KR101124368B1 - 누에번데기 추출물로부터 분리 정제된 에스트로겐 작용 물질을 함유하는 기능성 식품 - Google Patents

Abstract

본 발명은 누에번데기 추출물로부터 분리 정제된, 천연물질 유래 에스트로겐 작용 물질을 함유하는, 기능성 식품에 관한 것이다. 본 발명에서는, 생체 밖(in vitro)과 생체 안(in vivo)의 실험을 통해 누에번데기의 수용성 추출물로부터 본 발명에 따라 분리 정제된 물질의 에스트로겐 작용이 확인된다. 이러한 결과를 토대로, 본 발명에서는 누에번데기를 상온에서 물로 추출한 수용성 누에번데기 추출물 중 설폰산형 강산성 양이온교환수지(Dowex™ 50W-8X(H+)) 컬럼을 통해 분획하고 증류수로 세척하여 얻은 물질을 유효성분으로 함유하는 기능성 식품이 제공된다. 본 발명의 실시예에서는 본 발명의 에스트로겐 작용물질이 피토에스트로겐과 같은 에스트로겐 대체 물질로서 유용함이 확인된다.

Description

누에번데기 추출물로부터 분리 정제된 에스트로겐 작용 물질을 함유하는 기능성 식품 {Functional foods comprising an alternation material for estrogenic activity by silkworm(Bombyx Mori) pupa water extracts}

본 발명은 천연물질 유래 에스트로겐 작용 물질에 관한 것으로, 특히 누에번데기 추출물로부터 분리 정제된 에스트로겐 작용물질을 함유하는 기능성 식품에 관한 것이다.

폐경이란 난소의 기능이 소실됨을 의미하며 내분비적으로는 에스트로겐 분비 감소와 뇌하수체에서 생식샘 자극호르몬의 증가가 이루어지는 것이 특징이다. 이러한 폐경에 관한 중요한 호르몬인 에스트로겐은 1차적 여성 성호르몬과 같은 기능을 하는 난소에서 분비되는 스테로이드 호르몬이다. 에스트로겐은 성숙, 증식, 그리고 포유류의 샘의 분화 조절 역할을 하고, 유방암세포의 발생과 성장에 영향을 미친다 [문헌 26]. 또한 에스트로겐은 다양한 표적기관에서 분화와 증식에 관계되는 중요한 호르몬이기도 하다. 에스트로겐의 생물학적 활성은 스테로이드 전사인자의 superfamily에 속하는 에스트로겐 수용체를 통해 우선적으로 조절된다 [문헌 9]. 에스트로겐 수용체 알파와 베타는 같은 조직 혹은 다른 조직에서 다른 수준으로 발현되는 별개의 유전자 산물이다 [문헌 11], [문헌 18]. 에스트로겐 수용체 알파는 자궁, 간, 지방세포, 골격근, 뇌하수체와 시상하부에서 특이적으로 발현하지만, 에스트로겐 수용체 베타는 난소, 정소, 그리고 전립선과 같은 부위에서 발현하며, 변연계, 소뇌, 그리고 대뇌피질이 포함된 뇌에서도 발현한다 [문헌 22]. 에스트로겐 수용체 알파와 베타는 다른 세포 개체와 같이 같은 세포내에서 유방 조직, 비뇨생식계, 뼈, 그리고 심혈관계에서 공통적으로 발현한다 [문헌 18].

우리나라 여성의 평균 폐경 연령은 47.6세로 나타나 있다 (보건복지부, 2000). 폐경기에는 에스트로겐 결핍에 의해 안면홍조, 발한, 불면증, 우울증 및 비뇨 생식기계의 위축 등의 증상이 초래되는 경우가 많다. 이러한 폐경기 증상의 치료를 위해 에스트로겐을 투여하게 되는데, 에스트로겐 투여를 기피하는 여성들이 있다. 이에 따라 폐경기 증후군 증상에 대처할 수 있는 식물성 에스트로겐에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있는 실정이다.

종래의 연구에서 식물성 에스트로겐으로서 대두의 특정 성분(문헌 1, 문헌 2), 당귀와 인삼(문헌 3), 붉은 토끼풀(문헌 5)과 콩류(문헌 6)가 식물성 에스트로겐으로서의 활성을 보였다. 이뿐 아니라 승마추출물과 St. John's Wort의 복합물(문헌 12), 최근 백수오(Cynanchum wilfordii); 속단(Phlomis umbrosa); 당귀(Angelica gigas)의 복합추출물로 구성된 FGF271(문헌 23)도 식물성 에스트로겐의 대체물로서 기능이 밝혀지고 있다. 또한, 러프 등(Ruff et al.)은 피토에스트로겐이 암과 폐경기 증상을 감소시킨다고 보고했다(문헌 22).

한편, 누에번데기는 동의보감에 나와 있는 천연 자양강장 식품으로, 한방에서는 잠용자라고 부르며 성질이 고르고 맛이 달며 독성이 없어 풍과 여윈 것을 다스린다고 하였다. 그리고 소갈(당뇨병)이나 회충을 없애는 약효도 있다고 기재되어 있다. 강필돈(Pil-Don Kang, 문헌 20)은 누에 유래 불포화지방산의 기능성을 시험해본 결과 고지혈증 개선의 효과를 보이고, 피부단백질인 콜라겐 생성을 유의적으로 증가시키며, 콜라겐 분해효소 활성을 유의적으로 억제하고, 피부건조증의 개선에 빠르고 탁월한 효과가 있다고 입증한 바 있다. 또 리(Lee, 문헌 15)는 누에번데기 및 누에애벌레동충하초 열수추출물 모두 매우 우수한 암세포 성장억제 효과 및 수명연장 효과가 있음을 증명하였다. 이렇듯 누에번데기는 민간요법에서뿐 아니라 현대 과학에서도 효능에 관심을 갖고 있으며, 실험적인 방법으로 그 효능을 규명해 나가고 있는 실정이다.

누에번데기에 대해 그 수용성 추출물이 에스트로겐 효과를 갖는다고 보고되어 있다. 특허등록 제0764401호에서는 누에번데기 열수추출물이 에스트로겐의 활성증강에 효능이 있음을 확인하고, 누에번데기 열수추출물을 유효성분으로 하는 에스트로겐 증진용 건강기능성 식품을 제공하고 있다. 그러나 이러한 종래의 누에번데기 열수추출물은 기존 에스트로겐을 대체하여 사용하기에는 작용이 미약하였다. 따라서 이러한 수용성 추출물 중 에스트로겐 기능을 갖는 순수 물질을 분리 정제한다면 폐경기 여성들을 위한 치료제의 개발에 이용할 수 있을 것이다.

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본 발명은 본 발명자들의 앞선 특허출원 10-2008-0100710호 “누에번데기 추출물로부터 에스트로겐 활성화 물질을 분리하는 방법 및 분리된 에스트로겐 활성화 물질”의 연구결과를 토대로 누에번데기 수용성 추출물의 에스트로겐 작용을 생체 밖(in vitro)과 생체 안(in vivo)의 실험을 통해 증명하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 수용성 누에번데기 추출물 중 에스트로겐 대체물질에 적합한 정제법을 개발하여 더욱 순수한 에스트로겐 작용 물질을 분리해내는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 이렇게 분리된 누에번데기 추출물을, 피토에스트로겐과 같이 성호르몬과 관련된 질병을 예방할 수 있는 기능성 식품소재로 제공하는 것을 목적으로 한다.

이를 위해 본 발명에서는, 생체 밖(in vitro)과 생체 안(in vivo)의 실험을 통해 누에번데기의 수용성 추출물로부터 본 발명에 따라 분리 정제된 물질의 에스트로겐 작용이 확인된다. 특히 본 발명에서는 미성숙한 흰쥐에 난소 절제술을 하여 폐경기 모델을 만들고, 경구를 이용하여 상온에서 물로 추출한 누에번데기 추출물을 농도별(200㎎/㎏, 400㎎/㎏, 600㎎/㎏)로 투여한 후 몸무게와 간독성 검사, 혈중의 에스트로겐 농도를 측정하여 에스트로겐으로서의 기능성과 부작용을 증명한다.

이러한 결과를 토대로, 본 발명에서는
누에번데기 분말을 상온에서 물로 추출하여 얻은 수용성 상온 누에번데기 추출물을, 설폰산형 강산성 양이온교환수지(Dowex™ 50W-8X(H+)) 컬럼에 통과시키고 이어서 컬럼을 증류수로 세척하여 얻은 추출정제물질을 유효성분으로 함유하는 기능성 식품이 제공된다. 바람직하게는 상기 추출정제물질은 컬럼 통과에 이어 중력을 통해 증류수로 세척한 후 동결건조 시킨 것이다.

또한, 본 발명에서는 동물실험 결과를 토대로 인체에 대한 유효량을 제공한다. 본 발명의 분획 정제후 동결건조된 에스트로겐 작용 물질은 폐경기 성인여성에 대해 바람직하게는 50㎎～400㎎/㎏/d로 사용될 수 있다. 이를 40대 여성의 표준 체중(57.4㎏, 산자부 기술표준원, 2003)으로 환산하면 1일 2.8g～23g이 권장 사용량이 된다. 부작용이 없으므로, 이를 초과해서도 사용할 수 있으나 하기 실시예를 통해 확인되는 바와 같이 400㎎/㎏/d 이상에서는 오히려 효과가 떨어지므로 바람직하지 않다. 더욱 바람직하게는 폐경기 성인 여성에 대해 100㎎～300㎎/㎏/d의 유효량으로 사용될 수 있다.

본 명세서에서 “기능성 식품”은 건강을 호전시키는 생리효과를 가지는 식품 및 그 성분을 가지고 제조 및 가공한 식품으로서 건강기능식품, 건강보조식품, 건강식품 등을 모두 포함하는 의미로 사용된다.

하기 실시예로부터 확인되는 바와 같이, 본 발명의 누에번데기 수용성 추출물은, 농도 별로 처리하였을 때 정상 대조군과 에스트로겐을 처리한 군과 비교하여 피토에스트로겐과 같은 에스트로겐 대체 물질로 유용함을 확인할 수 있었다. 또한 본 발명에서는 분리정제된 물질의 주요 구성이 단백질임을 규명함으로써 누에번데기로부터 가장 순도가 높고 효과적인 에스트로겐 작용물질을 얻을 수 있다. 본 발명에 따라 얻어진 에스트로겐 작용 물질은 천연물질 유래의 효과 높은 에스트로겐 대체 물질로서 의약품과 건강기능성 식품, 건강보조식품 등의 다양한 용도로 사용될 수 있다.

도 1은 상온의 누에번데기 수용성 추출물을 농도별(200㎎/㎏, 400㎎/㎏, 600㎎/㎏)로 처리한 후 혈중 에스트로겐 농도를 측정한 결과이다. Control은 시료처리를 하지 않은 정상군이고, Negative는 시료처리를 하지 않은 폐경기 모델군, E2는 17β-estradiol과 함께 처리한 폐경기 모델 대조실험군이고, 200㎎/㎏와 400㎎/㎏, 600㎎/㎏을 처리한 군은 누에번데기 수용성 추출물을 해당 용량으로 처리한 폐경기 모델 실험군이다. 여기서 각각의 값은 mean± SE (n=8)값과 같이 발현되었다. 대조군 vs P<0.05
도 2는 실시예 3-2에서 준비된 시료 1 내지 3에 대해 인간 유방암 세포인 MCF-7 세포를 이용하여 24-well plate에서 5x10³ 세포/well의 양으로 배양한 결과이다. 도 2a는 시료 1의 결과이고, 도 2b는 시료 2의 결과이며, 도 2c는 시료 3의 결과이다. 배양하는 동안에 세포는 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 동안 250㎕/㎖, 62.5㎕/㎖, 15.6㎕/㎖, 3.9㎕/㎖의 농도로 처리하여 MTT 분석에 의해 세포 증식을 증명하였다. MTT 분석은 MTT 용액[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-tetrazolium bromide] (Sigma, St. Louis, MO)을 4시간 동안 처리하였고, 595㎚로 각 well의 흡광도를 분광 광도계를 사용하여 증명하였다. 시료의 그룹은 3회 실험하여 mean± SE (n=8)값과 같이 나타내었다. 시료의 그룹은 2way ANOVA를 이용하여 비교하였다. 대조군 vs *P<0.05,대조군 vs **P<0.01,그리고 대조군 vs***P<0.001
도 3은 시료 1을 100℃에서 30분간 열처리를 하였을 때와 하지 않았을 때를 비교 분석한 결과이다. 도 3과 같은 방법으로 분석하여 3회 실험한 후 mean± SE (n=8)값과 같이 나타내었다. 도 3a는 열처리하지 않은 시료 1의 결과이고, 도 3b는 열처리한 시료 1의 결과이다. 시료의 그룹은 2way ANOVA를 이용하여 비교하였다. 대조군 vs *P<0.05,대조군 vs **P<0.01,그리고 대조군 vs***P<0.001

본 발명에서는 본 발명자들의 앞선 연구 결과인, 누에번데기의 상온에서의 수용성 추출물이 에스트로겐 활성도에서 가장 효과적이라는 사실을 토대로, 이 수용성 추출물을 미성숙 흰쥐에 경구 투여하는 동물실험을 하였다. 미성숙 흰쥐의 난소 양쪽을 절제하여 폐경기 모델을 만들어 에스트로겐의 효능을 밝히는 실험을 실시하였다. 먼저 정상 대조군은 난소를 절제하지 않은 정상적인 흰쥐로서 시료를 먹이지 않았고, 대조군(Negative)은 난소를 절제한 폐경기 모델의 흰쥐로서 시료를 먹이지 않았다. 다음 실험 대조군으로서 폐경기 모델에 0.7㎎/㎏ 17β-에스트라디올(17β-estradiol)을 주사하였고, 마지막으로 실험군으로서 세포 실험에서 가장 효과가 좋았던 상온에서 추출한 누에번데기 수용성 추출물을 농도별(200㎎/㎏, 400㎎/㎏, 600㎎/㎏)로 나누어 폐경기 모델에 경구투여하였다. 본 실험에서 몸무게에 대한 자궁 무게의 비율(%)은 정상 대조군(0.2353±0.0076)에 비해 전반적으로 유의적인 차이를 보이는 반면, 누에번데기 수용성 추출물 200㎎/㎏ 섭취군(0.1908± 0.0085)이 유의적 변화를 보이지 않은 것으로 사료되고, 간 장해에 미치는 영향을 보았을 때에도 정상 대조군(GOT ; 0.090± 0.008, GPT ; 0.089± 0.010)과 비교할 때 200㎎/㎏ 섭취 시험군(GOT ; 0.102± 0.027, GPT ; 0.084± 0.012)이 가장 안정적으로 유의적인 차이가 없었다. 결정적으로 혈중 에스트로겐 발현 실험에서도 실험 대조군(15.27± 3.92㎍/L)을 제외한 실험군에서 누에번데기 수용성 추출물 200㎎/㎏ 섭취군(12.09± 1.97㎍/L)이 혈중 에스트로겐 농도가 가장 높았다. 즉 상온에서 추출한 누에번데기 수용성 추출물을 저농도로 섭취했을 때, 가장 적절한 에스트로겐 활성을 가지고 있는 것으로 판단되었다.

본 발명에서는 보다 순수한 물질을 얻기 위해 수용성 추출물을 증류수에 녹이고 설폰산형 강산성 양이온교환수지(Dowex™ 50W-8X(H+)) 컬럼을 사용하여 분획 정제하여 중력을 통한 흐름으로 세척하여 이들을 수집하였고 다시 동결건조 하였다(시료 1). Dowex™ 50W-8X(H+)는 시그마-알드리치사(Sigma-Aldrich)의 Dowex™ 50W-8X-100 (CAS Number 69011-20-7, MDL Number MFCD00132726)을 구입하여 H+으로 활성화시켜 사용하였다. 시료 1을 얻기 전 세척하는 단계에서 70% 에탄올에 용해시킨 후 중력을 이용한 분리에서 퇴적물을 얻고(시료 2), 그의 상등액을 추출하여 동결건조하였다(시료 3). 이들 정제물 중에서 시료 1은 에스트로겐 수용체 알파(IC₅₀ 1.019㎍/㎖)와 베타(IC₅₀ 1.210㎍/㎖)에서 대조군보다 높은 친화력을 보였고, 추가적으로 62.5㎍/㎖로 처리하였을 때 대조군과 비교하여 가장 높은 성장을 보였다(처리군: 703.21%, 대조군: 450.38%). 이러한 결과를 가지고 70%에탄올로 용해한 시료 2와 시료 3이 효과가 없던 이유를 밝히기 위해 Bradford 법을 이용하여 단백질 정량을 하고 탄수화물 정량을 하기 위해 페놀 황산법을 통해서 정성, 정량분석을 하였다. 시료 1의 건조중량 중 약 50.8%가 단백질이고 11.4%가 탄수화물이었다. 시료 1의 에스트로겐으로서의 효능이 단백질에 영향이 있을 것으로 예상하고 단백질의 변성을 유도한 열처리를 한 것과 하지 않은 것으로 실험적 비교를 하였다. MCF-7 세포의 증식률이 열처리를 한 시료 1보다 열처리를 하지 않은 시료 1에서 상대적으로 높았다. 즉 시료 1의 단백질이 에스트로겐의 활성에 영향을 미친 것으로 사료되었다.

이상의 결과로부터 상온에서 추출한 누에번데기의 수용성 추출물과 특정 분획물이 에스트로겐 활성을 갖고 있어, 에스트로겐 대체물질 또는 성호르몬과 관련된 질병을 예방할 수 있는 기능성 식품으로 개발 가능하다고 판단되었다.

[실시예]

이하 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

누에번데기 수용성 추출물 준비

누에번데기를 한국의 전북 남원시, 경북 예천군, 경북 영천시소재 잠사농가로부터 구입하였다. 누에번데기 분말을 6시간동안 상온에서 증류수로 추출하고 0.45㎛의 필터를 통하여 여과시켰다. 이 시료를 농도별(200㎎/㎏, 400㎎/㎏, 600㎎/㎏)로 하기 동물실험에 사용하였다.

실시예 2

동물의 사육 및 실험식이

2-1. 폐경기 모델을 위한 미성숙 Sprague Dawley 계 암컷 흰쥐의 난소 절제술 및 동물사육

생후 5주령의 Sprague Dawley계 암컷 흰쥐(㈜샘타코 BIOKOREA, 경기도)를 구입하여 사용하였으며 일주일간 일반배합 고형사료로 사육하였다. 이 후 미성숙 6주령을 난괴법 (randomized complete block design)에 의하여 난소 양쪽을 절제하여 폐경기 모델을 만들었다. 그리고 일주일간 적응시킨 후 7주령부터 4주간 실험식이를 공급하였다. 식이 구성은 먼저 정상 대조군(Control)은 난소를 절제하지 않은 정상 대조군으로서 시료를 먹이지 않았고, 대조군(Negative)은 난소를 절제한 폐경기 모델의 대조군으로서 시료를 먹이지 않았다. 다음 실험 대조군으로서 폐경기 모델에 0.7㎎/㎏의 17β-estradiol을 주사하였고, 실험군으로서 세포 실험에서 가장 효과가 좋았던 상온에서 추출한 누에번데기 수용성 추출물을 농도별(200㎎/㎏, 400㎎/㎏, 600㎎/㎏)로 나누어 음수에 용해시켜 경구로 매일 1회 4주간 경구투여하고, 식이 및 식수는 자유섭취하게 하였다. 사육조건은 온도 23± 3℃, 상대습도 55±15%, 명암주기 12시간을 주기로 자동조절되게 하였다. 이러한 실험 군을 미성숙 흰쥐에서의 자궁비대 반응(Uterotrophic assay)시험 분석으로서 시료의 독성과 에스트로겐의 효능을 분석하였으며, 결과는 아래 표 1과 같다. 본 실험에서 몸무게에 대한 자궁 무게의 비율(%)은 정상 대조군(0.2353± 0.0076)에 비해 전반적으로 유의적인 차이를 보이는 반면, 누에번데기 수용성 추출물 200㎎/㎏ 섭취군(0.1908± 0.0085)이 유의적 변화를 보이지 않은 것으로 보아 자궁에 큰 자극이나 독성을 주지 않는 것으로 사료되었다.

*2-2. 누에번데기 수용성 추출물의 부작용과 치료효과

누에번데기 수용성 추출물의 부작용을 측정하기 위해 혈청 GOT와 GPT를 측정하였으며, 측정에는 Reitman과 Frankel의 방법을 응용한 영동제약의 kit를 사용하였다. 즉 GOT 기질로 L-아스파르트산(L-Aspartic Acid)과 α-케토글루타르산(α-Ketoglutaric Acid), GPT 기질로 L-알라닌(L-Alanin)과α-케토글루타르산 용액에 각 혈청을 가하여 37℃에서 1분간 효소반응을 시킨 후 450nm에서 측정하였다. 결과는 아래 표 2와 같다.

또한, 실험한 시료의 에스트로겐 효능을 증명하기 위해 혈중의 에스트로겐을 측정하는 Japan EnviroChemicals.ltd의 kit를 사용하여 측정하였다. β-estradiol antigen-enzyme conjugate와 17β-estradiol buffer solution의 복합액인 항원효소복합용액을 만들어 혈청과 1:1로 항원항체 반응을 실온에서 1시간 반응시켰다. 그런 다음 17β-estradiol color solution으로 2분간 발색하여 17β-estradiol stop solution을 첨가하여 반응을 정지시킨 후 450nm에서 측정하였다. 결과는 도 1과 같다.

간 장해에 미치는 영향을 보았을 때에도 정상 대조군(GOT ; 0.090± 0.008, GPT ; 0.089± 0.010)과 비교할 때 200㎎/㎏ 섭취군(GOT ; 0.102± 0.027, GPT ; 0.084± 0.012)이 가장 안정적으로 유의적인 차이가 없었다(표2). 결정적으로 혈중 에스트로겐 발현 실험에서도 실험 대조군(15.27± 3.92㎍/L)을 제외한 실험군에서 누에번데기 수용성 추출물 200㎎/㎏ 섭취군(12.09± 1.97㎍/L)이 혈중 에스트로겐 농도가 가장 높았다(도 1).

실시예 3

누에번데기 수용성 추출물의 분획물에서 더욱 순수한 물질 준비

실시예 2의 결과를 토대로 이 추출물을 동결건조한 후 이를 증류수로 용해시키고 Dowex™ 50W-8X(H+) 컬럼을 사용하여 분획 정제하여 중력을 통한 흐름으로 세척한 후 이들을 수집하여 다시 동결건조 하였다(시료 1). 시료 1을 얻기 전 세척하는 단계에서 70% 에탄올에 용해시킨 후 중력을 이용한 분리에서 퇴적물을 얻고(시료 2), 그의 상등액을 추출하여 동결건조하였다(시료 3). 시료 1은 세척한 후 동결건조된 상태의 시료이고, 시료 2는 시료 1을 얻기 전 세척하는 단계에서 70% 에탄올에 용해시킨 후 중력을 이용한 분리에서 얻어진 퇴적물이고, 시료 3은 그 상등액을 추출하여 동결건조시킨 것이다.

실시예 4

누에번데기 수용성 추출물의 순수물질을 이용한 에스트로겐 수용체 결합능과 MCF-7 세포의 증식률 확인

4-1. 에스트로겐 수용체 결합능 분석

실시예 3과 같이 분획한 물질 3가지를 가지고 에스트로겐 수용체 결합능 분석한 실험 결과는 아래 표 3과 같다. 시료 1의 친화력은 에스트라디올을 처리한 그룹보다 높은 친화성을 보였다(시료 1; ERα: 1.01± 0.05, ERβ: 1.21± 0.07, 에스트라디올 처리군(ERα: 7.52± 0.06, ERβ: 1.91± 0.07)). 따라서, 누에번데기 수용성 추출물의 각각의 분획물 중 특히 시료 1는 에스트로겐 수용체에 결합하여 에스트로겐 효과를 나타낸다는 결론을 얻을 수 있었다.

표 3은 누에번데기 수용성 추출물 중 에스트로겐 수용체 결합의 IC₅₀ 값이다. 에스트로겐 수용체 경쟁적 값은 ELISA reader를 이용한 384-well plate로부터 산출되었다. 극성을 가지는 값에서 half-maximal의 실험 물질 결과의 농도가 IC₅₀ 이다. 각각의 값은 3회 실험을 반복하여 mean± SD값과 같이 발현 되었다.

4-2. MCF -7 세포의 증식률 분석

실시예 3에서 준비된 시료 1 내지 3을 실시예 4-2와 같이, MCF-7 세포와 함께 최종 농도 250㎍/㎖, 62.5㎍/㎖, 15.6㎍/㎖, 3.9㎍/㎖에서 24, 48, 72, 96시간 동안 배양하고 이를 MTT분석으로 측정하였다. 결과는 도 2a 내지 2c와 같다. 도 2a는 시료 1의 결과이고, 도 3b는 시료 2의 결과이며, 도 2c는 시료 3의 결과이다. 음성 대조군과 비교하여 시료 1은 MCF-7 세포의 가장 높은 증식을 유도하였다 (음성 대조군: 597.55± 7.55, 시료 1: 703.21± 35.72, 처리농도_62.5㎍/㎖)(도 2a). 따라서 누에번데기 수용성 추출물 중 시료 1이 세포증식을 유도하는 것으로 증명되었다. 계속해서 이어 시료 1의 에스트로겐 대체물질로서의 효능을 증명하였다. 시료 1의 어떠한 특정 성분에 의해 활성을 일으키는지 다음 실시예 5를 이어 실험하였다.

실시예 5

시료 1의 특성성분, 정량 분석

5-1. 특성성분, 정량 분석

시료 1을 에탄올 처리함으로써 활성이 없어졌다는 점에 착안하여 단백질의 경우 에탄올을 처리하였을 때 구조가 변성되어 활성이 사라지므로 Bradford법을 이용하여 단백질 정량실험을 수행해 보았다. 또한 페놀황산법을 이용하여 탄수화물 정량 실험도 함께 하여, 그 결과 시료 1의 건조중량 중 약 50.8%가 단백질이고 11.4%가 탄수화물이라는 결과를 얻었다.

5-2. 시료 1의 단백질 변성을 위한 추출물

실시예 5-1의 결과 시료 1에 단백질이 다량 포함되어 있었으므로, 이 단백질이 에스트로겐 효능을 지니는지 분석하였다. 비교 분석을 위해 시료 1을 100℃에 30분간 열처리하여 단백질을 변성시킨 시료와 변성시키지 않은 시료를 각각 준비하였다.

실시예 6

시료 1과 열처리한 시료 1의 에스트로겐 효능을 측정하기 위한 MCF -7 세포 증식률 측정

실시예 4에서 준비된 열처리한 시료 1과 열처리하지 않은 시료 1을 MCF-7 세포와 함께 최종 농도 250㎍/㎖, 62.5㎍/㎖, 15.6㎍/㎖, 3.9㎍/㎖에서 24, 48, 72, 96시간 동안 배양하고, 이를 MTT분석으로 측정하였다. 결과는 도 3a 및 도 3b와 같다. 도 3a는 열처리하지 않은 시료 1의 결과이고, 도 3b는 열처리한 시료 1의 결과이다. 열처리한 시료 1과 비교하였을 때 열처리하지 않은 시료 1은 MCF-7 세포의 가장 높은 증식을 유도하였다 (열처리한 시료 1: 1261.80± 37.94(도 3b), 시료 1: 1916.61± 60.10(도 3a), 농도처리: 62.5㎍/㎖) 따라서 누에번데기 수용성 추출물 중 62.5㎍/㎖의 시료 1이 세포증식을 유도하는 것으로 증명되었다 (도 3a). 누에번데기 수용성 추출물의 각각의 분획물 중 특히 시료 1에 있는 단백질이 에스트로겐 수용체에 결합하여 에스트로겐 효과를 나타낸다는 결론을 얻을 수 있었다.

Claims (5)

1. 누에번데기 분말을 상온에서 물로 추출하여 얻은 수용성 상온 누에번데기 추출물을, 설폰산형 강산성 양이온교환수지(Dowex™ 50W-8X(H+)) 컬럼에 통과시키고 이어서 컬럼을 증류수로 세척하여 얻은 추출정제물질을 유효성분으로 함유하는 기능성 식품.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 수용성 상온 누에번데기 추출물은, 누에번데기 분말을 상온에서 물로 추출한 후, 추출물을 동결건조시키는 과정과, 동결건조된 추출물을 증류수에 용해시키는 과정을 더 거쳐 얻은 것임을 특징으로 하는 기능성 식품.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 증류수 세척은 중력을 통해 증류수로 세척되는 것을 특징으로 하는 기능성 식품.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 추출정제물질을 50㎎～400㎎/㎏/d의 유효량으로 함유하는 기능성 식품.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 추출정제물질을 100㎎～300㎎/㎏/d의 유효량으로 함유하는 기능성 식품.

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