KR100764401B1

KR100764401B1 - 누에 번데기 열수추출물을 함유한 에스트로젠 활성화 작용을 갖는 기능성 식품

Info

Publication number: KR100764401B1
Application number: KR1020050028167A
Authority: KR
Inventors: 구성자
Original assignee: 주식회사 보고에프앤디; 이병희
Priority date: 2005-04-04
Filing date: 2005-04-04
Publication date: 2007-10-05
Also published as: KR20060106000A

Abstract

본 발명은 누에 번데기 열수추출물의 여성호르몬인 에스트로젠(estrogen)의 활성증강 효능에 대한 용도에 관한 것으로, 누에 번데기 열수추출물과 1종이상의 담체로 구성되며, 특히 주요 활성성분으로 누에 번데기 열수추출물과 인삼, 하수오 및 울금의 에탄올추출물을 중량비로 7 : 1 : 1 : 1의 비율로 구성된 에스트로젠(estrogen) 작용을 활성, 증진시키는 기능성 식품이다.

누에 번데기 열수추출물, 에스트로젠 활성 기능성 식품.

Description

누에 번데기 열수추출물을 함유한 에스트로젠 활성화 작용을 갖는 기능성 식품{Functional food containing silkworm extract for the promation of estrogenic activity}

도 1은 에스트로젠 수용체(estrogen receptor : ER)의 구조를 나타낸 도이고,

도 2는 에스트로젠 수용체 알파(estrogen receptor-α, ER-α)와 베타(estrogen receptor-β, ER-β)의 기초구조를 나타낸 도이며,

도 3은 에스트로젠 수용체 알파(estrogen receptor-α, ER-α)와 베타(estrogen receptor-β, ER-β)의 인체 전 분포도이고,

도 4는 에스트로젠 전구체를 보인 도이며,

도 5는 주요 에스트로젠 17β-에스트라디올, 에스트론, 에스트리올의 구조를 보인 도이고,

도 6은 에스트로젠의 합성과 대사경로에 관한 도이며,

도 7은 아로마타제(aromatase)로 안드로젠이 에스트로젠으로 전환되는 경로를 보인 도이며,

도 8은 에스트로젠의 대사의 태양을 보인 도이고,
도 9는 미성숙 마우스에서의 자궁/체중 무게비율을 나타낸 그래프이며,
도 10은 미성숙 마우스에서의 난소/체중 무게비율을 나타낸 그래프이고,
도 11은 미성숙 마우스의 간조직에서 에스트로젠 수용체 알파의 발현 (웨스턴 브롯팅 ; A) 및 발현을 덴시토미터로 수치화하고 정상대조군을 기준으로 발현의 증가와 억제를 백분율로 표시한 그래프이며(덴시토미터 분석 ; B),
(1) control(대조군), (2) 17β-에스트라디올(E2)(10^-6M), (3) 누에 번데기 열수추출물 KW100, (4) KW500, (5) 누에 번데기 열수추출물과 울금, 인삼, 하수오의 7 : 1 : 1 : 1의 혼합물 MK100, (6) MK500, (7) 누에 번데기 에탄올 추출물 KO100, (8) KO500으로 처리된 것임.
도 12는 미성숙 마우스의 간조직에서 에스트로젠 수용체 베타의 발현(웨스턴 브롯팅; A) 및 발현을 덴시토미터로 수치화하고 정상대조군을 기준으로 발현의 증가와 억제를 백분율로 표시한 그래프이다(덴시토미터 분석; B).
(1) control, (2) E2, (3) KW100, (4) KW500, (5) MK100, (6) MK500, (7) KO100, (8) KO500은 도 11 설명 참조.

에스트로젠(Estrogen)은 난소에서 분비되는 스테로이드계 여성호르몬으로 여러 표적 장기에서 그 기능이나 세포의 성장 및 분화에 관여하는 주요한 호르몬 중의 하나이다. 다른 스테로이드 호르몬과 마찬가지로 표적 세포(target cell)의 세포질 속에 있는 수용체와 결합하여 핵으로 옮겨지고 세포의 기능을 조절한다. 에스트로젠(Estrogen)의 표적 장기로는 유선, 자궁, 난소 및 고환과 전립선을 포함한 여성 및 남성의 생식 기관들과 뇌이다. 작용으로는 자궁의 발달, 자궁 내막·젖샘의 발달, 그 밖의 2차 성징의 촉진, 지방 합성의 증가, 간 기능과 골 대사로의 영향 등이 있다.

에스트로젠 수용체(Estrogen receptor, ER)는 스테로이드/티로이드 홀몬 수용체 슈퍼 패밀리(steroid/tyroid hormone receptor super family)의 일원으로서 전사를 직접 조절하는 표적 유전자(target gene)의 증강영역(enhancer region)에 존재하는 응답요소(responsive element)에 리간드(ligand) 의존적인 결합을 하여 그 작용을 매개한다. 에스트로젠(Estrogen)은 세포 내 에스트로젠 수용체(estrogen receptor, ER)에 결합하여 유전자(gene) 발현을 조절하고 이는 여러 표적(target) 조직의 성장, 분화 및 기능에 영향을 준다. 에스트로젠(Estrogen)이 에스트로젠 수용체(Estrogen receptor, ER)에 결합할 때 수용체중합화(receptor dimerization)가 발생하고 이는 곧 에스트로젠-응답요소(estrogen-responsive element; ERE)에 결합한다. 결과적으로, ER-ERE 복합체(complex)는 프로게스테론 수용체(progesterone receptor; PR)와 푸리세넬린(presenelin-2; pS2)와 같은 에스트로젠(estrogen)이 조절하는 표적 유전자(target gene)의 전사를 조절하고 결국 세포의 성장과 분화를 자극한다. 1995년까지 에스트로젠(estrogen)은 하나의 수용체(receptor; ERα)를 통해 작용한다고 생각했으나 이후 새로운 에스트로젠 수용체 섭타입(estrogen receptor subtype; ERβ)이 쥐 전립선으로부터 분리되었다. 이 두 수용체 섭타입(receptor subtype)의 조직 분포는 서로 다르다. 에스트로젠 수용체 알파(estrogen receptor-α, ER-α)는 자궁에서 다량 발현되고, 고환, 뇌하수체, 난소, 신장, 부고환, 부신에서 소량 발현되는 반면, 에스트로젠 수용체 베타(estrogen receptor-β, ER-β)는 전립선, 난소, 부신, 비장, 폐, 담낭, 뇌, 고환, 유방, 뼈에서 많이 발현된다. 에스트로젠 수용체 알파(estrogen receptor-α, ERα)와 에스트로젠 수용체 베타(estrogen receptor-β, ERβ) 모두는 중추 신경계, 유방, 심혈관계 및 뼈에 공존한다. 합성 또는 자연으로 존재하는 리간드(ligand)는 cell-type, ERE-promotor 환경, ER subtype, 다양한 보조활성제(coactivator)와 보조억제제(corepressor) 수준에 의해 영향받는 조직 특이적 작용을 나타낸다.

최근 연구에서 콩에 존재하는 피토에스트로젠(phytoestrogen)이 풍부한 섭취로 동양 여성의 암 발생과 핫 후래쉬(hot flash) 수를 감소시킨다고 보고되었고, 신혈관 생성 작용, 항산화 작용 등 생리적 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 인삼은 MCF-7 유방암세포(breast cancer cell)에서 estrogen-regulated gene인 pS2 발현을 유도한다고 보고되었고, 감초는 에스트로젠(estrogen) 및 앤티-에스트로젠(anti-estrogen) 활성 모두 갖는다고 보고되었다. 홉, 메밀, 회향씨, 보리, 호밀 등에서 추출한 물질로 폐경기 전 여성들을 대상으로 한 연구가 있으며, 콩류, 씨앗, 해조류에 대한 에스트로젠(estrogen) 활성 검색에 대한 연구가 보고된 바 있다. 이러한 활성의 임상적 의미는 아직 알려지지 않고 있다.

동의보감에 나와 있는 천연 자양 강정 식품인 누에 번데기는 한방에서는 잠용자(蠶踊子)라고 부르며, 성질이 고르고 맛이 달며 독이 없어, 풍과 여윈 것을 다스린다고 하였다. 그리고 당뇨병이나 회충 없애는 약효도 있다는 것이 개재되어 있다. 누에 번데기 수용성 추출물의 생활사를 잠깐 살펴보면 다음과 같다. 누에는 완전 탈바꿈을 하는 곤충으로 그 1세대는 알, 유충, 번데기 및 나방의 네 시기를 경과하면 알로 월동한다. 누에 알은 일정한 기간을 경과하면 부화하여 개미 누에가 되고, 개미 누에는 3-4 일 정도 뽕잎을 먹으면 잠에 들어간다. 이와 같이 첫잠에 들어간 상태를 1 면이라 하고, 이때의 누에를 1 면잠이라 부른다. 1 면은 16 시간 정도 잠을 잔 후 허물을 벗고 2 령인 누에가 된다. 누에는 보통 잠을 4 번 자는 4 면잠이다. 누에는 5 령이 되어서 7-8 일 정도 뽕잎을 먹으면 가장 크게 자라서 뽕 먹기를 중지하고 토사하기 시작한다. 이때의 누에를 익은 누에라고 한다. 익은 누에는 2-3 일 정도에 걸쳐서 누에고치를 짓고, 그 속에 들어가 번데기로 탈바꿈한 다음 번데기는 10-15 일 정도 지나서 나방으로 탈바꿈하여 누에고치를 뚫고 나와서 교미 산란을 하고 그 1 세대를 마친다. 누에 번데기는 고지혈증을 유발시킨 실험용 쥐에 누에 번데기에서 추출한 불포화 지방산을 먹인 결과 동맥 경화 지수를 30 % 정도 감소시키는 효과를 얻었다고 밝혀졌다. 또 피부의 기름기를 제거해 피부 건조증을 유발시킨 뒤 불포화 지방산을 바른 결과 피부 보습도가 바르지 않은 것에 비해 50 % 이상 향상된다는 보고가 된 바 있다. 그리고 수컷 누에 번데기의 성분에서 남성의 발기 촉진 성분의 하나로 알려진 cGMP의 합성을 촉진하는 단백질을 추출 분리해 그 구조를 구명하고 발기 촉진활성을 강화하는 성분이라는 사실을 실험적으로 입증된바있다.

본 발명에서는 누에 번데기 추출물 및 식용 자원 29 종을 대상으로 시험관 내 실험(In vitro assay)에서 MCF-7 cell proliferation assay와 estrogen receptor binding assay를 이용하여 estrogen 활성을 갖는 물질을 탐색하였다. 그리고 생체내 실험(in vivo assay)에서는 미성숙 ICR mouse에 누에 번데기 열수추출물과 에탄올추출물 및 한약재를 혼합한 복합체를 경구 투여하여 에스트로젠(estrogen) 증식 관련 인자의 발현을 확인하고, 난소와 자궁의 무게를 측정하여 에스트로젠(estrogen) 활성 효과를 관찰하여 기능성 식품을 개발하고자 하였다.

1. 에스트로젠(Estrogen)의 역할과 기능

1.1 에스트로젠(Estrogen) 반응

에스트로젠 수용체(Estrogen receptor; ER)은 리간드-활성(ligand-activated) 전사 요소로 활성화 후 특별한 DNA 요소와 결합하고 표적 유전자들의 전사 레블(level)을 조절한다. 최근 에스트로젠 수용체(ER)의 인산화는 에스트로젠(estrogen)의 활성과 관계없이 조절된다는 보고가 있다.

1.1.1. 의존성 리간드(ligand)의 작용 기전

에스트로젠 수용체(Estrogen receptor; ER)의 구조

에스트로젠 수용체(ER)은 핵 호르몬 수용체들의 구성 요소이고 활성화된 리간드(ligand)의 전사 요소이다. 에스트로젠(estrogen) 호르몬 작용의 중개자인 에스트로젠 수용체(ER)은 주요한 생리적 과정과 생식 기능을 가진다. 그것의 불균형은 불임증, 유방암 및 골다공증을 유발할 수 있다. 일차구조의 에스트로젠 수용체(ER) 순서(도 1 참조)는 595 아미노산을 구성하고 5 개의 다른영역, A/B, C, D, E 및 F로 다시 나눌 수 있다(Tora, L., et. al., The human estrogen receptor has two independent nonacrdic transcriptional active function, Cell 59, 477-487, 1989 참조). 또한 에스트로젠 수용체(ER)은 C맨 끝 LBD(ligand binding domain)은 리간드-의존성(ligand-dependent)의 활성화 기능(AF-2)을 가지고 N 말단 A/B 영역은 리간드-독립성(ligand-independent)의 활성화 기능(AF-1)을 가진다. A nuclear localization signal(NLS)는 C와 D 도메인(domain)의 사이에 있는 수용체에서 확인되었다. E 도메인(domain)은 ligand binding domain(LBD)처럼 다각적인 활동과 리간드 결합(ligand binding) 활성을 포함한다. C-말단 F 도메인의 모든 NRs와 이 영역의 역할은 알려지지 않고 있다.

에스트로젠 수용체(ER)은 이하의 다른 2개의 영역인 C말단 리간드-결합 도메인(ligand-binding domain)과 N말단 전이 활성 도메인(도 2 참조), 즉 에스트로젠 수용체 알파(ER-α)와 에스트로젠 수용체 베타(ER-β)로 존재한다. 에스트로젠(Estrogen)의 활동의 메커니즘에서 에스트로젠 수용체 베타(ER-β)가 보여주는 가장 중요한 요소는 그것이 많은 조직, 중앙 신경조직을 포함하여, 심장 혈관 계통, 면역 계통, 비뇨 생식기 지역, 위장 지역, 신장 및 폐 안에서 발현된다는 것이다. 에스트로젠 수용체 알파(ER-α)는 주로 자궁 및 유방 등의 생식기에 집중적으로 발현된다. 비록 에스트로젠 수용체 베타(ER-β)가 유방 동맥 안에 발현되어도 에스트로젠 수용체 알파(ER-α)가 이 조직 안에서 더 중요한 에스트로젠 수용체이다. 그리고 자궁 안 또한 에스트로젠 수용체 베타(ER-β)보다는 에스트로젠 수용체 알파(ER-α)가 더 많은 것으로 나타난다(도 3 참조). 폐경 후 여성의 호르몬 대체 요법이 점차 중요한 건강상의 논점으로 부각되기 때문에 이 세포 분배의 차이점은 약학의 관점에서 극도로 중요하다.

에스트로젠 활성(Estrogen activity)

에스트로젠은 난소에서 생성되어 혈관을 통해 표적 세포에 도달하여 단순 확산에 의해 세포 내로 들어가, 표적 세포의 핵 내에 존재하는 전사인자인 에스트로젠 수용체와 결합을 통하여 표적 유전자의 전사 활성도에 영향을 미침으로써 그 기능을 나타낸다. 리간드가 없을 경우 에스트로젠 수용체(ER)에는 소수의 복합적인 힛-삭 프로테인(heat-shock protein) 등의 여러 단백질과 결합되어 있다가 리간드의 결합으로 활성화되어 이량체(dimer)를 형성하여 특정 유전자의 증강제(enhancers)(hormone responsive element)에 결합하여 염기성 전사기관(basal transcription machinery)과 각종 보조조정자(coregulator)와 결합하여 전사 활동을 조절한다.

1.1.2. 비의존성 리간드의 작용기전(Signalling pathways)

몇 명의 연구가들은 에스트로젠 수용체(ER)을 생체내실험(in vivo)에서 인 단백질을 발견하고 인산화가 에스트로젠 수용체(ER)을 위해 중요하다고 발표했다. 에스트로젠 수용체(ER)은 리간드의 독립 인산화에 의해 활성화될 수 있다. 에스트라디올(Estradiol)에 종양세포 증식인자(TGF-a)와 인슐린양 성장인자(IGF-1)의 결합이 상승적인 활성화를 이루게 해도 에스트라디올이 없을 경우 에스트로젠 수용체(ER)은 표피 성장 요인(EGF)에 의해 활성화되어 성장 요인-a(TGF-a)와 인슐린양 성장 요인(IGF-1)을 변형시킨다. 표피 성장 요인(EGF)에 의한 자극은 에스트로젠 수용체(ER)의 A/B영역 안에 한 개 이상의 잔여물이 인산화에 관련되어 맵키나제(map kinase) 통로에 의해 전달된 것으로 나타난다. 에스트로젠 수용체(ER)은 어떤 기초적 전사 요인, 예를 들면, TBP(TATA binding protein)와 TAFⅡ30(TBP-associated factor)에 리간드-의존성(ligand-independent)의 성질 안에 직접적인 상호작용을 한다고 보고된바 있다.

1.2. 에스트로젠(Estrogen)의 생리적인 효과

에스트로젠은 난소 기능의 근원으로 여성의 건강 유지에 필수적이다. 폐경은 중년 나이에 자연스럽게 일어날 수도 있지만 젊은 여성에게 일어날 수도 있다. 에스트로젠은 사춘기 동안에 가슴의 성장과 비뇨 생식기의 성숙과 같은 이차 성징의 발달에 관련이 있다. 그리고 에스트로젠은 간, 뼈, 뇌, 혈과, 지방이 많은 조직 등의 표적 조직에서 발견되었다.

1.2.1. 뼈 형성

골은 석회화된 견고한 표면과 골수로 불리는 내부의 세포 성분이 결합된 특수 조직이다. 생리적으로 상이한 이 두 구조의 결합은 일생을 두고 지속적으로 골의 재 형성(bone remodeling) 과정에 기인한 것인데, 이는 골에 가해지는 호르몬이나 물리적 자극에 의해 골수에 있는 파골세포(osteoblast)들이 골의 표면으로 모여 골을 파들어가면서 파괴하는 골 흡수(bone resorption)와 흡수가 일어난 자리에 모여든 조골세포(osteoblast)에 의한 골 기질의 합성(bone formation)으로 설명된다. 정상인에게는 골세포에 의한 골 흡수와 형성이 균형을 이루고 있으나 유전적, 생리적, 환경적 요인에 의해 초래된 변화가 파골 세포의 작용을 상대적으로 증가시키면 골의 화학적 변화없이 골 흡수가 증가되어 골 밀도는 낮아지고 골다공증으로 이어지게 된다. 폐경기 여성에게서 특히 골다공증의 발생 빈도가 높은 이유는 에스트로젠의 분비가 감소하기 때문으로 설명할 수 있다.

1.2.2. 심 혈관계 질환

ERs은 간에서 발현된다. 에스트로젠은 저밀도 리포단백질(LDL) 수용체인 간 단백질로 발현되어지고, 증가된 저밀도 리포단백질(LDL) 수용체의 발현은 심 혈관계 질환을 줄인다고 보고된바 있다. 에스트로젠은 심장 세포와 관상동맥 세포에 직접적으로 영향을 미쳐 혈관을 확장시키는 역할을 한다. 혈관이 느슨해지고 팽창되면 혈관 벽의 저항성이 감소하게 되어 혈압은 떨어진다. 또한, 에스트로젠은 고밀도/저밀도 리포단백질(HDL/LDL)의 비율에 상당한 영향을 미친다. 이러한 에스트로젠의 효과들은 남성들 또는 폐경기 이후의 여성들에 비해 폐경기 전의 여성들에게서 관상동맥 질환 발명률이 낮게 나타나는데 기여한다. 많은 선진국에서 심 혈관계 질환은 남성과 여성 모두에게서 가장 큰 사망 원인으로 보고되는데 폐경 이후 여성의 심 혈관계 질환 발병률은 급속히 증가하여 남성의 발병률에 근접하게 된다고 보고된 바 있다.

1.2.3. 알츠하이머병

과거에 발표된 연구 결과들에 따르면, 여성이 에스트로젠(estrogen)을 보충받으면 알츠하이머병의 발병 위험이 감소하는 것으로 알려져 있었다. 그러나 일단 알츠하이머병이 발생하고 나면 호르몬을 투여하더라도 별다른 효과를 거두기 어렵다는 새로운 연구 결과가 발표되었다. 여성의 발생 비율이 남성에 비해 약 두 배 정도 더 높은 것으로 밝혀져 있다. 여성의 발명 비율이 남성에 비해 더 높은 이유는 여성이 남성보다 더 오래 사는 경향을 보이기 때문이다. 아직까지 알츠하이머병의 발병 원인은 확실히 밝혀져 있지 못하다. 다만, 여성의 경우 폐경기와 함께 에스트로젠의 함량이 감소함으로써 알츠하이머병의 발병 위험이 높아질 수 있다는 가설이 과거에 제기된 바 있다. 이와 같은 가설 제기 후 에스트로젠 보충을 통해 알 츠하이머병을 치료하려는 일련의 연구들이 진행중으로 보고되고 있다.

1.2.4. 유방암

유방암은 서구 여성의 암의 일반적인 형태이다. 유방암에 의한 위험요소 중 가장 많은 요인은 에스트로젠(estrogen) 증가이다. 세포 분열의 비율이 에스트로젠에 의하여 영향을 미치고 유방 상피 세포의 확산을 자극해서 여성의 유방암 위험을 증가시킨다.

1.3. 에스트로젠(Estrogen)의 합성과 물질대사

1.3.1. 에스트로젠(Estrogen)의 합성

스테로이드 호르몬계에 속하는 에스트로젠(estrogen)의 전구체는 콜레스테롤이다(도 4 참조). 에스트로젠이 몸안에 들어가면 17베타-에스트라디올(17β-estradiol), 에스트론(estrone)과 에스티리올(estriol)로 나눠진다(도 5 참조). 17베타-에스트라디올(17β-estradiol)은 에스트로젠 중에서 가장 중심이 되는 호르몬이다. 에스트로젠은 에스트라디올로 주로 난소에서 합성되나 다른 조직에서도 만들어진다(도 6 참조). 지방조직뿐만 아니라 피부, 골격근, 머리카락낭 그리고 뼈는 에스트로젠 생성 조직이다. 이 조직들 안에서 합성되는 주된 에스트로젠은 에스트론이고 이 조직 안에 합성되는 중요한 에스트로젠은 에스트론(estrone)으로 이 생성물은 폐경기 후 여성과 남성의 에스트로젠의 중요한 요소이다. 임신 중에 약한 에스트로젠인 에스트리올은 임산부나 태아의 부신으로부터 분리되어 전구체로부터 태반으로 합성되어진다. 월경 주기 동안에 난소 안에 에스트라디올의 합성은 여포 호르몬 자극 (FSH)과 뇌하수체 전엽에서 분비되는 황체 형성 호르몬 (LH)에 의해 자극된다.

사이토크롬(Cytochrome) P450(P450arom)인 아로마타제(aromatase)는, 에스트로젠 호르몬의 합성에 핵심효소이다(도 7 참조). 인체의 아로마타제 활성(Aromatase activity)은 지방 조직, 난소, 고환, 태반, 뇌 안에서 발현된다. CYP19는 에스트로젠을 재생산하는 기능을 가지고 있고, p450 효소는 환경 오염 물질의 개발과 재생산 독성학에 핵심 역할을 한다.

1.3.2. 에스트로젠(Estrogen)의 대사

에스트로젠(Estrogen)을 대사하는 사이토크롬(cytochrome) P450 효소는 표적 조직과 이 조직에서 수산화된 에스트로젠의 결과물들이 표현된다(도 8 참조). 에스트라디올(Estradiol) 대사산물은 에스트로젠 수용체에 가깝게 바꿔지고 표적 조직이 비 활동적이고 생물학적 효과를 형성할 수 있다. 표적 조직 안에 효소를 물질 대사로 변화시키는 변화는 에스트로젠 활동을 좌우한다. 카테콜(Catechol)에 에스트라디올(estradiol)이나 에스트론(estrone)의 2번 위치의 하이드록실화(2-hydroxylation)는 간에서의 중요한 변화 통로이다. 사이트크롬(cytochrome) P450의 많은 다른 이성체들(isoforms)은 간에서 에스트라디올의 2-하이드록실화된 것이다. 인간에게 사이토크롬(cytochrome) P4501A2과 3A은 간 에스트로젠 2-하이드록실화를 위해 중요한 효소이다. 인간 유방암 세포 MCF-7 cell에 에스트라디올의 하이드록실화는 사이토크롬(cytochrome) P4501A1/1A2의 촉매 작용에 영향을 미친것으로 나타난다. 사이토크롬(cytochrome) P450 3A4이 몇몇의 조직에 있기 때문에 사이토크롬 P450 isoform은 조직 안에서 에스트라디올의 2-하이드록실화를 도와준다.

본 발명의 목적은 누에 번데기 열수추출물을 함유한 여성호르몬인 에스트로젠(estrogen) 양작용을 갖는 기능성 식품을 개발, 제공하고자 하는 것으로, 에스트로젠 효능을 갖는 누에 번데기 열수추출물의 새로운 용도를 규명하고, 제품으로 개발하고자 하는 것이다.

본 발명은 누에 번데기 열수추출물을 유효성분으로 하는 에스트로젠 작용을 갖는 기능성 식품에 관한 것으로, 보다 상세하게는 에스트로젠 효과를 나타내기 위한 누에 번데기 열수추출물 유효량과 1종 이상의 담체로 구성된 에스트로젠 작용을 갖는 기능성 식품이다.

본 발명에 따른 더욱 바람직한 기능성 식품의 조성은 에스트로젠 효과를 갖는 누에 번데기 열수추출물 유효량과 인삼, 하수오 및 울금의 에탄올추출물을 7 : 1 : 1 : 1의 중량비율로 구성된 기능성 식품이다.

본 발명의 누에 번데기 추출물은 암수구별 없이 12-13 일째의 누에번데기를 믹서기에서 분쇄한 분말을 에탄올로 2-3 시간 동안 1차 추출한 후, 60 메쉬체로 여과한 다음 농축시켜 누에 번데기 에탄올추출물을 얻고, 그 다음 잔사를 2차로 정제수로 80~100 ℃로 추출 후 60 메쉬체로 여과 한 다음 여액을 동결건조시켜 얻은 누에 번데기 열수추출물이다.

인삼(Panax Ginseng), 하수오(Polygonum multiflorum) 및 울금(Curcuma longa)은 널리 알려진 약용식물로 각각을 에탄올로 추출 여과하고, 여액을 감압 농축한 후 동결건조시켜 각각 생약의 동결건조분말을 얻은 것이다.

제제면에서 허용가능한 담체로는 식품에 있어서 통상적으로 첨가될 수 있는 식품첨가물이 사용될 수 있다.

예를들면, 액체 제형으로는 누에 번데기 열수추출물 등 주요 활성물질과, 수용성 칼슘에 레드비트, DHA, 타우린, 올리고당, 액상과당, 구연산, β-싸이클로덱스트린, 비타민류, 및 정제수를 포함시켜 관용적으로 제제화할 수 있다.

정제 제형으로, 누에 번데기 열수추출물 등 주요 활성물질과 탄산칼슘, 유당 등의 부형제, 옥수수, 녹말 등의 결합제, 붕해제, 스테아린산, 탈크등의 활택제를 포함시켜 관용적으로 제제화할 수 있다.

캅셀 제형으로, 누에 번데기 열수추출물 등 주요 활성물질과, 탄산칼슘, 카오린 등의 부형제와 함께 경질캅셀화하던가, 오일 등의 기름 용매를 사용하여 에멀젼화하여 연질캅셀제로 제제화할 수 있다.

그밖에 과립제나 시럽제 등으로 제제화가 가능하다.

본 발명에 따른 에스트로젠양 작용을 갖는 기능성 식품의 복용량은 환자의 나이, 체중, 일반적 건강상태, 성, 식사, 투여시간, 배설속도, 약물병용, 치료하는 동안의 질병의 정도등에 따라 달라질 수 있으며, 바람직하게는 성인 체중 60 ㎏ 기준 누에 번데기 열수추출물을 1 일 100~150 ㎎까지 복용이 가능하다.

이하 본 발명에 따른 제제예 및 실험예를 기재한다.

제제예

1) 누에 번데기 열수추출물의 제조

누에 번데기 열수추출물은 암·수구별이 12-13 일째 누에 번데기를 1 ㎏을 체취하여 믹서기에서 분쇄하고 80 % 에탄올(EtOH)로 2 시간 동안 1 차 추출한 후, 60 메쉬체로 여과한 다음 증발기(Evaporator)에서 농축하여 누에 번데기 에탄올추출물을 얻고, 그 다음 잔사를 정제수로 80 ℃에서 500 ㎖씩 두번 추출 후, 60 메쉬체로 여과한 다음 여액을 7 일간 동결건조하여 누에 번데기 열수추출물을 얻었다(수율 표 1 참조).

2) 29종의 식용식물 후보물질은 각각 잘 건조된 분말 0.2 ㎏씩을 80 % 에탄올(EtOH)로 이틀동안 방치한 후 추출하여 여과하고, 여액을 감압 농축한 후 72 시간 동결건조시켜 각각의 식물의 에탄올추출물을 얻었다(수율 표 1 참조).

3) 정제

1 정중 처방(㎎)

누에 번데기 열수추출물 100

유당 350

총 450 ㎎

제제 방법 : 상기처방의 조성량을 갖고 균질하게 혼합한 후 타정하여 제조한다.

4) 연질캅셀

1 연질캅셀 중 처방 (㎎)

누에 번데기 열수추출물 70

인삼 에탄올추출물 10

하수오 에탄올추출물 10

울금 에탄올추출물 10

팜유 40

밀납 15

레시틴 15

콩기름 220

총 390 ㎎

제조방법 : 상기 처방의 조성량을 갖고 균질하게 혼합하여 현탁액을 제조한 후 젤라틴 연질캅셀에 충진하여 제조한다.

실험예

누에 번데기 열수추출물의 에스트로젠 작용에 관한 실험.

1. 재료 및 시약

본 실험에 사용된 누에 번데기(Silkworms) 및 식용식물 29종(Table 1)은 건조된 것으로 경동시장에서 구입하였다. 표준물질로는 17β-estradiol(E₂)(Sigma Chem. Co., USA)을 사용하였고, 추출용 에탄올은 Merck Co(Damstandt, 독일)의 제품을 사용하였다. MCF-7 human breast cancer cell line은 한국 세포주 은행(서울대학교 의과대학)에서 분양받아 계대 배양하여 실험에 사용하였다. 실험동물은 ICR계의 3주령 암컷 mouse(Orient Co., Ltd, Korea)를 이용하여 실험하였다.

2. 시료의 추출

누에 번데기 열수추출물은 암·수 구별 없이 12~13 일째 누에 번데기를 1 ㎏을 채취하여 믹서기에 분쇄하고 80 % 에탄올(EtOH)로 2 시간 동안 1 차 추출한 후, 60 메쉬체로 여과한 다음 증발기(Evaporator)에서 농축하여 누에 번데기 에탄올추출물을 얻고, 그 다음 잔사를 정제수로 80 ℃에서 500 ㎖씩 두번 추출 후 60 메쉬체로 여과하여 7 일간 동결 건조하여 얻은 누에 번데기 열수추출물을 사용하였다. 식용식물 29 종의 후보물질은 각각 잘 건조된 분말 0.2 ㎏씩을 80 % 에탄올(EtOH)에 이틀동안 실온에 방치한 후에 추출하여 여과하고 여액을 감압 농축한 후 72 시간 동결 건조해 시료로 사용하였다. 추출물의 수율은 표 1과 같다.

표 1. 시료의 수율

표 1. (계속)

1. 시험관내 실험(In vitro assay)

1-1. 세포배양

MCF-7 세포주는 폴리스틸렌(polystyrene) 세포배양 접시에 부착시키고, 5 % FBS(Gibco, USA)와 penicillin-streptomycin(Gibco, USA)이 함유된 페놀 레드후리 디엠이엠(phenol red-free DMEM)(Gibco, USA)을 사용하여 5 % CO₂, 37 ℃ 인큐베이터(incubator)에서 배양하였다. 배양된 세포는 3-4 일 마다 배양액을 교환하고, 1 주일마다 0.25 % 트립신(trypsin)으로 세포를 분리하여 원심분리(1,500 rpm, 5 min)한 후 일정 수 분할하여 계속 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.

1-2. MCF-7 세포의 증식 측정

시료 추출물은 디메틸설폭시드(DMSO, Sigma Chem, CO.)에 최종 농도가 0.05 %가 되도록 녹이고, 여과기(filter)(0.22 ㎛ pore size, Millipore)로 여과 멸균하여 사용하였다. 양성 대조군은 17베타-에스트라디올(17β-estradiol)(E₂)을 시료 추출물과 마찬가지로 디메틸설폭시드(DMSO)에 녹여 성인 여성의 에스트로젠(estrogen) 혈중 농도 40~80 pg/㎖(0.15^-0.3×10^-9M)를 기준으로 하여 10^-9~10^-6M의 농도로 사용하였다. 시료 추출물의 농도는 예비 실험을 통하여 결정한 250, 62.5, 15.6, 3.90 ㎍/㎖로 하여 실험하였다. 페놀 레드후리 디엠이엠(phenol red-free DMEM)에 5 % dextran-coated charcoal-stripped FBS (DCC-FBS)와 페니실린-스트랩토마이신(penicillin-streptomycin) (test media)를 희석시켜 96 well plate에 0.5×10⁴ cell/well의 농도로 분주하고 5 % CO₂, 37 ℃ 인큐베이터(incubator)에서 24 시간 전 인큐베이션(pre-incubation)한 후 시료 추출물, 17β-에스트라디올(E₂)를 농도별로 투여하여 5 일간 배양하였다. 각각의 well에 엠티티(MTT)시약을 30 ㎕/well의 농도로 첨가하고, 2 시간 30 분동안 37 ℃에서 배양하여 엠티티(MTT)가 호르마잔(formazan)으로 분해되도록 하였고 그 양은 엘리사 리더(ELISA Reader)를 이용하여 570 nm에서 흡광도(absorbance)를 측정하여 결정하였다. 흡광도는 엠티티(MTT)가 세포에 의해 호르마잔(formazan)으로 분해된 양을 나타내므로 각 well의 생존 세포 수와 비례한다. 각 시료에 대한 세포 증식 증가 효과는 3 회 반복 실험하여 평균값을 취하였고, 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도에 대한 시료군의 흡광도의 비를 백분율로 표시하고 그래프로 비교 분석하였다.

1-3. 차콜 덱스트란(Charcoal dextran)으로 처리된 FBS의 조제

소태아혈청(Fetal bovine serum)(FBS)는 estrogen 활성을 최소화시키기 위해 charcoal-dextran(CD)로 처리하였다. 활성화된 charcoal은 사용하기 전에 차가운 멸균증류수로 씻고 5 %양의 charcoal은 유리로 된 원심분리 튜브에 넣고 증류된 물은 채운 후 혼합액을 250 rpm으로 2 분간 원심 분리하여 상층액을 제거하고 멸균된 증류수를 채웠다. 이 과정을 3 회 반복하고 난 후 0.5 %의 텍스트란을 함유한 혼합액을 600 rpm으로 5 분간 원심 분리하고 상층액을 제거한 후 현탁액과 동일한 양의 FBS를 넣어 37 ℃에서 한 시간동안 저어주었다. 혼합물을 3,000 rpm에 20 분간 원심분리 후 상층액을 새로운 tube에 담아 3,000 rpm에 20 분간 원심분리하고 5 % charcoal-0.5 % dextran 포함된 FBS를 살균된 0.45 ㎛, 0.2 ㎛필터로 여과하여 -20 ℃에서 저장 후 사용하였다.

1-4. 에스트로젠 수용체 결합능(Estrogen receptor binding) 측정

에스트로젠 수용체(α, β) Competitor Assays Red Kit (PanVera, USA)를 사용하여 에스트로젠 수용체 결합능(ER binding) 측정을 실험하였다. ER competitor assay는 ER α와 ER β 리간드를 스크리닝하는 효율적인 방법으로서 에스트로젠 수용체(ER)이 florescent estrogen ligand에 첨가되어 ER/Flurmone ^TM EL(estrogen ligand) red complex가 형성된 후 시료가 첨가되면 에스트로젠 수용체(ER)에 결합하기 위해 ER/Flurmone ^TM EL red complex과 경쟁하게 된다. 만일 시료가 ER과의 결합능이 적으면 ER/Flurmone ^TM EL red complex가 그대로 남아있어 ER/Flurmone ^TM EL red complex의 형광도는 높은 값을 나타낼 것이고, 에스트로젠 수용체(ER)에 경쟁적으로 결합하는 시료는 ER에서 ER/Flurmone ^TM EL red ligand를 대신하여 결합하게 되어 그 형광도는 빠르게 감소할 것이다. 따라서 시료가 존재할 때 형광도의 변화가 에스트로젠 수용체(ER)에 대한 시료의 상대적인 친화도를 측정하는데 사용된다. 경쟁 커브(competition curve)를 작성하기 위해 희석된 농도별 시료에 ER/Flurmone ^TM EL red complex를 첨가하고 시료 농도에 따른 형광도 값을 측정한다. 최대 형광도의 절반이 되는 농도를 시료의 IC50으로 정의한다. 시료들은 4 %가 넘지 않는 DMSO에 섞여 ER Red Assay Buffer에 희석시킨다. 유리된 튜브에 에스트로젠 수용체 알파(ER α)는 30 nM, 에스트로젠 수용체 베타(ER β)는 60 nM, 그리고 Flurmone ^TM EL red는 2 nM 농도에 맞춰 ER Red Assay Buffer로 희석한다. 희석시켜놓은 시료들(에스트로젠 수용체 알파(ERα)는 8 ㎍/㎖ ~ 250 ㎍/㎖, 에스트로젠 수용체 베타(ERβ)는 0.2 ㎍/㎖ ~ 200 ㎍/㎖)을 black 384 well plate에 씩 넣고 만들어 놓은 ER α, ER β을 20 ㎕ 섞어서 암실에 37 ℃, 1~18 시간 방치시키고 난 후 필터 535 nm excitation, 590 nm emission의 조건으로 Fluorescence(TECAN, UK)을 찍었다. 약물 대조군으로 17베타-에스트라디올(17β-estradiol)을 사용하였다.

2. 생체내 실험(In vivo assay)

2-1. 동물 실험

ICR 계의 3 주령 암컷 ICR mouse를 입수하였으며, 입수시 체중은 7.5 g ~ 8.8 g 이였다. 고형사료(삼양주식회사, 한국)와 물을 충분히 공급하면서 1 주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 실험을 시작하였다. 실험실 온도는 24±2 ℃였으며, 습도는 40~50 %, 명암은 12 시간 주기로 하였다. In vitro에서 활성이 가장 좋은 누에 번데기 열수추출물과 에탄올추출물을 in vivo로 실험 후, 결과가 좋은 누에 번데기 열수추출물에 in vitro 실험에서 estrogen 활성이 좋은 3 가지 한약재(인삼, 울금, 하수오)를 첨가하여 실험하였다. 투여량은 1 인당 인상용량인 2 g의 약 3 배인 100 ㎎/㎏과 15 배인 500 ㎎/㎖로 설정하였다. 동물의 군분리는 순화기간 중 건강하다고 판정된 동물의 체중을 측정한 후 군별 7마리씩 체중이 균등하게 분배되도록 순위화한 체중을 이용하여 무작위법으로 분배하였다. 실험기간 중 주 1 회식 체중을 측정하였다. 시료물질은 0.2 % CMC(cellulose sodium salt)가 함유된 식염수에 녹여서 투여하였다. 투여경로는 경구투여로서 금속제 경구 투여용 존데를 이용하여 위 내에 직접 주입하였으며, 1 회/일, 7 일/주로 하여 약 4 주간 투여하였다. 누에 번데기 열수 추출물 100 ㎎/㎏, 500 ㎎/㎏을 투여한 군을 각각 KW100, KW500 이라 하고 누에 번데기 열수 추출물과 울금, 인삼, 하수오를 7 : 1 : 1 : 1의 비율로 혼합한 시료를 100 ㎎/㎏, 500 ㎎/㎏으로 투여한 군을 각각 MK100, MK500 이라고 하였으며, 누에 번데기 에탄올 추출물 100㎎/㎏, 500㎎/㎏을 투여한 군을 각각 KO100, KO500이라 하였다. 정상 대조군은 0.2 % CMC가 함유된 saline 을 동량 투여하였으며, 양성대조군은 25일째 17β-estradiol 0.7 mg/kg을 복강 투여하였다.

2-2. 동물과 조직의 무게 측정

실험 동물을 실험 전 24 시간 절식시킨 후, 에텔로 마취시켜 심장에서 전혈을 채취 후 3,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 혈청을 분리하고 간과 자궁, 난소 를 적출하여 무게를 측정하였다.

2-3. 혈청(Serum) AST, ALT 측정

실험동물에서 채취한 전혈을 3,000 rpm에서 10 분간 원심 분리하여 혈청(serum)을 획득하였다.　혈청(Serum) 20 ㎕을 각각 37 ℃에서 예비-인큐베이션(pre-incubation)된 AST (aspirate aminotransferase)와 ALT (alanine aminotransferase)　기질액 1.0 ㎖과 37 ℃ 수용상에서 60 분 (AST) 또는 30 분간 (ALT) 반응시켰다. 그 다음 발색액인 2,4-디니트로페닐히드라진(2,4-dinitrophenylhydrazine) 1.0 ㎖을 첨가하여 실온에서 20 분간 방치한 후, 0.4 N NaOH 10 ㎖을 가하여 효소 작용을 정지시키고 옥살로아세테이트(oxaloacetate) 및 피루베이트(pyruvate)와 반응해서 생긴 히드라존(hydra-zone)을 505 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2-4. 크레아티닌(Creatinine) 측정

실험 동물에서 채취한 전혈을 3,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 혈청(serum)을 획득하였다. A1는 맹검은 피크린산 시약 3 ㎖ 넣고 검체는 피크린산 시약 3 ㎖에 혈청 0.1 ㎖, 표준은 피크린산 시약 3.0 ml에 기준액 0.1 ㎖을 넣은 후 37 ℃ 수조에서 20 분간 방치 후, 맹검을 대조로 하여 검체 및 표준의 흡광도를 515 nm에서 읽는다. A2의 맹검과 검체는 에시드 시약 2 방울을 더 첨가하여 37 ℃ 수조에서 5 분간 방치 후 맹검을 대소로 하여 검체 및 표준의 흡광도를 515 nm로 읽는다. 단, 표준에는 에시드 시약을 넣지 않는다.

2-5. 단백질 분리

단백질을 추출하기 위하여 균질기로 간조직을 분쇄한 후 용해완층액(lysis buffer)를 함유하여 얼음에서 30 분 방치한 후, 4 ℃에서 10,000×g에서 10 분간 원심분리 후 상등액을 취했다. 그리고 브래드포드(Bradford) 방법을 사용하여 단백질을 정량하였다. 각 단백질 시료를 95 ℃에서 5 분간 끓인 후 -70 ℃에 보관하였다.

2-6. 웨스턴 블럿트 분석(Western blot Assay)

각 단백질 시료를 65 ℃에서 5 분간 끓인 후 10 % SDS-PAGE gel에 레인(lane)당 15 ㎕씩 로딩(loading)하여 200 V, 25 mA에서 60 분간 전기영동 하였다. 전기 영동 후 분리된 단백질을 Hybond ECL nitrocellulose membrane으로 전이하기 위해 hofer TE70 Semi-Dry Transfer Unit(Pharmacia, Bucks, UK)을 이용하여 32 V, 285 mA로 60 분간 블럿팅(blotting)한 후 단백질이 전이된 멤부레인을 TTBS(0.1 % Tween20가 함유된 Tris buffered saline) 완충액으로 세척한 다음, 10 % skin milk에서 하루를 방치하였다. 1차 항체(ERα, ERβ: Santa Cruz Biotech, Inc, USA)를 buffer에 1:2000 농도로 희석하여 4 ℃에서 반응시킨 후 멤브레인을 TTBS로 세척하고 1:50000 배로 희석한 2 차 항체(goat anti-rabbit IgG-peroxidase: Santa Cruz Biotech, Inc, USA)와 실온에서 2 시간 반응시켜 ECL법으로 발색하고 x-ray film에 감광하였다.

3. 통계분석

모든 실험 결과의 통계처리는 SAS 통계 프로그램 (SAS institute, 1998)을 이용하여 분석하였으며, 그 결과는 평균값과 표준오차로 표시하여 유의성을 아노바(ANOVA)로 검증하였다.

Ⅲ. 결과 및 고찰

1. 생체외 실험(In vitro assay)

1-1. MCF-7 세포 증식 효과

에스트로젠(Estrogen) 활성을 평가하기 위해 MCF-7 cell에서 세포 증식 효과에 대해 실험한 결과는 표 2와 같다. 각각의 시료의 농도는 4, 15.6, 62.5, 250 ㎍/㎖으로 하여 비교 분석하고 대조군의 세포 증식을 100 %로 환산하여 이에 각 시료군의 성장 비율로 나타내었다. 대조군은 단지 5 % 활성탄과 덱스트란을 전처리한 5 % 우혈청을 포함하는 배지만을 이용하여 배양하였다. 약물 대조군인 17β-estradiol은 농도 10^-9 M에서 162.53 %로 가장 많은 증식 효과를 가졌다. 누에 번데기 열수 추출물은 대조군에 비해 모두 유의적으로 세포 증식을 증가시켰으며 증식 증가 최대치는 4 ㎍/㎖농도에서 132.56 %이였다. 누에 번데기 에탄올 추출물은 농도 4, 15.6 ㎍/㎖에서 각각 101.76, 100.49 % 세포 증식을 시켰으나 농도 62.5, 250 ㎍/㎖에서는 세포 증식 억제 효과를 나타내었다. 대두 에탄올 추출물과 흑태 에탄올 추출물은 농도 250 ㎍/㎖에서 세포 억제 효과를 나타내었고 나머지 농도에서는 세포 증식 효과를 나타내었다. 쥐눈이콩 에탄올 추출물에서는 모든 농도에서 세포 억제 효과를 나타내었다. 서리태 에탄올 추출물은 농도 4, 15.6, 62.5 ㎍/㎖에서 세포 증식 효과를 나타내었다. 그 중 농도 4 ㎍/㎖에서 증식율이 117.97 %로 대조군에 비해 유의적으로 세포 증식을 시켰다. 마 에탄올 추출물에서 각각 농도에서 모두 세포 증식 효과를 나타내었다. 대조군에 비해 농도 15.6 ㎍/㎖과 62.5 ㎍/㎖에서 유의적인 세포 증식 효과를 보였다. 갈근 에탄올 추출물의 모든 농도에서 세포 증식 효과를 나타냈다. 농도 4 ㎍/㎖와 250 ㎍/㎖에서 대조군에 비해 유의적인 세포 증식 효과를 나타냈다. 석류 에탄올 추출물은 농도 4 ㎍/㎖에서 100.49 %로 세포 증식 효과를 나타내었고 맥아는 모든 농도에서 세포 증식 효과를 가졌다. 최대 세포 증식 효과는 농도 4 ㎍/㎖에서 107.42 %이였다. 백미, 현미, 흑미 에탄올 추출에서는 모두 세포 억제 효과를 나타내었다. 참깨 에탄올 추출물에서는 대조군에 비해 농도 62.5 ㎍/㎖에서 117.48 %로 유의적인 세포 증식 효과를 가졌으며 나머지 농도에서는 세포 억제 효과를 가졌다. 흑깨 에탄올 추출물에서는 모두 세포 억제 효과를 가졌으며 호두와 해바라기씨 에탄올 추출물에서는 각각 농도 15.6 ㎍/㎖과 4 ㎍/㎖에서 100.59 %, 104.39 %의 세포 증식 효과를 보였으며 나머지 농도에서는 세포 억제 효과를 가졌다. 계지 에탄올 추출물에서는 농도 4 ㎍/㎖에서 102.34 %의 세포 증식 효과를 보였고, 복분자에서는 모든 농도에서 세포 억제 효과를 보였다. 목화씨 에탄올 추출물의 농도 4 ㎍/㎖에서 112.40 %의 세포 증식 효과를 보였다. 구기자 에탄올 추출물에서 농도 4 ㎍/㎖에서 100.39 %의 세포 증식을 가졌고, 두충 에탄올 추출물에서는 농도 15.6, 62.5 ㎍/㎖에서 세포 증식 효과를 보였다. 인삼 에탄올 추출물의 농도 4 ㎍/㎖에서 120.31 %으로 대조군에 비해 유의적으로 세포 증식 효과를 보였으며 농도 15.6 ㎍/㎖에서 109.96 %의 세포 증가률을 가졌다. 하수오 에탄올 추출물에서 농도 250 ㎍/㎖를 제외하고 모두 세포 증식 효과를 보였으며 농도 15.6 ㎍/㎖에서는 대조군에 비해 유의적이였다. 황금 에탄올 추출물은 농도 4 ㎍/㎖와 15.6 ㎍/㎖에서 각각 108.03 %, 102.32 %의 세포 증식 효과를 가졌다. 소회향 에탄올 추출물의 모든 농도에서 세포 억제 효과를 가졌다. 숙지황 에탄올 추출물의 농도 250 ㎍/㎖을 제외한 모든 농도에서 세포 증식 효과를 보였으며, 오미자 에탄올 추출물은 농도 4 ㎍/㎖을 제외하고 모든 농도에서 세포 증식 효과를 가졌다. 당귀 에탄올 추출물은 250 ㎍/㎖을 제외한 나머지 농도에서 세포 증식 효과를 보였으며, 백출 에탄올 추출물은 농도 4 ㎍/㎖와 15.6 ㎍/㎖에서 각각 108.20 %, 106.05 %의 세포 증식 효과를 가졌다. 울금 에탄올 추출물에서는 모두 세포 증식 효과를 가졌으며 농도 4 ㎍/㎖와 15.6 ㎍/㎖에서는 118.75 %와 114.65 %로 대조군에 비해 유의적인 세포 증식 효과를 가졌다.

표 2. MCF-7 세포의 증식 측정

2. 에스트로젠 수용체 결합능(Estrogen receptor binding) 효과

본 연구에서는 시료의 에스트로젠 수용체 알파(ERα)의 결합능을 estrogen Receptor Competitor Assays Red Kit를 이용하였다. 시료가 에스트로젠 수용체 알파(ERα)와 에스트로젠 수용체(ER) 결합능이 적으면 ER/Flurmone ^TM EL red complex가 그대로 남아있어 ER/Flurmone ^TM EL red complex의 형광도는 높은 값을 나타낼 것이고, 에스트로젠 수용체 알파(ERα)와 에스트로젠 수용체 베타(ERβ)에 경쟁적으로 결합하는 시료는 에스트로젠 수용체(ER)에서 ER/Flurmone ^TM EL red ligand를 대신하여 결합하게 되어 그 형광도는 빠르게 감소하게 되는 원리를 바탕으로, 희석된 농도별 시료에 ER/Flurmone ^TM EL red complex를 첨가하고, 시료 농도에 따른 형광도 값을 측정하여 최대 형광도의 절반이 되는 농도 시료의 IC50 값을 표 3에 나타냈다.

시료에 에스트로젠 수용체 알파(ERα)결합능은 누에 번데기 에탄올 추출물, 누에 번데기 열수 추출물, 17베타-에스트라디올(E₂), 백출, 석류, 해바라기씨, 인삼, 참깨, 백태, 서리태, 오미자. 하수오, 울금, 흑깨, 소회향, 현미, 목화씨, 당귀, 두충, 백미, 쥐눈이콩, 흑태, 맥아, 구기자, 황금, 숙지황, 흑미, 복분자, 계지, 호두, 마, 갈근 순으로 IC50 값이 작게 나타났다. 에스트로젠 수용체 알파(ERα)의 결합능은 누에 번데기 에탄올 추출물이 IC50 8.6 ㎍/㎖로 가장 효과적으로 나타났으며, 다음이 누에 번데기 열수 추출물로 IC50 8.7 ㎍/㎖이다. 두 시료는 17β-estradiol(E₂)보다 높은 결합능을 보였다.

시료에 에스트로젠 수용체 베타(ER β)결합능은 누에 번데기 에탄올 추출물, E₂, 복분자, 누에 번데기 열수 추출물, 계지, 흑태, 황금, 백출, 울금, 참깨, 백미, 숙지황, 해바라기씨, 석류, 인삼, 두충, 흑미, 갈근, 소회향, 목화씨, 맥아, 백태, 하수오, 호두, 흑깨, 쥐눈이콩, 당귀, 오미자, 마, 현미, 구기자, 서리태 순으로 효과를 보였다. 누에 번데기 에탄올 추출물은 IC50 값 0.14 ㎍/㎖로 0.17 ㎍/㎖의 17β-estradiol보다 높은 결합능을 보였다.

표 3. 시료의 에스트로젠 수용체 친화력 측정.(IC50^*(㎍/㎖))

2. 생체내 실험(In vivo assay)

2-1. 미성숙 흰쥐에서의 체중 및 난소와 자궁의 무게 측정

미성숙 흰쥐에서 시료의 에스트로젠(estrogen) 활성을 연구한 결과 표 4에 나타난 바와 같다. 몸무게의 변화는 유의적인 차이를 보이지 않았다. 자궁의 무게는 정상대조군에 비해 모두 유의적인 차이를 보였다. 몸무게에 대한 자궁의 비율은 정상대조군에 비해 누에 번데기 열수추출물(KW500)을 제외하고는 모두 유의적 차이를 나타내었다. 자궁무게/몸무게의 비율(%)은 17베타-에스트라디올(E₂)군은 0.6527 %로 가장 높은 비율로 나타났고, 누에 번데기 에탄올추출물(KO500)은 0.4903 %의 비율을 나타내었다. KW100은 0.4849 %, K100과 누에 번데기 열수추출물과 울금, 인삼, 하수오 에탄올추출물의 7 : 1 : 1 : 1 의 혼합물 MK500은 0.4435 %, 0.4157 %의 비율을 보였고, KO100은 0.3874 %의 비율로 나타났다. 난소 무게/몸무게의 비율(%)는 정상대조군과 비교하여 MK100과 MK500은 유의적 변화를 보이지 않았으며, E₂는 0.0787 %, KW100은 0.0733 %, KW500은 0.0682 %, KO100과 KO500은 0.682 %과 0.675 %의 비율을 결과를 가졌다.

본 실험에서는 몸무게에 대한 자궁의 비율은 대조군에 비해 KW500을 제외하고는 모두 유의적 차이를 나타내었으며, E₂는 0.0787 %, KW100은 0.0733 %, KW500은 0.0682 %, KO100과 KO500은 0.682 %과 0.675 %의 비율을 결과를 가졌다. 몸무게에 대한 자궁과 난소의 비율이 정상대조군에 비해 증가한 것으로 보아 누에 번데기 열수 추출물과 한약재를 첨가한 누에 번데기 열수 추출물은 모두 에스트로젠(estrogen) 효과가 나타나는 것으로 사료된다.

표 4. 시료의 미성숙 마우스의 자궁무게에 대한 영향 측정.

2-2. 혈청 내 AST, ALT 활성과 크레아티닌 수치(creatinine level)

에스트로젠(Estrogen) 효과를 가진 시료들이 간장해에 미치는 영향은 표 5와 같다. 정상대조군의 AST 활성은 0.18±0.03 (unit/㎎) 였으며, 약물대조군은 0.17±0.02 (unit/㎎), 누에 번데기 열수 추출물(KW) 100 ㎎/㎏ 섭취군은 0.18±0.01 (unit/㎎), 누에 번데기 열수 추출물 500 ㎎/㎏ 섭취군은 0.20±0.07 (unit/㎎) 및 한약재 (인삼, 하수오, 울금 : 10 % : 10 % : 10 %)가 첨가된 누에 번데기 열수 추출물(MK)(70 %) 100 ㎎/㎏ 섭취군은 0.22±0.0085 (unit/㎎), 한약재(인삼, 하수오, 울금 : 10 : 10 : 10)가 첨가된 누에 번데기 열수 추출물(70 %)혼합물(MK) 500 ㎎/㎏ 섭취군은 0.23±0.01 (unit/㎎)였고 누에 번데기 에탄올 추출물(KO) 100 ㎎/㎏ 섭취군은 0.27±0.07 (unit/㎎), 누에 번데기 에탄올 추출물 500 ㎎/㎏ 섭취군은 0.28±0.04 (unit/㎎)로 나타났다. AST 활성을 정상대조군을 100 %로 나타내었을때 약물대조군은 75 %로 가장 낮아졌고 KW100, KW500, MK500, KO100은 각각 82.14, 89.29, 96.43, 89.29 %로 낮아졌고, MK100은 정상대조군과 같은 수치를 나타냈으며 KO500은 110.71 %로 높아졌다.

한편 ALT 활성은 정상대조군과 비교하여 유의적 차이를 보이지 않았다. 정상 대조군의 경우 0.08±0.03 (unit/mg), 약물 대조군은 0.06±0.01 (unit/mg), KW100 섭취군은 102.82±4.37 (unit), KW500 섭취군은 0.097±0.07 (unit/mg) 및 MK100 섭취군은 0.069±0.004 (unit/mg), MK500 섭취군은 0.09 (unit/mg), KO100 섭취군은 0.10±0.002 및 KO500 섭취군은 0.10±0.017를 보였다. ALT 활성을 정상대조군을 100 %로 나타내면 약물대조군이 28.84 %로 가장 낮은 활성치를 나타냈고, MK100은 88.14 %로 정상대조군에 비해 낮은 활성치를 보였다. 나머지 KW100, KW500, MK500, KO100, KO500은 각각 104.76, 119.04, 105.67, 122.49, 133.33 %로 정상대조군에 비해 높은 활성치를 보였다.

에스트로젠(Estrogen)의 효과를 가진 시료들이 신장해에 미치는 영향을 알아본 결과는 표 5와 같다. 정상대조군의 크레아티닌 level은 0.41±0.042 (mg/㎗), 약물대조 섭취군의 level은 0.31±0.05 (mg/㎗), KW100 섭취군은 0.332±0.03 (mg/㎗), KW500 섭취군은 0.36±0.039 (mg/㎗) 및 MK100 섭취군의 level은 0.41±0.07, MK500 섭취군은 0.39±0.03, KO100 섭취군은 0.36±0.06, KO500 섭취군은 0.45±0.04 (㎎/㎗)이었다. 정상 대조군의 level을 100 %로 환산하면 약물대조군이 75 %로 가장 낮은 활성치를 보였다. 정상 대조군에 비해 KW100, KW500, MK500, MK500 순으로 높은 활성치를 보였다. MK100은 정상대조군과 같은 수치를 나타내었으며 KO500은 정상 대조군 보다 높은 level을 나타내었다. 모든 섭취군은 정상대조군에 유의적인 차이를 가지지 않았다.

이에 본 실험에서 AST, ALT 의 활성 및 크레아티닌 수치(creatinine level)는 유의적인 차이가 없는 것으로 보아 모든 시료들이 간과 신장에 독성이 없는 것으로 사료되었다.

표 5. 미성숙 마우스의 혈청내 AST, ALT 활성과 크레아티닌 수치 측정.

2-3. 누에 번데기 열수추출물에 의한 에스트로젠(estrogen) 수용체 발현

에스트로젠(Estrogen) 수용체 발현은 도 11의 A에 나타난 바와 같다. 에스트로젠 수용체 알파(ERα)의 발현을 덴시토메타(densitometer)로 수치화하고, 정상대조군을 기준으로 발현의 증가와 억제를 백분율로 표시하여 도 11의 B에 나타내었다. 0.7 ㎎/㎏ 농도의 17β-에스트라디올(E₂)처리에 의한 ERα의 발현은 대조군(100 %)에 비해 311 % 증가되었고, 누에 번데기 열수추출물 KW100 (100 ㎎/㎏) 및 KW500 (500 ㎎/㎏) 처리에 의해 각각 197 %, 106 %, 누에 번데기 열수추출물과 울금, 인삼, 하수오의 7 : 1 : 1 : 1의 혼합물 MK100 (100 ㎎/㎏) 및 MK500(500 ㎎/㎏) 처리에 의해 각각 103 %, 139 %에 증가되었고, 누에 번데기 에탄올추출물 KO100(100 ㎎/㎏) 및 KO500 (500 ㎎/㎏)처리에 의해 각각 대조군의 98 %, 95 % 감소되었다. 누에 번데기 열수추출물(KW)에 의한 ERα 발현은 농도 의존적으로 감소하였으며, 누에 번데기 열수추출물과 울금, 인삼, 하수오의 7 : 1 : 1 : 1 혼합물(MK)에 의한 ERα 발현은 농도 의존적으로 증가하였다. 누에 번데기 에탄올추출물(KO)는 ERα의 발현에 영향을 주지 못했다. 본 실험에서 ERα의 수용체 발현에서 정상대조군을 100 %로 하였을 때 약물대조군이 311 %로 KW100이 197 %로 가장 높은 효과를 보였다.

에스트로젠(Estrogen) 수용체 발현은 도 12의 A에 나타난 바와 같다. 에스트로젠 수용체 베타(ERβ)의 발현을 덴시토메타(densitometer)로 수치화하고, 정상 대조군을 기준으로 발현의 증가와 억제를 백분율로 표시하여 도 12의 B에 나타내었다. 0.7 ㎎/㎏농도의 17β-에스트라디올(E₂)처리에 의한 ERβ의 발현은 대조군(100 %)에 비해 159 % 증가되었으나 ERα 발현 증가에 비해 약하였다. 누에 번데기 열수추출물 KW100 (100 ㎎/㎏) 및 KW500 (500 ㎎/㎏)처리에 의해 각각 147 %, 124 %, 누에 번데기 열수추출물과 울금, 인삼, 하수오의 7 : 1 : 1 : 1 혼합물 MK100 (100㎎/㎏) 및 MK500 (500 ㎎/㎏)처리에 의해 각각 135 %, 112 %로 증가되었고, 누에 번데기 에탄올추출물 KO100 (100 ㎎/㎏) 및 KO500 (500 ㎎/㎏)처리에 의해 85 %, 83 %로 감소되었다. KW과 MK에 의한 ERβ 발현은 농도 의존적으로 감소하였다. 본 실험에서 ERβ의 수용체 발현에서도 KW100은 147 %로 가장 높은 발현을 보였다.

Ⅳ. 요 약

누에 번데기 추출물 및 식용자원 29종으로부터 에스트로젠(estrogen) 활성을 갖는 물질을 탐색하고 미성숙 마우스(mouse)에서 누에 번데기 열수과 에탄올 추출물을 및 3종의 한약재가 첨가된 누에 번데기 열수 추출물 및 3종의 한약재가 첨가된 누에 번데기 열수 추출물을 투여하여 에스트로젠(estrogen) 증식 관련 인자의 발현을 확인한 결과는 다음과 같다.

1. 생체외 실험(In vitro)에서 estrogen activity screening assay를 위하여 MCF-7 cell proliferation assay를 수행한 결과, 시료 중 누에 번데기 열수 추출물이 4 ㎍/㎖농도에서 132.56 %로 정상 대조군에 비해 유의적으로 가장 높은 세포 증식 효과를 보였고, 15.6 ㎍/㎖, 62.5 ㎍/㎖농도에서도 128.56 %, 121.87 %로 유의적으로 높은 활성을 나타내었다. 인삼은 4 ㎍/㎖농도에서 120.31 %, 하수오는 15.6 ㎍/㎖농도에서 109.38 %, 울금은 4 ㎍/㎖, 15.6 ㎍/㎖농도에서 각각 118.75 %, 114.65 %의 유의적인 세포 증식 효과를 보였다.

2. 에스트로젠 수용체(Estrogen receptor) α와 β에 대한 시료의 상대적인 친화도를 측정하기 위해 ER competitor assay를 시료의 농도에 따른 형광도 값을 측정한 후 최대 형광도의 절반이 되는 농도를 시료의 IC50으로 정의하였다. 에스트로젠 수용체 알파(ER-α)와 에스트로젠 수용체 베타(ER-β)에 대한 시료의 상대적인 친화도 중 가장 높은 것은 누에 번데기 지용성 추출물로서 ER-α와 ER-β에 대한 IC값이 각각 8.6 ㎍/㎖과 0.14 ㎍/㎖로 나타났다. 그 다음으로 활성이 높은 시료는 누에 번데기 수용성 추출물로 ER-α와 ER-β에 대한 IC값이 각각 8.7 ㎍/㎖와 0.27 ㎍/㎖로 나타났다.

3. 미성숙 흰쥐에서 누에 번데기 열수 추출물(KW), 누에 번데기 에탄올 추출물(KO) 및 누에 번데기 열수 추출물(KW) 각각에 하수오, 인삼, 울금을 7 : 1 : 1 : 1의 비율로 첨가한 복합체(MK)를 각각 100 ㎎/㎏와 500 ㎎/㎏의 농도로 30 일간 경구투여한 결과 체중은 유의적 변화를 나타내지 않았다. 체중에 대한 자궁의 무게는 정상 대조군에 대하여 모두 유의적인 증가를 나타내었다(p<0.05). E₂(17β-estradiol)이 0.65 %로 가장 높은 비율로 나타났고, 다음 KO500, KW100, MK100 순으로 각각 0.49 %, 0.48 %, 0.44 %이었다. 체중에 대한 난소의 무게는 정상 대조군에 대해 MK군을 제외하고 모두 유의적인 변화를 보였다. E₂(17β-estradiol)이 0.0787 %로 가장 높은 비율로 나타났고, KW100은 0.0733 %로 나타났다.

4. 미성숙 흰쥐의 혈청 내 AST와 ALT 활성 및 크레아티닌 수치(creatinine level)는 모두 군간에 유의적인 변화는 보이지 않았다(p<0.05). 즉 모든 시료가 간과 신장에 독성을 나타내지 않은 결과이다.

5. 에스트로젠 수용체 알파(ERα)의 발현을 덴시토메타(densitometer)로 수치화하여 정상 대조군을 기준으로 발현의 증가와 억제를 백분율로 표시한 결과, E₂(17β-estradiol)가 311 % 증가되었고, 누에 번데기 열수추출물 KW100 (100 ㎎/㎏) 및 KW500 (500 ㎎/㎏) 군은 각각 197 %, 106 %, 누에 번데기 열수추출물과 울금, 인삼, 하수오의 7 : 1 : 1 : 1의 혼합물 MK100 (100 ㎎/㎏) 및 MK500 (500 ㎎/㎏)군은 각각 103 %, 139 % 증가되었고, 누에 번데기 에탄올추출물 KO100 (100 ㎎/㎏) 및 KO500 (500 ㎎/㎏)는 각각 98 %, 95 %로 감소되었다. 에스트로젠 수용체 베타(ERβ)의 발현을 덴시토메타로 수치화하여 정상 대조군을 기준으로 발현의 증가와 억제를 백분율로 표시한 결과, E₂(17β-estradiol)가 대조군의 159 % 증가되었고, 누에 번데기 열수추출물 KW100 (100 ㎎/㎏) 및 KW500 (500 ㎎/㎏)군은 147 %, 124 %, 누에 번데기 열수추출물과 울금, 인삼, 하수오의 7 : 1 : 1 : 1 혼합물 MK100 (100 ㎎/㎏) 및 MK500 (500 ㎎/㎏)군은 각각 135 %, 112 % 증가되었으며, 누에 번데기 에탄올추출물 KO100 (100 ㎎/㎏) 및 KO500 (500 ㎎/㎏)는 각각 85 %, 83 %로 감소되었다.

이상의 결과에서 보여주듯이, 시험관내 실험(in vitro assay)의 탐색을 통하여 높은 에스트로젠(estrogen) 활성을 가진 시료들을 적출해 생체내 실험(in vivo assay)을 한 결과, 누에 번데기 열수추출물 및 한약재(인삼, 하수오, 울금)를 첨가한 7 : 1 : 1 : 1의 누에 번데기 혼합물이 에스트로젠(estrogen) 활성에 높은 효능을 가지고 있는 것으로 사료 된다.

본 발명에 따른 누에 번데기 열수추출물 또는 누에 번데기 열수추출물과 인삼, 하수오 및 울금의 에탄올추출물을 7 : 1 : 1 : 1의 비율로 함유한 기능성 식품은 여성 호르몬인 에스트로젠의 작용 및 효과를 증강시키는 성질을 갖고 있어, 에스트로젠 작용을 갖는 건강기능식품으로의 개발이 바람직하다.

Claims

암수구별 없이 12-13 일째의 누에 번데기를 믹서기에서 분쇄한 분말을 에탄올로 2-3 시간 동안 1차 추출한 후, 60 메쉬체로 여과한 다음 농축시켜 누에 번데기 에탄올추출물을 얻고, 그 다음 잔사를 2차로 정제수로 80~100 ℃로 추출 후 60 메쉬체로 여과 한 다음 여액을 동결건조시켜 얻은 누에 번데기 열수추출물을 유효성분으로 하는 에스트로젠(estrogen) 증진용 건강기능성 식품.
청구항 1에 있어서, 1종이상의 제제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 함유한 에스트로젠(estrogen) 증진용 건강기능성 식품.
유효성분으로 암수구별 없이 12-13 일째의 누에번데기를 믹서기에서 분쇄한 분말을 에탄올로 2-3 시간 동안 1차 추출한 후, 60 메쉬체로 여과한 다음 농축시켜 누에 번데기 에탄올추출물을 얻고, 그 다음 잔사를 2차로 정제수로 80~100 ℃로 추출 후 60 메쉬체로 여과 한 다음 여액을 동결건조시켜 얻은 누에 번데기 열수추출물과 인삼 에탄올추출물, 하수오 에탄올추출물 및 울금 에탄올추출물을 7 : 1 : 1 : 1의 중량비율로 구성된 에스트로젠(estrogen) 증진용 건강기능성 식품.