JP2020519658A - 長時間作用性グラチラマー及び脂肪由来幹細胞での多発性硬化症の治療 - Google Patents
長時間作用性グラチラマー及び脂肪由来幹細胞での多発性硬化症の治療 Download PDFInfo
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Abstract
Description
酢酸グラチラマー(GA)としても知られ、コパキソン(登録商標)という商品名で市販されているコポリマー1は、ミエリン塩基性タンパク質で発見されたL−グルタミン酸、L−アラニン、L−チロシン及びL−リジンの4個のアミノ酸で構成されるランダムポリマー(平均分子量6.4kD)である。アミノ酸の平均モル分率は、それぞれ、0.141、0.427、0.095及び0.338であり、コポリマー1の平均分子量は4,700〜11,000ダルトンである。酢酸グラチラマーは、L−アラニン、L−リジン及びL−チロシンを有するL−グルタミン酸ポリマー、酢酸塩(塩)と化学的に命名される。その構造式は、(Glu、Ala、Lys、Tyr)xCH3COOH又は(C5H9NO4_C3H7NO2_C6H14N2O2_C9H11NO3)xC2H4O2[CAS−147245−92−9]、おおよその比はGlu14Ala43Tyr10Lyz34x(CH3COOH)20である。コパキソン(登録商標)は、皮下注射用の透明で、無色からわずかに黄色の、滅菌済み非発熱性溶液である。各ミリリットルは、20mgの酢酸グラチラマー及び40mgのマンニトールを含有する。溶液のpH範囲は、約5.5〜7.0である。コパキソン(登録商標)は、再発型の多発性硬化症を有する患者の治療に適応される。
米国特許第8,377,885号は、多発性硬化症の治療における皮下若しくは筋肉内注入又は注射に適するデポー形態の治療有効量のグラチラマーを含む長時間作用性経口医薬組成物、特に、治療有効量の酢酸グラチラマーを含む組成物を開示している。
MSCは、もともと成人骨髄内で特定された多能性自己再生細胞源である。自然に、それらは分化して、骨芽細胞、軟骨細胞及び脂肪細胞を生成する。MSCは、胚性幹(ES)細胞に代わる多能性幹細胞の入手しやすい源を提供する。MSCは、自己供給源に由来することができ、また、同種の使用に有利な免疫特権的性質によって特徴付けられるので、細胞療法における免疫抑制の必要性を潜在的に回避する。
過去数十年にわたって、脂肪組織が、エネルギー貯蔵所としての主な機能に加えて、多能ストローマ細胞のための豊富な供給源であることも示されている(Zuk et al.,Mol Biol Cell 2002;13:4279−4295)。
本発明は、脂肪由来間葉系幹細胞を利用する。本明細書で使用される場合、「ADSC」又は「hADSC」(すなわち、ヒト脂肪由来幹細胞)と略記される「脂肪由来間葉系幹細胞」又は「脂肪由来幹細胞」という用語は、脂肪組織から採取されるプラスチック接着性の多能性細胞を指す。細胞集団は、細胞の少なくとも95%がCD44、CD73及びCD90を発現し、細胞の少なくとも90%がCD105を発現し、かつ細胞の少なくとも95%がCD45、CD19、CD11B及びHLADRを発現しないことによって特徴付けられる。
本明細書で使用する「酢酸グラチラマー」という用語は、コパキソン(登録商標)という商品名で販売されており、それぞれ0.141、0.427、0.095、及び0.338の平均モル分率を有する4個の天然アミノ酸:L−グルタミン酸、L−アラニン、L−チロシン、及びL−リジンを含有する合成ポリペプチドの酢酸塩からなるコポリマー1として以前に知られていた化合物を指す。コパキソン(登録商標)中の酢酸グラチラマーの平均分子量は4,700〜11,000ダルトン(FDAコパキソン(登録商標)ラベル)であり、アミノ酸の数は約15〜約100個のアミノ酸の範囲である。この用語はまた、化学的誘導体及び化合物の類似体を指す。典型的には、化合物は、米国特許第5,981,589号、同第6,054,430号、同第6,342,476号、同第6,362,161号、同第6,620,847号、及び同第6,939,539号のいずれかで指定されるように調製され、特徴付けられ、これらの参考文献の各々の内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。
750mg含むが、これらに限定されない。しかしながら、投与されるグラチラマーの量は、選択された投与経路、患者の年齢、体重、及び患者の症状の重症度を含む様々なパラメータに応じて、医師によって決定されることが理解される。本発明の様々な実施形態によれば、グラチラマーの治療有効量は、約1mg〜約500mg/日の範囲である。あるいは、そのようなグラチラマーの治療有効量は、約20mg〜約100mg/日である。
実施例1−C57BL/6マウスにおけるMOG誘導性慢性EAEに対するGAデポー及びヒトADSCの効果
材料及び方法
酢酸グラチラマー:(商品名コパキソン(登録商標))予め充填されたシリンジ中20mg/ml、Teva Pharmaceutical Industries Ltd.,Petah−Tikva,Israel)。皮下注射(SC)用。
細胞調製のプロトコル:
ADSCの単離:
ヒト組織由来の脂肪吸引物を、室温(RT)で等量のPBSで4回洗浄した。次いで、脂肪吸引物を振盪しながら、コラゲナーゼ(NB4、Serva)を用いて37℃で30分間消化した。その後、消化した試料をRTで10分間、300〜500gで遠心分離し、未消化の脂肪を含む上部液体を除去した。異物を含まない増殖培地(StemMACS(商標)、Miltentyi)を等量添加することによって反応を停止させた後、RTで10分間、500gでさらに遠心分離した。得られたペレットを50mlの遠心分離管に移し、培地で洗浄し、同じ条件で遠心分離した。上清を除去し、ペレットを、25mlの赤血球溶解緩衝液(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO,USA)を用いて、RTで10分間再懸濁した。25mlのPBSを添加し、試料を5分間500gで遠心分離した。ペレットを、10mlの培地に再懸濁し、100μmフィルターを通して濾過し、その後、さらに10mlの培地を添加した。溶液を5分間、500gで遠心分離した。手順を、40μmのフィルターを用いて繰り返し、細胞を計数した。得られた細胞を間質血管画分(SVF)と呼ぶ。
SVFを、75cm2あたり約2×106個の細胞密度で播種した。細胞を約80%集密度まで増殖させ、トリプシン処理し、最高3〜4回継代培養した。次いで、細胞を収集し、マーカー:CD105、CD73、CD90、CD45、CD44、CD19、CD11B、HLADR及びCD34についてFACSによって分析した。細胞を、使用するまで液体窒素中で凍結保存した。使用する場合は、凍結した細胞を解凍し、50,000細胞/cm2の濃度で播種し、一晩インキュベートした。細胞ICV注入の前に、細胞をトリプシン処理し、計数し、2×105細胞/PBS4μlの濃度で注入用に調製し、30分以下の間、使用するまで氷上に置いた。ICV注入を、定位システムを用いて行い、マウスの脳を傷つけないように注意した。
疾患症状の発症から28日目まで、体重を毎日測定した。EAEを、免疫後0日目から28日目に、1日1回マウスの臨床スコアリングにより評価した(表1)。死んだ動物には臨床スコア5を与え、動物の死ぬ前の最終重量測定値を最終体重として記録した。
最大スコアの平均値:
分析の指定日までの特定のグループ内の各マウスについて記載された最高スコアの平均値である。
平均疾患期間:
(各マウスについての分析の日−疾患発症日)の合計/(1グループ当たりのマウスの数)
平均発症日:
各マウスの疾患発症の日の合計/1グループあたりのマウスの数
臨床スコアの曲線下面積(AUC):
マイクロソフトエクセルを用いて計算され、疾患負荷を表す。
EAEモデルの実験計画を表2に詳述する(各グループにおいてn=10)。
MOG誘発性EAEにおけるADSCの細胞用量治療効果を評価するために(上記のように)、異なる量(1×105又は2×105)のADSCを単独で、又は2mgのGAデポーのIM注射と組み合わせて、ICV投与のために使用した。実験計画を表6に詳述する(各グループにおいてn=10)。
試験物の最初の注入から28日まで計算した試験結果を図6〜10に記載する。
表7〜15に、上記の実施例1に記載したように調製し、1〜5回継代したADSCの9つの試料のFACS分析をまとめる。表16〜17及び図11は、平均値+標準偏差(「StDev」)の値を示す。表及び図に見られるように、マーカーは、P3の後に安定化される。継代数P3〜P4は、約14以下の集団倍加と同等である。
Claims (32)
- 多発性硬化症の治療方法であって、酢酸グラチラマーを含み、持続放出性デポー形態の医薬組成物を、それを必要とする対象に非経口投与することと、前記対象のヒト脂肪由来幹細胞(hADSC)を中枢神経系(CNS)に投与することと、を含む方法。
- 酢酸グラチラマー及び前記hADSCを含む前記医薬組成物が同じ日に投与される、請求項1に記載の方法。
- 酢酸グラチラマー及び前記hADSCを含む前記医薬組成物が別々の日に投与される、請求項1に記載の方法。
- 酢酸グラチラマーを含む前記医薬組成物の投与と前記hADSCの投与の間の期間が、1〜14日の範囲である、請求項3に記載の方法。
- 酢酸グラチラマーを含む前記医薬組成物が、1〜6週ごとに1回投与される、請求項1に記載の方法。
- 酢酸グラチラマーを含む前記医薬組成物が、4週ごとに1回投与される、請求項1に記載の方法。
- 前記hADSCが1回投与される、請求項1に記載の方法。
- 前記hADSCが2回以上投与される、請求項1に記載の方法。
- 前記hADSCが、2〜8ヶ月ごとに投与される、請求項8に記載の方法。
- 酢酸グラチラマーを含む前記医薬組成物が前記hADSCの前に投与される、請求項1に記載の方法。
- 酢酸グラチラマーを含む前記医薬組成物が前記hADSCの後に投与される、請求項1に記載の方法。
- 酢酸グラチラマーを含む前記医薬組成物が、筋肉内投与用に製剤化され、前記投与が筋肉内注射によるものである、請求項1に記載の方法。
- 酢酸グラチラマーを含む前記医薬組成物が皮下移植用に製剤化され、前記投与が皮下注射によるものである、請求項1に記載の方法。
- 前記hADSCの投与が髄腔内投与によるものである、請求項1に記載の方法。
- 前記hADSCの投与が、脳室内又は側脳室内(ICV)投与によるものである、請求項1に記載の方法。
- 前記hADSCが、脂肪吸引によってヒト皮下脂肪から得られる、請求項1に記載の方法。
- 前記hADSCが自己である、請求項1に記載の方法。
- 前記hADSCが同種異系である、請求項1に記載の方法。
- 前記hADSCが、前記細胞の少なくとも95%がCD44、CD73及びCD90を発現し、前記細胞の少なくとも90%がCD105を発現し、かつ前記細胞の少なくとも95%がCD45、CD19、CD11B及びHLADRを発現しないことによって特徴付けられる、請求項1に記載の方法。
- 前記hADSCが、さらに、前記細胞の0.1〜10%がCD34を発現することによって特徴付けられる、請求項19に記載の方法。
- 前記hADSCの投与が、1回の投与あたり約105〜3×108個の細胞を投与することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記酢酸グラチラマーが、約0.14のグルタミン酸、約0.43のアラニン、約0.10のチロシン及び約0.33のリジンのモル比でL−アラニン、L−グルタミン酸、L−リジン、及びL−チロシンの酢酸塩を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記酢酸グラチラマーが、約15〜約100個のアミノ酸を含む、請求項1に記載の方法。
- 酢酸グラチラマーを含む前記医薬組成物が、酢酸グラチラマーの医薬として許容される生分解性又は非生分解性担体を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記担体が、ポリ(D,L−ラクチド−コ−グリコリド)(PLGA)、ポリ(D,L−ラクチド)(PLA)、ポリグリコリド(PGA)、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシブチレート、ポリオルトエステル、ポリアルカン無水物、ゼラチン、コラーゲン、酸化セルロース、及びポリホスファゼンからなる群から選択される、請求項24に記載の方法。
- 酢酸グラチラマーを含む前記医薬組成物が、水中油中水型二重乳化プロセスによって調製される微粒子の形態である、請求項1に記載の方法。
- 前記微粒子が、治療有効量の酢酸グラチラマーを含む内部水相、生分解性及び非生分解性ポリマーから選択される担体を含む水不混和性ポリマー相、及び外部水相を含む、請求項26に記載の方法。
- 前記水不混和性ポリマー相が、PLA及びPLGAから選択される生分解性ポリマーを含む、請求項27に記載の方法。
- 前記外部水相が、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリソルベート、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドブロック共重合体及びセルロースエステルから選択される界面活性剤を含む、請求項27に記載の方法。
- 酢酸グラチラマーを含む前記医薬組成物が、酢酸グラチラマーを約20〜500mg含む、請求項1に記載の方法。
- 前記対象が、進行型の多発性硬化症を患っている、請求項1に記載の方法。
- 酢酸グラチラマーを含む医薬組成物であって、中枢神経系(CNS)に投与されるヒト脂肪由来幹細胞(hADSC)と組み合わせて多発性硬化症の治療に使用するための、非経口投与用の持続放出性デポー形態の医薬組成物。
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