티제닌을 처리한 경우 타입 I 콜라겐 단백질의 발현 정도를 나타낸 웨스턴 블럿 사진이고, 도 48은 피부섬유아세포에 메디카르핀을 처리한 경우 타입 I 콜라겐 단백질의 발현 정도를 나타낸 웨스턴 블럿 사진이다. 도 45 내지 48에서 보듯이, 정상 사람 섬유아세포에서 타입 I 콜라겐의 발현이 대조구(vehicle)와 비교하여 농도 의존적으로 증가함을 확인하였으므로, 본 발명의 화합물이 콜라겐과 같은 세포외 기질의 발현을 조절하여 주름 개선 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 18: 본 발명의 화합물의 UV에 의해 유도되는 세포노화 억제효과 분석
상기 4종의 화합물(사티바논, 달베르긴, 이소리퀴리티제닌, 및 메디카르핀)이 UVB 조사에 의해 유도된 케라틴형성세포의 노화에 미치는 영향을 확인하고자, 세포노화의 중요 지표인 베타-갈락토시데이즈 활성을 측정하여 분석하였다.
구체적으로, 6 cm 배양 디쉬에 2× 105 cells 밀도로 접종된 케라틴형성세포를 38시간동안 배양하고, 상기 4종의 화합물(사티바논, 달베르긴, 이소리퀴리티제닌, 및 메디카르핀)을 1μM의 농도로 가한 후에, UVB(40 mJ/cm2)를 조사하고, 다시 24시간 동안 배양하였다. 상기 각 배양된 케라틴형성세포를 PBS로 세척하고 고정액(2% formaldehyde, 0.2% glutaraldehyde)을 가하여 7분 동안 고정하였으며, 상기 고정액을 제거하고, 다시 PBS로 3번 세척한 다음, 염색 혼합물(10× Staining solution, Reagent B, Reagent C, X-gal solution)과 이산화탄소가 제거된 상태의 37℃ 암실에서 17시간 동안 반응시키고, 베타-갈락토시데이즈의 활성을 측정하는 키트(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 상기 각 세포에서 베타-갈락토시데이즈 활성을 측정하였다(참조: 도 49). 이때, 대조구로서 UVB 및 상기 화합물이 처리되지 않은 케라틴형성세포와, 상기 UVB 처리없이 상기 각 화합물만이 처리된 케라틴 형성세포를 사용하였다.
도 49는 4종의 화합물(사티바논, 달베르긴, 이소리퀴리티제닌, 및 메디카르핀)과 UVB가 처리된 케라틴형성세포에서 활성화된 베타-갈락토시데이즈를 나타내는 현미경사진과 상기 현미경사진에서 염색된 베타-갈락토시데이즈를 정량한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 49에서 보듯이, UVB조사에 의한 베타-갈락토시데이즈 활성의 유의한 증가가, 사티바논, 달베르긴, 이소리퀴리티제닌, 및 메디카르핀 처리에 의해 유의하게 억제됨을 확인하였다.
실시예 19: 본 발명의 화합물의 UVB에 의해 유도되는 활성 산소종의 생성 억제효과 분석
상기 4종의 화합물(사티바논, 달베르긴, 이소리퀴리티제닌, 및 메디카르핀)이 케라틴형성세포와 피부섬유아세포에서의 세포외기질 단백질의 발현에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
구체적으로, 6 cm 배양 디쉬에 2 × 105 cells 밀도로 접종된 케라틴형성세포에, 상기 4종의 화합물과 UVB를 처리하지 않은 대조군, 상기 세포에 UVB(40 mJ/cm2)를 조사하고, 다시 30분 동안 배양한 실험군 21, 상기 세포에 상기 4종의 화합물을 1㎍/㎖의 농도로 가하고 38시간동안 배양한 다음, UVB(40 mJ/cm2)를 조사하고, 다시 30분 동안 배양한 실험군 22 및 상기 세포에 상기 4종의 화합물을 1㎍/㎖의 농도로 가하고 38시간동안 배양한 실험군 23을 각각 설정하였다. 그런 다음, 상기 각 대조군 및 실험군의 세포를 10 μM H2DCF-DA(DCF-DA, Calbiochem, San Diego, CA)로 처리하고, 다시 30분 동안 배양한 후, 차가운 PBS로 2번 세척하였으며, 공초점현미경(Confocal laser scanning microscope, Model 1X70, Olympus, Japan)으로 촬영하고, 공초점현미경상에서 촬영된 형광값을 정량하였다(참조: 도 50).
도 50은 대조구 및 각 실험군의 활성산소종의 생성정도를 나타내는 공초점현미경 사진과, 상기 공초점현미경사진에서 나타나는 형광값을 정량한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 50 에서 보듯이, UVB조사 30분 후에 정상 사람 케라틴형성세포에서 ROS의 생성이 유의하게 증가하였으나, 사티바논, 달베르긴, 이소리퀴리티제닌, 및 메디카르핀을 처리한 경우 UVB조사에 의한 ROS 생성유도가 현저하게 억제됨을 확인하였으므로, 강진향의 주요구성성분인 사티바논, 달베르긴, 이소리퀴리티제닌, 및 메디카르핀이 세포내에서 UVB조사에 의해 유도된 활성 산소종의 생성을 저해함으로써 세포노화를 억제하는 것을 알 수 있었다.

Claims (29)

  1. 강진향 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, C1 ~ C4의 저급 알콜 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 추출한 것인 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 저급 알콜 용매는 메탄올 또는 에탄올인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 분획물은 물 분획물, 에틸 아세테이트 분획물, n-헥산 분획물 또는 클로로포름 분획물인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 강진향 추출물 또는 이의 분획물은 피부세포에서 PPAR δ를 활성화시켜 세포외 기질 단백질의 발현을 촉진하는 것인 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 세포외 기질 단백질은 타입 I 콜라겐, 타입 III 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴, 또는 TGF-β1인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 강진향 추출물 또는 이의 분획물은 UV 조사에 의해 발생되는 활성산소종(ROS)의 생성을 억제하는 것인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 강진향 추출물 또는 이의 분획물은 베타-갈락토시데이즈 활성을 억제하는 것인 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 피부 노화 억제 또한 피부 주름 개선용 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 피부 노화 억제 또한 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
  12. 강진향 추출물 또는 이의 분획물로부터 유래된 사티바논(sativanone), 메디카르핀(medicarpin), 달베르긴(dalbergin), 및 이소리퀴리티제닌(isoliquiritigenin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 조성물.
  13. 제12항에 따른 조성물을 포함하는 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 약학 조성물은 의약외품 제조에 사용되는 것인 조성물.
  16. 제12항에 따른 조성물을 포함하는 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
  17. 제1항의 조성물을 손상된 피부에 투여하는 단계를 포함하는 피부 노화를 억제 또는 피부 주름을 개선하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 추출물은 물, C1 ~ C4의 저급 알콜 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 추출한 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 저급 알콜 용매는 메탄올 또는 에탄올인 방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 분획물은 물 분획물, 에틸 아세테이트 분획물, n-헥산 분획물 또는 클로로포름 분획물인 방법.
  21. 제17항에 있어서, 상기 강진향 추출물 또는 이의 분획물은 피부세포에서 PPAR δ를 활성화시켜 세포외 기질 단백질의 발현을 촉진하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 세포외 기질 단백질은 타입 I 콜라겐, 타입 III 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴, 또는 TGF-β1인 방법.
  23. 제17항에 있어서, 상기 강진향 추출물 또는 이의 분획물은 UV 조사에 의해 발생되는 활성산소종(ROS)의 생성을 억제하는 것인 방법.
  24. 제17항에 있어서, 상기 강진향 추출물 또는 이의 분획물은 베타-갈락토시데이즈 활성을 억제하는 것인 방법.
  25. 제12항의 조성물을 손상된 피부에 투여하는 단계를 포함하는 피부 노화를 억제 또는 피부 주름을 개선하는 방법.
  26. 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 조성물의 제조를 위한 강진향 추출물 또는 이의 분획물의 용도.
  27. 제1항 또는 제12항의 조성물의 피부 노화 억제 또한 피부 주름 개선용 약학적 조성물의 제조를 위한 용도.
  28. 제1항 또는 제12항의 조성물의 피부 노화 억제 또한 피부 주름 개선용 화장료 조성물의 제조를 위한 용도.
  29. 피부 노화 억제 또는 피부 주름 개선용 조성물의 제조를 위한 강진향 추출물 또는 이의 분획물로부터 유래된 사티바논(sativanone), 메디카르핀(medicarpin), 달베르긴(dalbergin), 및 이소리퀴리티제닌(isoliquiritigenin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염의 용도.
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