KR20020091404A - 강진향 추출물의 제조방법, 그에 의해 얻어지는 강진향추출물 및 이를 포함하는 골다공증 예방 및 치료용약학조성물과 건강식품 - Google Patents
강진향 추출물의 제조방법, 그에 의해 얻어지는 강진향추출물 및 이를 포함하는 골다공증 예방 및 치료용약학조성물과 건강식품 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 강진향(降眞香; Lignum Acronychiae) 추출물의 제조방법, 그에 의해 수득되는 강진향 추출물 및 이를 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학조성물과 건강식품에 관한 것으로서, 구체적으로 강진향 추출물에는 포르모노네틴(formononetin) 등의 식물 에스트로겐(phytoestrogen)이 다량 포함되어 있으므로 본 발명에 의한 강진향 추출물은 노화 또는 폐경 등의 다양한 원인에 의해 유발되는 골다공증을 부작용이 없이 예방 및 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 건강 식품으로도 응용될 수 있다.
Description
본 발명은 강진향 추출물의 제조방법, 그에 의해 수득되는 강진향 추출물 및이를 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학조성물과 건강식품에 관한 것으로서, 구체적으로 강진향 추출물에는 포르모노네틴(formononetin) 등의 식물 에스트로겐(phytoestrogen)이 다량 포함되어 있으므로 본 발명에 의한 강진향 추출물은 노화 또는 폐경 등의 다양한 원인에 의해 유발되는 골다공증을 부작용이 없이 예방 및 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 건강 식품으로도 응용될 수 있다.
골(骨)은 신체의 물리적 지지체로서 필요한 골량과 구조를 보존하는 역할을 하며, 칼슘(Ca2+) 등의 보관고로서 칼슘 등의 혈중 농도 유지에 중요한 역할을 하고 있다. 이러한 기능을 수행하기 위하여 골은 항상 분해 작용과 재구축(remodeling) 작용이 조화롭게 이행되는 것이 필요하고, 이 과정에서 골 흡수와 골 형성이 함께 진행되는 동적인 상태를 이루게 된다. 이와 같은 골 흡수와 골 형성간의 평형 관계가 파괴되면 골 흡수가 골 형성에 상대적으로 상회하게 되어 골 밀도 또는 골량이 감소되고 골 강도가 유지되지 못하는 상태인 골다공증(osteoporosis)이 나타날 수 있다.
골다공증은 골조직의 석회가 감소되어 치밀질이 엷어지고 그로 인해 골수강이 넓어지는 상태로서, 증세가 진전됨에 따라 골량이 전체적으로 감소되어 골이 구조적으로 약해짐으로 작은 충격에도 쉽게 골절 및 형태학적인 변형이 초래되는 질환으로서, 이 환자는 일차적으로 골원이 차지하는 공간과 피질의 두께가 감소하는증상을 보인다(Reilly, D. T. and Burstein, A. H., 1994,J. Bone Joint Surg.,56, 1001-1022). 골량은 유전적 요인, 영양섭취, 호르몬의 변화, 운동 및 생활습관의 차이 등 여러 가지 요인들에 의해 영향을 받으며, 골다공증의 원인으로는 노령, 운동부족, 저체중, 흡연, 저칼슘 식이, 폐경, 난소 절제 등이 알려져 있다. 한편, 개인차는 있지만 백인보다는 흑인이 골 재흡수 수준(bone resorption level)이 낮아 골량이 더 높으며, 대개 골량은 14∼18세에 가장 높고 노후에는 1년에 약 1%씩 감소한다. 특히 여성의 경우 30세 이후부터 골 감소가 지속적으로 진행되며, 폐경기에 이르면 호르몬 변화에 의해 골 감소가 급격히 진행된다. 즉, 폐경기에 이르면 에스트로젠 농도가 급속히 감소하는데, 이 때 IL-7(interleukin-7)에 의한 것처럼 B-임파구(B-lymphocyte)가 다량 생성되어 골수(bone marrow)에 B 세포 전구체(pre-B cell)가 축적되고 이로 인해 IL-6의 양이 증가하여 파골 세포의 활성을 증가시키므로 결국 골량이 감소하게 된다.
이와 같이 골다공증은 정도에 차이는 있으나 노년층, 특히 폐경기 이후의 여성에게 있어서는 피할 수 없는 증상으로, 선진국에서는 인구가 노령화됨에 따라 골다공증 및 그 치료제에 대한 관심이 점차 증가되고 있다. 또한, 전세계적으로 골질환 치료와 관련되어 약 1300억 달러의 시장이 형성되어 있는 것으로 알려져 있으며 앞으로 더 증가할 것으로 예상되기 때문에, 세계적인 각 연구 기관과 제약회사에서는 골질환 치료제 개발에 많은 투자를 하고 있다.
골다공증은 그 형태와 원인에 따라 여러 가지 타입으로 나눌 수 있는데, 크게는 폐경에 의한 타입 I 골다공증과 노화로 인한 타입 Ⅱ 골다공증 등을 들 수 있다(Dempster. D. W. and Lindsay, R., 1993,Lancet,341, 797-801). 이러한 골다공증의 발생 원인에 대하여 많은 연구가 이루어지지는 못하였으나, 타입 I 및 타입 Ⅱ 골다공증은 많은 경우 내분비 장애에 의하여 유발되고 이외에도 질병, 영양실조 또는 칼슘 이온의 흡수 감소로 인한 칼슘, 인산염 및 비타민 D 등의 결핍으로 생긴다고 알려져 있다(Sambrook, P. et al., 1993,N. Engl. J. Med.,328, 1747-1752; Marie, P. J. et al., 1989,J. Clin. Endocrinol. Metab.,69, 272-279; Krane, S. M. and Holick, M. F., 1994,in Harrison's Principles of Internal Medicine,vol. 2, pp 2172-2183).
또한, 골다공증 환자는 혈장에서 IGF-1(Insulin-like growth factor) 농도가 감소되는 것이 관찰되고 이는 척추 무기질 밀도(Bone Mineral Density, BMD)와 상관 관계가 있으며 근골 대사에 중요한 호르몬인 타이로이드(thyroids), 부갑상선 호르몬(PTH), 코티졸(cortisol) 및 에스트로겐(estrogen) 그리고 비타민 D3 와도 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되어 있다(Johansson, A. G. et al., 1992,J. Int. Med.,232, 447-452; Abbasi, A. A. et al., 1993,J. Am. Genetrics Soc.,41, 975-982). 이외에도 호르몬의 변화와 골 밀도 간의 관계에 대하여 현재 많은 연구가 진행되고 있다.
상기 타입 I 및 타입 Ⅱ 골다공증은 수십년에 걸쳐 일어나는 질병이므로 이를 치료하기 위하여 몇 가지의 단순 약물을 단 기간 동안 복용하는 것으로는 충분하지 않다. 지금까지 골다공증 치료제로서 에스트로겐 또는 테스토스테론 등이 일반적으로 사용되어 왔고, 이외에도 칼슘제제, 인산염, 불소제제, 이프리플라본(Ipriflavone), 비타민 D, 칼시토닌(calcitonin) 등이 치료제로 사용될 수 있다고 보고되었으나 이들을 장기 복용하는 경우 더 큰 부작용이 초래되므로 인체에 부작용이 없는 새로운 골다공증 치료제를 개발하는 것이 필요하다.
또한, 지금까지는 파골 세포의 기능을 저해하여 과다한 골 흡수를 억제하는 골다공증 치료제가 주로 개발되어 왔으나 골 흡수의 억제만으로는 골량의 감소에 의한 골절 위험성을 회복하기는 어려우므로 골 흡수의 억제뿐만 아니라 골 형성을 촉진시킬 수 있는 약제가 개발되어야 한다.
한편 골다공증은 만성적인 질환이므로 예방적인 차원에서 손 쉬운 검사 방법이 많이 개발되는 것이 필요하다. 골 조직은 석회화된 단단한 조직이므로 분석하는 방법에 있어서 제한이 있지만 골다공증을 초기에 진단하는 방법으로 다음과 같은 방법들이 개발되어 있다. 구체적으로 단일 중복-광자 흡수 측정방법(single dual-photon absorptiometry), 정량 측정 토모그래피(quantitative computed tomography), X-선 이중에너지 밀도 측정방법(X-ray based dual energy densitometry) 및 총 칼슘의 중성자 활성 분석방법(neutron activation analysis) 등을 들 수 있다(Joffe, I. and Epstein, S., 1991,Seminars Arthr. Rheum.,20(4), 256-272). 그러나 골 밀도의 1회 측정만으로는 골의 변형을 알 수 없어 연속적으로 수년에 걸쳐 시간적인 간격을 두고 측정해야만 골량의 감소를 알 수 있는단점이 있다.
또 다른 방법으로 정확하고 예민하지만 많은 숙련을 필요로 하는 골다공증 진단 방법으로 골의 변형을 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin) 염색을 이용하여 조직 검사하는 방법이 있다(Cameron, J. R. and Sorenson, J., 1963,Science,142, 230). 이외에도 혈액이나 뇨 검사를 통하여도 간접적으로 이를 진단할 수 있는데, 혈액 내 세포들의 분포 상태를 검토하는 여러 가지 생화학적 임상 검사 및 호르몬의 정량 분석을 통하여 생리적인 변화 상태를 검토할 수 있다.
이와 같이 골다공증은 정도에 차이는 있으나 노년층, 특히 폐경기 이후의 여성에게 있어서는 피할 수 없는 증상으로 선진국에서는 인구가 노령화됨에 따라 골다공증 및 그 치료제에 대한 관심이 점차 증가되고 있다. 또한 전세계적으로 골질환 치료와 관련되어 약 1300억 달러의 시장이 형성되어 있는 것으로 알려져 있으며 앞으로 더 증가할 것으로 예상되기 때문에 세계적인 각 연구 기관과 제약회사에서는 골질환 치료제 개발에 많은 투자를 하고 있다.
현재 골다공증 치료제로 사용되고 있는 물질로는 에스트로겐(estrogen), 안드로제닉 아나볼릭 스테로이드(androgenic anabolic steroid), 칼슘 제제, 인산염, 불소 제제, 이프리플라본(ipriflavone) 및 비타민 D3등이 있다. 또한 1995년 미국 머크사(Merk Co.)에서는 아미노비스포스포네이트(aminobisphosphonate)를 1997년미국 릴리사(Lilly Co.)에서는 선택적인 에스트로겐 수용체 조절기(selective estrogen receptor modulator, SERM)로서의 역할을 하는 랄록시펜(raloxifene)을 골다공증에 대한 신약으로 개발한 바 있다.
한편, 종래 골다공증 치료제는 대부분 에스트로겐 계통의 물질로서 에스트로겐 계통의 물질은 장기 투여할 경우 암, 담석, 혈전증 등의 부작용이 나타나는 것으로 알려져 있다(Whitehead, M.I. 등, Am.J. Obset. Gynecol.,1987, 156, 1313-1322; Storm, T. 등,N. Engl. J. Med.,1990, 322, 1265-1271). 그러나 골다공증은 약물의 단기 투여만으로는 치료할 수 없으며 약물의 장기 투여가 필수적이므로 약물을 장기 투여할 때에도 상기와 같은 부작용이 없고 에스트로겐을 대체할 수 있을 만큼 우수한 약효를 갖는 새로운 물질을 개발하기 위한 많은 연구가 있었으며, 현재 에스트로겐 대체 물질로 관심의 초점이 되고 있는 것 중의 하나가 대두 이소플라본(soybean isoflavone) 등의 식물 에스트로겐(phytoestrogen)이다.
식물 에스트로겐은 1946년 베네트 등에 의해 최초로 보고되었는데, '클로바 병(clover disease)[붉은 클로바종(red clover,Trifolium subterraneumvar. Dwalganup)에 속하는 식물을 먹은 양은 불임률이 30% 이상 증가되어 '클로바 병'이라 명명됨]'의 원인이 이 식물에 함유된 성분 중 에스트로겐과 유사한 이소플라보노이드(isoflavonoid)임을 밝히고 식물에서 얻어낸 이러한 화합물을 식물 에스트로겐이라 명명하였다.
식물 에스트로겐으로 알려진 물질로는 다이드제인(daidzein),제니스테인(genistein), 포르모노네틴(formononetin), 비오카닌 A(biochanin A) 등의 이소플라본(isoflanone)류 화합물, 쿠메스트롤(coumestrol) 등의 쿠메스탄(coumestan)류 화합물, 엔테롤락톤(enterolactone) 등의 리그난(lignan)계 화합물 및 엔테로디올(enterodiol) 등의 페놀(phenol)계 화합물이 있다. 이들 식물 에스트로겐은 대개 아글리콘(aglycone), 6'-O-아세틸글루코시드(6'-O-acetylglucoside), 6'-O-말로닐글루코시드(6'-O-malonylglucoside) 등의 형태로 존재하며 다이드제인과 제니스테인은 7-O-글루코시드(7-O-glucoside)의 형태로 존재한다. 상기 화합물들 중 당 화합물은 장내 박테리아의 β-글루코시다제(β-glucosidase) 또는 위산에 의해 가수분해되어 결국 유리(free) 이소플라본인 아글리콘의 형태로 흡수되는 것으로 알려져 있다.
한편, 상기 이소플라본류 화합물 중 포르모노네틴은 다이드제인의 전구체로서 포르모노네틴 벤젠 고리의 메톡시기가 디메틸레이션(demethylation)되면 다이드제인으로 변환되며, 다이드제인의 케톤기가 제거되면 에콜로 변환된다. 또한 비오카닌 A는 제니스테인의 전구체로서 비오카닌 A 벤젠 고리의 메톡시기가 디메틸레이션되면 제니스테인으로 변환된다.
식물 에스트로겐은 일반적으로 동물의 에스트로겐과 유사한 작용을 나타내는데 에스트로겐 수용체에 결합하여 유방암 세포의 성장을 억제하며 폐경기 이후 나타나는 심혈관 질환(cardiovascular disease) 및 기타 증상의 치료에 에스트로겐을 대체하여 사용할 수 있다. 또한, 식물 에스트로겐이 골다공증에 유효함이 많이 보고되고 있는데, 현재 대두 식품을 많이 섭취하는 동양 여자는 미국인에 비해 에스트로겐 부족에 기인하는 골다공증과 심장병의 발현이 적은 것으로 보고되었다(Y. Ishimi et al., Selective Effects of Genistein, a Soybean Isoflavone, on B-Lymphopoiesis and Bone Loss Caused by Estrogen Deficiency,Endocrinol.,1999, 140(4), 1893-1900). 최근에는 식물 에스트로겐인 다이드제인이나 제니스테인과 같은 이소플라본 화합물이 골다공증 예방 및 치료에 유용함을 뒷받침하는 연구 결과가 많이 보고되고 있다.
제니스테인은 골 재흡수 속도(bone resorption rate)와 골 형성 속도(bone formation rate)에 영향을 미치며(Fanti, M. C.et al.,Osteoporos Int.,1998, 8, 274-281), 두개관 세포 배양(calvarial cell culture)에 적용한 경우 파골 세포의 생성이나 골 소실에 직접 작용하지는 않았다. 한편 제니스테인 100∼200 ㎍/㎏을 3일간 투여하면 대퇴 골중간부(femoral metaphyseal)와 대퇴 골간(femoral diaphyseal)의 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase, 이하 "ALP"라 약칭함), DNA 및 칼슘 농도가 증가하였고, 50 ㎍/㎏을 투여하면 ALP와 DNA의 농도만 증가하고 칼슘 농도에는 변화가 없었다. 그러나 아연 5.5 ㎎/㎏를 제니스테인과 함께 투여하면 ALP, DNA 및 칼슘 농도가 모두 증가하였다. 즉, 제니스테인은 뼈에 대해 동화 작용(anabolic effect)을 일으키며, 이러한 동화 작용은 아연으로 인해 증가되고 골 단백질의 생성을 촉진시킨다는 것을 알 수 있었다(Gao, Y. H.et al.,Gen. Pharmac.,1998, 31(2), 199-202).
시험관 내(in vitro) 실험에서도 제니스테인은 골중간부 조직(metaphyseal tissue)의 ALP, DNA 및 칼슘 농도를 증가시켰고 아연을 함께 가할 경우 그 효과는 더욱 증가되었다. 또한 다이드제인의 전구물질인 랄록시펜은 골 소실을 방지하는 한편 자궁에 영향을 미치지 않으면서도 에스트로젠 효과(estrogenic effect)를 나타내었다(Ishimi, Y.et al.,Endocrinol.,1999, 140(4), 1893-1900).
한편, 인간 골아세포(human osteoblastic cell)와 골수의 골간 스트로말(bone marrow osteoprogenitor stromal: HBMS) 세포의 1차 세포배양(primary cell culture)에 IL-1β를 첨가하면 투여량 의존적(dose-dependent) 또는 시간 의존적으로 IL-8 mRNA의 양이 증가한다. 이 때, 글루코코르티코이드(glucocorticoids), 덱사메타손(dexamethasone) 및 코르티손(cortisone)은 IL-1β에 의해 IL-8의 양이 증가하는 것을 억제하였으며, PTH(parathyroid hormone)은 IL-8에 전혀 영향을 미치지 않았다. 또한 제니스테인도 IL-1β에 의해 IL-8이 증가하는 것을 억제하여 IL-1β에 의한 IL-8의 조절이 신호 전달 경로(signal transduction pathway)를 통해 진행된다는 것을 알 수 있었다(Chaudhary, L. R.et al.,J. Bio. Chem.,1996, 271(28), 16591-16596).
PDGF(platelet-derived growth factor)와 IGF-Ⅱ(insulin-like growth factor-Ⅱ)는 MG-63 세포와 조골세포(osteoblast) 1차 배양에서 강력한 미토겐(mitogen)으로 작용하는데, 이 두 물질을 제니스테인과 함께 투여한 경우 PDGF를 포함하는 시험군에서는 IP3(inositol trisphosphate)가 증가되었으나 IGF-Ⅱ를 포함하는 시험군에서는 IP3가 증가되지 않았다. 즉, 제니스테인은 PDGF에 의한 인산화(phosphorylation) 및 미토겐으로서의 작용은 억제하였으나 IGF-Ⅱ에는 영향을 미치지 않았으며, 따라서 제니스테인이 특정한 티로신 키나제에만 작용한다는 것을 알 수 있었다.
제니스테인의 파골세포에 의한 골 재흡수(bone resorption)에 대한 실험에서 IC50은 3 μmol/L로 측정되었으며, 10 μM에서 생체내(in vivo) 및 시험관내(in vitro) 실험에서 파골세포에 대한 활성(osteoclastic activity)을 억제하였다. 반면 다이드제인은 30 μM에서 골 재흡수에 대한 효과가 없었으며, 10-8∼10-10M의 세포 배양액에서는 골 재흡수를 촉진시켰다(J .P. Williams, et al.,Am. J. Clin. Nutr.,1998, 68(suppl), 1369S-74S; H. Tobe,et al.,Bioscience Biotech. and Biochem.,1997, 61(2), 370-371).
한편 이프리플라본(Ipriflavone) 등과 같은 이소플라본류는 에스트로젠 수용체에 직접적으로는 작용하지 않는다는 보고도 있으나, 골량의 소실을 억제하며 특히 짧은 기간 안에 골 생성을 촉진시켜 골량의 감소를 억제하는 것으로 알려져 있다.
이처럼 식물 에스트로젠이 뼈에 미치는 영향은 일부 상반된 점도 있지만 전체적으로 골밀도(bone mineral density: BMD)를 증가시키는 것으로 보고되고 있으며 계속하여 많은 연구가 진행되고 있다.
인간 자궁 선암 세포(human endometrial adenocarcinoma cell)에서 식물 에스트로젠에 의한 ALP 활성을 골다공증 치료제로서 사용되고 있는 에스트라디올(estradiol)을 기준으로 하여 비교해 보면, 쿠메스트롤 5×10-2배, 제니스테인과 에콜(equol) 10-3배, 다이드제인 7×10-3배, 비오카닌 A 1.5×10-4배, 포르모노네틴 10-5배이다. 그러나 자궁(uterus)에 미치는 에스트로젠 활성(estrogenic activity)은 디에틸스틸베스트롤(diethylstilbestrol)을 기준으로할 때, 쿠메스트롤 3.5x10-4배, 제니스테인 10-5배, 다이드제인 7.5x10-6배, 비오카닌 A 4.6×10-6배, 포르모노네틴 2.6x10-6배 정도로 상당히 낮았다. 에스트로젠 효과를 나타내는 양은 쿠메스트롤과 포르모노네틴의 경우 각각 알팔파(alfalfa) 5 g, 9,412 g이고 제니스테인과 다이드제인의 경우 각각 두부 48 g, 145 g이었다.
한편 식물 에스트로젠을 상용하는 동물들은 일반적으로 식물 에스트로젠의 혈중 농도가 높기 때문에 불임 등의 문제를 유발할 수도 있으며, 식물 에스트로젠은 항에스트로젠 활성(anti-estrogenic effect)을 나타내기도 하므로 자궁과 같이 에스트로젠 수용체(estrogen receptor)의 밀도가 높은 조직이나 장기에는 큰 영향을 미칠 수도 있다. 난소가 제거되면 골밀도(bone mineral density: BMD)가 감소하는데, 제니스테인을 난소 제거 쥐(OVX)에 투여한 결과, 골수 세포(bone marrow cell)의 수를 감소시키고 자궁의 무게는 증가시키지 않으면서도 BMD를 증가시켰다. 또한 이 결과는 소주골(trabecular bone)의 국소 해부(microcomputed tomography)와 조직 분석(histological analysis)에서도 확인할 수 있었다. 이러한 제니스테인의 작용 기전은 티로신 키나제 저해제(tyrosine kinase inhibitor)뿐만 아니라 파골 세포의 골소실 활성에 기인하는 작용일 수도 있다. 반면 난소 제거 쥐에게 제니스테인을 1 ㎎/kg 또는 5 ㎎/kg 투여하면 BMD의 감소가 억제되었으며 골 재흡수보다는 골 형성이 증가되었다. 또 다른 보고에 의하면 제니스테인은 투여량 의존적으로(dose-dependent) 약효에 변화가 있는 것으로 나타났다. 즉, 난조 제거 쥐에 제니스테인을 25 ㎍/g 투여하면 자궁에 영향을 미쳤으나, 5 ㎍/g 투여하면 자궁에는 영향을 미치지 않고 BMD를 더 증가시켰으며, 1 ㎍/g 투여하면 자궁과 BMD 모두에 영향이 미치지 않았다.
또한 폐경기 여성에게 제니스테인을 매일 90 mg씩 6개월간 투여했을 때에도 BMD의 증가가 확인되었다. 콩가루(soy flour)(다이드제인 포함) 6주 투여로는 얼굴 홍조(hot flush)를 40%나 감소시켰는데 이 결과는 뇨 중에 함유된 에콜의 배설량과도 일치하였으며, 밀가루(wheat flour)는 엔테롤락톤(enterolactone)을 함유하며 얼굴 홍조를 25%나 감소시켰다. 그러나 제니스테인을 소량 투여하면(0.5 ㎎/일) 에스트로젠과 유사한 작용을 나타내지만(에스트로젠 수용체에 작용 물질(agonist)로 작용) 높은 양(5 ㎎/㎏)에서는 역효과(adverse effect)가 더 크다는 보고도 있다(Anderson, J.J.B.et al.,P.S.E.B.M.,1998, 217, 345-350).
각각 50 ㎎씩 이소플라본을 투여할 경우, 제니스테인과 다이드제인의 최고 혈장 농도는 각각 130∼640 ng/㎖, 반감기는 약 7∼8시간인 것으로 알려져 있다. 또한 배당체(glycosides)의 생물학적 이용 효능(bioavailability)이 아글리콘보다 높아서, 소변으로 배설되는 양은 제니스테인 24%, 다이드제인 66%, 에콜 28%이다. 제니스테인, 다이드제인 및 에콜의 흡수 반감기는 1.5∼3 시간이며, 소변으로 배설되는 반감기는 각각 7, 4, 9 시간인 것으로 보고되었다(2nd International Symposium on the Role of Soy in Preventing and Treating Chronic Disease, Brussels, Belgium, 1996).
상기와 같이 골다공증 치료 및 예방에 효과를 나타내는 이소플라본을 에스트로겐의 대체 물질로서 사용하기 위해서는 다량의 화합물을 확보할 필요가 있다. 일반적으로 이소플라본은 주로 식물에서 추출되어 사용되고 있는데, 상기의 목적을 달성하기 위해서는 이소플라본을 다량 얻을 수 있는 공급원을 찾는 것이 중요한 과제이다.
현재까지 보고된 바에 의하면 이소플라본은 주로 콩과(Leguminosae family) 식물에 다량 함유되어 있는 것으로 알려져 있으며, 이에 본 발명자들을 비롯한 국내의 몇몇 연구팀이 한국의 전통 식품 중 콩의 가공 식품과 발효 식품에 함유된 이소플라본의 함량을 측정하였으며, 또한 본 발명자들은 콩과에 속하는 한약재인 황기(Astragali Radix;Astragalus membranaceus Bunge)의 골다공증 치료제로서의 효과를 확인하여 특허출원한 바 있다(대한민국 특허출원 제1998-3604호, 등록 제0284657호). 구체적으로 한국의 전통 식품인 두부, 콩나물, 된장, 간장, 청국장, 춘장, 메주, 대두, 완두콩, 약콩 및 강남콩 등에 함유된 이소플라본 중에서 제니스테인, 다이드제인 및 포르모노네틴을 정량하였다. 이 때 이소플라본의 혈중 농도와 소변으로 배설된 양을 분석하였으며, 정량 분석 방법으로는 자외선 분광기, ECD(electrochemical detector) 분광기 또는 형광 분광기 등의 검출기를 이용한 HPLC(high pressure liquid chromatography) 또는 기체 크로마토그래피나 RIA(radio immunoassay) 분석법 등을 사용하였다.
18여 종의 대두에 대하여 식물 에스트로겐 중 제니스테인과 다이드제인을 분석한 결과에 의하면, 대두에는 318-1107 ㎎/㎏의 제니스테인과 379-1242 ㎎/㎏의다이드제인이 포함되어 있으며, 그 중에서도 대두 품종의 하나인 단엽의 이소플라본이 제일 많은 양으로 전체 콩가루(soyflour)에 대하여 2317 ㎎/㎏이 포함되어 있었다(Choi, J. S. et al., Isoflavone Contents in some Varieties of Soybean,Foods and Biotechology,1996, 5(2), 167-169). 또한 콩의 가공 식품에서 식물 에스트로겐의 농도를 분석한 결과, 국내산 액상 두유에는 약 309 ㎎/㎏의 다이드제인(이하 특별한 언급이 없는 한 건조량 기준임)과 약 367 ㎎/㎏의 제니스테인, 두부에는 584 ㎎/㎏의 다이드제인과 568 ㎎/㎏의 제니스테인, 연두부에는 566 ㎎/㎏의 다이드제인과 625 ㎎/㎏의 제니스테인, 순두부에는 817 ㎎/㎏의 다이드제인과 702 ㎎/㎏의 제니스테인이 포함되어 있어서 상대적으로 높은 농도를 포함하고 있음을 확인하였다. 한편 콩나물의 경우(건조량)에는 194 ㎎/㎏의 다이드제인과 230 ㎎/㎏의 제니스테인이 포함되어 있었는데, 대두가 발아하면 이소플라본의 농도가 증가한다고 알려져 있다(최연배,Kor. J. Food Sci. Technol., 1998, 30(4), 745-750). 이외에 알파파(bud stage)에서는 포르모노네틴의 함량이 극미량이었으나(Saloniemi,Proc Soc Exp Biol Med,1995, 208, 13-17), 알파파 싹(sprout)에서의 함량은 약 3.4 ㎍/g 이었고 클로버 싹에서의 함량은 22.8 ㎍/g 이었다(Frank,J. Agric Food Chem,1994, 42, 1905-1913).
강진향(降眞香; Lignum Acronychiae)은 Rutaceae과에 속하는 식물인Acronychia pedunculataMiq.의 껍질을 제거한 뿌리(심재)로서 강진(降眞) 혹은 강향(降香)으로 명명되기도 하는데, 원 식물은 강향단(Dalbergia odoriferaT.Chen.)으로 뿌리 부분을 캐서 껍질을 벗기고 말려서 사용한다. 주성분으로는 달버진(dalbergin), 노달버진(nordalbergin), 이소들버진(isodlbergin), 들베게논(dlbegenone), 달버지크로민(dalbergichromene) 1-[2',4'-(디히드록시(Dihydroxy)-3',5'-디(di)-(3"-메틸부티닐(methylbut-2"-enyl))-6'-메톡시페닐에타논(methoxy]phenylethanone), 아크로닐린(acronylin), 아크로베스톤(acrovestone), 디메틸아크로베스톤 1(demethylacrovestone 1), 버갑텐(bergapten), 딕타민(dictamnine), 스키미아닌(skimmianine), 이볼리트린(evolitrine), 코쿠스아기닌(kokusaginine) 및 바우레놀(baurenol) 등이 알려져 있고, 그 밖에 히드록시옵투스티렌(hydroxyobtustyrene), 이소무크로너스티렌(isomucronustyrene), 메틸(methyl)-2-히드록시(hydroxy)-3,4-디메톡시벤조산(dimethoxybenzoate),(+)-듀어틴(duartin),(-)-멜리로토카펜(melilotocarpan) C,(-)-멜리로토카펜(melilotocarpan) D4,(-)-메틸니솔린(methylnissolin),(-)-오도리카펜(odoricarpan), 3'-메톡시다이드제인(methoxydaidzein), 3(R)-5'-메톡시베스티톨(methoxyvestitol),(3R-형)-클라우스퀴논(claussequinone), 달버진 플라번 다이머(dalbergia flavan dimer) Do-18, 달버진 플라번 다이머(dalbergia flavan dimer) Do-19, 달버진 플라번 다이머(dalbergia flavan dimer) Do-20, 달버진 플라번 다이머(dalbergia flavan dimer) Do-21, 달버진 비스 이소플라번(dalbergia-bis-isoflavan) 1, 달버진 비스 이소플라번(dalbergia-bis-isoflavan) 2, 달버진 비스 이소플라번(dalbergia-bis-isoflavan) 3, 달버진 비스 이소플라번(dalbergia-bis-isoflavan) 4, 달버진 비스 이소플라번(dalbergia-bis-isoflavan) 5, 포르모노네틴(formononetin), (dl-형)-이소듀어틴(isoduartin), 이소리퀴리티제닌(isoliquiritigenin), 이소메디카핀(isomedicarpin),(dl-형)-메디카핀(medicarpin), (dl-형)-뮤크로눌라톨(mucronulatol), 옵투스티렌(obtustyrene), 오도리플라벤(odoriflavene), (3R-형)-베스티톨(vestitol), (dl-형)-베스티톨(vestitol), 네르올리돌(nerolidol), 2-아릴(aryl)-2',6-디히드록시(dihydroxy)-4'-메톡시벤조퓨란(methoxybenzofuran), 6-디메틸비그나퓨란(demethylvignafuran), 6-히드록시(hydroxy)-2-(2-히드록시(hydroxy)-4-메톡시페닐(methoxyphenyl))벤조퓨란(benzofuran), β-비스아볼렌(bisabolene), β-파르네센(farnesene) 및 바우레놀(baurenol) 등을 함유하고 있다. 본초강목에는 강진향이 뼈가 부러져 상한 것과 칼에 베인 상처를 치료하고 출혈을 멈추게하고 진정시키며 부기를 가라앉히고 새살이 돋아나게 한다고 한다. 대표적인 처방은 남청즙(藍靑汁), 벽사고, 벽예산, 자연동산(自然銅散), 향보소란(香譜笑蘭) 및 향보신료(香譜新料) 등이 있다. 강진향은 향보신료(香譜新料)로 동의보감(東醫寶鑑) 및 필용방(必用方)으로 말(末), 밀반균(蜜拌均)을 태워서 사용하고, 향보소란(香譜笑蘭)은 동의보감(東醫寶鑑) 및 필용방(必用方)에 수록된 처방으로 가루를 소량의 꿀에 개어 태워서 사용한다. 자연동산(自然銅散)은 원(元)나라의 처방으로 동의보감(東醫寶鑑) 및 세의득효방(世醫得效方)에 수록된 제상(諸傷)약으로 타박상(打撲傷), 근골절상(筋骨折傷)에 사용하며 가루를 1회 5전, 술로 먹으며 활혈거어(活血祛瘀), 속근접골(續筋接骨)에 사용한다. 남청즙(藍靑汁)은 송(宋)나라의 처방으로 동의보감(東醫寶鑑) 및 인제직지방(仁齋直指方)에 수록되었고 제충(諸蟲), 노채에 사용하며 연화(硏和), 월초 5경 복용(月初五更服用), 1회 1되 마신다고 되어있고 온중화충(溫中化蟲)이라고 한다. 벽사고는 송(宋)대의 소아(小兒)용 처방으로 중악(中惡)에 사용하며 웅황(雄黃), 사향(麝香), 연밀(煉蜜), 작고(作膏)로 소량을 유향탕과 복용하며 화탁개규(化濁開竅), 청열해독(淸熱解毒)작용을 한다고 동의보감(東醫寶鑑) 및 전씨소아방직결(錢氏小兒方直訣)에 기록되어 있다. 벽예산은 명(明)으로부터 내려온 처방으로 동의보감(東醫寶鑑) 및 의학정전(醫學正傳)에 수록되어 있고 소아(小兒)에 사용하며 각등분(各等分), 조말(粗末)로 태워서 사용하며 두창양법(痘瘡禳法)에 사용한다고 한다.
그러나, 아직까지 골다공증 예방 또는 치료와 관련하여 강진향을 사용한 예는 보고된 바 없다.
이에, 본 발명자들은 골다공증 예방제 또는 치료제로 사용할 수 있는 식물 에스트로겐의 공급원으로서 대두를 대체할 수 있는 것을 찾고자 노력하던 중 전통 한약재에 대한 검색을 실시하였으며, 그 중 강진향 추출물에 다량의 식물 에스트로겐 특히 포르모노네틴이 다량 포함되어 있는 것을 알아내고 강진향 추출물 및 포르모노네틴 및 그 유도체를 골다공증 치료제 또는 예방제 및 건강 식품으로 유용하게 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 제 1목적은 골다공증의 예방 및 치료 효과가 있는 강진향 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제 2의 목적은 상기의 방법에 의하여 수득되는 강진향 추출물을 제공하는 것이다.
본 발명의 제 3의 목적은 상기의 강진향 추출물을 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 제 4의 목적은 상기의 강진향 추출물을 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 건강식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 제 5의 목적은 강진향으로부터 프로모노네틴을 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 강진향 추출물로부터 분리한 포르모노네틴의 HPLC 크로마토그램을 보여주는 그래프이고,
도 2는 포르모노네틴을 투여한 래트의 경골 염색 사진이다.
A ; 대조군,
B ; 포르모노네틴 투여군 (1 ㎎/㎏/day),
C ; 포르모노네틴 투여군(10 ㎎/㎏/day)
상기의 제 1의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 강진향 건조물에 알코올 수용액을 첨가하거나, 산 또는 염기 용액으로 가수분해하는 것을 특징으로 하는 강진향(Lignum Acronychiae) 추출물의 제조방법을 제공한다.
이하 본 발명의 강진향 추출물의 제조방법을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 강진향 추출물의 제조방법에 의하면, 상기 강진향 추출물은 식물 에스트로겐 화합물을 유리 화합물(free compound)의 형태 및 당 또는 다른 알킬(alkyl)기 등 여러가지 치환기와 결합된 결합형 형태로 포함할 수도 있으며 가수분해에 의해 전체 식물 에스트로겐 화합물을 유리 화합물의 형태로 포함할 수도 있다.
구체적으로 본 발명에서는 강진향 건조물을 알코올 수용액에 첨가하고 5 내지 40℃에서 침지하여 상기 강진향 추출물을 제조하는 방법을 제공한다. 상기에서 알코올 수용액은 10 내지 100%의 에틸알콜(ethyl alcohol), 10 내지 100%의 메틸알콜(methyl alcohol) 및 주정으로 구성된 군으로부터 선택되어 사용될 수 있다. 이 방법에 의하면 강진향 추출물에는 유리 화합물 형태인 식물 에스트로겐 화합물과 당이 결합된 형태의 식물 에스트로겐 화합물이 모두 포함된다.
또한 본 발명에서는 강진향 건조물을 산 또는 염기로 가수분해하여 강진향 추출물을 제조하는 방법을 제공한다. 이 때 상기 산 또는 염기는 0.1 내지 2 N의 농도인 것이 바람직하며, 산은 염산, 황산, 질산 및 인산으로 구성된 군으로부터 선택되어 사용될 수 있고 염기는 수산화나트륨 및 수산화칼륨으로 구성된 군으로부터 선택되어 사용될 수 있다. 이 방법에 의하면 당 또는 다른 알킬기 등 여러가지 치환기와 결합되어 있던 식물 에스트로겐 화합물이 가수분해되어 강진향 추출물에는 식물 에스트로겐 화합물이 유리된 형태로 포함된다.
상기 제 2의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기의 제조방법에 의해 수득되는 강진향 추출물을 제공한다.
본 발명의 강진향 추출물을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 강진향 추출물은 골다공증 예방 및 치료에 효과가 뛰어나며, 식물에스트로겐(phytoestrogen)을 다량 포함하고 있는 것이 특징이며, 대표적으로 포르모노네틴을 다량 함유하고 있다.
종래 식물 에스트로겐의 공급원으로서 주로 사용되고 있던 대두 추출물과 상기 강진향 추출물을 비교해 보면, 강진향 추출물에는 포르모노네틴 등의 식물 에스트로겐이 월등히 많이 포함되어 있다. 또한 강진향 추출물의 수율은 강진향 건조물에 대하여 30.63 ±1.13%로 매우 높고 대두에 비해 강진향의 값이 더 저렴하므로 강진향 추출물은 대두 추출물보다 유용한 식물 에스트로겐의 공급원으로 사용될 수 있다(표 1참조).
상기의 제 3의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 강진향 추출물을 유효 성분으로 함유하는 골다공증 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 강진향 추출물에 다량 함유되어 있는 포르모노네틴은 하기화학식 1로 표시되는 식물 에스트로겐인 이소플라보노이드의 일종으로서, R1위치에 수소가 치환되고 R2위치에 메틸기가 결합된 화합물이다.
본 발명의 골다공증 치료 또는 예방용 약학조성물은 상기 강진향 추출물 또는 포르모노네틴 및 그 유도체를 유효 성분으로 함유하며, 식물 에스트로겐의 단일 화합물과 비교해 볼 때 골다공증 치료 또는 예방의 효과가 월등히 높다. 포르모노네틴의 유도체는 상기화학식 1로 표시되는 이소플라본의 모든 유도체가 될 수 있으며, 구체적으로는 R1에 β-D-glucopyranosyl 기가 치환된 오노닌(ononin)이 될 수 있으며, 이외에도 R1및 R2위치에 C1내지 C4의 알킬기로 치환된 경우와 포도당 및 람노즈(rhamnose) 등의 당화합물로 치환된 모든 유도체가 될 수 있다. 이외에도 가수분해에 의해 포르모노네틴이 생성되는 3'-methoxydaidzein , Biochanin (5,7-Dihydroxy-4'-methoxyisoflavone 혹은 5,7-Dihydroxy-3-(4-methoxyphenyl) -4H-1-benzopyran-4-one), Calycosin (Clycosin 혹은 3',7-Dihydroxy-4'-methoxyisoflavone 혹은 3'-Hydroxyformononetin), Glycitin (4',7-Dihydroxy-6-methoxyisoflavone-7-0-β-glucopyranoside), Kakkanin (5-Hydroxy-4'-methoxyisoflavone-7-0-[β-D-xylopyranosyl-(1-6)-β-glucopyranoside]), Pratensein (3',5,7-Trihydroxy-4'-methoxyisoflavone), Prunetin (4',5-Dihydroxy-4'-methoxyisoflavone 혹은 Padmakastein 혹은 Prunustein 혹은 5-Hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-7-methoxy-4H-1-benzopyran-4-one), Pueraria Glycoside(PG)-3, Puerarin-4'-methyl ether, Sissotrin (Astroside 혹은 5,7-Dihydroxy-4'-methoxyisoflavone-7-0-β-D-glucopyranoside), Tectoridin(Shekanin 혹은 Shekkanin 혹은 4',5,7-Trihydroxy-6-methoxyisoflavone-7-0-β-D-glucopyranoside), Tectorigenin (4',5,7-Trihydroxy-6-methoxyisoflavone) 등도 모두 골다공증 치료용 또는 예방용으로 사용할 수 있음은 당연하다.
상기 강진향 추출물 또는 그에 함유되어 있는 포르모노네틴 및 그 유도체는 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
즉, 본 발명의 강진향 추출물 또는 그에 함유되어 있는 포르모노네틴 및 그 유도체는 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 강진향 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 또한 골다공증 예방 및 치료제로서의 효능 증진을 위해 칼슘이나 비타민 D3를 첨가할 수 있다.
투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배를 함유하거나 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.
강진향 추출물의 유효용량은 0.1 내지 1000 ㎎/㎏이고, 바람직하기로는 1 내지 1000 mg/kg이며, 하루 1-6 회 투여될 수 있다. 또한 포르모노네틴 및 그 유도체의 유효용량은 0.1 내지 1000 ㎎/㎏이고, 바람직하기로는 1 내지 1000 mg/kg이며, 하루 1-6 회 투여될 수 있다.
본 발명의 강진향 추출물을 마우스에 경구 투여시 및 복강내 투여시의 독성 실험을 수행한 결과, 경구 투여 독성시험에 의한 50% 치사량(LD50)은 적어도 20 g/kg 이상인 것으로 나타났다.
상기 제 4의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 강진향 추출물을 유효 성분으로 함유하는 골다공증 예방 및 치료용 건강 식품을 제공한다.
강진향 추출물 또는 그에 함유된 포르모노네틴 및 그 유도체를 함유하는 건강 식품으로는 강진향 및 포르모노네틴을 주성분으로 만든 즙, 티, 젤리, 쥬스 등의 건강식품 및 기호품을 들 수 있으며, 근골절상 치료, 지혈 등을 목적으로 하는 민간요법제 등을 들 수 있다. 또한 남청즙(藍靑汁), 벽사고, 벽예산, 자연동산(自然銅散), 향보소란(香譜笑蘭) 및 향보신료(香譜新料) 등과 같은 여러 한의학 처방들에도 사용할 수 있다.
마지막으로 상기 제 5의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 강진향으로부터 포르모노네틴을 분리하는 하기의 단계들을 포함하는 방법을 제공한다
1)강진향에 알콜을 첨가하여 환류추출하면서 가수분해시키는 단계;
2) 단계 1의 추출액에 염기를 첨가하여 여과하는 단계; 및
3)상기 여과액으로부터 포르모노네틴을 분리하는 단계.
상기에서 단계 1)에서 알콜은 메탄올인 경우가 바람직하며 단계 2)의 염기는 수산화나트륨인 경우가 바람직하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 강진향 추출물의 제조 1
강진향 건조물 분말 50 g을 70% 메탄올 수용액 500 ㎖에 첨가하여 실온에서 2일 동안 교반시켰다. 교반 과정을 거쳐 얻어진 용액을 거름종이로 여과한 후 감압 농축하여 메탄올을 제거한 뒤 동결 건조하여 수분을 제거하였다. 상기의 방법에 의하여 식물 에스트로겐 화합물이 유리 포르모노네틴의 형태 및 당 또는 다른 알킬기 등 여러가지 치환기와 결합된 형태의 결합형 포르모노네틴의 두 가지 형태로 존재하는 강진향 추출물 15.32 ± 0.57 g을 얻었다(강진향 건조물에 대한 수율 : 30.63 ± 1.13 %).
<실시예 2> 강진향 추출물의 제조 2
강진향 건조물 분말 0.1 g을 1 N HCl 수용액 1 ㎖에 넣고 100℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 2시간 동안 가수분해시킨 뒤 상기 반응액을 동결건조로 수분을 제거하여 본 발명의 강진향 추출물을 제조하였다.
<실시예 3> 강진향으로부터 포르모노네틴의 분리
5 ℓ 플라스크에 강진향 건조물 분말 300 g과 50% 메탄올(메탄올 : 1 N HCl = 1 : 1(v/v)) 3 ℓ를 첨가한 후, 가열기(heating mantle)에서 100℃의 온도로 2시간 동안 환류 추출하여 가수분해하였다. 상온으로 식힌 후 10 N 수산화나트륨으로 추출용액의 pH를 7.0으로 적정하여 종이필터를 사용하여 여과한 후, 여과한 찌꺼기에 50% 메탄올(메탄올 : 물 = 1 : 1(v/v)) 600 ㎖를 첨가하여 재추출하였다. 상기와 동일한 방법으로 재추출을 총 5회 반복 수행한 후, 상기에서 얻어진 추출액과 재추출액을 종이 필터로 여과한 후 합하여 감압농축하였다. 농축된 추출액을 동결건조하여 완전히 건조시키고(수율 약 45%), 건조된 추출물을 분말로 하여 클로로포름 : 아세톤(9 : 1) 혼합 용액에 녹여 여과한 후 여과액을 감압농축하고 찌꺼기는 클로로포름 : 아세톤(9 : 1) 혼합 용액으로 반복 추출하였다. 상기에서 얻어진 추출물 약 20 g에 클로로포름 : 아세톤(9 : 1) 혼합 용액을 소량 첨가하여 실리카겔 컬럼(높이 약 5 cm)에 부가하였다. 이 때의 이동상은 클로로포름 : 아세톤(9 : 1) 혼합 용액을 사용하였으며, 포르모노네틴이 포함된 층을 분리하여 그 분획을 건조시켰다. 건조시킨 분획 1.5 g을 클로로포름 : 아세톤(8 : 2) 혼합 용액에 소량 녹였으며, 실리카겔 컬럼(사용 실리카겔의 무게는 150 g)에서 이동상으로 클로로포름 : 아세톤(8 : 2) 혼합 용액을 사용하여 포르모노네틴을 분리하였다. 분리한 분획을 TLC로 분리하여 포르모노네틴이 함유된 층을 모았다. 분리한 층을 완전히 건조시킨 후 소량의 100% 메탄올을 사용하여 침전물인 포르모노네틴을 분리하였으며 이를 HPLC를 사용하여 함량을 측정하였다.
그 결과, 침전물의 포르모노네틴의 함량은 93 내지 98% 였다(도 1).
<비교예 1> 대두 추출물의 제조 1
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 대두(한국 문경산, 농협 하나로 양곡)를 사용하여 대두 추출물을 제조하였다.
<비교예 2> 대두 추출물의 제조 2
상기 실시예 2와 동일한 방법으로 대두(한국 문경산, 농협 하나로 양곡)를 사용하여 대두 추출물을 제조하였다.
<실험예 1> 강진향 추출물의 분석
하기와 같은 방법에 의하여, 상기 실시예 1 및 실시예 2에서 얻은 강진향 추출물에 포함된 식물 에스트로겐을 비교예 1 및 비교예 2에서 얻은 대두 추출물에 포함된 식물 에스트로겐과 비교·분석하였다.
<1-1> 분석 시료의 제조
상기 실시예 1에서 얻은 강진향 추출물 10 ㎎, 비교예 1에서 얻은 대두 추출물 300 ㎎을 각각 메탄올 600 ㎕에 넣어 녹인 후 4℃에서 14,000 rpm으로 20분 동안 원심분리하였다. 원심분리하여 얻어진 상등액을 취해 0.45 ㎛의 구멍 크기를 갖는 주사기용 필터로 여과하여 분석 시료를 제조하였다.
또한, 실시예 2에서 얻은 강진향 추출물을 건조약재 해당량 40 ㎎, 비교예 2에서 얻은 대두 추출물 300 ㎎을 각각 100% HPLC 시약용 메탄올 600 ㎕에 가한 후 초음파 추출(sonication)을 1시간 동안 실시하였다. 추출액 1 ㎖를 취하여 4℃, 14,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하였고, 얻어진 상등액 500 ㎕를 취하여 0.45 ㎛ 구멍 크기의 주사기용 필터로 여과하여 분석 시료를 제조하였다.
<1-2> 시료의 분석
상기 실험예 <1-1>에서 제조된 시료에 대하여 HPLC(High Performance LiquidChromatography; Thermo Separation Products, Fremont, CA, 미국, 모델명 spectra system P1000)를 실시하여 강진향 추출물에 포함된 식물 에스트로겐의 종류 및 함유량을 분석하였다. 이동상으로는 5 mM 농도의(NaH2PO4(pH 4.6) : 메탄올 = 4 : 6) 혼합 용액을 사용하였고, 컬럼으로는 루나(Luna) 5 ㎛ C18(250 ×4.6 mm)을 사용하였으며 유속은 1 ㎖/분으로 하였다. 내부 표준 물질은 상기 이동상에서 포르모노네틴의 머무름 시간(retention time) 및 꼬리끌림(tailing)과 다른 물질들의 머무름 시간이 내부 표준 물질의 머무름 시간과 겹치는 지를 고려하여 알로에-에모딘(aloe-emodin)을 선택하였다. 또한 표준 물질로는 알로에-에모딘, 제니스테인 및 다이드제인(이상 모두 Sigma사, St. Louis, MO, 미국)을 사용하였으며, 포르모노네틴은 본 발명자들이 황기에서 추출 및 정제하여 핵자기공명분석기(NMR) 및 질량분석기(MASS)로 확인한 후에 사용하였다(대한민국 특허등록 제284657호 참조). 0.051-213.71 ㎍/㎖의 다이드제인, 0.056-194.20 ㎍/㎖의 제니스테인 및 0.025-5.00 ㎍/㎖의 포르모노네틴을 메탄올을 사용하여 각각 여러 농도로 희석하고 내부 표준 물질인 4 ㎍/㎖의 알로에-에모딘을 표준 물질과 동량 첨가하여 용액을 제조하였다. 상기 용액을 20 ㎕씩 HPLC에 주입하여 각각의 크로마토그램을 얻었으며, 260 nm에서의 흡광도를 측정하여 식물 에스트로겐의 종류 및 함유량을 결정하였다. 여러 농도에서 다이드제인, 제니스테인 및 포르모노네틴의 피크 높이를 각각 내부 표준 물질의 피크 높이에 대한 비율(peak height ratio)로 계산하여 표준 검량 곡선을 작성하였으며, 이들에 대한 검량곡선식 및 상관계수는 시그마 플럿(Sigmaplot) 프로그램(Jandel Scientific, Chicago, IL, U.S.A.)을 이용하여 계산하였다.
그 결과, 본 발명의 강진향 추출물에 포함된 식물 에스트로겐의 양을 측정하여 하기표 1에 나타내었다. 비교군으로는 비교예에서 얻은 대두 추출물을 사용하였다.
| 강진향 추출물 | 대두 추출물 | ||
| 다이드제인 | 유리 화합물(실시예 1) | ND* | 14.52 ±1.75 |
| 전체량(실시예 2) | ND | 1022.15 ±201.08 | |
| 제니스테인 | 유리 화합물(실시예 1) | ND | 22.49 ±2.81 |
| 전체량(실시예 2) | ND | 408.58 ±92.05 | |
| 포르모노네틴 | 유리 화합물(실시예 1) | 1802.04 ±200.82 | 0.0606 ±0.0341 |
| 전체량(실시예 2) | 2189.14 ±136.46 | 0.1613 ±0.132 | |
| 단위 : ㎎/㎏* ND : 측정안됨(not detected) |
상기표 1에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 의한 강진향 추출물에는 대두 추출물에 비하여 월등히 많은 양의 식물 에스트로겐 화합물이 포함되어 있음이 확인되었고, 대두 추출물과 강진향 추출물에 포함된 포르모노네틴의 양을 비교해 보면 강진향은 대두 추출물에 비하여 유리 화합물의 형태로는 약 30,000배, 전체량으로는 약 13,500배 이상 포함되어 있음이 확인되었다. 반면 강진향 추출물에서는 다이드제인이나 제니스테인은 검출되지 않았다.
이와 같이 본 발명에 의한 강진향 추출물에는 골다공증의 예방 및 치료에 효과적인 식물에스트로겐인 포르모노네틴이 다량 함유되어 있으므로, 본 발명의 강진향 추출물은 골다공증 치료제 또는 예방제로서 뿐만 아니라 건강 식품으로도 유용하게 사용될 수 있다.
<실험예 2> 조골세포 증식 실험
본 발명에 의한 강진향 추출물이 조골세포(osteoblast)의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 실시하였다.
<2-1> 조골세포의 선별 및 세포 배양
뼈의 구성 성분인 조골세포와 유사한 성질을 나타내는 Saos-2 세포주를 서울대학교 의과대학 암연구소의 한국 세포주 은행으로부터 분양 받아 실험에 사용하였다.
Saos-2 세포는 10%의 FBS, 100 유니트/㎖의 페니실린 및 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI 1640배지(Gibco BRL, 미국)를 사용하여 37℃ 온도를 유지시키며 5% CO2배양기(incubator)에서 배양하였다. 배지는 1 주일에 2 내지 3회 교환하였고 1주일에 1회 계대 배양하였다. 상기 세포주는 배양 플라스크에 단일층(monolayer)을 형성하며 자라는 특성이 있기 때문에 계대 배양시에는 0.25% 트립신(trypsin) 용액을 사용하여 단일층을 벗겨 내었다.
<2-2> 약물의 농도에 따른 세포 증식 실험 : MTT 실험
상기 세포주를 96-웰 플레이트에 20,000 세포수/웰로 접종하고 상기 실시예 1 및 실시예 2에서 얻은 강진향 추출물을 건조약재 해당 5 내지 5 ×10-7㎎/㎖의 농도가 되도록 각 농도별로 6개의 웰에 첨가하였다. 강진향 추출물은 비극성이므로 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO)에 용해시켜 사용하였으며, 배양 조건에서 DMSO의 최종 농도는 1%가 되도록 하였다. 또한, 실시예 3에서 얻은 포르모노네틴을 농도별로 웰에 가하여 사용하였다. 한편 대조군으로는 강진향 추출물을 첨가하지 않은 것을 사용하였고 비교군으로서는 현재 골다공증 치료제로 주로 사용되고 있는 NaF, 1,25(OH)2D3및 17β-에스트라디올(E2)과 그 외에 식물에스트로겐인 제니스테인 및 비오카닌 A를 각각 농도별로 웰에 가하여 사용하였다.
상기에서 준비된 것을 37℃, 5% CO2배양기에서 3일 동안 배양하였고, 배양 후 각각의 웰에 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Triazolyl Blue)를 0.05 ㎎/㎖ 농도로 첨가하여 동일한 조건에서 4시간 동안 더 배양하였다. MTT 첨가 후 생성된 포르마잔(formazan) 결정을 DMSO로 용해시켜 ELISA 판독기로 550 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
세포 증식율(%)은 하기수학식 1을 이용하여 강진향 추출물을 첨가하지 않은 대조군 웰의 흡광도에 대한 추출물 첨가군 웰의 흡광도의 비로서 계산하였으며, 강진향 추출물을 동일한 농도로 처리한 6개 웰의 값을 평균하였다.
그 결과, 강진향 추출물에 의한 조골세포 증식율(%)을 하기표 2에 나타내었다.
| Saos-2 세포 증식율(%) | ||||||||||
| 시험군 | 비교군 | |||||||||
| 농도(㎎/㎖) | 실시예1의 강진향 추출물 | 실시예 2의 강진향 추출물 | 농도(㎎/㎖) | 포르모노네틴 | NaF | E2 | 제니스테인 | 다이드제인 | 비오카닌 A | 1,25(OH)2D3 |
| 5×10-7 | 63.35 | 99.74 | 1×10-7 | 104.54 | 113.52 | 103.17 | 121.88 | 107.44 | 97.89 | 93.58 |
| 5×10-6 | 107.62 | 99.12 | 1×10-6 | 100.85 | 112.62 | 118.11 | 143.58 | 114.59 | 103.14 | 96.01 |
| 5×10-5 | 102.27 | 98.39 | 1×10-5 | 104.04 | 92.02 | 93.79 | 134.77 | 88.37 | 106.11 | 101.55 |
| 5×10-4 | 100.26 | 101.46 | 1×10-4 | 98.33 | 102.93 | 96.48 | 121.37 | 93.99 | 75.75 | 103.93 |
| 5×10-3 | 106.88 | 102.23 | 1×10-3 | 82.14 | 103.56 | 100.07 | 122.95 | 87.12 | 105.16 | 120.88 |
| 5×10-2 | 121.43 | 109.10 | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 5×10-1 | 24.03 | 188.85 | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 5 | 10.35 | 0.00 | - | - | - | - | - | - | - | - |
상기표 2에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 의한 강진향 추출물은 Saos-2 세포와 같은 조골세포 유사 세포에 대하여 대조군의 189%로 우수한 증식률을 나타내었다. 또한 종래 골다공증 치료제로 사용되고 있는 NaF, E2에 비하여 조골세포 증식률이 더 우수할 뿐만 아니라 다이드제인 등과 같은 단일 화합물보다 더 높은 세포 증식률을 나타내었다. 따라서 본 발명에 의한 강진향 추출물은 골다공증 치료 또는 예방과 관련된 약물 및 건강 식품에 유용하게 사용될 수 있다.
<2-3> ALP(alkaline phosphatase)의 활성 검색
조골세포는 ALP 활성을 나타내므로 본 발명에 의한 강진향 추출물이 조골세포의 ALP 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하여 확인하였다.
상기 실험예 <2-2>의 MTT 실험에서와 동일한 세포수의 Saos-2 세포주에 시험 물질을 동일한 농도로 처리하고 동일한 조건에서 3일 동안 배양한 후 수확하였다. 이 때 비교군으로는 NaF, E2, 제니스타인, 다이드제인, 비오카닌 A 및 1,25(OH)2D3를 각각 사용하였다. 한편, ALP가 p-니트로페닐포스페이트(p-nitrophenylphosphate)를 p-니트로페놀(p-nitrophenol)과 포스페이트(phosphate)로 분해시키는 것을 이용하여 405 nm에서의 흡광도의 변화를 이용하여 ALP 활성을 측정하였으며, 그 결과를 하기표 3에 나타내었다.
| Saos-2 세포의 ALP 활성률(%) | ||||||||||
| 시험군 | 비교군 | |||||||||
| 농도(㎎/㎖) | 실시예 1의 강진향 추출물 | 실시예 2의 강진향 추출물 | 농도(㎎/㎖) | 포르모노네틴 | NaF | E2 | 제니스테인 | 다이드제인 | 비오카닌 A | 1,25(OH)2D3 |
| 5×10-7 | 114.65 | 102.55 | 1×10-7 | 95.73 | 94.81 | 96.18 | 110.43 | 101.94 | 104.74 | 192.15 |
| 5×10-6 | 118.05 | 100.45 | 1×10-6 | 264.12 | 94.56 | 100.92 | 134.82 | 99.87 | 103.52 | 93.92 |
| 5×10-5 | 116.02 | 93.84 | 1×10-5 | 111.38 | 93.02 | 98.71 | 123.09 | 103.00 | 131.27 | 99.51 |
| 5×10-4 | 112.66 | 117.57 | 1×10-4 | 105.69 | 87.17 | 90.85 | 124.71 | 93.01 | 101.94 | 182.73 |
| 5×10-3 | 110.44 | 111.71 | 1×10-3 | 90.59 | 87.05 | 91.03 | 121.47 | 98.00 | 98.35 | 167.46 |
| 5×10-2 | 121.74 | 136.03 | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 5×10-1 | 104.64 | 63.81 | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 5 | 1.59 | 72.22 | - | - | - | - | - | - | - | - |
상기표 3에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 의한 강진향 추출물은 Saos-2 세포에 대하여 대조군의 136%로 우수한 ALP 활성을 나타내었다. 또한 종래 골다공증 치료제로 사용되고 있는 NaF, E2에 비하여 ALP 활성이 더 우수할 뿐만 아니라, 다이드제인 및 제니스타인 등의 단일 화합물보다 더 높은 활성을 나타내었다. 또한 포르모노네틴은 대조군의 264%로 NaF, E2에 비하여 ALP 활성이 더 우수할 뿐만 아니라, 다른 식물에스트로겐인 다이드제인, 제니스테인보다 더 높은 활성을 나타내었다. 따라서 본 발명에 의한 강진향 추출물 및 포르모노네틴은 조골세포의 활성을 증가시켜 골의 생성을 촉진시킬 수 있으므로, 골다공증 치료 또는 예방과 관련된 약물 및 건강 식품에 유용하게 사용될 수 있다.
<실험예 3> 난소 적출 래트(rat)에 대한 동물 실험
폐경기 이후 타입 I(type I) 골다공증이 일어나는 SD(Sprague-Dawley)계 래트의 암컷을 대상으로 하여 골다공증에 대한 동물 실험을 수행하였다.
<3-1> 실험 동물 및 실험 단계
실험 재료로는 한국화학연구소에서 분양 받은 생후 10주된 체중 200-300 g 정도의 SD계 암컷 래트를 사용하였다. 실험은 크게 흰쥐의 난소 적출술의 시행, 각 군에 따른 약물 투여, 체중변화 측정, 적출술 후 일정 기간마다 래트를 희생하여 조직학적 관찰 및 조직 형태 계측학적 분석하는 과정으로 나누어 실시하였다.
<3-2> 난소 적출술 및 약물 투여
난소 적출술은 sham군(정상군)을 제외하고 대조군과 시험군의 모든 래트 암컷에서 양측 난소 적출술을 수행하였다. 5 ㎎/100 g의 케타민(ketamine)(유한양행, 대한민국)과 1 ㎎/100 g의 자일라진(xylazine)(한국 바이엘, 대한민국)을 래트의 좌측 및 우측 후지 대퇴근에 근육 주사하여 래트 암컷을 전신 마취시켰다. 하복부의 털을 제거하고 동물의 체위을 반듯이 눕힌 상태에서 포타딘액(삼일제약: 요오드, 대한민국)으로 수술 부위를 소독한 후, 무균 조작 하에서 수술을 수행하였다. 정중선(백선)을 중심으로 하복부에서 2 cm 정도로 피부, 복근 및 복막을 절개하고, 소독된 핀셋으로 난소를 노출시켜 난관을 견사로 결찰한 후 좌우 난소를 적출하였다. 항생제(썰파포르테-4, 유니화학 주식회사) 0.3 ㎖를 복강 내에 주입하여 감염을 방지하였으며, 견사와 나일론사를 사용하여 복막, 복근 및 피부를 봉합하였다.
Sham군(정상군)은 난소 적출을 제외한 모든 수술을 행한 동물들로 구성되는데, 난소를 적출하고 약물 투여를 하지 않은 대조군에 대한 비교군으로서 난소 적출로 인한 변화를 대조군과 비교하기 위하여 준비하였다. 반면에 대조군은 난소 적출술을 행하고 약물 투여를 실시한 투여군들의 동물들과 비교하여 약물 투여에 기인하는 변화를 비교하기 위한 것이다.
난소를 적출하고 나서 1주 후부터 Sham군과 대조군은 10% Tween 80 용액을, E2군은 17β-에스트라디올을 1 ㎍/kg/day로 시험 약물 투여군(포르모노네틴 투여군)은 시험 약물을 9주 동안 1 mg/kg/day 또는 10 mg/kg/day로 복강 주사하여 동물 실험을 실시하였다. 골밀도 검사를 위하여 5, 6번 요추골(lumbar) 및 오른쪽 경골(tibia)을 분리하였고 4% 포르말린(formalin) 용액(10% 희석액)에 보관하였다.
<3-3> 약물투여에 의한 체중 및 조직무게의 변화 측정
상기 실험예 <3-2>에 의해 난소가 적출된 후 약물이 투여된 실험동물의 체중 및 조직무게를 약물 투여시 투여 전, 후 일정기간 동안(난소 적출 전, 후, 약물 투여 1-9주 동안)을 측정하여 난소 적출을 제외한 모든 수술을 행한 Sham군 및 난소를 적출하고 약물 투여를 하지 않은 대조군의 체중 및 조직무게와 본페로니 다중 비교법(boneferroni multiple comparison method)으로 비교하였다. 각 군의 실험동물의 체중 및 조직무게의 측정 결과를 하기표 4및표 5에 나타내었다.
| 주령(week) | 대조군 | Sham | E2 | 포르모노네틴(1 ㎎/㎏/day) | 포르모노네틴(10㎎/㎏/day) |
| 10 | 227.67±4.66 | 224.63±3.65 | 227.83±5.20 | 239.60±5.55 | 215.62±5.76 |
| 11 | 252.09±3.82 | 234.70±3.36# | 250.71±5.30 | 260.17±5.36 | 234.86±5.11 |
| 12 | 280.73±4.01** | 240.54±3.57## | 261.46±5.46* | 285.87±7.14* | 264.22±5.79** |
| 13 | 304.48±3.93** | 249.44±3.21##** | 275.55±5.43##** | 315.98±8.29** | 290.79±5.87** |
| 14 | 319.79±4.10** | 254.18±3.56##** | 288.68±6.27##** | 331.95±8.85** | 301.42±6.82** |
| 15 | 326.49±5.42** | 262.05±3.73##** | 293.86±6.35##** | 341.95±9.63** | 308.73±5.75** |
| 16 | 334.36±5.39** | 265.94±3.98##** | 299.18±6.27##** | 350.42±9.76** | 313.52±6.23** |
| 17 | 342.31±5.89** | 269.52±3.88##** | 307.50±7.03##** | 353.67±10.18** | 323.67±6.11** |
| 18 | 346.44±6.46** | 273.67±3.76##** | 313.02±6.97##** | 358.86±10.81** | 325.50±6.07** |
| 19 | 354.74±6.75** | 279.14±3.35##** | 319.29±7.33##** | 368.26±10.90** | 336.21±6.48** |
| 20 | 362.23±6.58** | 284.68±4.00##** | 325.73±9.15##** | 372.47±11.12** | 346.42±6.57** |
10주령과 비교하여 *; p<0.05, **; p<0.01,
대조군과 비교하여 #; p<0.05, ##; p<0.01
| 자궁(mg) | 간(g) | 신장(g) | 경골(g) | |
| 대조군 | 81 ±4 | 9.82 ±0.24 | 1.91 ±0.06 | 0.57 ±0.02 |
| Sham군 | 454 ±20** | 9.35 ±0.30 | 1.92 ±0.05 | 0.54 ±0.02 |
| E2 | 271 ±10** | 9.42 ±0.28 | 1.96 ±0.07 | 0.53 ±0.02 |
| 포르모노네틴(1 mg/kg/day) | 88 ±5 | 9.68 ±0.40 | 1.84 ±0.05 | 0.57 ±0.01 |
| 포르모노네틴(10 mg/kg/day) | 94 ±2 | 9.81 ±0.24 | 1.81 ±0.06 | 0.50 ±0.02 |
대조군과 비교하여 *; p<0.05, **; p<0.01
상기표 4에 나타낸 바와 같이, Sham군과 E2가 투여된 실험군에서는 약물투여 기간 동안 대조군에 비하여 체중의 증가가 현저하게 낮은 반면, 본 발명의 포르모노네틴이 투여된 실험군에서는 대조군과 거의 동일한 양상으로 체중이 증가되었음을 알 수 있다. 상기 결과는 정상상태에서는 주령의 증가에 따라 체중이 증가하며 강진향 추출물의 투여가 주령 증가에 따른 체중의 증가에 아무런 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
또한,표 4에 나타낸 바와 같이 각 군의 실험동물에서 자궁을 제외한 모든 조직들의 무게는 별다른 차이를 나타내지 않았으나, 자궁의 무게는 Sham군과 E2 투여군에서는 대조군에 비하여 각각 5.5배 및 3.4배 정도씩 증가되었으나 포르모노네틴 투여군에서는 대조군과 거의 유사하였다.
<3-4> 병리조직학적 관찰
채취한 대퇴골 조직을 10% 포르말린 용액에 고정한 후 포름산 내에서 탈회를 실시하였다. 골조직의 관찰 부위를 수술칼로 절단한 뒤 70-100% 알코올과 아세톤에 이르는 단계별 탈수 과정을 거쳐 자일렌으로 청명하고 파라핀 포매를 실시하였다. 파라핀 포매된 골조직을 마이크로톰으로 5 ㎛로 절단하고 헤마톡실린 및 에오신(hematoxyline & eosin, H&E) 염색을 실시하고, 광학 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 각 군의 골조직 간에 병리학적인 차이는 관찰되지 않았으므로 시험 약물의 투여로 인한 생체 내 독성은 없는 것으로 판단되었다(도 2).
<3-5> 형태계측학적 분석
각 군의 요추골 및 경골부에서 하기와 같은 방법에 의해 형태계측학적 분석을 실시하였다.
정량적 영상 분석기(Quantitative image analysis system, Wild Leitz Co.)의 디지털화 장치(digitizer)로 각 소주의 윤곽선을 따라 그려 컴퓨터 화면에 영상을 얻고 특수한 컴퓨터 체계를 이용하여 이 영상의 면적을 자동적으로 계산하고 이것으로 소주골(trabecular)의 면적을 구하였다. 각 경골의 근위부에서 성장판의 직하부의 부분 중 가로변의 길이가 성장판 길이의 약 2/3정도 되는 길이로 기준 면적 2 ×106㎛2인 직사각형의 내부에 있는 소주골의 평균 면적을 컴퓨터를 이용하여 구하고 그 직사각형 내부의 골소주의 개수를 구한 다음 평균 면적에 개수를 곱하여 각각의 골 표본의 소주골 면적을 구한 후 통계 처리하였으며, 그 결과를 하기표 6에 나타내었다.
| 오른쪽 경골 | 요추골 | |||
| 소주골의 면적(×104μm2) | 대조군에 대한소주골의 면적(%) | 소주골의 면적(×104μm2) | 대조군에 대한소주골의 면적(%) | |
| 대조군 | 34.28 ±1.75 | 100.00 ±5.10 | 63.42 ±2.50 | 100.00 ±3.94 |
| Sham군 | 88.38 ±5.31** | 257.85 ±15.48** | 91.13 ±3.80** | 143.70 ±5.99** |
| E2 | 49.19 ±1.76** | 143.52 ±5.14** | 85.50 ±2.68** | 134.82 ±4.23** |
| 포르모노네틴(1 mg/kg/day) | 45.27 ±3.97* | 132.08 ±11.58* | 83.62 ±2.93** | 131.85 ±4.62** |
| 포르모노네틴(10 mg/kg/day) | 46.94 ±5.68* | 136.94 ±16.58* | 85.27 ±4.64** | 134.46 ±7.32** |
대조군과 비교하여 *; p<0.05, **; p<0.01
상기표 6에서 볼 수 있듯이, 난소 적출한 대조군은 정상 상태(Sham 군)에 비해 경골의 소주골 면적이 60% 정도, 요추골의 소주골 면적이 30% 정도 감소되었고, 이는 골다공증이 유발되었음을 나타내었다. 난소 적출로 인한 소주골 면적은 E2나 포르모노네틴의 투여로 인해 증가되었는데, 정상군인 Sham군에 비해서는 낮았으나(P<0.01) 대조군에 비해서는 유의성있게 증가하였다(P<0.05). 포르모노네틴이 1 또는 10 ㎎/㎏/day 투여된 군은 대조군에 비하여 경골의 경우 약 32-37% 정도, 요추골의 경우 약 31-34% 정도 소주골의 면적을 증가시켰으며, 특히 현재 골다공증의 예방 및 치료제로 사용되는 E2와 비슷한 정도로 소주골의 면적을 증가시켰다. 따라서 본 발명에 의한 강진향 추출물 및 포르모노네틴 및 그 유도체는 골다공증의 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의한 강진향 추출물은 종래 식물 에스트로겐의 공급원으로 사용되던 대두 추출물에 비해 포르모노네틴 등의 식물 에스트로겐을 다량 포함하고 있으면서 대두에 비해 값이 저렴하므로 새로운 식물 에스트로겐의 공급원으로 유용하며, 체중의 변화없이 골의 밀도만을 효과적으로 증가시키고 천연한약재로서 부작용이 없으므로 포르모노네틴 및 그 유도체를 사용하는 여러 가지 질병의 예방제 및 치료제의 원료 또는 건강식품으로 유용하게 사용될 수 있다. 특히 강진향 추출물은 우수한 골다공증 치료 또는 예방 효과를 나타내므로골다공증 치료제 또는 예방제로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 건강 식품으로도 응용될 수 있다.
Claims (10)
- 강진향 건조물에 알코올 수용액을 첨가하거나, 산 또는 염기 용액으로 가수분해하는 것을 특징으로 하는 강진향(Lignum Acronychiae) 추출물의 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 알코올 수용액은 10 내지 100%의 에틸알콜(ethyl alcohol), 10 내지 100%의 메틸알콜(methyl alcohol) 및 주정으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 강진향 추출물의 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 산 또는 염기 용액은 0.1 내지 2 N의 농도인 것을 특징으로 하는 강진향 추출물의 제조방법.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조된 강진향 추출물.
- 강진향 추출물을 유효 성분으로 함유하는 골다공증 치료 및 예방용 약학조성물.
- 강진향 추출물을 유효 성분으로 함유하는 골다공증 예방 및 치료용 건강 식품.
- 1) 강진향에 알콜을 첨가하여 환류추출하는 단계;2) 단계 1의 추출액에 염기를 첨가하여 여과하는 단계; 및3) 상기 여과액으로부터 포르모노네틴을 분리하는 단계를 포함하는 강진향으로부터 포르모노네틴을 분리하는 방법.
- 제 7항에 있어서, 알콜은 메탄올이고, 염기는 수산화나트륨인 것을 특징으로 하는 강진향으로부터 포르모노네틴을 분리하는 방법.
- 포르모노네틴 및 그 유도체를 유효 성분으로 함유하는 골다공증 치료 또는 예방용 약학조성물.
- 포르모노네틴 및 그 유도체를 유효 성분으로 함유하는 건강 식품.
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| AMND | Amendment | ||
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