KR20200141501A

KR20200141501A - 염증성 질환 치료용 줄기세포의 기능 강화를 위한 스타틴 봉입 나노입자 제제, 및 이를 함유하는 염증성 질환 치료용 기능 강화 줄기세포

Info

Publication number: KR20200141501A
Application number: KR1020207032747A
Authority: KR
Inventors: 마사아키 이이; 야스히코 타바타
Original assignee: 각코우호징 오사카 이카야쿠카 다이가쿠
Priority date: 2016-05-06
Filing date: 2017-04-27
Publication date: 2020-12-18
Also published as: EP3453391A4; CN109152764A; WO2017191808A1; US20190134201A1; US20210038725A1; EP3453391A1; US10842876B2; KR20190018420A

Abstract

본 발명은, 스타틴이 생체 흡수성 폴리머를 포함하는 나노입자에 봉입되어 이루어지는 스타틴 봉입 나노입자 등으로, 줄기세포의 기능을 증강시키기 위하여 이용되며, 상기 줄기세포는 염증성 질환의 치료용 줄기세포이다.

Description

염증성 질환 치료용 줄기세포의 기능 강화를 위한 스타틴 봉입 나노입자 제제, 및 이를 함유하는 염증성 질환 치료용 기능 강화 줄기세포 {STATIN-CONTAINING NANOPARTICLE PREPARATION FOR ENHANCING FUNCTION OF STEM CELLS FOR TREATING INFLAMMATORY DISEASE AND FUNCTIONALLY ENHANCED STEM CELLS CONTAINING SAME FOR TREATING INFLAMMATORY DISEASE}

본 발명은 스타틴을 봉입하는 나노입자에 관하며, 특히 염증성 질환 치료용 세포의 기능을 증강시키기 위한 스타틴 봉입 나노입자(제제에 사용되는 입자, 이 입자를 포함하는 제제 등)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 스타틴 봉입 나노입자를 함유하는 염증성 질환 치료용 줄기세포에 관한 것이다.

스타틴은, 간에서의 콜레스테롤 생합성의 율속 효소인 HMG-CoA 환원 효소를 저해하는 화합물로 알려져 있다. 스타틴에 의해 혈중 콜레스테롤 값을 저하시킬 수 있어, 고콜레스테롤혈증의 치료약으로 이용된다. 또한 스타틴은 고콜레스테롤혈증 외에도, 그 항염증 작용에 따라 협심증이나 심근경색과 같은 허혈성 심질환 및 동맥경화 등의 질환에 효과적인 것도 임상시험을 통해 밝혀졌다.

지금까지, 스타틴에 따른 질환 치료 효과의 향상이나, 부작용의 저감을 위해 다양한 연구가 이루어지고 있으며, 예를 들어 특허문헌1에는, 혈관 신생 촉진을 목적으로 스타틴을 투여하는 경우, 스타틴을 나노입자에 봉입하고, 그 스타틴 봉입 나노입자를 환자에게 국소 투여함으로써, 지금까지보다 소량의 스타틴으로 혈관 신생을 촉진시킬 수 있음이 개시되었다.

스타틴은, 전술한 바와 같이 여러 가지 작용을 나타내며, 특히 항염증 작용을 갖고 있어, 염증성 질환에 대한 적용에 관해서도 활발하게 연구가 이루어지고 있다. 예를 들어 비특허문헌 1에는, 스타틴의 일종인 심바스타틴이, 마우스 염증성 장 질환 모델에서 항염증 작용을 나타냄이 개시되어 있다. 또한, 비특허문헌 2에는, 크론병 환자에 대한 아토르바스타틴의 항염증 효과에 대하여 기재되어 있다.

근년 들어 다능성을 갖는 줄기세포를 이용하여, 각종 질환을 치료하는 연구도 진행되고 있다. 줄기세포는, 일반적으로 배아 줄기세포(ES 세포)나, 골수 유래 줄기세포 및 지방 유래 줄기세포 등 간엽계의 체성 줄기세포(somatic stem cell) 외에, 인공 다능성 줄기세포(iPS 세포) 등이 알려져 있으며, 다양한 연구에 이용되고 있다. 그 중에서도, 취급이 간편한 지방 유래 줄기세포에 대한 연구가 급속히 발전하여, 각종 질환에 대한 재생의료의 임상시험이 널리 이루어지고 있다. 또, 지방 유래 줄기세포는, 재생의료 뿐만 아니라, 약제 유발성 장염 마우스 모델에서 장염 억제 효과를 나타내는 것도 보고되었다(예를 들어 비특허문헌 3 참조).

[특허문헌1] 일본 특허공개공보 2012-21002호 공보

[비특허문헌1] 아베 요스케(阿部洋介) 등, 궤양, 37(2010), 169-173. [비특허문헌2] Grip, O et al, Br J Pharmacol. 155(2008), 1085-1092. [비특허문헌3] Gonzalez, MA et al. Gastroenterology 136(2009), 978-989.

염증성 질환을 치료하기 위해, 예를 들어 상기 비특허문헌 1 및 2에 개시된 바와 같이 스타틴 사용 시에, 스타틴의 효과를 보다 효율적으로 발휘할 수 있도록 하기 위해, 예를 들어 특허문헌 1에 개시된 바와 같이 스타틴을 나노입자에 봉입하고, 당해 스타틴 봉입 나노입자를 환자에게 투여하는 것을 생각할 수 있다. 그러나, 특허문헌 1에서는, 스타틴 봉입 나노입자를 환자에게 국소 투여하고, 이와 같이 함으로써 지금까지보다 소량의 스타틴으로 유효성이 인정되지만, 투여한 스타틴 나노입자가 대식세포(Macrophage)에 탐식되는 등으로 불균일하게 병소에 분포하기 쉬워 안정된 치료효과를 얻기가 어려울 수 있다.

한편, 비특허문헌 3에 개시된 바와 같이 줄기세포만을 이용하여 염증성 질환을 치료하는 경우에도, 줄기세포를 환부에 국소 투여할 필요가 있으며, 대량의 세포를 필요로 하기 때문에, 비용과 시간이 소요될 뿐만 아니라 세포 투여 시 부작용의 출현 빈도도 증가할 가능성이 있다. 또한, 자가 세포 이식을 상정한 경우, 지방 조직이 적게 분리될 수 있는 줄기세포가 적거나, 또는 고령·당뇨병 등의 대사질환의 요인에 의해 줄기세포 기능이 저하된 증례에서는, 적은 수의 줄기세포로 우수한 치료 효과를 얻기 위해, 그 줄기세포의 다양한 기능을 향상시킬 필요가 있을 것으로 생각된다.

본 발명은 상기 과제를 감안하여 이루어진 것이다. 본 발명을 창작하는 목적은, 세포 제제 등으로 사용되는 줄기세포의 염증성 질환에 대한 치료 효과를 향상시켜, 부작용을 억제하면서 그 줄기세포의 기능을 향상시킬 수 있도록 하는 데 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 예의 연구한 결과, 스타틴이 나노입자에 봉입되어 이루어지는 스타틴 봉입 나노입자를 줄기세포에 함유시킴으로써, 그 줄기세포의 기능이 증강되고, 스타틴을 원하는 부위에 효율적으로 전달할 수 있어, 염증성 질환의 치료에 높은 효과를 나타내는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다. 즉, 본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자는, 스타틴이 생체 흡수성 폴리머를 포함하는 나노입자에 봉입되어 이루어지는 스타틴 봉입 나노입자로, 줄기세포의 기능을 증강시키기 위한 입자이며, 이 줄기세포는 염증성 질환 치료용 줄기세포인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자는, 줄기세포에 처리됨으로써 (구체적으로는 이 나노입자가 줄기세포에 포함됨으로써), 그 처리된 줄기세포의 기능을 증강시킬 수 있고, 그 줄기세포를 생체 내에 투여함으로써 다양한 효과를 나타낸다. 구체적으로, 본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자로 줄기세포를 처리하면, 처리된 줄기세포는 파고사이토시스(phagocytosis)에 의해 스타틴 봉입 나노입자를 취하고, 스타틴 봉입 나노입자가 포함된 줄기세포는 이주능 및 증식능의 증강과 더불어, 면역 억제능이 증강된다. 이로써, 예를 들어 염증성 질환을 앓는 환자의 체내에, 본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자가 처리된 줄기세포를 투여함으로써, 줄기세포의 증강된 면역 억제 작용과 이 줄기세포에서 서방되는 스타틴의 항염증 작용으로, 우수한 염증성 질환의 치료 효과를 나타낸다.

본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자에서, 생체 흡수성 폴리머로는 폴리젖산(poly lactic acid: PLA) 또는 폴리젖산-글리콜산 공중합체(poly(lactic-co-glycolic acid): PLGA)를 사용할 수 있다.

PLA 및 PLGA는 체내에서 분해됨으로써, 봉입된 스타틴을 방출할 수 있으며, 또 PLA는 그 가수분해에 따라 젖산으로 분해되고, PLGA는 그 가수분해에 따라 젖산과 글리콜산으로 분해되며, 각각 최종적으로 물과 탄산 가스로 되어, 인간 등의 동물에 대하여 무해하므로, PLA 또는 PLGA를 나노입자 재료로 사용하는 것은 매우 바람직하다.

본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자는, 상기 줄기세포로서 간엽계 줄기세포, 특히 지방 유래 줄기세포를 증강시키기 위한 것임이 바람직하다.

지방 유래 줄기세포는, 지방 조직을 채취하여, 채취한 조직을 콜라게나제 처리한 후 원심 비중법으로 단핵구 세포만을 채취하고, 채취한 단핵구 세포를 배양 접시에서 4일 정도 배양하여, 접착된 세포를 지방 유래 줄기세포로서 선택 및 분리할 수 있다. 또한 셀루션 시스템(Celution System, Cytori사제) 등을 이용하여 지방조직으로부터 용이하면서도 대량으로 추출, 분리 배양할 수 있다. 지방 유래 줄기세포는, 간엽계 줄기세포에 속하고, 다능성도 가지며, 또 상기와 같이 간편하게 많은 양을 채취할 수 있기 때문에, 다양한 질병에서의 재생 의료에 이용하는 데에 유리하다. 또한 지방 유래 줄기세포는, 항염증성 사이토카인을 생산 방출하여 염증성 세포의 활성을 억제하므로, 염증성 질환의 치료에 유리하다.

또한, 본 발명에 따른 기능 증강 줄기세포는, 상기 스타틴이 생체 적합성 나노입자에 봉입되어 이루어지는 스타틴 봉입 나노입자를 함유하며, 염증성 질환의 치료용인 점에 특징이 있다.

이와 같은 본 발명에 따른 기능 증강 줄기세포는, 상기 스타틴 봉입 나노입자를 함유하고 있기 때문에, 전술한 바와 같이, 상기 스타틴 봉입 나노입자에 의해 면역 억제능 등의 세포 기능이 증강되어, 염증성 질환의 치료에 우수한 효과를 발휘할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 기능 증강 세포는, 스타틴을 서방할 수 있으며, 그 방출된 스타틴의 항염증 작용에 따라 염증성 질환의 치료에 유리하다.

본 발명에 따른 기능 증강 줄기세포는, 위에서 설명한 이유에서 상기 지방 유래 줄기세포인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에 따른 기능 증강 줄기세포는, 의약품으로 허용 가능한 용매 및 부형제와 혼합하여 세포 제제로 제제화 할 수도 있다. 본 발명에 따른 줄기세포의 생체 내 투여는, 개복 등의 수술이 불필요한 점이 바람직하며, 정맥 내 투여용 또는 동맥 내 투여용 세포 제제로 제제화되는 것이 바람직하다. 이와 같이 하면, 환자에게 본 발명에 따른 줄기세포를 간편하게 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 기능 증강 줄기세포 제제는, 줄기세포의 기능이 증강되기 때문에, 정맥 내 투여 또는 동맥 내 투여라도 적은 투여량으로 높은 효과를 얻을 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 기능 증강 줄기세포 제제는, 동맥 내 투여를 함으로써, 특히 정맥 내 투여로는 도달시키기가 곤란한 장 등의 염증부에 줄기세포를 집적시킬 수 있다. 따라서, 동맥 내 투여를 이용함으로써, 적은 용량으로 균일하게 세포를 병소에 분포시켜, 안정된 높은 효과를 얻을 수도 있다. 또, 본 발명에 따른 기능 증강 줄기세포 제제는, 일정한 원하는 효과를 얻을 수 있다면, 국소 투여도 할 수 있다.

본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자 및 이를 함유하는 기능 증강 줄기세포 등에 따르면, 줄기세포의 기능을 증강시킬 수 있어, 이 줄기세포를 생체 내에 투여함으로써, 염증 질환 치료에 우수한 효과를 나타낸다.

[도 1] 인간 지방 유래 줄기세포의 배양 배지 중에 로다민 적색 형광색소 봉입 PLA 나노입자를, 그 최종 농도가 20μg/mL, 50μg/mL, 80μg/mL 또는 100μg/mL가 되도록 첨가하고, 1시간 후 또는 2시간 후에 줄기세포를 공초점 레이저 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타내는 사진이다.
[도 2] 마우스 지방 유래 줄기세포의 배양 배지 중에 로다민 적색 형광색소 봉입 PLGA 나노입자를, 그 최종 농도가 20μg/mL, 50μg/mL, 75μg/mL 또는 100μg/mL가 되도록 첨가하고, 30분 후에 줄기세포의 로다민 적색 형광색소 봉입 PLGA 나노입자의 포함량을 FACS로 측정한 결과를 나타내는 사진이다.
[도 3] 인간 지방 유래 줄기세포의 배양 배지 중에 입경 200nm ~ 400nm 또는 400nm ~ 600nm의 로다민 적색 형광색소 봉입 PLGA 나노입자를 첨가하고, 1시간 후에 줄기세포를 공초점 레이저 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타내는 사진이다.
[도 4] 인간 지방 유래 줄기세포에 대하여 100μg/mL의 농도로 심바스타틴 봉입 PLA 나노입자를 1시간 처리시킨 후, 지방 유래 줄기세포에서 배지 중으로 방출된 심바스타틴의 양을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
[도 5] 마우스 지방 유래 줄기세포에 대하여 50μg/mL의 농도로 심바스타틴 봉입 PLA 나노입자를 30분 처리한 후, 지방 유래 줄기세포에서 배지 중으로 방출된 심바스타틴의 양을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
[도 6] (a)는 PLA 나노입자 또는 스타틴 봉입 PLA 나노입자를 처리한 인간 지방 유래 줄기세포의 이주성(migratory property) 측정결과를 나타내는 그래프이며, (b)는 스타틴 봉입 PLA 나노입자를 처리한 인간 지방 유래 줄기세포의 증식성 측정결과를 나타내는 그래프이다.
[도 7] 정맥 투여에 의해 로다민 적색 형광색소 봉입 PLGA 나노입자를 포함하는 마우스 지방 유래 줄기세포가 투여된 마우스의 대장을, 공초점 레이저 형광 현미경을 이용하여 관찰한 결과를 나타내는 사진이다.
[도 8] 동맥 투여에 의해 로다민 적색 형광색소 봉입 PLGA 나노입자를 포함하는 마우스 지방 유래 줄기세포가 투여된 마우스의 대장을, 공초점 레이저 형광 현미경을 이용하여 관찰한 결과를 나타내는 사진이다.
[도 9] PBS (인산 버퍼) 스타틴 비봉입 나노입자 함유 지방 유래 줄기세포, 또는 스타틴 봉입 나노입자 함유 지방 유래 줄기세포를 투여한 DSS 장염 모델 마우스의 체중의 경시적 변화를 나타내는 그래프이다.
[도 10] (a)는 PBS, 스타틴 비봉입 나노입자 함유 지방 유래 줄기세포, 또는 스타틴 봉입 나노입자 함유 지방 유래 줄기세포를 투여한 DSS 장염 모델 마우스의 대장의 길이를 나타내는 그래프이며, (b)는 PBS, 스타틴 비봉입 나노입자 함유 지방 유래 줄기세포, 또는 스타틴 봉입 나노입자 함유 지방 유래 줄기세포를 투여한 DSS 장염 모델 마우스의 DAI 스코어를 나타내는 그래프이다.
[도 11] DAI 스코어의 설명을 위한 도표이다.
[도 12] PBS, 스타틴 비봉입 나노입자 함유 지방 유래 줄기세포, 또는 스타틴 봉입 나노입자 함유 지방 유래 줄기세포를 투여한 DSS 장염 모델 마우스에서의, TNFα, IL-17, IL-6 및 IL-1β의 유전자 발현량을 나타내는 그래프이다.
[도 13] (a)는 PBS, 스타틴 비봉입 나노입자 함유 지방 유래 줄기세포, 또는 스타틴 봉입 나노입자 함유 지방 유래 줄기세포를 투여한 DSS 장염 모델 마우스의 대장의 조직학적 분석 결과를 나타내는 사진이며, (b)는 그것을 스코어화한 그래프이다.
[도 14] PBS, 스타틴 비봉입 나노입자 함유 지방 유래 줄기세포, 또는 스타틴 봉입 나노입자 함유 지방 유래 줄기세포를 투여한 간질성 폐렴 모델 마우스, 및 정상 마우스 폐의 조직학적 분석 결과를 나타내는 사진이다.
[도 15] PBS, 스타틴 비봉입 나노입자 함유 지방 유래 줄기세포, 또는 스타틴 봉입 나노입자 함유 지방 유래 줄기세포를 투여한 경피증(scleroderma) 모델 마우스, 및 정상 마우스 피부 조직의 조직학적 분석 결과를 나타내는 사진이다.
[도 16] PBS, 스타틴 비봉입 나노입자 함유 지방 유래 줄기세포, 또는 스타틴 봉입 나노입자 함유 지방 유래 줄기세포를 투여한 신경 손상 모델 마우스의 좌골 신경 기능지수(SFI)의 측정결과를 나타내는 그래프이다.
[도 17] 정상 마우스와 Shn-2KO 마우스의 둥지 만들기 행동 분석 결과를 나타내는 사진이다.
[도 18] PBS, 스타틴 비봉입 나노입자 함유 지방 유래 줄기세포, 또는 스타틴 봉입 나노입자 함유 지방 유래 줄기세포를 투여한 Shn-2KO 마우스의 둥지 만들기 행동 분석 결과를 나타내는 사진이다.
[도 19] PBS, 인간 지방 유래 줄기세포, 또는 스타틴 봉입 나노입자 함유 인간 지방 유래 줄기세포를 투여한 퇴행성 관절염 모델 마우스, 정상 마우스의 관절 연골 조직의 조직학적 분석 결과를 나타내는 사진이다.
[도 20] PBS, 인간 지방 유래 줄기세포, 또는 스타틴 봉입 나노입자 함유 인간 지방 유래 줄기세포를 투여한 퇴행성 관절염 모델 마우스의 관절 손상도 채점 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 21] PBS, 마우스 지방 유래 줄기세포, 또는 스타틴 봉입 나노입자 함유 마우스 지방 유래 줄기세포를 투여한 치매증 모델 마우스, 및 정상 마우스의 기억 분석 결과이다. (a)는 반즈 미로 시험(Barnes maze test)에서 대상 구멍을 찾아 탈출 케이지로 들어갈 때까지 마우스의 이동거리를 나타내는 그래프이며, (b)는 상기 탈출 케이지로 들어갈 때까지의 시간을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 실시하기 위한 형태를 도면에 기초하여 설명한다. 다음의 바람직한 실시형태의 설명은, 본질적으로 예시에 불과하며, 본 발명, 그 적용 방법 또는 그 용도의 제한을 의도하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자는, 스타틴이 폴리젖산-글리콜산 공중합체를 포함하는 나노입자에 봉입되어 이루어지는(봉입된) 스타틴 봉입 나노입자이며, 줄기세포의 기능을 증강시키기 위하여 사용된다. 본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 스타틴 봉입 나노입자 제제는, 상기 스타틴 봉입 나노입자 외에, 안정화제, 보존제, 완충제, pH 조절제, 부형제 등의 제제화에 통상적으로 사용되는 첨가제를 포함할 수 있다.

본 발명에서 스타틴이란, HMG-CoA(3-히드록시-3-메틸글루타릴-코엔자임A) 환원 효소 억제제인 화합물을 모두 포함하는 것이며, 예를 들어, 심바스타틴(simvastatin), 로수바스타틴(rosuvastatin), 피타바스타틴(pitavastatin), 아토르바스타틴(atorvastatin), 세리바스타틴(cerivastatin), 플루바스타틴(fluvastatin), 프라바스타틴(prabastatin), 로바스타틴(lovastatin) 및 메바스타틴(mevastatin) 등을 들 수 있다. 스타틴은 전술한 바와 같이, 콜레스테롤 저하 작용을 갖는 것으로 알려져 있는데, 이 밖에 심혈관 질환의 발생이나 진행 위험을 저감시키는 점이 대규모 임상 시험으로 밝혀졌다. 또한 혈관 내피 세포나 골수 유래의 혈관 내피 전구 세포를 통한 혈관 신생 촉진 작용에 대하여서도 많은 보고가 이루어졌다. 또한, 항염증 작용을 나타내는 것도 알려져 있다.

본 발명에서, 나노입자는 스타틴을 봉입할 수 있는 생체 흡수성 폴리머라면 그 재료는 한정되지 않으나, 폴리젖산(poly lactic acid: PLA) 또는 폴리젖산-글리콜산 공중합체(poly(lactic-co-glycolic acid): PLGA)를 포함하는 나노입자를 이용하는 것이 바람직하다. PLA는 체내에서 분해되어 젖산으로 분해되고, PLGA는 체내에서 분해되어 젖산과 글리콜산으로 분해되며, 각각 최종적으로 물과 이산화탄소로 되므로 체내에 무해하여 바람직하다.

본 발명에서 스타틴 봉입 나노입자는, 줄기세포로의 도입 효율의 관점에서, 광산란법으로 측정했을 때, 개수 평균 입경의 상한과 하한이 다음과 같이 가공(제조)된다.

ㆍ 개수 평균 입경의 상한은, 1000nm 미만, 바람직하게는 약 600nm 이하(보다 바람직하게는 600nm 이하), 보다 바람직하게는 약 400nm 이하(보다 더 바람직하게는 400nm 이하)이다.

ㆍ 개수 평균 입경의 하한은 약 100nm 이상(보다 바람직하게는 100nm 이상), 바람직하게는 약 200nm 이상(보다 더 바람직하게는 200nm 이상)이다.

예를 들어, 스타틴 봉입 나노입자의 개수 평균 입경은, 광산란법으로 측정했을 때, 1000nm 미만, 바람직하게는 약 100nm 내지 약 600nm(보다 바람직하게는 100nm ~ 600nm), 더욱 바람직하게는 약 200nm 내지 약 400nm(보다 더 바람직하게는 200nm ~ 400nm)이다.

본 발명에서 스타틴 봉입 나노입자는, 상기의 개수 평균 입경을 만족하도록 가공할 수 있는 방법이라면 어떠한 방법으로도 제조될 수 있으나, 바람직하게는 구형 정석법(spherical crystallization technique)을 사용하여 제조된다. 구형 정석법은, 화합물 합성의 최종 과정에서 결정의 생성·성장 과정을 제어함으로써, 구형 크리스탈 입자를 설계하고, 그 물성을 직접 제어하여 가공할 수 있는 방법으로 잘 알려져 있다. 이 구형 정석법의 하나로 주지의 에멀젼 용매 확산법(ESD법)이 있다.

에멀젼 용매 확산법은, 스타틴을 봉입하기 위한 상기 PLA 또는 PLGA 등의 생체 흡수성 폴리머가 용해 가능한 양용매(good solvent)와, 폴리머가 용해되지 않는 빈용매(poor solvent) 2종의 유기 용매를 사용하여 수행된다. 먼저 양용매 중에 PLA 또는 PLGA 등의 폴리머를 용해하고, 이 폴리머가 석출되지 않도록 스타틴 용해액을 양용매에 첨가하여 혼합한다. 이 혼합액을 교반된 빈용매 중에 적하하면, 빠르게 양용매가 빈용매로, 또, 빈용매는 양용매로 상호 확산되므로, 유기 용매상과 수상의 계면이 흐트러져, 양용매가 자기 유화되고, 서브 미크론 크기의 에멀젼 드롭이 형성된다. 그 후, 양용매 및 빈용매의 상호 확산이 더욱 진행되어, 에멀젼 드롭 내의 PLA 또는 PLGA 등의 폴리머 및 스타틴의 용해도가 저하되고, 그 결과 스타틴을 포함한 구형 결정 입자의 폴리머 나노입자가 생성된다.

본 발명에서 줄기세포는, 전능성, 다능성 또는 다분화능을 갖는 세포이며, 예를 들어 배아 줄기세포(ES 세포), 인공 다능성 줄기세포(iPS 세포) 및 간엽계 줄기세포 등의 체성 줄기세포를 들 수 있다. 본 발명에서는, 많은 줄기세포를 보다 간편하면서 대량으로 얻는다는 관점에서, 골수 조직이나 지방 조직 등으로부터 얻어지는 간엽계 줄기세포를 이용하는 것이 바람직하다. 그 중에서도 특히, 지방 유래 줄기세포를 이용하는 것이 보다 바람직하다. 지방 유래 줄기세포는, 세포 단독으로 투여되는 것은 이미 임상에서 이루어지고 있으며, 지방을 비롯하여 뼈, 간, 심장 등으로 분화하는 것이 알려져 있다. 지방 유래 줄기세포는 지방 조직에서 얻을 수 있으며, 이 지방 조직은 지방 흡입 등의 저침습 기술로 피하지방 등으로부터 용이하게 얻을 수 있다. 지방 유래 줄기세포는, 상기와 같이 얻어진 지방 조직으로부터 셀루션 시스템(사이토리사제) 등을 이용하여 추출 및 분리됨으로써 풍부하게 채취 가능하다. 이로써 본 발명에 따른 줄기세포로 이용하는데 매우 유리하다.

본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자의 줄기세포에의 처리는, 예를 들어 이 줄기세포가 배양된 배양 배지 중에 첨가함으로써 이루어진다. 이와 같이 하면, 파고사이토시스에 의해 줄기세포가 스타틴 봉입 나노입자를 세포 내에 취하므로, 특별한 시약 등을 이용하는 일 없이, 간편하게 줄기세포 내로 스타틴 봉입 나노입자를 함유시킬 수 있다.

본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자에 의해 처리된 줄기세포는, 특히 이주능, 증식능 및 면역 억제능이 증강되며, 특히 염증성 질환에 대한 치료 효과가 증강된다. 이러한, 본 발명에 따른 기능 증강 줄기세포는, 정맥 내 투여 또는 동맥 내 투여로도 적은 투여량으로 우수한 효과를 나타낸다. 구체적으로, 본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자에 의해 처리된 상기 지방 유래 줄기세포를 동맥 내 투여하면, 지방 유래 줄기세포가 혈류에 따라 염증을 나타내는 장기, 예를 들어 장에 도달하여 염증부에 집적 및 증식하여, 항염증성 사이토카인을 생산하고, 또 염증성 세포의 활성을 억제한다. 그 결과, 염증성 질환에 대한 우수한 치료 효과를 나타낸다.

본 발명에 있어서 염증성 질환이란, 염증을 병인의 하나로 하는 질환을 말하며, 장염이나 폐렴과 같은 그들 질환의 특징적인 증상이 염증인 것으로 한정됨 없이, 폐고혈압증이나 치매 등과 같은 그 질환의 발병 과정에 염증이 관여하는 것도 포함한다. 구체적으로, 본 발명에서의 염증성 질환은, 전신성 홍반성 루푸스(Systemic Lupus Erythematosus: SLE), 경피증, 아토피성 피부염, 류마티스 관절염, 간질성 폐렴, 기관지 천식, 폐고혈압증, 궤양성 대장염이나 크론병 등의 염증성 장질환(IBD), 신경 손상, 척수 손상, 뇌졸중(뇌경색이나 뇌출혈 후 후유증), 근위축성 측색 경화증, 만성 염증성 탈골수성 다발성 신경염, 조현병(schizophrenia), 치매, 장기 이식 시의 거부 반응, 만성 신장염(신경화증) 등을 들 수 있다.

또한 지방 유래 줄기세포는, 전술한 바와 같이, 함유시킨 스타틴 봉입 나노입자를 세포 내에서 가수 분해함으로써 봉입된 스타틴을 서방한다. 이로써, 지방 유래 줄기세포는 체내에 투여면, 투여 후에 스타틴을 서방하고 방출된 스타틴에 의해 더욱 항염증 효과를 얻을 수 있다.

[실시예]

다음에, 본 발명에 따른 줄기세포 기능 증강용 스타틴 봉입 나노입자 및 이를 함유하는 기능 증강 줄기세포 등을 상세하게 설명하기 위한 실시예를 나타낸다.

우선, 스타틴 봉입 나노입자의 제조방법에 대하여 설명한다. 여기서는 특히, 스타틴으로 심바스타틴을 이용하고, 나노입자로 폴리젖산(PLA) 또는 폴리젖산-글리콜산 공중합체(PLGA)를 포함하는 나노입자를 사용하였다.

PLA(중량 평균 분자량 20000) 50mg과 심바스타틴 2.5mg을 아세톤 2mL, 에탄올 0.5mL의 혼합액에 용해시켜 폴리머 용액으로 하였다. 이를 실온에서 500rpm으로 교반한 뒤, 2wt% PVA 용액 10mL 중에 적하하여, 심바스타틴 봉입 PLA 나노입자 현탁액을 얻었다. 이어서, 실온에서 500rpm으로 교반을 계속하면서 유기 용매(아세톤, 에탄올)를 증류 제거하였다. 약 5시간 용매 증류 후, 현탁액을 4℃, 60000g으로 30분간 원심 분리하고, 침전물을 회수하여 증류수에 재현탁시켰다. 이 원심 분리와 증류수의 재현탁 작업은 총 3회 실시하였다. 그 후, 현탁액을 하룻밤 동결 건조하여, 심바스타틴 봉입 PLA 나노입자를 얻었다. 심바스타틴은 1mg의 나노입자 중에 24.94μg 봉입되었다. 심바스타틴 봉입 PLGA 나노입자도 마찬가지 방법으로 얻었다.

이들을 스타틴 봉입 나노입자로 하여 이하의 시험에 사용하였다.

다음으로, 줄기세포에 대하여 상기와 같이 하여 얻어진 스타틴 봉입 나노입자를 처리할 때의 최적 처리농도를 검토하기 위해 다음의 시험을 실시하였다.

당해 시험을 실시하기 위해 우선, 콜라게나제 처리 및 원심 비중법을 이용한 주지의 방법을 이용하여 인간 지방 조직으로부터 지방 유래 줄기세포(Adipose derived Stem Cell: AdSC)를 얻고, 또, 마우스 지방 조직으로부터 지방 유래 세포를 얻었다. 그 방법에 대하여 이하에 상세히 설명한다.

먼저, 인간 지방 조직으로부터 지방 유래 줄기세포를 얻는 방법에 대하여 설명한다. 미리 Liberase TM RG(0.5mg/mL = 0.47WU/mL, Sigma 5401127001 50mg/vial)/HBSS(ThermoFisher 14175095) 용액 및 10 × 용혈 용액(NH₄Cl 8.3g, NaHCO₃ 1.2g, 0.5M EDTA 용액 200μL/100mL)을 준비해 둔다. 50mL 흡입 주사기 내의 지방 3개(150mL)를 노즐 부착된 플라스틱 병(AS ONE #1-4640-03 광구 세척병 1000ml)에 옮기고, 등량의 PBS(-)로 세척, 폐액을 4,5회 반복한다. 상기 Liberase TM RG 용액(50mg/vial을 20mL HBSS에 용해하고, 반량 10mL를 HBSS 40mL(합계 50mL)로 희석한 후 약 150mL의 지방 조직에 사용한다.)를 지방 용액의 병에 넣어 가볍게 Vortex한 후, 진탕 항온조를 이용하여 37℃, 20분간 진탕 배양한다. 그 후, 20% FBS/DMEM F12 50mL를 상기 병 안에 첨가하여 효소 반응을 정지시킨다. 병의 노즐로부터 액층(지방의 하층)을 셀 스트레이너(100μm, BD)를 통과시키면서 복수의 새로운 50mL 튜브에 나누어 회수한다. 1200rpm(300g)×5min으로 원심(브레이크 있음) 처리하고 상층액을 버린다. 1mM EDTA/PBS 40mL/튜브로 세포 펠렛을 현탁하고, 셀 스트레이너(40μm, BD)를 통과시키면서 같은 개수의 새로운 50mL 튜브에 옮긴다. 1200rpm(300g)×5min으로 원심(브레이크 있음)처리하여 상층액을 버린다. 1mM EDTA/PBS 2ml로 세포를 현탁하여 1개의 튜브에 모으고, 용혈 용액 8mL를 가하여 혼합한 후 10분간 냉소(OnIce) 저장한다(용혈 조작). 1mM EDTA/PBS를 45mL 부근까지 가한 후, 1200rpm(300g)×5min으로 원심 분리하여 상층액을 버린다. 세포 펠렛을 PBS(-) 또는 10% DMEM F12로 현탁하여, 5% CO₂ 배양기에서 10% DMEMF12와 함께 3, 4일간 배양하여, 접착 세포를 지방 유래 줄기세포(AdSC)로 실험에 사용한다(P0). 계대 배양할 경우, 1 : 3 ~ 4의 비율(3000-4000/cm²의 밀도)로 다시 3, 4일간 계대 배양한다.

한편, 마우스 지방 조직에서 지방 유래 줄기세포를 얻는 방법은 다음과 같다. 미리, 콜라게나제 VIII형(2mg/mL, Sigma #C2139)/1% BSA HBSS 용액을 진탕 항온조 37℃에서 해동시켜 둔다. 또, 1mM EDTA/PBS는 EDTA(0.5M EDTA, pH8.0, LifeTechnologies, AM9260G), 10X DPBS, Ca(-), Mg(-)(GIBCO, 14200-166)을 희석하여 제작해 둔다. 그 후 2, 3마리의 마우스를 마취시킨 후에 심와부에서 26 ~ 29G 바늘의 주사기(인슐린 주사기 등)로 탈혈사시킨다. 피하 지방(고간 ~ 등부)을 채취하여 3.5cm 배양 접시(생리 식염수를 중앙에 한 방울 적하하여 지방 조직을 취하기 쉽게 해둔다)에 모아둔다. 지방 조직을 뚜껑 위에 올려 놓은 채 가위로 소편(20 ~ 30회 정도)이 되도록 절단한 후, 지방 조직을 지방과 같은 부피의 콜라게나제 용액과 함께 15mL 튜브에 넣는다. 뚜껑을 닫고 튜브를 전도 혼합한 후, 진탕 항온조를 이용하여 37℃에서 30분간 배양한다. 10% FBS/DMEM F12 배지를 같은 양으로 추가하여 효소 반응을 정지시킨다. 최상부의 지방층을 흡입 제거한 후, 상층액을 셀 스트레이너(40μm, BD, 352340)에 통과시켜 새로운 50mL 튜브로 회수한다. 1200rpm(250g)×5min에서 원심(브레이크 있음) 처리하고 상층액을 버린다. 1mM EDTA/PBS(-)를 10ml까지 튜브에 추가하여 세포 펠렛을 현탁한다. 1200rpm(250g)×5min에서 원심(브레이크 있음) 처리하고 상층액을 버린다. 세포 펠렛을 10% FBS/DMEM F12 배지에서 현탁한 후, 배양 접시에 파종한다(P0). 5% CO₂ 배양기에서 3, 4일간 배양하고, 접착 세포를 AdSC로서 1 : 1로 계대(P1)한다. 5% CO₂ 배양기에서 4, 5일간 배양하고, 접착 세포를 AdSC로서 1 : 3으로 계대(P2)한다. 80 ~ 90% 정도까지 세포 밀도가 증가한 시점에서 실험에 사용한다.

전술한 방법으로 인간 지방 유래 줄기세포를 얻은 후, 상기 에멀젼 용매 확산법을 이용하여 스타틴 대신 로다민 적색 형광색소를 PLA 나노입자에 봉입함으로써 얻어진 로다민 적색 형광색소 봉입 PLA 나노입자를, 그 최종 농도가 20μg/mL, 50μg/mL, 80μg/mL 또는 100μg/mL가 되도록, 상기 지방 유래 줄기세포의 배양 배지 중에 첨가하였다. 그 1시간 후(1h) 또는 2시간 후(2h)에 로다민 적색 형광색소 봉입 PLA 나노입자의 도입에 대하여 공초점 레이저 형광 현미경을 이용하여 관찰하였다. 여기서, 핵의 염색은 DAPI를 이용하여 통상적인 방법으로 염색하였다. 그 결과를 도 1에 나타낸다.

또한, 상기와 마찬가지 방법으로 마우스 지방 유래 줄기세포에서도 로다민 적색 형광색소 봉입 나노입자를 포함시키고, 그 도입에 대하여 플로 사이토메트리(Fluorecence-activated cell sorting: FACS) 분석으로 측정하였다. 단, 나노입자로 PLGA 나노입자를 이용하고, 로다민 적색 형광색소 봉입 PLGA 나노입자의 최종 농도는 20μg/mL, 50μg/mL, 75μg/mL 및 100μg/mL로 하여, 로다민 적색 형광색소 봉입 PLGA 나노입자의 첨가 30분 후에 FACS 장치(BD FACSAria, BD Biosceinces) 및 이 장치에 부속된 분석 소프트웨어를 이용하여 측정 및 분석하였다. 그 결과를 도 2에 나타낸다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 로다민 적색 형광색소 봉입 PLA 나노입자는, 모든 농도에서 인간 지방 유래 줄기세포에 포함된 것을 알 수 있다. 단, 처리농도 의존적으로, 인간 지방 유래 줄기세포의 로다민 적색 형광색소 봉입 PLA 나노입자의 도입량이 증대한다. 또, 처리 시간이 1시간인 경우보다 2시간인 경우가, 인간 지방 유래 줄기세포에 의한 심바스타틴 봉입 PLA 나노입자의 도입량이 많음도 알 수 있다. 특히, 로다민 적색 형광색소 봉입 PLA 나노입자를 100μg/mL의 농도에서 인간 지방 유래 줄기세포에 처리한 경우에, 많은 로다민 적색 형광색소 봉입 PLA 나노입자가 줄기세포에 포함되었음이 확인되었다.

한편, 마우스 지방 유래 세포에서도, 도 2에 나타낸 바와 같이, 로다민 적색 형광색소 봉입 PLGA 나노입자는, 모든 농도에서 마우스 지방 유래 줄기세포에 도입되어, 특히 처리농도 의존적으로, 마우스 지방 유래 줄기세포의 로다민 적색 형광색소 봉입 PLGA 나노입자의 도입량이 증가하였다.

다음으로 지방 유래 줄기세포에 의한 나노입자의 도입이, 나노입자의 입경에 따라 차이가 발생하는지 여부를 검토하기 위하여 다음의 시험을 실시하였다.

우선, 200nm ~ 400nm의 입경을 갖는 PLGA 나노입자와, 400nm ~ 600nm의 입경을 갖는 PLGA 나노입자를 준비하고, 상기 시험과 마찬가지로, 상기 에멀젼 용매 확산법을 이용하여 스타틴 대신 로다민 적색 형광색소를 당해 PLGA 나노입자에 봉입하였다. 이로써, 상기 각 입경 범위의 로다민 적색 형광색소 봉입 PLGA 나노입자를 제조하였다. 다음으로, 제조한 당해 PLGA 나노입자를 최종 농도 100μg/mL가 되도록, 인간 지방 유래 줄기세포의 배양 배지(10% FBS/DMEM F12) 중에 첨가하였다. 그 1시간 후에, 로다민 적색 형광색소 봉입 PLGA 나노입자의 도입에 대하여 공초점 레이저 형광 현미경을 이용하여 관찰하였다. 여기서, 핵의 염색은 DAPI를 사용하여 통상적인 방법으로 염색하였다. 그 결과를 도 3에 나타낸다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 로다민 적색 형광색소 봉입 PLGA 나노입자는, 모든 입경에서 인간 지방 유래 줄기세포에 도입되었음을 알 수 있다. 이 결과로부터, 나노입자의 입경이 200nm ~ 600nm의 범위라면 양호하게 지방 유래 줄기세포에 도입시킬 수 있음이 시사되었다. 여기서, 다음의 각 시험에서는, 개수 평균 입경 약 300nm의 나노입자를 사용하였다.

다음으로, 심바스타틴 봉입 나노입자를 도입한 지방 유래 줄기세포가, 그 후 세포 내에서 스타틴을 어느 정도의 시간에 걸쳐 방출하는지를 검토하기 위하여, 배지 중에 방출된 스타틴의 양을 측정하였다. 여기서는, 상기 시험과 마찬가지로 인간 지방 유래 줄기세포에 대하여 100μg/mL의 농도에서 심바스타틴 봉입 PLA 나노입자를 1시간 처리한 후, 배지를 교환하고, 배지 교환부터 6시간 후, 18시간 후, 24시간, 48시간, 72시간, 120시간, 168시간 및 336시간 후에, 배지 중에 방출된 심바스타틴의 양을 측정하였다. 구체적으로, 이 측정은 HPLC(High-pressure Liquid Chromatography)법을 이용하여 수행하였다. 이 측정결과를 도 4에 나타낸다.

또, 상기와 같은 방법으로 마우스 지방 유래 줄기세포에서도 스타틴을 어느 정도의 시간에 걸쳐 방출하는지를 측정하였다. 단, 여기서는 50μg/mL의 농도에서 심바스타틴 봉입 PLGA 나노입자를 30분간 처리하였다. 그 결과를 도 5에 나타낸다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 측정 개시부터 24시간 후에 약 60% 정도의 스타틴이 인간 지방 유래 줄기세포에서 방출되며, 모든 스타틴이 방출되는 데 약 336시간이 걸렸다. 이 결과로부터, 인간 지방 유래 줄기세포에 도입된 스타틴은, 인간 지방 유래 줄기세포에서 빠르게 방출되는 것이 아니라 느리게 서방됨을 알 수 있다. 따라서 긴 시간에 걸쳐 스타틴을 방출할 수 있기 때문에, 양호한 치료 효과를 기대할 수 있다.

한편, 마우스 지방 유래 세포에서도, 도 5에 나타낸 바와 같이, 인간 지방 유래 줄기세포의 경우와 마찬가지로, 측정 개시부터 24시간 후에 약 60% 정도의 스타틴이 마우스 지방 유래 줄기세포에서 방출되고, 모든 스타틴이 방출되는 데 약 336시간이 걸렸다. 이 결과로부터, 마우스 지방 유래 줄기세포에 도입된 스타틴도 오랜 시간에 걸쳐 방출되기 때문에, 양호한 치료 효과를 기대할 수 있다.

다음으로, 상기 심바스타틴 봉입 나노입자에 따른 지방 유래 줄기세포의 이주능 및 증식능과 같은 기능의 증강에 대하여 검토하기 위해 다음의 시험을 실시하였다.

먼저, 이주성 시험 키트(Transwell(등록 상표))을 이용하여 인간 지방 유래 줄기세포의 이주능에 대하여 검토하였다. 구체적으로, Transwell 플레이트의 각 웰의 다공 멤브레인 상에 인간 지방 유래 줄기세포를 5×10⁴cells/well로 파종하고, 배지 중에 스타틴을 봉입하지 않은 PLA 나노입자를 20μg/mL, 또는 심바스타틴 봉입 PLA 나노입자를 20μg/mL, 50μg/mL 및 100μg/mL의 농도가 되도록 첨가하여, 16 ~ 18시간 후에 Transwell 멤브레인을 통과한 세포 수를 측정하였다. 그 결과를 도 6(a)에 나타낸다.

도 6(a)에 나타낸 바와 같이, 20μg/mL의 스타틴 비봉입 PLA 나노입자로 처리한 경우(PLA20), 및 20μg/mL의 심바스타틴 봉입 PLA 나노입자로 처리한 경우(PLA-ST20)는, 미처리인 대조군(Control)과 비교하여 인간 지방 유래 줄기세포의 이주성에 변화는 없었으나, 50μg/mL의 심바스타틴 봉입 PLA 나노입자로 처리한 경우(Statin50)는, 인간 지방 유래 줄기세포의 이주성이 증가하였다. 또한, 100μg/mL의 심바스타틴 봉입 PLA 나노입자로 처리한 경우(Statin100)는, 인간 지방 유래 줄기세포의 이주성이 감소하는 결과가 되었다. 이 결과로부터, 최적의 처리농도가 있기는 하나, 심바스타틴 봉입 PLA 나노입자에 의해 인간 지방 유래 줄기세포의 이주능을 항진할 수 있음이 시사되었다.

다음으로, 심바스타틴 봉입 나노입자에 의한 지방 유래 줄기세포의 증식성 향상에 대하여 MTT assay 분석으로 검토한 결과에 대하여 설명한다.

우선, 인간 지방 유래 줄기세포를 96well 마이크로 플레이트에 5000cells/well의 세포 수로 파종하고, 심바스타틴 봉입 PLA 나노입자를 20μg/mL, 50μg/mL 또는 100μg/mL의 농도가 되도록 첨가하여, 48시간 후에 배지를 교환하고, MTT 용액을 각 웰에 첨가하여 2시간 후에 분광광도계를 이용하여 450nm의 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 6(b)에 나타낸다.

도 6(b)에 나타낸 바와 같이, 심바스타틴 봉입 나노입자를 20μg/mL(Statin20), 50μg/mL(Statin50) 및 100μg/mL(Statin100)의 농도로 처리한 경우 모두, 미처리인 대조군(Control)과 비교하여 인간 지방 유래 줄기세포의 증식이 인정되며, 특히 50μg/mL의 농도로 처리한 경우, 대조군에 비해 현저한 증식성의 증가를 보였다. 이 결과로부터, 심바스타틴 봉입 PLA 나노입자에 의해, 인간 지방 유래 줄기세포의 증식능이 항진될 수 있음이 시사되었다.

이상과 같이, 스타틴 봉입 나노입자에 의한 지방 유래 줄기세포의 이주능 및 증식능과 같은 기능의 증강에 대하여 검토한 결과, 스타틴 봉입 나노입자에 의해, 지방 유래 줄기세포의 기능을 증강시킬 수 있다. 이들 기능이 증강됨으로써 지방 유래 줄기세포는 염증성 질환의 치료에 유리하다.

다음으로, 마우스 IBD 모델을 이용하여, 본 발명에 관한 스타틴 봉입 나노입자를 함유하는 줄기세포의 염증성 질환의 치료 효과에 대하여 검토하였다.

우선, 덱스트란 황산나트륨(DSS)을 이용한 장염 마우스 모델을 이용하여, 본 발명에 따른 줄기세포의 바람직한 투여 세포 수 및 투여 경로를 검토하였다. 그 방법 및 결과에 대하여 이하에 설명한다.

우선, 6 ~ 8주령의 C57BJ/6J 마우스에 대하여, 물 대신 2.5%의 DSS를 포함하는 물을 5일간 계속 주어 장염을 발병시키고, 5일째에 마우스 지방 유래 줄기세포를 경정맥, 복강 내, 또는 경동맥 투여하였다. 마우스 지방 유래 줄기세포로는, 미리 상기와 마찬가지 방법으로 로다민 적색 형광색소 봉입 PLGA 나노입자를 도입시킨 것을 사용하였다. 경동맥 투여는 구체적으로, 마우스 좌측 총경동맥 원위부를 6-0 견사로 결찰하고, 그 바로 아래를 가위로 약 2mm 절개한 후에 30G 카테터를 삽입하여 수행하였다. 투여 세포 수는 2×10⁴, 1×10⁵ 및 3×10⁵cells로 하였다. 그 후, 5일째부터 8일째까지 통상적인 물로 되돌리고 자유 음수시켰다. 8일째에 마우스를 안락사시킨 후 해부하여, 대장을 적출하고 조직학적 분석을 실시하였다. 구체적으로, 로다민 적색 형광색소 봉입 PLGA 나노입자의 도입에 대하여 공초점 레이저 형광 현미경으로 관찰하였다. 여기서, 핵 염색은 DAPI를 이용하여 통상적인 방법으로 염색하였다. 그 결과를 도 7 및 도 8에 나타낸다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 마우스 지방 유래 줄기세포를 경정맥 또는 복강 내 투여한 경우는, 로다민 염색된 줄기세포의 존재가 인정되지 않았다. 한편, 도 8에 나타낸 바와 같이, 마우스 지방 유래 줄기세포를 경동맥 투여한 경우는, 투여 세포 수가 1×10⁵cells 이상이면 줄기세포의 존재가 인정되며(도 8의 화살표 부분), 즉, 줄기세포가 염증을 일으킨 장에 집적될 수 있음이 시사되었다.

다음으로, 상기 결과에 기초하여, 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 지방 유래 줄기세포의 장염 억제 효과에 대하여 검토하였다. 이하에, 그 방법 및 결과에 대하여 설명한다.

우선, 상기 시험과 마찬가지로, 6 ~ 8주령의 C57BJ/6J 마우스에 대하여, 물 대신 2.5%의 DSS를 포함한 물을 5일간 계속 주어 장염을 발병시켰다. 5일째에 PBS, 스타틴 비봉입의 나노입자를 포함하는 마우스 지방 유래 줄기세포, 또는 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 마우스 지방 유래 줄기세포를 경동맥으로 투여하였다(각 군 n = 6). 마우스 지방 유래 줄기세포의 투여량은 2×10⁵cells/마우스로 하였다. 스타틴 비봉입 나노입자는 PLGA를 이용하고, 스타틴 봉입 나노입자는 상기 심바스타틴 봉입 PLGA 나노입자를 이용하여, 이들 나노입자 50μg/mL와 마우스 지방 유래 줄기세포를 30분 ~ 1시간 공배양하여, 스타틴 비봉입 나노입자 또는 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 마우스 지방 유래 줄기세포를 얻었다.

그 후, 5일째부터 8일째까지는 통상적인 물로 되돌리고 자유 음수시켰다. 시험 개시 0일째부터 8일째까지 매일 체중을 측정하였다. 또한 8일째에 마우스를 안락사시킨 후 해부하여, 대장을 적출하고 조직학적 분석 등을 실시하였다. 구체적으로, 대장 길이의 측정, Disease Activity Index(DAI) 스코어 측정, 염증성 사이토카인 등의 면역 제어에 관련된 유전자 발현을 측정하였다.

먼저, 도 9에 상기 각 군의 체중 측정결과를 나타낸다. 도 9의 그래프는, 0일째의 체중을 100%로 했을 경우의 체중의 증감 비율을 나타낸다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 각 군에서 DSS에 의해 장에 염증이 생겨, 5일째를 기점으로 체중이 마찬가지로 감소하였다. 그러나 6일째 이후, PBS를 투여한 대조군에 비해, 스타틴 비봉입 나노입자를 포함하는 마우스 지방 유래 줄기세포를 투여한 군(AdSC군) 및 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 마우스 지방 유래 줄기세포를 투여한 군(Sim-AdSC군)의 체중 감소 비율이 작아지고, 특히 Sim-AdSC 군에서는 체중 감소가 거의 보이지 않게 되었다.

다음으로, 도 10(a)에 대장의 길이의 측정결과를 나타낸 도 10(b)에 DAI 스코어의 측정결과를 나타낸다.

도 10(a)에 나타낸 바와 같이, Sim-AdSC 군, AdSC 군, 대조군의 순으로 대장의 길이가 긴 것을 알 수 있다. 대장에 염증이 생기면 통상 그 길이가 짧아지는 것으로 알려져 있으며, 따라서, Sim-AdSC군, AdSC군, 대조군의 순서로 염증이 억제되었음을 알 수 있다.

또한, 도 10(b)에 나타낸 바와 같이, DAI 스코어도 Sim-AdSC군, AdSC군, 대조군의 순으로 스코어가 작아지는 것을 알 수 있다. DAI 스코어란, 도 11에 표시된 기준에 따라, 각 마우스의 중증도를 스코어화한 것으로, 스코어가 클수록 중증임을 나타낸다. 따라서, Sim-AdSC군, AdSC군, 대조군의 순서로 염증이 억제되었음을 알 수 있다.

다음으로, 각 군에서 염증 등의 면역제어에 관련된 사이토카인으로 TNFα, IL-17, IL-6 및 IL-1β의 유전자 발현에 대한 측정결과를 도 12에 나타낸다. 구체적으로, 여기서는 각 군의 장 조직을 채취하고, 이들 조직의 TNFα, IL-17, IL-6 및 IL-1β의 유전자 발현에 대하여, 마우스의 이들 각 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 정량적 RT-PCR법으로 분석을 실시하였다.

도 12에 나타낸 바와 같이, TNFα, IL-17 및 IL-1β에서, Sim-AdSC군 및 AdSC군에서는 대조군과 비교하여 이들의 유전자 발현량이 현저하게 감소하였다. 또, IL-6에서는, Sim-AdSC군이 대조군 및 AdSC군과 비교하여 그 유전자 발현량이 현저하게 감소하였다. 이들 결과로부터, 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 지방 유래 줄기세포에 의해, 면역 억제 작용이 발생하여 염증을 억제할 수 있음이 시사된다.

다음으로, 각 군의 조직학적 분석결과를 도 13에 나타낸다. 구체적으로, 여기서는 각 군의 장 조직을 채취하여, 4% 파라포름알데하이드 용액에 고정시킨 후 박절 표본을 제작하여 HE 염색을 실시하였다. 염증 세포의 침윤 정도에 따라 조직 손상 정도의 스코어화(Matts의 생검 조직 분류)를 실시하여 비교 검토하였다. 여기서, Matts 생검 조직 분류는 다음의 기준으로 스코어화한 것이다.

1 정상 조직

2 점막, 점막 하층에 소량의 염증성 세포 침윤

3 점막, 점막 하층에 다량의 염증성 세포 침윤

4 선와 농양(crypto abscess)의 존재와 점막 전층에 다수의 염증성 세포 침윤

5 염증성 세포 침윤을 동반한 점막 조직의 미란·궤양·괴사.

도 13(a)는, 각 군의 대장 절편 염색 사진이고, 도 13(b)는 그것을 스코어화한 것이다.

도 13(a) 및 (b)에 나타낸 바와 같이, Sim-AdSC군, AdSC군, Control군의 순서로 염증이 억제되었음을 알 수 있다.

다음으로, 간질성 폐렴 마우스 모델을 이용하여, 본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자를 함유하는 줄기세포의 염증성 질환 치료 효과에 대하여 검토하였다. 그 방법 및 결과에 대하여 이하에 설명한다.

간질성 폐렴 마우스 모델로는 C57B6/J 마우스에 피하 이식형 침투압성 지속 주입 펌프로 블레오마이신을 투여하여 간질성 폐렴이 발병시키는 주지의 모델을 이용하였다. 구체적으로, 먼저 6 ~ 8주령의 C57B6/J 마우스에 대하여 블레오마이신을 매일 100μg/day의 양으로 2주 동안 피하 투여함으로써 간질성 폐렴을 발병시켰다. 또, 블레오마이신 투여 개시부터 1주일 후에 PBS, 스타틴 비봉입 나노입자를 포함하는 마우스 지방 유래 줄기세포, 또는 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 마우스 지방 유래 줄기세포를 정맥 내에 투여하였다. 마우스 지방 유래 줄기세포의 투여량은 2.5×10⁴cells/mouse로 하였다. 스타틴 비봉입 나노입자는 PLGA를 이용하고, 스타틴 봉입 나노입자는 상기 심바스타틴 봉입 PLGA 나노입자를 이용하여, 이들 나노입자 100μg/mL와 마우스 지방 유래 줄기세포를 30분 ~ 1시간 공배양하여 스타틴 비봉입 나노입자 또는 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 마우스 지방 유래 줄기세포를 얻었다.

그 후, 블레오마이신 투여 개시부터 3주 후에 마우스를 안락사시켜 해부하고, 폐를 꺼내 조직학적 분석을 실시하였다. 구체적으로, 여기서는 각 군에서 폐 조직을 채취하고, 4% 파라포름알데하이드 용액에서 고정시킨 후, 박절 표본을 제작하여 HE 염색을 실시하였다. 도 14에, 각 군의 폐 절편 염색 사진을 나타낸다. 또한, 도 14에는 블레오마이신이 투여되지 않은 정상 마우스의 폐 절편 염색 사진도 나타낸다.

도 14에 나타낸 바와 같이, 정상 마우스의 폐 조직에서는, 폐포 내에 염색되지 않은 공동 부분이 많이 인정되는데, 블레오마이신으로 간질성 폐렴에 걸린 마우스에 대하여 PBS만을 투여한 마우스의 폐 조직은, 정상 마우스에 비해 염증 부분으로 간주되는 영역이 염색되어, 공동 부분의 감소가 인정된다. 또한, 스타틴 비봉입 나노입자를 포함하는 마우스 지방 유래 줄기세포를 투여한 마우스(AdSC)에서는, 상기 PBS군과 비교하여 염색 부분이 감소하여 공동 영역의 증가가 인정된다. 또, 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 마우스 지방 유래 줄기세포를 투여한 마우스(Sim-AdSC)에서는, 정상 마우스와 동등한 수준까지의 회복이 인정된다. 이들 결과로부터, 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 지방 유래 줄기세포에 의해, 간질성 폐렴에도 염증을 억제할 수 있음이 시사된다.

다음으로, 경피증 마우스 모델을 이용하여, 본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자를 함유하는 줄기세포의 염증성 질환 치료 효과에 대하여 검토하였다. 그 방법 및 결과에 대하여 이하에 설명한다.

경피증 마우스 모델로는 BALB/c 마우스에 블레오마이신을 투여하여 경피증을 발병시키는 주지의 모델을 이용하였다. 구체적으로, 먼저 6 ~ 8주령의 BALB/c 마우스에, 블레오마이신을 매일 100μg/day의 양으로 3주간 피하 투여함으로써 경피증을 발병시켰다. 또, 블레오마이신 투여 개시부터 1주일 후에 PBS, 스타틴 비봉입 나노입자를 포함하는 마우스 지방 유래 줄기세포(1.0×10⁴cells/mouse 혹은 2.5×10⁵cells/mouse), 또는 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 마우스 지방 유래 줄기세포(1.0×10⁴cells/mouse)를 정맥 내에 투여하였다. 스타틴 비봉입 나노입자는 PLGA를 이용하고, 스타틴 봉입 나노입자는 상기 심바스타틴 봉입 PLGA 나노입자를 이용하여, 이들 나노입자 100μg/mL 또는 200μg/mL와 마우스 지방 유래 줄기세포를 30분 ~ 1시간 공배양하여, 스타틴 비봉입 나노입자 또는 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 마우스 지방 유래 줄기세포를 얻었다.

그 후, 블레오마이신의 투여 개시부터 3주일 후에 마우스를 안락사시켜 해부하고, 피부 조직을 채취하여 조직학적 분석을 실시하였다. 구체적으로, 여기서는, 각 군의 피부 조직을 채취하여 4% paraformaldehyde 용액에서 고정시킨 후, 박절 표본을 제작하여 HE 염색을 실시하였다. 도 15에 각 군의 피부 절편 염색 사진을 나타낸다. 또한, 도 15에는 블레오마이신이 투여되지 않은 정상 마우스의 피부 절편 염색 사진도 나타낸다.

도 15에 나타낸 바와 같이, 정상 마우스의 피부 조직에서는, 표피(흰색 화살표)의 존재가 인정되나, 블레오마이신에 의해 경피증이 발생한 마우스에 PBS만을 투여한 마우스의 피부 조직은, 정상 마우스에 비해 표피가 매우 얇아지고 진피 부분(검은색 화살표)이 두꺼워졌다. 또한, 스타틴이 비봉입 나노입자를 포함하는 마우스 지방 유래 줄기세포를 투여한 마우스(AdSC 1×10⁴, AdSC 2.5×10⁵)에서는, 상기 PBS군과 비교하여 진피의 두께가 얇아졌으며, 특히 줄기세포를 더 많이 투여한 AdSC 2.5×10⁵에서는 진피의 두께가 더 얇아졌음을 알 수 있다. 또한 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 마우스 지방 유래 줄기세포를 투여한 마우스(Sim100-AdSC 1.0×10⁴, Sim200-AdSC 1.0×10⁴)에서는, 상기 PBS군과 비교하여 진피의 두께가 작아졌으며, 특히 200μg/mL의 스타틴을 봉입한 나노입자를 이용한 Sim200-AdSC 1.0×10⁴에서는 정상 마우스의 피부 조직에서의 진피 두께에 가까운 정도까지 회복하였음을 알 수 있다. 이들 결과로부터, 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 지방 유래 줄기세포에 의해 경피증의 증상을 개선할 수 있음이 시사된다.

다음으로, 신경 손상 마우스 모델을 이용하여, 본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자를 함유하는 줄기세포의 염증성 질환 치료 효과에 대하여 검토하였다. 그 방법 및 결과에 대하여 이하에 설명한다.

신경 손상 마우스 모델로는 C57B6/J 마우스 왼쪽 좌골 신경을 겸자로 20초간 조여 신경 손상을 제작하는 주지의 모델을 이용하였다. 구체적으로, 먼저 10 ~ 12주령의 C57B6/J 마우스에 대하여, 마취 하에 좌측 둔부의 피부를 절개한 후, 대퇴부 근육의 근초를 박리하여 왼쪽 좌골 신경을 노출시키고, 해당 왼쪽 좌골 신경을 겸자로 20초간 압박하여 신경을 손상시켰다. 그 3일 후에 PBS, 스타틴 비봉입 나노입자를 포함하는 마우스 지방 유래 줄기세포, 또는 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 마우스 지방 유래 줄기세포를 정맥 내에 투여하였다. 마우스 지방 유래 줄기세포의 투여량은 5×10⁴cells/mouse로 하였다. 스타틴 비봉입 나노입자는 PLGA를 이용하고, 스타틴 봉입 나노입자는 상기 심바스타틴 봉입 PLGA 나노입자를 이용하여, 이들 나노입자 100μg/mL와 마우스 지방 유래 줄기세포를 30분 ~ 1시간 공배양하여 스타틴 비봉입 나노입자 또는 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 마우스 지방 유래 줄기세포를 얻었다.

그리고, 신경 손상 직전, 상기 투여 직전, 신경 손상된 1주일 후, 2주 후, 3주 후, 4주 후, 5주 후에 운동 기능 평가를 실시하였다. 운동 기능은 좌골 신경 기능 지수(Sciatic Functional Index : SFI)를 이용하여 평가하였다. SFI는, 마우스 뒷다리의 족흔 길이(PL), 첫째 발가락 중앙에서 다섯째 발가락 중앙까지의 거리(TS), 둘째 발가락 중앙에서 넷째 발가락 중앙까지의 거리(IT), 오른쪽의 정상적인 다리(N)와 왼쪽의 신경 손상 다리(E) 양쪽에서 측정하여, 다음 식으로 구하였다.

SFI = -38.3×(EPL-NPL)/NPL+109.5×(ETS-NTS)/NTS+13.3×(EIT-NIT)/NIT-8.8

각 군에서의 SFI 측정결과를 도 16의 그래프에 나타낸다. 도 16에 나타낸 바와 같이, PBS만을 투여한 마우스에 비해, 스타틴 비봉입 나노입자를 포함하는 마우스 지방 유래 줄기세포를 투여한 마우스(AdSC)에서는 SFI가 높아져 있어, 운동 기능이 회복되었음이 인정된다. 또한, 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 마우스 지방 유래 줄기세포를 투여한 마우스(Sim-AdSC)는 SFI가 더욱 높아져, 더욱 운동 기능이 회복된 것으로 인정된다. 이들 결과로부터, 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 지방 유래 줄기세포에 의해, 신경 손상의 증상을 개선할 수 있음이 시사된다.

다음으로, 조현병 마우스 모델을 이용하여, 본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자를 함유하는 줄기세포의 염증성 질환 치료 효과에 대하여 검토하였다. 그 방법 및 결과에 대하여 이하에 설명한다.

조현병 마우스 모델로는, C57B6/J 마우스의 schnurri-2(Shn-2) 유전자를 넉아웃한 마우스를 이용하였다(RIKEN BRC). Shn-2 넉아웃(KO) 마우스의 뇌는 조현병 환자의 뇌에서 보고된 특징을 매우 높은 유사도로 갖추고 있는 것으로 알려졌다(K Takao et al., Neuropsychophamacology (2013) 38, p1409-1425). 실제로, Shn-2KO 마우스가 정상 마우스와 비교하여, 행동 이상을 나타내는지 여부를 둥지 만들기 행동으로 검토하였다. 여기서는, 정상 마우스(WT) 및 Shn-2KO마우스에게 펠트를 주고, 펠트를 갉아 둥지 상태로 만드는지 여부를 관찰하였다. 그 결과를 도 17에 나타낸다.

도 17에 나타낸 바와 같이, 정상 마우스는 펠트를 모두 갉아 그것을 깔았지만, Shn-2KO마우스는 거의 펠트를 갉는 일이 없었다. 이 결과로부터도, Shn-2가 넉아웃된 마우스는 조현병 모델로 이용할 수 있다고 할 수 있다.

그래서, 상기 Shn-2KO마우스를 이용하여, 본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자를 함유하는 줄기세포의 조현병 치료 효과에 대하여 검토하였다. 우선, 상기 Shn-2KO마우스에 대하여, PBS, 스타틴 비봉입 나노입자를 포함하는 마우스 지방 유래 줄기세포, 또는 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 마우스 지방 유래 줄기세포를 정맥 내에 투여하였다. 마우스 지방 유래 줄기세포의 투여량은 1×10⁴cells/mouse로 하였다. 스타틴 비봉입 나노입자는 PLGA를 사용하고(50μg), 스타틴 봉입 나노입자는 상기 심바스타틴 봉입 PLGA 나노입자(20μg 또는 50μg)를 사용하여, 이들 나노입자와 마우스 지방 유래 줄기세포를 30분 ~ 1시간 공배양하여 스타틴 비봉입 나노입자 또는 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 마우스 지방 유래 줄기세포를 얻었다. 투여 후에 각 마우스 케이지 안에 펠트를 넣고, 그 1주일 후에 펠트의 상태를 관찰하였다. 또, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 펠트 상태에 따라 스코어를 기록하였다. 도 18에 관찰 결과 및 스코어를 나타낸다.

[표 1]

도 18에 나타낸 바와 같이, PBS만을 투여한 마우스에서는 둥지 만들기 행동은 거의 보이지 않고, 조현병의 증상이 강하게 보였다. 또, 스타틴 비봉입 나노입자를 포함하는 마우스 지방 유래 줄기세포를 투여한 마우스(PLGA 50μg-AdSC)에서도, 둥지 만들기 행동이 약간 보이는 정도였다. 한편, 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 마우스 지방 유래 줄기세포를 투여한 마우스에서, 심바스타틴 봉입 PLGA 나노입자를 20μg 이용한 경우(SimPLGA 20μg-AdSC)에서는, 둥지 만들기 행동이 일부 보이며, 증상의 회복이 인정되었다. 또한 심바스타틴 봉입 PLGA 나노입자를 50μg 이용한 경우(SimPLGA 50μg-AdSC)에서는, 정상 마우스에 가까운 둥지 만들기 행동을 보이며, 증상의 현저한 회복이 인정된다. 이들 결과로부터, 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 지방 유래 줄기세포에 의해, 조현병의 증상을 개선할 수 있음이 시사된다.

다음으로, 퇴행성 관절염(osteoarthritis : OA) 마우스 모델을 이용하여, 본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자를 함유하는 줄기세포의 염증성 질환 치료 효과에 대하여 검토하였다. 그 방법 및 결과에 대하여 이하에 설명한다.

OA 마우스 모델로는 BALB/c 마우스에 대하여 오른쪽 무릎관절 전방 십자인대의 절단 및 내측 반월판 절제술을 실시하는 주지의 모델을 이용하였다. 구체적으로는, 외과적으로 BALB/c 누드 마우스(수컷, 10주령)의 오른쪽 무릎관절 전방 십자인대를 절단함과 더불어, 내측 반월판을 절제하고, 4일 후부터 4일간(수술 후 4 ~ 7일), 당해 마우스에 대하여 회전 바퀴를 이용하여 15000회전 정도의 바퀴운동 부하를 주어, OA를 유도하였다. 수술 후 7일째에, PBS, 인간 지방 유래 줄기세포, 또는 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 인간 지방 유래 줄기세포를, 29G 주사 바늘을 사용하여 해당 마우스 오른쪽 무릎 내관절에 국소 투여하였다. PBS 투여량은 10μL로 하였다. 또, 인간 지방 유래 줄기세포의 투여량은 1×10⁴cells/mouse로 하고, 용매로 10μL의 PBS를 사용하였다. 스타틴 봉입 나노입자로는 상기 심바스타틴 봉입 PLGA 나노입자를 사용하고, 이들 나노입자 20μg/mL와 인간 지방 유래 줄기세포(1×10⁴cells)를 30분 ~ 1시간 공배양하여 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 인간 지방 유래 줄기세포를 얻었다. 각 군 n = 3으로 하였다.

상기 투여부터 2주일 후에 마우스를 안락사시킨 다음 해부하여, 오른쪽 무릎 관절 연골 조직을 채취하여 조직학적 분석을 실시하였다. 구체적으로, 여기서는 각 군의 오른쪽 무릎의 관절 연골 조직을 채취하여, 4% paraformaldehyde 용액에서 고정시킨 후 박절 표본을 제작하여 사프라닌 O(Safranin O) 염색을 실시하였다. 사프라닌 O는 연골 기질을 염색하는 염색 시약이다. 도 19에, 각 군의 관절 연골 조직 절편의 염색 사진을 나타낸다. 또한, 도 19에는 오른쪽 무릎관절 전방 십자인대의 절단 및 내측 반월판 절제술을 받지 않은 정상 마우스의 오른쪽 무릎 관절 연골 조직 절편의 염색 사진도 나타낸다.

도 19에 나타낸 바와 같이, 정상 마우스의 관절 연골 조직에서는, 경골 골두부에 두꺼운 연골층이 존재함과 더불어, 사프라닌 O에 의한 염색이 인정된다(진한 회색 부분). 이에 반해, OA가 유도된 마우스에 PBS를 투여한 군(PBS군)에서는, 경골 골두부의 연골층이 매우 얇아졌으며, 당해 연골층에서 사프라닌 O에 의한 염색은 인정되지 않았다. 한편, OA가 유도된 마우스에 인간 지방 유래 줄기세포를 투여한 군(AdSC군)에서는, PBS군과 비교하여 경골 골두부의 연골층이 두껍고, 사프라닌 O에 의한 염색도 적지만 인정된다. 또, OA가 유도된 마우스에 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 인간 지방 유래 줄기세포를 투여한 군(Statin-AdSC군)에서는, 상기 AdSC군보다 더 경골 골두부의 연골층이 두껍고, 사프라닌 O에 의한 염색 부분도 많이 인정된다.

또한, 상기 PBS군, AdSC군 및 Statin-AdSC군에 대하여, 관절 손상도를 병리 조직학적 소견으로 채점하였다. 채점 기준은 Osteoarthritis and Cartilage 18(2010) S17-S23에 기초하여 다음과 같이 평가하였다.

[표 2]

상기 채점 기준에 따라, 각 군의 채점을 실시한 결과를 도 20에 나타낸다. 도 20에 나타낸 바와 같이, PBS군에서는 스코어가 높고, 간접 손상도가 높으나, AdSC군은 PBS군보다 스코어가 낮고, 또 Statin-AdSC군에서는 스코어가 더 낮은 결과가 되었다. 이들 결과로부터, 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 지방 유래 줄기세포에 의해, 퇴행성 관절염의 증상을 개선할 수 있음이 시사된다.

다음으로, 치매증 마우스 모델을 이용하여, 본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자를 함유하는 줄기세포의 염증성 질환 치료 효과에 대하여 검토하였다. 그 방법 및 결과에 대하여 이하에 설명한다.

치매증 모델 마우스로는, 이화학 연구소 바이오 리소스센터에서 얻은 C57BL/6-App<tm3(NL-G-F)Tcs>를 이용하였다. 해당 모델 마우스에 대하여, PBS, 지방 유래 줄기세포, 또는 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 지방 유래 줄기세포를, 마우스의 꼬리 정맥에서 서서히 투여하였다. 본 시험에서는, 지방 유래 줄기세포로 C57BL/6 마우스의 피하 지방에서 얻은 마우스 지방 유래 줄기세포를 사용하였다. 지방 유래 줄기세포의 투여량은 1×10⁴cells/mouse로 하고, 용매로 200μL의 PBS를 사용하였다. 스타틴 봉입 나노입자로는 상기 심바스타틴 봉입 PLGA 나노입자를 사용하고, 이들 나노입자 20μg과 1×10⁴cells의 마우스 지방 유래 줄기세포를 37℃에서 30분 배양하여, 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 마우스 지방 유래 줄기세포를 얻었다. 투여시의 용매는 200μL의 PBS를 사용하였다.

상기 투여된 마우스 및 정상적인 야생형 마우스에 대하여, 그 기억 평가를 하기 위해 주지의 반스 미로 시험(Barnes maze test)을 실시하였다. 구체적으로, 상기 투여일을 0일째로 하여, 0일째, 7일째 및 14일째에 기억 분석으로서, 각 마우스의 반스 미로 테이블 주변부에 설치된 20개의 서클 중 하나에만 설치된 타겟 홀을 찾고, 이 타겟 홀과 연통하는 탈출 케이지에 도달할 때까지의 시간 및 이동 거리를 측정하였다. 또한, 상기 측정(기억 분석) 전날의 오전과 오후에 각 1회씩 기억 훈련을 실시하였다.

상기 각 마우스는, 여러 마리의 마우스와 함께 하나의 케이지에서 사육하고, 상기 기억 훈련 및 기억 분석 1시간 이상 전에 개별 케이지로 나누어 환경에 적응시켰다. 기억 훈련은, 먼저 마우스를 미로 테이블의 중앙에 배치된 흰 원통 용기 내에 1분간 정치한 후, 이 원통 용기를 미로 테이블에서 제거함과 더불어 마우스가 싫어하는 초음파 부저를 울렸다. 그 후 3분간, 마우스에게 타겟 홀을 찾게 하고, 탈출 케이지에 들어간 시점에서 초음파 부저를 정지했다. 단, 3분이 경과해도 마우스가 탈출 케이지에 들어 가지 않는 경우는, 마우스를 투명한 원통 용기에 넣어 주위 환경을 보이고 기억시키면서 30초 정도의 시간을 들여 강제로 마우스를 탈출 케이지에 넣었다. 탈출 케이지에 넣은 후 1분 동안은 그 환경에 적응시켰다. 기억 훈련은 상기 공정을 3회 반복하였다.

기억 훈련 다음 날에 실시하는 기억 분석은, 우선, 기억 훈련과 마찬가지로, 마우스를 미로 테이블의 중앙에 배치된 흰 원통 용기 내에 1분간 정치한 후, 이 원통 용기를 미로 테이블에서 제거함과 더불어, 마우스가 싫어하는 주파수의 초음파 부저를 울려, 행동 추적 기록을 개시하였다. 그 후, 마우스가 타겟 홀을 찾아 탈출 케이지에 들어간 시점에서 초음파 부저를 정지하고, 행동 추적 기록을 정지하였다. 행동 추적 기록에는, 행동 분석 시스템인 LimeLite 소프트(ActiMetrics, Inc. IL, USA)를 이용하여, 초음파 부저가 울린 후 마우스가 탈출 케이지에 들어갈 때까지의 이동거리(목표 도달 이동거리)와 시간(목표 도달 시간)을 측정하였다. 상기 각 마우스의 기억 분석 결과를 도 21에 나타낸다.

도 21에 나타내는 바와 같이, 0일째는, 정상 마우스(WT)와 비교하여, PBS가 투여된 치매증 모델 마우스(PBS), 지방 유래 줄기세포가 투여된 치매증 모델 마우스(AdSC) 및 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 지방 유래 줄기세포가 투여된 치매증 모델 마우스(SimAdSC) 모두, 탈출 케이지에 도달할 때까지의 이동 거리 및 시간이 길었다. 그러나 7일째, 14일째 등 시간이 경과함에 따라, 지방 유래 줄기세포 또는 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 지방 유래 줄기세포가 투여된 치매증 모델 마우스는, PBS가 투여된 치매증 모델 마우스에 비해, 탈출 케이지에 도달할 때까지의 이동거리 및 시간이 짧아졌다. 특히 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 지방 유래 줄기세포가 투여된 치매증 모델 마우스는, 14일째에 정상 마우스와 동등한 결과가 인정되었다. 이들 결과로부터, 스타틴 봉입 나노입자를 포함하는 지방 유래 줄기세포에 의해, 치매의 증상을 개선할 수 있음이 시사된다.

이상의 결과로부터, 본 발명에 따른 스타틴 봉입 나노입자는 줄기세포의 기능을 증강할 수 있으며, 이 기능 증강 줄기세포는 염증성 질환이 있는 대상에 투여됨으로써, 장 등의 염증부에 집적하고, 면역을 억제하여 항염증 작용을 발휘할 수 있다. 또, 본 발명에 따른 줄기세포는, 도입된 스타틴을 서방할 수 있으며, 이로써 스타틴 자체의 항염증 효과도 얻을 수 있으므로, 염증성 질환의 치료에 유익하다.

Claims

스타틴이 생체 흡수성 폴리머를 포함하는 나노입자에 봉입되어 이루어지는 스타틴 봉입 나노입자로서,
상기 입자는, 줄기세포의 기능을 증강시키기 위한 입자이고,
상기 줄기세포는, 염증성 질환의 치료용 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 스타틴 봉입 나노입자.
제 1 항에 있어서, 상기 생체 흡수성 폴리머는, 폴리젖산(PLA) 또는 폴리젖산-글리콜산 공중합체(PLGA)인 것을 특징으로 하는, 스타틴 봉입 나노입자.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 줄기세포는, 지방 유래 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 스타틴 봉입 나노입자.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증강되는 줄기세포의 기능은, 이주능 또는 증식능인 것을 특징으로 하는, 스타틴 봉입 나노입자.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환은, 염증성 장 질환인 것을 특징으로 하는, 스타틴 봉입 나노입자.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환은, 간질성 폐렴인 것을 특징으로 하는, 스타틴 봉입 나노입자.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환은, 경피증인 것을 특징으로 하는, 스타틴 봉입 나노입자.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환은, 신경 손상인 것을 특징으로 하는, 스타틴 봉입 나노입자.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환은, 조현병인 것을 특징으로 하는, 스타틴 봉입 나노입자.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환은, 관절염인 것을 특징으로 하는, 스타틴 봉입 나노입자.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환은, 치매증인 것을 특징으로 하는, 스타틴 봉입 나노입자.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 스타틴 봉입 나노입자를 함유하는 염증성 질환 치료용 기능 증강 줄기세포.
제 12 항에 있어서, 상기 줄기세포는 지방 유래 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 기능 증강 줄기세포.
제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 상기 줄기세포의 증강된 기능은, 이주능 또는 증식능인 것을 특징으로 하는, 기능 증강 줄기세포.
제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환은, 염증성 장 질환인 것을 특징으로 하는, 기능 증강 줄기세포.
제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환은, 간질성 폐렴인 것을 특징으로 하는, 기능 증강 줄기세포.
제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환은, 경피증인 것을 특징으로 하는, 기능 증강 줄기세포.
제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환은, 신경 손상인 것을 특징으로 하는, 기능 증강 줄기세포.
제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환은, 조현병인 것을 특징으로 하는, 기능 증강 줄기세포.
제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환은, 퇴행성 관절염인 것을 특징으로 하는, 기능 증강 줄기세포.
제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환은, 치매증인 것을 특징으로 하는, 기능 증강 줄기세포.
제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 기능 증강 줄기세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 염증성 질환을 치료하기 위한 동맥 투여용 세포 제제.
제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 기능 증강 줄기세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 염증성 질환을 치료하기 위한 정맥 투여용 세포 제제.
제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 기능 증강 줄기세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 염증성 질환을 치료하기 위한 국소 투여용 세포 제제.
제 22 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환은, 염증성 장 질환인 것을 특징으로 하는, 세포 제제.
제 22 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환은, 간질성 폐렴인 것을 특징으로 하는, 세포 제제.
제 22 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환은, 경피증인 것을 특징으로 하는, 세포 제제.
제 22 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환은, 신경 손상인 것을 특징으로 하는, 세포 제제.
제 22 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환은, 조현병인 것을 특징으로 하는, 세포 제제.
제 22 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환은, 퇴행성 관절염인 것을 특징으로 하는, 세포 제제.
제 22 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환은, 치매증인 것을 특징으로 하는, 세포 제제.