CN100360180C - 共聚物1和相关肽和多肽及其处理过的t细胞在神经保护性治疗中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供治疗中枢或周围神经系统损伤或疾病的方法。在一个实施方案中，通过给予活化T细胞来起到治疗作用，该T细胞可以识别Cop 1或Cop 1相关肽或多肽抗原，促进神经再生、或防止或抑制神经系统内神经元退化。在另一个实施方案中，治疗包括给予Cop 1或Cop 1相关肽或多肽，以促进神经再生、或防止或抑制神经系统中，即中枢神经系统或周围神经系统中神经元退化。活化T细胞已由Cop 1或Cop 1相关肽或多肽的存在而被活化，它可以单独给药或与Cop 1或Cop 1相关肽或多肽组合一起给药。

Description

共聚物1和相关肽和多肽及其处理过的T细胞在神经保护性治疗中的用途

相关申请的交叉参考

本申请要求以下申请的优先权，2000年1月20日提交的美国申请09/487,793，2000年6月7日提交的美国申请60/209,799，和2000年7月20日提交09/620,216。由此，申请09/487,793，60/209,799和09/620,216中每个申请的内容都在此引作参考。

发明领域

本发明涉及这样的组合物和方法，它们用于促进神经再生或防止或抑制神经元退化以改善神经系统(NS)损伤或疾病的影响。特别地，本发明涉及这样的组合物，其中含共聚物1(Cop1)或Cop1相关肽或多肽、和/或用Cop1或Cop1相关肽或多肽处理的活化T细胞，以促进神经再生或防止或抑制人类患者中枢或周围神经系统内神经疾病或损伤引起的神经元退化。本发明的组合物可单独给药或可选地以任何期望组合来给药。

发明背景

神经系统含中枢和周围神经系统。中枢神经系统(CNS)由脑和脊髓组成；周围神经系统(PNS)由所有其他的神经元件组成，即脑和脊髓以外的神经和神经节。

神经系统病变可由创伤性损伤引起，如穿透性创伤或钝器伤，或由疾病或紊乱引起，其中包括但不限于阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、糖尿病神经病、老年性痴呆和缺血。

保持中枢神经系统完整性是复杂的“平衡作用”，其中涉及免疫系统。大多数组织中，免疫系统在保护、修复和痊愈中起基本作用。由于其独特的免疫特性，中枢神经系统中的免疫反应相对有限(Streilein，1993，1995)。越来越多的证据表明，哺乳动物中枢神经系统损伤后不能恢复功能反映了损伤组织和免疫系统间的无效对话。例如，中枢神经系统和血液中巨噬细胞间有限的联系影响轴索显微术后轴突的再生能力；移植活化巨噬细胞可促进中枢神经系统再生(Lazarov Spiegler et al，1996；Rapalino et al，1998)。

已经证明活化T细胞可进入中枢神经系统实质，这与其抗原特异性无关，但似乎只有能与中枢神经系统抗原反应的T细胞能够持续(Hickey et al，1991；Werkele，1993；Kramer et al，1995)。与中枢神经系统白质中抗原，如髓鞘碱性蛋白(MBP)，反应的T细胞在给予未经过实验处理的受试大鼠几天内可诱导瘫痪疾病即实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)(Ben-Nun，1981a)。抗MBP T细胞也与人疾病多发性硬化症有关(Ota，K.et al，1990；Martin，1997)。然而，尽管它具有致病能力，但在健康个体免疫系统中存在抗MBP T细胞克隆(Burns，1983；Pette，M.et al，1990；Martin et al，1990；Schluesener et al，1985)。活化T细胞在完整中枢神经系统中正常存在，可在中枢神经系统白质病变部位瞬间积聚(Hirschberget al，1998)。

中枢神经系统损伤的灾难性后果是，原发性损伤经常伴随邻近神经元渐进的继发性损失，而这些神经元表面上没有损伤、或仅受初始损伤的边际性破坏(Faden et al，1992；Faden et al，1993；McIntosh，1993)。原发性损伤引起细胞外离子浓度的改变、自由基的量增加、神经递质释放、生长因子衰竭和局部炎症。这些改变触发邻近神经元的破坏性事件级联，尽管这些神经元避开了原发性损伤(Lynch et al，1994；Bazan et al，1995；Wu et al，1994)。通过活化电压依赖的或激动剂门控的通道、离子渗漏，活化钙离子依赖的酶如蛋白酶、脂酶和核酸酶，线粒体功能障碍和能量衰竭、神经元细胞死亡的极大化，由此可以介导这种继发性破坏(Yoshina et al，1991；Hovda etal，1991；Zivin et al，1991；Yoles et al，1992)。由原发性损伤直接引起的损失以外的广泛性神经元损失被称为“继发性退化”。

引起疾病自我传播的最常见载体之一是谷氨酸，甚至当原发性危险因素去除或减弱时也能如此，它是一种可表现双重活性的兴奋型氨基酸：作为基本神经递质在正常中枢神经系统(CNS)中起关键作用，但当超过其生理水平时则变得有毒。已有报道在许多CNS疾病中谷氨酸水平提高。作为兴奋毒性化合物，谷氨酸是急性和慢性(包括青光眼中视神经退化)退行性疾病中最常见毒性载体之一(Pitt et al.，2000和Schoepp et al.，1996)。内源性谷氨酸归因于在癫痫持续状态、脑缺血或创伤性脑损伤后发生的急性脑损伤。这也有助于如肌萎缩性侧索硬化症和亨廷顿氏舞蹈病类疾病中的慢性神经退化。

大量研究集中于通过使用局部作用药物，如NMDA受体拮抗剂，来减弱谷氨酸细胞毒作用(Brauner-Osborne et al.，2000)。然而，该类型的常规治疗经常不能令人满意，如在中和毒性作用上它可能干扰其生理作用。对于人，这种化合物有精神作用及其它副作用，这使之不适于用作治疗剂。作为普遍存在的CNS神经递质，它们也有干扰谷氨酸基本生理功能的缺点。因为谷氨酸活性对于正常生理功能必需，而在急性损伤后或慢性CNS疾病中具有潜在破坏性，任何中和其有害作用的尝试都必须不消除其在体内其它位点处的基本活性。

中枢神经系统损伤的另一种有害后果是，哺乳动物中枢神经系统内的神经元在损伤后不能自发性再生。因而，中枢神经系统损伤引起运动和感觉功能的永久性损伤。

无论损伤的严重程度，脊髓病变最初导致完全功能性麻痹，称为脊髓休克。可以观察到一些脊髓休克的自发性恢复，这在损伤后几天开始并在三到四周内逐渐停止。损伤程度越小，功能性恢复越好。恢复程度是未破坏组织减去继发性退化引起损失量的函数。神经保护处理可改进损伤恢复，它可以降低继发性退化。例如，减轻谷氨酸作用经常是神经保护性药物开发的靶标。N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体或α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸(AMPA)受体拮抗剂就是为此目的正开发的药物。当它们干扰NMDA和AMPA受体功能时，这些药物将不可避免地有严重副作用，因为这些受体对于CNS活性至关重要。在脑缺血和创伤性脑损伤动物模型中，NMDA和AMPA受体拮抗剂保护其免受急性脑损伤和迟发性行为缺陷。这类化合物正在进行人体测试，但疗效仍待确认。可以对作用于谷氨酸能传递的药物产生应答的其它临床状况包括癫痫病、健忘症、焦虑、痛觉过敏和精神病(Meldrum，2000)。

在本发明人的实验室中近来已经发现，识别患者神经系统(NS)抗原的活化T细胞促进神经再生或赋予神经保护作用。参考PCT公开WO 99/60021，其全部内容在此引作参考。更具体地，在部分挤压破碎的视神经大鼠模型中(Moalem et al，1999)以及脊髓损伤大鼠模型中(Hauben et al，2000)显示MBP反应性T细胞具有神经保护作用。直至最近，一直认为免疫系统排斥免疫细胞参与神经系统修复。非常令人惊奇的发现是NS-特异的活化T细胞可用于促进神经再生或保护神经系统组织避免继发性退化，而这可在CNS或PNS损伤或疾病引起的破坏后发生。

如所述WO 99/60021公开描述，NS-特异的活化T细胞对患者NS抗原具有特异性。用来赋予T细胞特异性的抗原可以是患者自身NS抗原、由此衍生的肽、或另一个体甚或另一物种的NS抗原、或由此衍生的肽，只要活化T细胞识别患者NS中的抗原即可。

所述NS-特异的活化T细胞用于促进神经再生或防止或抑制疾病影响。如果待治疗疾病是自身免疫病，其中自身免疫抗原是NS-抗原，则用于治疗由这种疾病引起的神经损伤或退化的T细胞不被活化用于对抗该疾病中相同的自身免疫抗原。

以上引用的PCT公开WO 99/60021中披露，含有给予NS-特异的活化T细胞用于改善损伤或疾病影响的治疗可选择与NS-特异的抗原或其衍生肽组合。如所述WO 99/60021定义，NS-特异的抗原是指这种抗原，它特异性活化T细胞，从而在活化后，活化T细胞积聚于患者NS中损伤或疾病位点。进一步，口服NS-特异的抗原或其衍生肽可以结合主动免疫以建立损伤后立即发生的临界免疫应答。

此在先发明中，用于体内或体外活化T细胞或免疫患者的NS-特异的抗原，可以是由NS组织获得的抗原，优选来自CNS损伤或疾病位点的组织。公开的天然或合成NS-特异抗原或表位包括MBP、MOG、PLP、MAG、S-100、β-淀粉样蛋白、Thy-1、P0、P2和神经递质受体。公开于WO 99/60021中的这种有用的NS-特异的抗原的具体实例是人MBP、人蛋白脂蛋白(PLP)和人少突胶质细胞糖蛋白。另外公开的还有NS-特异自体抗原的衍生肽或NS-特异抗原的衍生物，它们活化T细胞，但不诱导自身免疫病，如含髓鞘碱性蛋白(MBP)51-70位氨基酸的肽。

这种NS-特异的T细胞的作用机理仍有待阐明，但外源给予的T细胞大量积聚于CNS损伤位点提示，存在于损伤位点T细胞在神经保护中起显著作用。然而已显示，尽管积聚是必要条件，但对此目的这并不充分，因为对非自身抗原卵清蛋白特异的T细胞也在该位点积聚，但没有神经保护作用(Hirschberg et al，1998)。

一种高分子量合成碱性无规共聚物由L-Ala、L-Glu、L-Lys和L-Tyr残基组成，其摩尔比约是6份Ala比2份Glu比4.5份Lys比1份Tyr，其分子量为15,000-25,000，它首先描述于美国专利3,849,550中，作为一种药剂用于治疗或预防实验过敏性脑脊髓炎(EAE)、一种类似多发性硬化症(MS)的疾病，易感动物可以诱导发生此病。平均分子量23,000的多批这种共聚物，称为共聚物1或Cop1，显示在几种动物中可以高效预防和抑制EAE(Teitelbaum et al，1971，1974a，1974b)。

后来发现，Cop1可以显著降低恶化-间歇型MS患者中的复发数(Bornstein et al，1990；Sela et al，1990；Johnson et al，1994)。共聚物1为醋酸盐形式的合成多肽，包含L-Glu、L-Ala、L-Tyr和L-Lys，其平均摩尔分数为0.141、0.427、0.095和0.338，它是COPAXONE，即一种治疗多发性硬化症的药剂的活性成分。

显而易见，MS治疗中共聚物1的作用是抑制或灭活多发性硬化症患者对髓鞘抗原的自身免疫性T细胞反应。就此目的，每日皮下注射给予无佐剂的共聚物1。

本来设计Cop1是为了模仿MBP并诱导EAE，但发现它不能导致脑炎，甚至能抑制MBP(Teitelbaum et al，1971)、(PLP)(Teitelbaumet al，1996)、或(MOG)(Ben-Nun et al，1996)诱导的EAE。Cop1预防EAE发生及改善多发性硬化症(MS)的确切机理仍然未知，然而该共聚物的一些重要免疫学特性已经显现。研究证明了Cop1和MBP在T细胞(Webb et al，1973)和抗体(Teitelbaum et al，1988)水平上的部分交叉反应。Cop1可起MBP免疫显性表位的T细胞抗原受体的拮抗剂作用(Aharoni，1998)，它也可结合多种MHC II类分子并防止它们结合到具有特异性抗原识别特性的T细胞上(Fridkis-Hareli et al，1999a)。啮齿动物中，Copl可以诱导这种调节细胞，该细胞可以是致脑炎T细胞的旁观抑制细胞(bystandersuppressors)(Ahroni，1998)。已经发现过继转移这种T细胞可阻止MBP(Aharoni et al，1993)、PLP(Ahroni，1998)、或全脊髓匀浆(Ahroni et al，1997)诱导的EAE发生。

进一步，也已有直接证据报道，Cop1和相关共聚物和II型胶原(CII)肽与类风湿性关节炎(RA)相关的HLA-DR分子间的竞争性相互作用，以及CII特异性T细胞免疫应答的抑制，这提示这些化合物可以有效对抗类风湿性关节炎(Fridkis-Hareli，1998，1999b)。

为获得“口服耐受”而口服自身抗原已被公开用于治疗多种自身免疫病。例如，EP 359 783公开口服MBP治疗多发性硬化症。PCT国际公开WO 91/12816、WO 91/08760和WO 92/06704都公开了用多种自身抗原的口服耐受方法治疗其它自身免疫病。吞入或吸入共聚物1治疗多发性硬化症，以达到抑制对髓鞘抗原的自身免疫性T细胞应答，这已经公开于PCT公开WO 98/30227。

也已对共聚物1相关的化合物进行研究并发现其具有共聚物1相似的特性。例如，由共聚物1中四种氨基酸的三种组成的共聚物结合到纯化的MHC II类分子上组成的共聚物(Fridkis-Hareli et al，1999a，WO 005250)。另外，共聚物1与多发性硬化症和类风湿性关节炎相关的HLA-DR分子的结合基序最近已经阐明(Fridkis-Hareliet al，1999b)。根据这些结合基序，很容易推断并测试序列确定的多肽结合到HLA-DR分子的肽结合沟。预计这些肽以与Cop1自身相似的方式作用。这种合成肽的例子公开于WO 005249。

本部分或本申请的任意其它部分中任何参考文献的引用或确定都不应认为是承认该文献是可用的本发明的先有技术。

发明简述

本发明涉及促进神经再生或防止或抑制神经元退化以改善和治疗神经系统(NS)疾病或损伤影响的方法和组合物。本发明部分基于申请人意外的发现：抗Cop1的活化T细胞促进神经再生或赋予神经保护作用。它进一步部分基于本发明人意外的发现：抗Cop1的活化T细胞保护神经细胞免受谷氨酸毒性作用。如此处所用，“神经保护”指防止或抑制神经系统中损伤或疾病的退化作用，包括避免继发性神经退化作用，而即使当原发性危险因素已经消除或减弱时这种作用仍持续存在。其中既包括保护白质也包括保护灰质。直至最近仍然认为，免疫系统排斥免疫细胞参与神经系统修复。非常令人惊奇地发现，Cop1活化的T细胞可用于促进神经再生或保护神经系统组织免受CNS或PNS损伤或疾病引起的破坏之后的继发性退化作用。

此处所用的“活化T细胞”包括(i)通过暴露于Cop1或Cop1相关肽或多肽而活化的T细胞和(ii)这种活化T细胞的后代。

在一个实施方案中，本发明提供含有治疗有效量的Cop1特异的活化T细胞的药物组合物以及用这种组合物促进神经再生或防止或抑制CNS或PNS中的神经元退化，其量可以有效改善NS损伤或疾病的影响。此处所用的“Cop1特异的活化T细胞”是指对Cop1或Cop1相关肽或多肽具有特异性的活化T细胞。

Cop1特异的活化T细胞用于促进神经再生或防止或抑制继发性退化作用，这种作用可能在原发性NS损伤或由疾病或状况引起的神经退化过程作用后出现，这种疾病或状况描述于下面第(3)部分，但不包括多发性硬化症。非限制性实例包括青光眼、中风、缺血、枪伤以及危险运动引起的脑损伤。Cop1特异的活化T细胞不仅提供抗髓鞘(白质)相关的原发性和继发性危险因素的神经保护作用，而且就所发现的抗谷氨酸毒性保护作用来说，还可以对抗与神经细胞体自身(灰质)相关的原发性和继发性危险因素。因而，预期Cop1特异的活化T细胞可用于本发明目的，并且没有已知的免疫治疗技术能提示这种用途。

进一步，正如Cop1防止谷氨酸毒性，其作用不单单通过与髓鞘的交叉活性。它也必须有调节活性，如通过创建调节细胞或调节物质。就这种调节活性来看，Cop1免疫接种及Cop1特异的活化T细胞预期也可保护白质和灰质免受氧化应激和其它来源的神经细胞损伤引起的损伤。另外，由于这种调节活性，本发明也能用于保护神经细胞不仅免于多发性硬化症，这正如先有技术提示，而且免于多发性硬化症以外的其它自身免疫疾病。

本发明也提供含有治疗有效量的Cop1或Cop1相关肽或多肽的药物组合物以及用这种组合物促进神经再生或防止或抑制CNS或PNS中的神经元退化的方法，其量可以在体内外有效活化T细胞，其中活化T细胞抑制或改善NS损伤或疾病的影响。

本发明实践中，含有给予Cop1特异的活化T细胞以改善和治疗损伤或疾病影响的治疗可以与Cop1或Cop1相关肽或多肽组合。

另外，当给予在佐剂中的Cop1引发后，口服Cop1或Cop1相关肽或多肽抗原可有效进行神经保护。因此，口服Cop1可用于增强T细胞活性，继而用这种Cop1进行初步活化，优选辅以佐剂，以建立损伤后立即出现的临界T细胞应答。

另一实施方案中，可建立细胞库保存Cop1敏化的T细胞以便需要时在较晚时间进行个体的神经保护治疗。在此情况下，可从个体获取自体T细胞。另外可保存异体或半异体T细胞，从而每种最常见的II类MHC的T细胞库都可获得。一旦个体损伤有待治疗，优选使用保存的自体T细胞，但如果不能得到自体T细胞，则应使用与患者具有相同MHC II类分子的细胞，并且预期这些细胞将在此个体中可以工作。细胞优选保存状态是暴露于Cop1或Cop1相关肽或多肽之后的活化状态。然而细胞也可保存于静止状态，一旦解冻则立即活化并制备供使用。库中的细胞系优选冷冻保存。细胞系用本领域公知的任一种方法制备。一旦细胞解冻，优选在注射前进行培养以消除死细胞。培养期间，可以按初始的活化方法用Cop1抗原或肽活化或再活化细胞。另外，可在存在促有丝分裂原如植物凝集素(PHA)或伴刀豆球蛋白A(优选前者)的条件下培养以使之活化，这甚至将使细胞进入更高的活化状态。细胞培养几天对患者将无伤害，因为本发明的治疗可以在损伤后一周或更长时间内的任何时候进行而仍然有效。另外如果时间是关键因素，保存细胞可以在解冻后立即使用。

附图简述

图1A和1B表示从大鼠视网膜切除的标记(存活)的RGCs数目/mm²，这些大鼠分别在轻度(图1A)或严重(图1B)的视神经损伤后立即注射含PBS的不完全弗氏佐剂(IFA)(图中标作PBS)或含Cop1特异的T细胞的IFA(标作Tcop1)。

图2A和2B代表分泌的神经营养因子的ELISA试验。大鼠抗MBP(图2A中白条)或抗Cop1(图2A中黑条)的T细胞与其特异性抗原在刺激培养基中培养48小时。收集T细胞上清并进行夹心ELISA反应。图中表示每个样品中分泌的NT3、BDNF、NGF和NT-4/5浓度。抗Cop1 T细胞分泌的BDNF或NT-3量与抗MBP T细胞分泌量的比例参见图2B。图中表示出神经营养因子(NT)5次独立实验的平均比例±SD。

图3表示Cop1免疫如何保护视神经纤维免受继发性退化。轻度视神经损伤后，立即用含PBS的IFA或含Cop1的IFA皮下免疫大鼠。为评价继发性退化，挤压损伤后两周在视神经损伤位点的远端使用神经示踪染料4-Di-10-Asp。5天后处死大鼠，切除视网膜并做成平展标本。在荧光显微镜下计算位于距每个视网膜中视盘大致相同距离的四个视野中标记(存活)的RGC数目，Cop1免疫的神经保护作用与PBS注射相比有显著差异(P＜0.05，斯氏t检验)。结果是两次试验的汇总，每组含8到10只大鼠。

图4表示Cop1免疫如何保护视神经纤维免受谷氨酸毒性作用。用乳化于完全弗氏佐剂(CFA)中的Cop1免疫小鼠，同时对照小鼠仅注射CFA。然后每只小鼠的一只眼仅注射盐水，另一只眼注射含200nmol谷氨酸的盐水。给予谷氨酸7天后切除视网膜并做成平展标本。计算标记(存活)的视网膜神经节细胞(RGCs)数目。柱状条表示分别接受盐水或含谷氨酸盐水的CFA处理小鼠剩余的RGC占对照的百分比，以及分别接受盐水或含Cop1盐水的CFA-Cop1处理小鼠剩余的RGC占对照的百分比。

图5A和5B表示用pMOG免疫(图5A)或被动转移抗MBP T细胞(图5B)不能保护小鼠RGC免受谷氨酸毒性作用。图5A中，通过玻璃体内注射L-谷氨酸(200nmol)将其RGC直接暴露于谷氨酸毒性之前14天，用pMOG免疫C57BL/6J小鼠。4天后用FluoroGold逆行标记RGC，3天后切除视网膜并计数(见实施例3试验2的材料和方法部分)。RGC存活率表示为每mm²平均值±SEM。在含pMOG的CFA处理组(n＝8)和用含PBS的CFA处理的对照组(n＝7)间，没有观察到注射谷氨酸后RGC存活率的显著差异。图5B中，谷氨酸静脉注射至路易氏大鼠。4天后给予染料4-Di-10-Asp以标记RGC，随之5天后切除视网膜并计数。注意T细胞处理组的视网膜存活率与对照组无显著差异(每mm²RGC数，平均值±SEM(每组n＝6))。

图6A和6B表示玻璃体内注射谷氨酸后淋巴细胞的侵润。谷氨酸注射入C57b1/6小鼠玻璃体内。24小时后切除眼睛并经组织学处理。图中表示出注射谷氨酸小鼠(图6A)和对照小鼠(图6B)的经H&E染色的视网膜切片(10μm厚)。横条＝200μm。

图7表示视神经损伤后视网膜神经节细胞的存活率。用乳化于CFA中的50μg Cop-1免疫后10天，用FluoroGold(见实施例3试验2的方法部分)逆行标记成年Balb/c近交鼠的RGC。对照小鼠注射含PBS的CFA(每组n＝8-12)。RGC标记3天后，对小鼠视神经的眼内部分进行严重挤压损伤。损伤两周后，切除视网膜并计数标记RGC(见实施例3试验2的方法部分)。与非免疫对照相比，用含Cop-1的CFA免疫的小鼠存活率显著提高(P＜0.001，斯氏t检验)。

图8A-8D表示通过Cop-1主动免疫而避免谷氨酸毒性的神经保护作用。图8A中，注射谷氨酸之前10天，通过皮下注射含Cop-1的CFA(5mg/ml细菌)或注射含PBS的CFA免疫小鼠。图中表示一次试验结果(每组中n＝5)。与注射含PBS的CFA的小鼠或仅接受谷氨酸的小鼠相比，Cop-1免疫小鼠的每mm²RGC存活数(平均值±SEM)有显著提高(P＜0.02，双尾t检验)。注射含PBS的CFA对RGC数目的作用检测不出。重复试验3次，都有相同的结果。Cop-1处理组中13只动物和PBS处理组中15只动物都进行了测试。图8B中，玻璃体内注射谷氨酸后，立即用乳化于CFA中的Cop-1(5mg/ml细菌)免疫小鼠。一周后检测每mm²的RGC存活数(平均值±SEM)。图中表示一次试验的结果，Cop-1免疫的作用显著(P＜0.05；双尾t检验；Cop-1组n＝12，对照组n＝8)。该试验用11只小鼠作Cop-1免疫及8只小鼠注射含PBS的CFA(5mg/ml细菌)进行重复。图8C中表示谷氨酸刺激并立即用含Cop-1佐剂(其中含0.5mg/ml细菌)免疫后的RGC存活率。与注射谷氨酸小鼠(n＝5)相比，Cop-1免疫小鼠(n＝15)中每mm²存活的RGC数显著提高(P＜0.04；双尾t检验)。图8D中表示谷氨酸刺激之前、之后立即或之后48小时进行免疫的RGC存活。柱状条表示由重复试验中收集的每处理组中所有检测小鼠获得的总体结果。刺激后48小时进行免疫没有发现其作用。

图9表示Cop-1免疫不能保护小鼠免于NMDA毒性。注射NMDA之前10天，小鼠(n＝5-7)经皮下注射含Cop-1的CFA或含PBS的CFA进行免疫。如图5A所示，标记RGC并在荧光显微镜下计数RGC活细胞数。Cop-1免疫小鼠的RGC存活率表示为正常眼中存活的百分数，它与注射PBS的小鼠相似(P＝0.55，斯氏t检验)，表明没获得神经保护。

图10表示Cop-1反应性T细胞保护RGC免于谷氨酸毒性。注射谷氨酸(200nmol)后，立即向小鼠注射Cop-1反应性T细胞或PBS。施加染料，制备并计数RGC，然后按图5B计算RGC存活。与注射PBS的对照小鼠视网膜相比，注射Cop-1反应性T细胞的小鼠视网膜中见到明显更多的标记RGC(P＜0.0007，斯氏t检验)。

图11A-11D表示缓慢增加IOP和Cop-1免疫对路易氏大鼠视网膜神经节细胞存活的影响。图11A中，激光烧灼引起巩膜外层及边缘静脉阻塞，导致IOP增加以及随后视网膜神经节细胞的死亡。激光处理3周后，与未处理大鼠的15.8±0.2mm Hg(n＝7)相比，静脉阻塞大鼠的平均IOP是30.4±0.42mm Hg(平均值±SEM，n＝5)。图11B中，静脉阻塞3周后，与未处理大鼠相比，激光处理大鼠的视网膜神经节细胞计数要小19.9％±0.51％(平均值±SEM)。图11C中，静脉阻塞后立即用Cop-1免疫减小视网膜神经节细胞损失。激光处理后立即用含Cop-1(200μg)的CFA(n＝15)或注射含PBS的CFA(n＝13)免疫大鼠。3周后，切除视网膜并作整体标本，计算用罗丹明聚葡糖胺预标记的视网膜神经节细胞数。柱状条代表每组大鼠中视网膜神经节细胞损失，计为未处理大鼠中视网膜神经节细胞数(平均值±SEM)的百分数。两组中视网膜神经节细胞数的差别显著(P＜0.0001；双尾t检验)。图11D中，通过静脉阻塞后10天免疫大鼠，检验Cop-1延迟免疫对视网膜神经节细胞损失的影响。柱状条代表Cop-1处理组(n＝5)或PBS处理组(n＝4)中视网膜神经节细胞损失，计为未处理动物中视网膜神经节细胞数(平均值±SEM)的百分数。Cop-1延迟免疫后观察到神经保护作用的趋势；仅在单尾t检验中有显著差异(p＝0.04)。

发明详述

仅为解释方便，本发明详述分为以下部分：(1)Cop1特异的活化T细胞；(2)Cop1和Cop1相关的肽和多肽；(3)治疗用途；(4)制剂和给药；(5)建立T淋巴细胞自体细胞库；(6)实施例；和(7)结果讨论；

(1)Cop1特异的活化T细胞

如第二部分中所定义，Cop1特异的活化T细胞(ATCs)是在存在Cop1或Cop1相关肽或多肽时被活化的T细胞。这种ATC可用于治疗，也即改善或抑制CNS或PNS的损伤或疾病的影响，这些损伤或疾病导致NS退化，或用于促进NS、特别是CNS中的再生。另外，因为谷氨酸在所有神经退行性疾病中，无论是慢性或急性，是一种载体，这种ATCs有可能用于保护CNS细胞免于谷氨酸毒性并用于治疗由谷氨酸毒性引起或加剧的疾病或状况，如异常眼内压。

Cop1特异的活化T细胞优选来自自体，最优选CD4和/或CD8表型，但也可是来自有亲缘关系的供体的异体T细胞，例如兄弟姐妹，父母，孩子，或HLA匹配或部分匹配的、半异体或全异体的供体。

除了用分离自患者的自体T细胞外，本发明也含有使用半异体T细胞用于神经保护。这些T细胞可制备成短期或长期细胞系并按常规冻存方法保存，供解冻及立即或培养1-3天后向经受中枢神经系统损伤并需要T细胞神经保护的患者给药。

使用半异体T细胞基于以下事实，T细胞可以识别由外源抗原呈递细胞(APC)呈递的特异性抗原表位，前提是APC表达I类或II类MHC分子，以及T细胞识别的抗原表位，而特异性应答T细胞群体受限于这些MHC分子。因而，半异体的T细胞群体可识别至少一种该患者MHC分子的等位基因产物，并且特异于Cop1表位，这种细胞将能识别患者NS损伤区域与Cop1交叉反应的抗原并产生需要的神经保护作用。在粘附分子、白细胞迁移分子和T细胞迁移到损伤区域、积聚并活化所需的辅助分子之间有很小或没有多态性。因而，半异体T细胞将可迁移并积聚于需要神经保护的CNS位点并将被活化以产生期望的作用。

已知半异体T细胞将被患者免疫系统排斥，但该排斥需要约两周来产生。因此，半异体T细胞将有两周时间发挥神经保护作用。两周后，半异体T细胞将被患者身体排斥，但该排斥对患者有益，因为这将从患者除去外源T细胞并防止活化T细胞任何不利的后果。因而半异体T细胞提供重要的安全作用并是优选的实施方案。

已知相对少量的HLA II类分子被群体中大多数个体共有。例如，约50％犹太人群体表达HLA-DR5基因。因而，受限于HLA-DR5的对Cop1反应的特异性T细胞库对该群体的50％有用。用限于几种其它优势HLA分子的少量其它T细胞系可基本覆盖整个群体，这种分子如DR1、DR4、DR2等。因此，可制备并保存统一的功能性T细胞系的库，供立即使用于给定群体的任何个体。这种T细胞库将克服在开放的治疗机会窗期间从需要神经保护的患者获得足量特异性T细胞的任何技术问题。半异体T细胞将在完成其神经保护后被安全排斥。本发明的该方面不与此处所述的使用自体T细胞相矛盾，并且是其补充。

Cop1特异的活化T细胞优选不经减毒，尽管可以使用减毒的Cop1特异的活化T细胞。可以用本领域公知的方法减毒，包括但不限于，通过γ辐射，例如1.5-10.0Rad(Ben-Nun et al，1981b；Ben-Nunet al，1982)；和/或通过压力处理，例如美国专利4,996,194所述(Cohen et al)。在一种优选实施方案中，Cop1特异的活化T细胞按如下分离。根据本领域已知的方法分离并纯化T细胞(Mor et al，1995)。对于例证性实例参见第6部分实施例1。

用已知程序分离并扩增识别Cop1的患者循环T细胞。为获得Cop1特异的活化T细胞，分离T细胞然后用已知程序扩增Cop1特异的活化T细胞(Burns et al，1983；Pette et al，1990；Martin et al，1990；Schluesener et al，1985；Suruhan-Dires Keneli et al，1993，它们以其整体形式在此引作参考)。

T细胞体外活化期间，可将T细胞培养于添加至少一种适用的生长促进因子的培养基中以使之活化。适用于此目的的生长促进因子包括但不限于，细胞因子，例如肿瘤坏死因子α(TNF-α)，白细胞介素2(IL-2)，和白细胞介素4(IL-4)。

在一个实施方案中，活化T细胞内源性产生一种改善NS中损伤或疾病影响的物质。

在另一个实施方案中，活化T细胞内源性产生一种刺激其它细胞的物质，包括但不限于，转化生长因子β(TGF-β)，神经生长因子(NGF)，神经营养因子3(NT-3)，神经营养因子4/5(NT-4/5)，脑衍生的神经营养因子(BDNF)；干扰素γ(IFN-γ)和白介素6(IL-6)，其中其它细胞直接或间接地改善损伤或疾病的影响。

体外扩增以后，将T给予哺乳动物治疗对象。在一个优选实施方案中，该T细胞给予人类患者。优选用Cop1或Cop1相关的肽或多肽进行T细胞扩增。

Cop1活化的T细胞可立即使用或保存供以后使用，例如通过以下冻存方法。Cop1特异的活化T细胞也可用之前的冻存T细胞获得，也即细胞解冻后，T细胞与Cop1或Cop1相关的肽或多肽一起孵育，最优与外周血淋巴细胞(PBL)一起孵育，以获得Cop1特异的ATC制备物。

对本领域技术人员显而易见，培养前后T细胞可以保存，例如通过冻存方法。

可用的冻存剂包括但不限于二甲亚砜(DMSO)(Lovelock et al，1959；Ashwood-Smith，1961)，甘油，聚乙烯吡咯烷酮(Rinfret，1960)，聚乙二醇(Sloviter et al，1962)，白蛋白，葡聚糖，蔗糖，乙二醇，i-赤藓糖醇，D-核糖醇，D-甘露醇(Rowe et al，1962)，D-山梨醇，i-肌醇，D-半乳糖，氯化胆碱(Rowe et al，1962)，氨基酸(Phan The Tran et al，1960a)，甲醇，乙酰胺，甘油单乙酸酯(Lovelock，1954)，无机盐(Phan The Tran et al，1960b；PhanThe Tran et al)，和组合羟乙基淀粉和人血清白蛋白的DMSO(Zarouliset al，1980)。

受控冷却速率很关键。不同的冻存剂(Rapatz et al，1968)及不同的细胞类型具有不同的最佳冷却速率。见例如，Rowe et al(1962b)；Rowe(1966)；Lewis et al(1967)；和Mazur(1970)关于冷却速度对细胞存活及其移植能力的影响。水变成冰时的熔解热应最小。可用例如程序冷冻装置或甲醇浴程序进行冷却程序。

程序冷冻装置允许确定最佳冷却程序并实现标准的可重复的冷却。程控速率冷冻仪如Cryomed或Planar允许调节冷冻方案达至期望的冷却速率曲线。

完全冷冻后，细胞可迅速转移到长期冷冻容器中。在一个实施方案中，样品可低温保存于机械冷冻机中，如维持约-80℃或约-20℃温度的冷冻机。在一个优选实施方案中，样品可低温保存于液氮(-196℃)或其蒸汽中。高效液氮冰箱的获得大大方便这种保存方法，它类似一个具有极低真空和内部超级绝缘的大型保温容器，如此热泄漏和氮损失保持在绝对最低的水平。

操作、冻存和T细胞长期保存的注意事项和程序可以发现，例如在以下文献中，在此引作参考：Gorin(1986)和国际原子能机构(1969)。

可以获得或考虑使用其它活细胞冻存方法或其改进方法，例如冷金属镜技术，见Livesey et al(1987)；Linner et al(1986)；也见Senken et al的美国专利4,199,022，Schwartz的美国专利3,753,357和Fahy的美国专利4,559,298。

冷冻细胞优选迅速解冻(例如在维持于37-47℃的水浴)并在融化后立即冷却。为防止细胞在解冻中成团可处理细胞。为防止成团，可用多种方法，包括但不限于在冻存前后添加DNA酶(Spitzer et al，1980)、低分子量葡聚糖和柠檬酸盐、柠檬酸盐、羟乙基淀粉(Stiffet al，1983)、或酸性柠檬酸葡萄糖酯(Zaroulis et al，1980)等。

冻存剂如果对人有毒，应在将解冻T细胞用于治疗前除去。除去冻存剂的一种方法是稀释到可忽略的浓度。

一旦冷冻T细胞解冻并恢复，按此处所述的关于非冷冻T细胞的方法将其用于促进神经元再生。如果在冻存前已经活化，一旦解冻，T细胞可立即使用。然而，优选在注射患者前培养解冻细胞以消除死细胞。进一步，如果冻存细胞是静止细胞，或在冻存前已活化但为帮助细胞达到更高的活化率，在此约1到3天的培养过程中，可加入适当的活化剂以活化细胞。通常，有足够时间允许给药前的这种培养步骤，因为可以在损伤后一周或可能更长的时间内给予T细胞，而仍然保持其神经再生和神经保护作用。

(2)Cop1和Cop1相关的肽和多肽

含Cop1或Cop1相关肽或多肽抗原或其衍生物的药物组合物可用于防止或抑制导致NS，特别是CNS退化的损伤或疾病的影响，用于保护CNS细胞免于谷氨酸毒性，或用于治疗谷氨酸毒性引起或加剧的损伤或疾病。另外，Cop1或Cop1相关肽或多肽抗原或其衍生物可用于T细胞的体内外活化。在一个实施方案中，促进神经再生或防止或抑制CNS或PNS损伤或疾病影响的方法包括将Cop1或Cop1相关肽或多肽抗原或其衍生物给予哺乳动物，其中Cop1或Cop1相关肽或多肽抗原或其衍生物体内活化T细胞，产生的T细胞群体积聚于CNS或PNS损伤或疾病位点。另一实施方案中，在用于保护CNS细胞免于谷氨酸毒性或用于治疗谷氨酸毒性引起或加剧的损伤或疾病的方法中，给予Cop1或Cop1相关肽或多肽抗原或其衍生物。

用于本发明的组合物可以是Cop1或Cop1相关肽或多肽。对本发明目的，“Cop1或Cop1相关肽或多肽”意味着包括任何肽或多肽，包括无规共聚物，它们与髓鞘碱性蛋白(MBP)有功能性交叉反应并能在抗原呈递中与MBP竞争II类MHC。

组合物可含有无规共聚物，其中含合适量的正电荷氨基酸，如赖氨酸或精氨酸，与带负电荷的氨基酸(优选较少量)，如谷氨酸或天冬氨酸组合，可选地与作为填充物的电中性氨基酸如丙氨酸或甘氨酸组合，并可选地与适于赋予共聚物免疫原性的氨基酸，如像酪氨酸或色氨酸之类的芳香氨基酸组合。这种组合物可包括公开于WO 005250中的任何一种，其全部内容在此引作参考。

更具体地，用于本发明的组合物含有至少一种共聚物，它选自含有一种氨基酸的无规共聚物，该氨基酸选自以下各组中至少三组中的每一组：

(a)赖氨酸和精氨酸；

(b)谷氨酸和天冬氨酸；

(c)丙氨酸和甘氨酸；

(d)酪氨酸和色氨酸。

用于本发明的共聚物可由L-或D-氨基酸或其混合物组成。本领域技术人员已知，L-氨基酸存在于大多数天然蛋白中。然而，D-氨基酸有商业供应并可取代用于制造本发明的三元共聚物及其它共聚物的一些或全部氨基酸。本发明包括同时含D-和L-氨基酸的共聚物，以及基本由L-或D-氨基酸组成的共聚物。

在本发明一个实施方案中，共聚物含4种不同的氨基酸，每种来自(a)到(d)组中的不同组。根据本发明该实施方案优选的共聚物含有丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸和酪氨酸的组合，其带有净总正电荷且分子量为约2,000到40,000道尔顿，优选约2,000到13,000道尔顿。最优选的实例是平均分子量约4,700到13,000道尔顿的共聚物1(Cop1)。优选的分子量范围及制造优选形式共聚物1的方法描述于美国专利5,800,808，其全部内容以整体形式在此引作参考。显而易见这只是以实例的方式给出，并且如果与以上一般标准一致，该组合物的成分及各成分的相对比例都可以变化。因而，共聚物可以是约15到约100个氨基酸长度的多肽，优选约40到约80。

在另一个实施方案中，共聚物含3种不同的氨基酸，每种来自(a)到(d)组的三组中的不同组，这些共聚物在此称为三元共聚物。

在一个实施方案中，用于本发明的三元共聚物包含酪氨酸、丙氨酸和赖氨酸，以下称为YAK。这些三元共聚物中氨基酸的平均摩尔分数可以变化。例如，酪氨酸的摩尔分数可以是约0.005到约0.250；丙氨酸的摩尔分数可以是约0.3到约0.6；以及赖氨酸的摩尔分数可以是约0.1到约0.5。平均分子量在约2,000到约40,000道尔顿之间，并优选约3,000到约35,000道尔顿。在更优选的实施方案中，平均分子量为约5,000到约25,000道尔顿。可以用精氨酸取代赖氨酸、甘氨酸取代丙氨酸、和/或色氨酸取代酪氨酸。

在另一个实施方案中，用于本发明的三元共聚物包含酪氨酸、谷氨酸和赖氨酸，以下称为YEK。这些三元共聚物中氨基酸的平均摩尔分数可以变化：谷氨酸的摩尔分数可以是约0.005到约0.300，酪氨酸的摩尔分数可以是约0.005到约0.250，以及赖氨酸的摩尔分数可以是约0.3到约0.7。平均分子量在约2,000到约40,000道尔顿之间，并优选约3,000到约35,000道尔顿。在更优选的实施方案中，平均分子量为约5,000到约25,000道尔顿。可以用天冬氨酸取代谷氨酸、精氨酸取代赖氨酸、和/或色氨酸取代酪氨酸。

在另一实施方案中，用于本发明的三元共聚物包含赖氨酸、谷氨酸和丙氨酸，以下称为KEA。这些三元共聚物中氨基酸的平均摩尔分数也可以变化。例如，谷氨酸的摩尔分数可以是约0.005到约0.300，丙氨酸的摩尔分数可以是约0.005到约0.600，以及赖氨酸的摩尔分数可以是约0.2到约0.7。平均分子量在约2,000到约40,000道尔顿之间，并优选约3,00到约35,000道尔顿。在更优选的实施方案中，平均分子量为约5,000到约25,000道尔顿。可以用天冬氨酸取代谷氨酸、甘氨酸取代丙氨酸、和/或精氨酸取代赖氨酸。

在另一实施方案中，用于本发明的三元共聚物包含酪氨酸、谷氨酸和丙氨酸，以下称为YEA。这些三元共聚物中氨基酸的平均摩尔分数也可以变化。例如，酪氨酸的摩尔分数可以是约0.005到约0.250，谷氨酸的摩尔分数可以是约0.005到约0.300，以及丙氨酸的摩尔分数可以是约0.005到约0.800。平均分子量在约2,000到约40,000道尔顿之间，并优选约3,000到约35,000道尔顿。在更优选的实施方案中，平均分子量为约5,000到约25,000道尔顿。可以用色氨酸取代酪氨酸、天冬氨酸取代谷氨酸、和/或甘氨酸取代丙氨酸。

在更优选的实施方案中，这些三元共聚物中氨基酸的摩尔分数大约是共聚物1优选的摩尔分数。共聚物1中氨基酸的摩尔分数是谷氨酸约0.14，丙氨酸约0.43，酪氨酸约0.10，以及赖氨酸约0.34。共聚物1最优选的平均分子量为约5,000到约9,000道尔顿。如果进行一或多个下面的取代，此处公开用途中共聚物1的活性预期仍保留：天冬氨酸取代谷氨酸、甘氨酸取代丙氨酸、精氨酸取代赖氨酸、和色氨酸取代酪氨酸。

更优选的谷氨酸、丙氨酸和酪氨酸的三元共聚物，或YEA，其单体摩尔比是约0.21比约0.65比约0.14。

更优选的谷氨酸、丙氨酸和赖氨酸的三元共聚物，或KEA，其单体摩尔比是约0.15比约0.48比约0.36。

更优选的谷氨酸、酪氨酸和赖氨酸的三元共聚物，或YEK，其单体摩尔比是约0.26比约0.16比约0.58。

更优选的酪氨酸、丙氨酸和赖氨酸的三元共聚物，或YAK，其单体摩尔比是约0.10比约0.54比约0.35。

可通过本领域技术人员可用的任何方法制造三元共聚物。例如，可在缩合条件下用期望摩尔比的氨基酸溶液制造三元共聚物，或通过固相合成方法制造。缩合条件包括合适的温度、pH和溶剂条件，供一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基缩合形成肽键。缩合剂，例如二环己基碳二亚胺，可用于帮助形成肽键。封闭基团可用于保护官能团，如侧链部分及一些氨基或羧基，避免不期望的副反应。

例如，可使用美国专利3,849,650公开的方法，其中酪氨酸、丙氨酸、γ-苄基谷氨酸和N-ε-三氟乙酰基赖氨酸的N-羧酸酐(carboxyanhydride)在室温下无水二氧六环中用二乙胺作引发剂进行聚合。用含溴化氢的冰乙酸可去封闭谷氨酸的γ-羧基。用1M哌啶除去赖氨酸的三氟乙酰基。本领域技术人员容易理解，通过选择性去除与谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸或赖氨酸中任何一个有关的反应，可对方法进行调整以制造含期望氨基酸，也即，共聚物1中四个氨基酸中的三个，的肽或多肽。对此应用目的，术语“环境温度”和“室温”意指约20到约26℃的温度范围。

多肽合成期间或制造出三元共聚物以后，可调节三元共聚物的分子量。在多肽合成期间调节分子量，要调节合成条件或氨基酸的量，使多肽达到期望的大致长度时停止合成。合成以后，期望分子量的多肽可通过任何可用的大小选择方法，如在分子量选择柱或凝胶上的多肽层析，然后在期望分子量范围收集。本发明的多肽也可部分水解以除去高分子量的部分，例如酸或酶水解，然后纯化以除去酸或酶。

在一个实施方案中，可用以下方法制备期望分子量的三元共聚物，其中包括将保护多肽与氢溴酸反应以形成具有期望分子量分布的三氟乙酰多肽。通过一或多次试验反应确定反应持续时间和反应温度。试验反应期间，改变时间和温度并检测给定批次试验多肽的分子量范围。提供最佳分子量范围的多肽批次所使用的试验条件用于批量生产。因而，可通过以下方法制造具期望分子量分布的三氟乙酰多肽，其中包括按试验反应已确定的反应时间和温度将保护多肽与氢溴酸反应。然后用哌啶水溶液进一步处理具有期望分子量分布的三氟乙酰多肽，以形成具期望分子量的低毒性多肽。

在优选实施方案中，给定批次的保护多肽测试样品在温度约20-28C与氢溴酸持续反应约10-50小时。通过几次试验反应确定最佳条件。例如，在一个实施方案中，保护多肽在温度约26℃与氢溴酸持续反应约17小时。

因为Cop1结合MS-相关HLA-DR分子的结合基序已知(Fridkis-Hareli et al，1999b)，很容易制备确定顺序的多肽并按Fridkis-Hareli et al(1999b)所述的方法测试其与HLA-DR分子肽结合沟的结合。这种肽的实例公开于WO 005249，其全部内容在此引作参考。在所述申请中具体公开的肽中的32个在下表1中列出。预期这种肽及其它类似肽具有类似Cop1的活性。然而，这很容易通过按与本发明一致的方法测试其活化T细胞的能力来确定。所有这些都无需过多的试验。这种肽及其它类似肽也被认为在Cop1相关肽或多肽的范围内，且其用途被认为是本发明的一部分。

表1

序列编号	肽序列
		1234567891011121314151617181920212223242526272829303132	AAAYAAAAAAKAAAAAEKYAAAAAAKAAAAAKEYAAAAAAKAAAAAKKYAAAAAAKAAAAAEAYAAAAAAKAAAAKEAYAAAAAAKAAAAAEEYAAAAAAKAAAAAAEYAAAAAAKAAAAEKAYAAAAAAKAAAAAAKYEAAAAAKAAAAAAKYAEAAAAKAAAAEAAYAAAAAAKAAAAEKKYAAAAAAKAAAAEAKYAAAAAAKAAAAAEKYAAAAAAAAAAAAKEYAAAAAAAAAAAAKKYEAAAAAAAAAAAKKYAEAAAAAAAAAAEAYKAAAAAAAAAAKEAYAAAAAAAAAAAAEEYKAAAAAAAAAAAAEYKAAAAAAAAAAEKAYAAAAAAAAAAAAAKYEAAAAAAAAAAAAKYAEAAAAAAAAAEKKYAAAAAAAAAAAEAKYAAAAAAAAAAAAEYAKAAAAAAAAAAAEKAYAAAAAAAAAAEKYAAAAAAAAAAAAAYKAEAAAAAAAAAAAKYAEAAAAAAAAAA

本发明优选的共聚物是共聚物1，此处也称为Cop1。共聚物1已在几个国家批准用于治疗多发性硬化症(MS)，商品名为COPAXONE，Glatiramer acetate。COPAXONE是Teva Pharmaceuticals Ltd.，Petah Tikva，Israel的商标。几个临床试验表明共聚物1的耐受良好，只有很少副反应且大多是注射位置的轻度反应(Johnson et al，1995)。

(3)治疗用途

第(1)到(2)部分中描述的组合物可用于促进神经再生或防止或抑制继发性退化，否则它可能在原发性NS损伤后发生，例如闭合性头部损伤和钝器伤，比如参加危险运动引起的创伤，穿透性创伤如枪伤，出血性中风，缺血性中风，青光眼，脑缺血，或手术如肿瘤切除引起的损伤。另外，这种组合物可用于改善导致退行性过程的疾病影响，例如灰质或白质(或同时都有)中的退化，这可由多种疾病或紊乱引起，包括但不限于：糖尿病视网膜病，老年性痴呆，阿尔茨海默氏病，帕金森病，面神经(Bell’s)麻痹，青光眼，亨廷顿舞蹈病，肌萎缩性侧索硬化症(ALS)，持续癫痫，非动脉炎性视神经病变，椎间盘脱出，维生素缺乏，朊病毒疾病如克-雅氏病，腕管综合征，与多种疾病相关的周围神经病变，这些疾病包括但不限于尿毒症、卟啉症、低血糖症、干燥综合症、急性感觉神经病变、慢性共济失调性神经病、胆汁性肝硬化、原发性淀粉样变性、阻塞性肺病、肢端肥大症、吸收不良综合征、真性红细胞增多症、IgA和IgGγ球蛋白病、多种药物(例如甲硝唑)和毒素(例如乙醇或有机磷酸)的并发症、夏-马-图三氏病、共济失调毛细血管扩张、Friedreich共济失调、淀粉样多神经病、肾上腺脊髓神经病、巨轴索神经病、植烷酸贮积症、弥漫性体血管角质瘤、脂蛋白血症等。根据本发明谷氨酸保护作用方面的发现，可根据本发明的方法治疗的其它临床状况包括癫痫，健忘症，焦虑，痛觉过敏、精神病、癫痫发作，眼内压异常升高、氧化应激，以及阿片耐受和依赖。另外，本发明谷氨酸保护作用方面，也即，治疗由谷氨酸毒性引起或加剧的损伤或疾病，可包括术后治疗如CNS肿瘤切除及其它形式CNS手术后的治疗。

令人惊奇地发现Cop1免疫可用于防止谷氨酸毒性，根据这一事实，预计与本发明一致的Cop1治疗或Cop1相关的T细胞治疗将在以上列举的疾病治疗中有效，其中不仅是髓鞘受影响的晚期阶段，而且在神经元受引起谷氨酸升高到毒性水平的因素攻击的早期阶段也有效。因而，本发明可用于任何适应症，即由谷氨酸水平升高引起或加剧的慢性或急性神经退化，包括缺血性中风、阿尔茨海默氏病等的早期阶段。

进一步，这种谷氨酸毒性保护作用确证，Cop1的作用不限于其与髓鞘的交叉反应。它也必须具有调节活性，如通过产生调节细胞或调节物质。由于这种调节活性，预计Cop1接种以及Cop1特异的活化T细胞也可保护白质和灰质免受氧化应激及其它来源的神经细胞损伤。另外，因为这种调节活性，本发明也可用于保护神经细胞不仅免于多发性硬化症，这正如现有技术所提示，而且免于多发性硬化症以外的自身免疫病。

在优选实施方案中，活化T细胞或含本发明的Cop1或Cop1相关肽或多肽的免疫复合物用于治疗疾病或紊乱，其中显示必须进行促进神经再生或防止或抑制继发性退化作用的治疗，但不包括多发性硬化症和瘤形成。在优选实施方案中，本发明组合物给予人类患者。

如以上公开，Cop1已被用作药剂，用于多发性硬化症患者中抑制或灭活自身免疫性T细胞对髓鞘抗原的反应性。对此目的，不用佐剂，将Cop1每日皮下注射给药。先有技术中也有公开通过口服途径向多发性硬化症患者给予Cop1，其目的也是诱导抑制自身免疫性T细胞对髓鞘抗原的应答。需要注意在治疗多发性硬化症的先有技术中，Cop1的这些用途与本发明的主题，即Cop1的神经保护用途有根本性不同。首先，如来自本发明人实验室的WO 99/60021所示，神经保护作用是通过活化特异性针对髓鞘抗原的自身免疫性T细胞来介导。因此，最令人惊奇的是，Cop1，作为设计用于抑制T细胞自身免疫的药剂，其作用应该要求活化特异性抗髓鞘T细胞自身免疫。其次，根据本发明Cop1的神经保护用途是基于给予抗Cop1的T细胞，这不同于Cop1用于治疗多发性硬化症的方法。第三，在一个优选实施方案中，本发明包括使用佐剂进行Cop1给药，如不完全弗氏佐剂或完全弗氏佐剂，这是一种Cop1制剂类型，在多发性硬化症治疗或任何其它治疗目的中不曾使用。同时本发明包括口服给予Cop1用于神经保护，这总是在用Cop1，优选使用佐剂，初步活化后进行。因此，在Cop1初步活化后，口服Cop1可用于增强T细胞活性。

因此，组合物及其作用模式和神经保护作用在理论和实践上都是新颖的。以特异性设计的方式使用Cop1活化特异性针对髓鞘抗原的T细胞，以用于神经保护，包括改善自身免疫病引起的退化过程，这对本领域的一个普通技术人员来说不是显而易见的，他们熟悉使用Cop1抑制或灭活T细胞对髓鞘抗原的反应活性。

Cop1活化的T细胞也可用于改善肿瘤引起的退化过程，而不需使用免疫治疗方法。Cop1活化的T细胞将在神经退化位点积聚并有助于抑制这种退化。

(4)制剂和给药

根据本发明使用的药物组合物可按常规方式用一或多种生理可接受的载体或赋形剂配制。载体必须是“可接受的”，意思是与组合物中的其它成分相容并且对接受者无害。

下面列举载体、给药方式、剂量形式等的已知可用的具体实例，本发明可从中可选用载体、给药方式、剂量形式等。然而，本领域的普通技术人员将明白，所选的任何给定的制剂和给药方式应首先测试并确定可获得期望的结果。因而，例如，当活性成分是Cop1或Cop1相关肽或多肽时，特定的制剂和给药方式必须允许活性成分起疫苗作用，以增加由此体内活化的T细胞。如果不能获得这种免疫应答，那么特定的制剂和给药方式不能用于本发明。

与之相似，如果活性成分是活化T细胞，那么应测试特定的制剂和给药方式，确保待给药的活化T细胞以活性状态进入血流，这样根据本发明它们可以集中到CNS中的损伤位点。

术语“载体”指稀释剂、佐剂、赋形剂或运载体，治疗剂与之一起给药。药物组合物中的载体可含有粘合剂，如微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮(polyvidone或povidone)，黄蓍胶，明胶，淀粉，乳糖或一水合乳糖；崩解剂，如褐藻酸，玉米淀粉等；润滑剂或表面活性剂，如硬脂酸镁，或月桂基硫酸钠；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；和/或增香剂，如薄荷，水杨酸甲酯，或橙味香精。

给药方法包括但不限于，胃肠外给药，例如，静脉内，腹膜内，肌内，皮下，粘膜(例如口，鼻内，颊，阴道，直肠，眼内)，鞘内，局部，和皮内途径。可以系统性或局部给药。

对于口服给药，药物组合物可以是液体形式，例如，溶液，糖浆或混悬液，或可以作为药物产品，使用前用水或其它合适的载体补充。这种液体制剂可按常规方法用药物允许的添加剂制备，如助悬剂(例如，山梨醇糖浆，纤维素衍生物或氢化食用油脂)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水载体(例如，杏仁油，油性酯，或分馏植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)。药物组合物的形式可以是，例如用药物允许的赋形剂按常规方法制备的片剂或胶囊，赋形剂如粘合剂(例如，预糊化玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖，微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁，滑石粉或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或淀粉甘醇酸钠)；或润湿剂(例如，月桂基硫酸钠)。可用本领域公知的方法包被片剂。

口服制剂可适当地配制成可以控制释放活性化合物。

对于颊部给药，组合物可采用常规方法配制的片剂或锭剂形式。

组合物可配制供注射用的胃肠外给药，例如，快速浓注或连续输注。注射制剂可以单位剂量形式提供，例如安瓿或多剂量容器包装，并附加防腐剂。组合物可采用这种形式如油性或水性中的混悬液，溶液或乳液，并可包含配制助剂如助悬剂，稳定剂和/或分散剂。替代性地，活性成分可以是粉末形式，可在使用前用合适的载体构造，例如，无菌无热源水。

组合物也可配成直肠组合物如栓剂或保留灌肠剂，例如包含常规的栓基如可可油或其它甘油酯。

对于吸入给药，根据本发明的组合物常规以气溶胶喷雾剂形式递送，从压缩包装或喷雾器中提供，其中使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它合适气体。就压缩气溶胶来说，剂量单位可以由计量阀门确定。用于吸入器或吹入器中的胶囊和药筒，例如由明胶制成，可以配制成包含粉末混合物，其中混有化合物和合适的粉末基质如乳糖或淀粉。

在优选实施方案中，含Cop1活化的T细胞、Cop1或Cop1相关肽或多肽的组合物根据常规方法配制，如适用于人体静脉给药的药物组合物的方法。典型地，静脉给药组合物是无菌等渗水缓冲溶液。必要时，组合物也可包括助溶剂和局部麻醉剂如利诺卡因以在注射位点止痛。一般来说，成分分别单独供应或混在一起供应。当组合物准备以输液方式给药时，可以用含无菌药物级水或盐水的输液瓶来配送。当组合物以注射方式给药时，可提供无菌水或盐水安瓿，这样成分可在给药前混合。

含Cop1或Cop1相关肽或多肽的药物组合物可选地可与佐剂一起给药按常规方式免疫接种。这种佐剂的非限定性实例包括明矾和不完全弗氏佐剂。提高给药肽或多肽免疫原性的其它方式包括与白蛋白或与其它载体以聚集体或复合体形式给药。所有这些对于疫苗领域的普通技术人员都熟知。可代谢脂乳液，如Intralipid或Lipofundin也可用作Cop1治疗的载体，其方式公开于WO 97/02016，其全部内容在此引作参考。虽然已知这些物质引起TH1向TH2的细胞因子转移，然而对于本发明目的，没有理由不相信TH2细胞因子能起作用，并且可能甚至是优选。

当Cop1口服摄入时，可与其它食品形式混合，并以固体、半固体、混悬液或乳液形式使用；另外它可与可药用载体混合，包括水、助悬剂、乳化剂、增香剂等。在一个实施方案中，口服组合物有肠溶性包衣。使用肠溶性包衣在本领域公知。例如，Lehman(1971)给出肠溶性包衣如Eudragit S和Eudragit L。药物赋形剂手册(第二版)The  Handbook of Pharmaceutical Excipients，2^nd Ed.也给出了Eudragit S和Eudragit L的应用。可用于本发明的一种Eudragit是L30D55。

通过吸入或滴鼻，Cop1也可以上述某些形式经鼻给药。进一步，可使用经口吸入递送Cop1到气管和支气管通道的粘膜内层。

本发明也提供药物包装或药盒，其中含有一或多个容器，其中填充有本发明药物组合物的一或多种成分。

在优选实施方案中，在NS损伤或检测到退行性病变后的短时间内，将本发明的药物组合物向哺乳动物给药，优选给人。本发明的治疗方法可以含有给予Cop1活化的T细胞或Cop1或Cop1相关肽或多肽，或其任意组合。当用组合治疗时，可以在给予Cop1活化的T细胞之前、同时或之后给予Cop1。

在一个实施方案中，本发明的组合物与下面的一或多种组合在一起给药(a)单核巨噬细胞，优选培养的单核细胞(见PCT公开WO97/09985所述，它的全部内容在此引作参考)，由此它已经刺激使之增强其促进神经再生的能力；(b)神经营养因子如酸性成纤维细胞生长因子；和(c)抗炎治疗物质(即，抗炎甾体，或非甾体抗炎肽如Thr-Lys-Pro(TKP))。

在另一实施方案中，根据PCT公开WO 97/09985和1998年3月11日提交的美国专利申请序列号09/041,280的单核巨噬细胞注射到CNS中损伤或病变位点，这是在胃肠外途径给予Cop1活化的T细胞、Cop1或Cop1相关肽或多肽之前、同时或之后进行。

在另一实施方案中，给予Cop1活化的T细胞、Cop1或Cop1相关肽或多肽，可以作为单剂量给药或者可重复给药，优选间隔两周及然后相继更长间隔，每月一次、每季度一次、每六个月一次等。根据待治疗疾病或状况，疗程可持续几个月、几年或偶尔也在个体的整个生命期。在CNS损伤情况下，治疗跨度可以是几天到几个月或甚至几年，直至状况稳定且没有或仅有有限危险会发生继发性退化。对于人慢性病或帕金森病，根据本发明治疗可持续一生。

对本领域技术人员很明显，治疗效果有时依赖于待治疗状况或疾病，依赖于个体年龄和健康状况，依赖于个体的其它体质参数(例如，性别、体重等)，以及多种其它因素，例如个体是否在服用其它药物等。

含有本发明Cop1活化T细胞的治疗组合物的最佳剂量与受待治疗位点NS损伤或疾病影响的神经纤维数目成比例。在优选实施方案中，约5×10⁶到约10⁷个细胞的剂量范围用于治疗影响约10⁵个神经纤维的病变，如完全切断大鼠视神经，约10⁷到约10⁸个细胞的剂量范围用于治疗影响约10⁶-10⁷个神经纤维的病变，如完全切断人视神经。本领域技术人员很明显可根据待治疗损伤位点或病变中认为受影响的神经纤维数目，按比例上下调整T细胞剂量。

(5)建立T淋巴细胞自体细胞库

为使神经损伤后的继发性破坏最小，可给予用Cop1或Cop1相关肽或多肽敏化的自体或半异体T淋巴细胞来治疗患者。因为治疗窗仍未精确限定，应在原发性损伤之后尽可能早进行治疗，以使成功机会最大化，优选在约一周内。

为跳过活化所需时间和治疗所需时间的间隔，可用个人的自体T淋巴细胞储备建库，以备用于将来NS损伤时经神经保护性治疗继发性退化。T淋巴细胞分离自血液，然后用Cop1或Cop1相关肽或多肽敏化。然后冷冻细胞并按个人名字、识别号和血型适当保存于细胞库中直至需要。

另外，可处理CNS中的自体干细胞并保存，在NS创伤性疾病情况下如缺血或机械损伤时供个体患者使用，或者用于治疗神经退行性状况如阿尔茨海默氏病或帕金森病。替代性地，可在库中冷冻保存半异体或异体T细胞，用于与T细胞来源具有共同MHC II类分子的任何个体。

以下实施例举例说明本发明的某些特征，但不是对本发明范围的限制。

(6)实施例

实施例1和2的材料和方法

动物.雌性成年同系路易氏大鼠(8-12周龄)由魏兹曼科学研究所动物繁育中心提供。大鼠饲养于光照和温度可调的房间，并且每次试验中年龄匹配。根据IACUC(实验动物管理和使用委员会)制定的规则来使用动物。

抗原.豚鼠脊髓来源的髓鞘碱性蛋白(MBP)和卵清蛋白(OVA)购自Sigma(St.Louis，MO)。本发明使用的Cop1是TevaPharmaceuticals(以色列)的COPAXONE，该产品由市场购得。

抗体.小鼠抗大鼠T细胞受体(TCR)单克隆抗体由Boris Reizis博士友情提供。偶联Cy-3的羊抗小鼠IgG(与大鼠、人、牛和马血清蛋白具有最小交叉反应)购买Jackson ImmunoResearch(West Grove，PA)  。

T细胞系.T细胞系从用上述抗原免疫的路易氏大鼠的引流淋巴结细胞(draining lymph node cells)中产生(Ben-Nun et al，1981a)。抗原溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)(1mg/ml)并用补充4mg/ml结核杆菌(Difco)的等体积不完全弗氏佐剂(IFA)(Difco Laboratories，Detroit，MI)乳化。向大鼠后脚掌注射0.1ml乳液的抗原10天后，处死大鼠并手术摘除及分离其引流淋巴结细胞。清洗细胞，并在刺激培养基中用抗原(10μg/ml)活化，刺激培养基中含Dulbecco’s改良Eagle’s培养基(DMEM)并补充L-谷氨酰胺(2mM)、2-巯基乙醇(5×10^-5M)、丙酮酸钠(1mM)、青霉素(100IU/ml)、链霉素(100μg/ml)、非必需氨基酸(1ml/100ml)和自体血清1％(v/v)。37℃、98％相对湿度和10％CO₂孵育72小时后，将细胞转移到增殖培养基中，它由上述同样浓度的DMEM、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、丙酮酸钠、非必需氨基酸和抗生素组成，并添加10％胎牛血清(FCS)(v/v)和10％T细胞生长因子，它来源自伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激的脾细胞上清(Gillis et al，1978)。细胞在增殖培养基中生长4-10天，然后在刺激培养基中存在辐照(2000rad)胸腺细胞(10⁷细胞/ml)的条件下再次用抗原(10μg/ml)刺激。通过重复刺激和增殖来扩增T细胞系(Ben-Nun et al，1982)。

视神经挤压损伤.按前述方法对视神经进行挤压损伤(Duvdevaniet al，1990)。简单说，通过腹膜内注射Rompun(甲苯噻嗪，10mg/kg；Vitamed，Israel)和Vetalar(氯胺酮，50mg/kg；Fort DodgeLaboratories，Fort Dodge，IA)对大鼠深度麻醉。用双目手术显微镜对右眼行外眦切开术，并切断侧边与角膜的连接。分离出眼球牵缩肌后，通过眶内钝器解剖暴露出视神经。用校准的交叉动作镊子，对视神经在距眼1-2mm处行挤压损伤。制造轻度和严重挤压损伤供短期试验(两周)，因为已经表明该时间段可最优的展现继发性退化及其对治疗的反应(Yoles，1998)。不干扰未损伤的平行对照。

通过逆行标记视网膜神经节细胞检测继发性退化.挤压损伤两周后将荧光亲脂染料，4-(4-二癸基氨基)苯乙烯基)-N-甲基碘化吡啶(4-Di-10-Asp)(Molecular Probes Europe BV，Netherlands)施加到损伤位点的远端，由此检测视神经轴突及其相连的视网膜神经节细胞(RGC)的继发性退化。因为只有完整的轴突可运输染料到其胞体，损伤两周后施加染料到损伤位点的远端，确保只有在原发性和继发性退化中存活的轴突才被计数。这种方法可以区分功能仍然完整的神经元和轴突受损但细胞体仍活着的神经元，因为只有其纤维形态完整的神经元可吸收施加到损伤位点远端的染料并将其运输到细胞体。用这种方法，标记RGC的数目可靠地反映了仍具有功能的神经元数目。按下面的方法进行标记和检测：第二次暴露右侧视神经，但仍不破坏视网膜血液供应。在距损伤远端边界1-2mm处行完全轴索切开术，将4-Di-10-Asp的固体结晶(0.2-0.4mm直径)沉积于新形成的轴索切开术位点。使用染料5天后处死大鼠。从眼中分离视网膜，在4％多聚甲醛溶液中制成平展的完整标本，并用荧光显微镜检查标记RGC。

酶联免疫吸附试验.抗MBP T细胞在增殖培养基中生长一周，然后用PBS清洗并重悬于刺激培养基中。存在辐照的胸腺细胞(10⁷细胞/ml)的条件下，将T细胞(0.5×10⁶细胞/ml)与ConA(1.25μg/ml)、或与MBP抗原(10μg/ml)、或与Cop1抗原(10μg/ml)、或与OVA抗原(10μg/ml)、或不加抗原在37℃、98％相对湿度和10％CO₂条件下一起孵育。另外，将辐照的胸腺细胞(10⁷细胞/ml)单独在刺激培养基中孵育。48小时后离心细胞，收集上清并取样。用夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(Promega，Madison，WI)并与标准NT(用酶标仪在450nm处测定吸光度)比较，从而确定样品中神经营养因子(NT)-3、神经生长因子(NGF)、和NT-4/5的浓度。用灵敏的夹心ELISA检测样品中脑衍生神经营养因子(BDNF)的浓度。简单地说，在96孔平底板上包被鸡抗人BDNF抗体(Promega，Madison，WI)，它溶于0.025M NaHCO₃和0.025M Na₂CO₃中(pH 8.2)。用封闭溶液将重组人BDNF(用作标准；Research Diagnostics，Flanders，NJ)系列稀释，封闭溶液中含3％牛血清白蛋白(BSA)、0.05％聚乙二醇-失水山梨醇月桂酸酯(Tween-20)和溶于PBS中的1％FCS(pH8.2)。将多孔板与小鼠抗人BDNF抗体(Research Diagnostics)一起孵育，然后与溶于封闭液中的偶联过氧化物酶的羊抗鼠IgG一起孵育(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)，从而检测结合的BDNF。用3，3’5，5’-四甲基-联苯胺液体基质系统(Sigma，St.Louis，MO)对多孔板显色。加入1M H₃PO₄终止反应，并在450nm检测光密度。每次试验的结果计算成每毫升样品中分泌的NT量，其中首先扣除与刺激培养基一起孵育的辐照胸腺细胞的背景水平。

免疫组织化学.将神经的径向冷冻切片(10μm厚)放到包被明胶的载玻片上并冷冻至准备荧光染色。切片在乙醇中室温固定10分钟，用双蒸水清洗两次，并在含0.05％Tween-20的PBS中孵育3分钟。然后在室温下将切片与小鼠抗大鼠TCR单克隆抗体(Hunig，1989)一起孵育1小时，抗体稀释于含3％FCS和2％BSA的PBS中。然后用含0.05％Tween-20的PBS清洗切片3次，然后与偶联Cy3的羊抗小鼠IgG(与大鼠、人、牛和马血清蛋白具有最小交叉反应；JacksonImmunoResearch，West Grove，PA)室温下一起孵育1小时。用含0.05％Tween-20的PBS清洗切片，并用含1，4-二氮双环(2，2，2)辛烷的甘油处理以抑制荧光淬灭。切片用Zeiss通用型荧光显微镜观察。

实施例1： 抗Cop1 T细胞的神经保护作用

过继转移Cop1反应性T细胞对损伤视神经有保护作用

在本发明人实验室的前期研究中已经表明，在大鼠急性CNS创伤后，被动转移对CNS自身抗原如MBP特异的致脑炎性T细胞可以避免损伤扩展，并因而阻止继发性退化(见WO 99/60021)。此处举例说明Cop1反应性T细胞的神经保护作用，不同于MBP反应性T细胞，这种T细胞不是致脑炎性的。轻度(图1A)或严重(图1B)视神经损伤后，立即向大鼠注射含PBS的IFA或含Cop1特异的T细胞的IFA。为评价继发性退化，损伤后两周在视神经损伤位点的远端使用神经示踪染料4-Di-10-Asp。5天后处死大鼠，切除视网膜并做成平展标本。在荧光显微镜下计算位于每个视网膜视神经盘大致相同距离的四个视野中标记(存活)的RGC数目，结果示于图1A和图1B。与PBS注射相比，Cop1反应性T细胞的神经保护作用对轻度挤压损伤(P＜0.005，斯氏t检验)和严重挤压(P＜0.05，斯氏t检验)损伤都有显著性。结果是三次试验的汇总，每组含6到10只大鼠。

Cop1反应性T细胞在损伤和非损伤神经元组织中都积聚

本发明人实验室之前已表明，向挤压损伤大鼠被动转移抗MBP的T细胞之后，注射T细胞大量积聚于损伤位点。相对于内源性抗MBP T细胞在PBS处理的损伤大鼠中的积聚，本研究中被动转移Cop1反应性T细胞也引起注射T细胞在损伤位点的显著积聚。Cop1处理的大鼠中T细胞积聚在注射后7天最多。这些发现与不同特异性的注射T细胞系的早期结果吻合。在那些研究中，损伤神经病变位点的T细胞积聚是非选择性的，而未损伤神经中只有对CNS自身抗原特异的T细胞才发现其积聚。因此，损伤神经中Cop1特异性T细胞积聚不提供任何迹象表明其与任何固有的CNS蛋白有交叉识别以及相应的活性。然而，与MBP特异的T细胞相似，Cop1特异的T细胞也在非损伤神经中积聚，而不同于OVA特异的T细胞(结果未示出)。尽管与MBP特异的T细胞相比Cop1反应性T细胞积聚更少，这些发现进一步支持Cop1和MBP有体内交叉活性的观念。

MBP特异的和Cop1特异的注射T细胞系的细胞因子和神经营养因子谱

培养上清来自未刺激T细胞或分别用含以下物质的刺激培养基刺激48小时的T细胞：ConA丝裂源、或MBP抗原、或Cop1抗原，将培养上清用于夹心ELISA。收集含这些细胞分泌产物的培养基并用ELISA定量其细胞因子浓度，结果见表2。活化T细胞分泌的细胞因子量大大超过未刺激T细胞。MBP刺激的T细胞优选表达Th1特异性细胞因子INF，而Cop1刺激的T细胞优选表达Th2特异性的细胞因子IL-10。ConA刺激的T细胞上清中检测到的细胞因子分泌量最大(表2)  。

表2

	静止状态		MBP刺激		CopI刺激		ConA刺激
									Tmbp	Tcop	Tmbp	Tcop	Tmbp	Tcop	Tmbp	Tcop
	IFN-γ(pg/ml)IL-10(pg/ml)	72541	6645382	156921941	92513	7242365	118257244	227583565									225256503

本发明人实验室中最近证明用其特异性抗原活化的T细胞神经营养性表达和分泌上调。在关于T细胞介导的神经保护作用机理的研究中，将本研究的T细胞上清用ELISA检测有神经保护作用的T细胞的神经营养因子谱。Cop1刺激的T细胞同时分泌NGF和NT-4/5，但分泌量小于抗MBP的T细胞。相对于抗MBP的T细胞，Cop1刺激的T细胞生的NT-3可以忽略；而BDNF的产生量很高(图2A)。不同刺激的T细胞分泌的NT-3和BDNF量在四次独立检测中产生相似的结果。每种情况下，Cop1刺激的T细胞产生的BDNF比抗MBP的T细胞多约2.5倍，而NT-3的量仅相当于其10％(图2B)。

实施例2： COP1接种

Cop1接种保护视神经免于继发性退化

本实施例意在表明用含Cop1的IFA接种，两天后再进行一次加强，导致免疫应答，其强度足以用于临界时间窗内的神经保护。麻醉大鼠实施视神经轻度挤压损伤，立即接种含Cop1的IFA，并在两天后加强。两周后逆行标记RGC，接着5天后处死大鼠并切除其视网膜。与注射含PBS的IFA的对照大鼠相比，用含Cop1的IFA接种的大鼠表现出显著神经保护的证据。

实施例3： 避免谷氨酸毒性

试验1：Cop1接种保护视神经纤维免于谷氨酸毒性

因为Cop1免疫具有潜在的对损伤神经的神经保护作用，重要的是发现是否这种保护仅限于由创伤引起的神经损伤，或者具有更一般的神经保护作用，可以避免谷氨酸诱导的毒性引起的有害环境状况。因此进行以下试验。

免疫.每只C57B1/6J OLA小鼠(8-10周龄)注射总量75μg的Cop1，其中Cop1用等体积含5mg/ml分枝杆菌H37 RA(Difco)的完全弗氏佐剂(CFA)乳化。另一组小鼠注射用CFA乳化的磷酸盐缓冲液(PBS)。在将谷氨酸引入视网膜前10天皮内注射乳液，总体积为0.1ml。

谷氨酸毒性.免疫10天后，麻醉小鼠，并将含200nmol谷氨酸的1μl盐水注射入右眼的玻璃体。左眼不注射作为对照。

标记视网膜神经节细胞.评估RGC存活率前3天(72小时)，麻醉每只小鼠并放置于立体定位装置中。暴露颅骨并保持干燥和洁净。确定前囟点并作标记。指定注射点是脑表面2mm深度，前后轴向在前囟点后2.92mm，以及距中线的0.5mm侧向。在左右半球的指定坐标上的头皮中钻一窗口，然后用汉密尔顿注射器施加神经示踪染料FluroGold(4％盐水溶液；Fluorochrome，Dever，CO)(1μl，速度0.5μl/min)。

评估RGC存活率.施加谷氨酸几天后，摘除眼球并分离出视网膜，在4％多聚甲醛溶液中制备成平展的完整标本。6到8个相同大小的视野(0.078mm²)中标记细胞，位于视神经盘约1mm处，在荧光显微镜下计数并作平均，结果示于图4。与对照相比，发现Cop1免疫的小鼠其谷氨酸毒性大约高出4倍。

试验2：接种保护神经元免于谷氨酸毒性和眼压过高

用来自髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MMOG)的肽或用MBP主动或被动免疫，这对轴突损伤后提供有效的神经保护(Moalem et al.，1999a；Moalem et al.，1999b and Fisher et al.，2000)，但在本研究中显示不能保护神经元免于谷氨酸引起的毒性。然而，接种Cop1可以避免谷氨酸毒性。在维持高压并且不受免疫接种影响的条件下，在大鼠青光眼模型中，Cop1免疫进一步显示对眼压过高引起的视网膜神经节细胞死亡具有高效保护作用。

材料和方法

动物.所有动物根据实验动物管理和使用委员会制定的规则来使用。C57BL/6J和Bal b/c系小鼠，8-13周龄，和8-12周龄的成年同系路易氏大鼠由魏兹曼科学研究所动物繁育中心提供，并饲养于光照和温度可调的房间。每次试验前通过腹膜内给予氯胺酮80mg/kg和甲苯噻嗪16mg/kg麻醉动物。

抗原.Cop1购自Teva Pharmaceuticals(Petah Tikva，Israel)。髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)肽(pMOG)1-2 2(GQFRVIGPGHPIRALVGDEAEL)(序列编号：33)在魏兹曼科学研究所化学系M.Fridkin教授实验室合成，其中使用Fmoc方法的自动多肽合成仪(AMS422，Abimed，Langenfeld，Germany)。豚鼠脊髓来源的MBP购自Sigma(Israel)。

免疫.分别用75μg或100μg Cop1免疫小鼠或大鼠，或用300μg pMOG免疫，pMOG首先用含0.5或5mg/ml结核杆菌的等体积完全弗氏佐剂(CFA)乳化。乳液(总体积0.15ml)皮下注射肋腹上一个位点。一周后向pMOG免疫小鼠另一侧肋腹给予同样的免疫作为加强。对照小鼠注射含磷酸盐缓冲液(PBS)的CFA(Difco，Detroit，Michigan，USA)。

视神经挤压损伤.麻醉小鼠或大鼠并在距眼球1-2mm处视神经的眶内部分实施重度挤压损伤。在双目手术显微镜的辅助下，切断连接并暴露出视神经。用校准的交叉动作镊子并采用不干扰血液供应的特别处理，挤压神经2s(小鼠)或30s(大鼠)。

注射谷氨酸和NMDA.用27号针在巩膜上部穿刺麻醉小鼠或大鼠的右眼。并用带30号针头的10-μl汉密尔顿注射器尽可能远地插入玻璃体。向小鼠注射溶解于盐水中的总体积1μl(200nmol)L-谷氨酸或1μl N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA；75nmol；RBI，Boston，MA)。

损伤前向小鼠给予立体定位染料.暴露颅骨并用15％过氧化氢保持干燥和洁净。确定并标记前囟点。在两半球的上丘部位上钻孔(中线后0.292mm，以及侧边距0.05mm)(注意：该数据与前面试验1相比，小了一个数量级，译者认为两者本应相同)。然后用立体定向测量装置和汉密尔顿注射器，在两半球上丘的一点上，脑骨下0.16mm或0.175mm深处(取决于小鼠株系)，向小鼠注射FluroGold(5％盐水溶液；Fluorochrome，Dever，CO；1μl)。

评估小鼠中视网膜神经节细胞存活率.给予小鼠致死量的戊巴比妥(170mg/kg)。摘除眼球，并分离视网膜，在多聚甲醛(4％，溶于PBS)中制成平展的完整标本。在4-6个选定的相同大小的视野(0.078mm²)中计数标记细胞，选定视野位于距视神经盘(0.3mm)大致相同的距离处，以排除作为视神经盘间距函数的RGC密度的变化。在荧光显微镜下(放大800倍)对视野计数，这由不了解小鼠所受处理的观察者操作。计算每个视网膜中每个视野RGC的平均数。

评估大鼠中视网膜神经节细胞存活率.损伤后将荧光亲脂染料，4-(4-二癸基氨基)苯乙烯基)-N-甲基碘化吡啶(4-Di-10-Asp)(Molecular Probes Europe BV，Netherlands)施加到视神经头的远端，由此检测大鼠RGC存活率。按以下方法实施标记和检测：暴露视神经但不破坏视网膜血液供应。在距视神经头1-2mm处行完全轴索切开术，将4-Di-10-Asp的固体结晶(0.2-0.4mm直径)沉积于所形成的轴索切开术位点。使用染料5天后处死大鼠。从眼中分离视网膜，在4％多聚甲醛溶液中制成平展的完整标本，并用荧光显微镜检查标记RGC。在IOP实验动物中，通过逆运输葡聚糖四甲基罗丹明(DTMR)(Molecular Probes，OR)来标记神经节细胞。分子量3000的DTMR结晶施加到距眼球约2-3mm的视神经切头。24小时后制作视网膜完整标本，并在400x放大下的8个区域计数标记神经节细胞，其中每象限2个(距视神经盘边缘0.66到1.103mm)。

小鼠Cop-1-T细胞系产生.小鼠T细胞系从用Cop-1抗原免疫的C57BL/6J小鼠的引流淋巴结细胞中产生(Ben-Nun et al，1981a)。抗原溶解于PBS(1mg/ml)并用补充5mg/ml结核杆菌(Difco)的等体积CFA乳化。后脚掌免疫10天后，处死小鼠并手术摘除及分离引流淋巴结细胞。清洗细胞，并在刺激培养基中用抗原(10μg/ml)活化，刺激培养基中含RPMI并补充L-谷氨酰胺(2mM)、2-巯基乙醇(5×10^-5M)、青霉素(100单位/ml)、链霉素(100μg/ml)和自体血清1％(v/v)。37℃、98％相对湿度和10％CO₂孵育72小时后，将细胞转移到RPMI增殖培养基中，其中补充非必需氨基酸(1ml/100ml)、丙酮酸钠(1mM)、和上述同样浓度的L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、青霉素和链霉素，并添加5％胎牛血清(v/v)和10％T细胞生长因子，它来源自伴刀豆球蛋白A刺激的脾细胞上清。细胞在增殖培养基中生长10-14天，然后在刺激培养基中存在辐照(2500rad)脾细胞(10⁷细胞/ml)的条件下再次用抗原(10μg/ml)刺激。通过重复刺激和增殖来扩增T细胞系(Ben-Nun et al，1982)。该细胞系表型与前已描述的基本相似(Aharoni et al.，1997)。

大鼠Cop-1-T细胞系产生.T细胞系从用上述抗原免疫的路易氏大鼠的引流淋巴结细胞中产生(Ben-Nun et al，1981a)。抗原溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)(1mg/ml)并用补充4mg/ml结核杆菌(Difco)的等体积不完全弗氏佐剂(IFA)(Difco Laboratories，Detroit，MI)乳化。向大鼠后脚掌注射0.1ml乳液的抗原10天后，处死大鼠并手术摘除及分离引流淋巴结细胞。清洗细胞，并在刺激培养基中用抗原(10μg/ml)活化，刺激培养基中含Dulbecco’s改良Eagle’s培养基(DMEM)并补充L-谷氨酰胺(2mM)、2-巯基乙醇(5×10^-5M)、丙酮酸钠(1mM)、青霉素(100IU/ml)、链霉素(100μg/ml)、非必需氨基酸(1ml/100ml)和自体血清1％(v/v)。37℃、98％相对湿度和10％CO₂孵育72小时后，将细胞转移到增殖培养基中，它由上述同样浓度的DMEM、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、丙酮酸钠、非必需氨基酸和抗生素组成，并添加10％胎牛血清(FCS)(v/v)和10％T细胞生长因子，它来源自伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激的脾细胞上清(Gillis et al，1978)。细胞在增殖培养基中生长4-10天，然后在刺激培养基中存在辐照(2000rad)胸腺细胞(10⁷细胞/ml)的条件下再次用抗原(10μg/ml)刺激。通过重复刺激和增殖来扩增T细胞系。

组织学分析.注射谷氨酸或盐水7天后，通过注射致死量的戊巴比妥(170mg/kg)处死小鼠，摘除眼球，4℃下在甲醛(4％，溶于PBS溶液)中固定48小时。石蜡包埋切片(10μm厚)并用苏木精和曙红(H&E)染色。

大鼠眼压过高的产生/提高大鼠眼内压.雄性路易氏大鼠用氯胺酮(15mg/kg)、乙酰丙嗪(1.5mg/kg)和甲苯噻嗪(0.3mg/kg)的混合物麻醉。眼内压(IOP)升高由激光凝固边缘和巩膜外静脉完成。间隔一周大鼠接受两次蓝绿氩气激光(0.2秒1瓦，两次处理在50μm内共产生130-150个点；Coherent，Palo Alto，CA)处理。大鼠肌内注射兽用镇定剂乙酰丙嗪3.0mg/kg并在眼上局部涂覆丙美卡因0.5％以麻醉角膜后，用TONO-PEN(Mentor，Norwell，MA)每周一次测量IOP。

结果

髓鞘相关抗原不能防止谷氨酸毒性。本发明人实验室之前已证明，被动和主动免疫髓鞘相关抗原可降低与小鼠和大鼠中视神经挤压损伤相关的创伤后退化(实施例1和2；Moalem et al.，1999和Fisheret al.，2000)和与成年大鼠脊髓结构性损伤相关的创伤性退化(Hauben et al.，2000a and Hauben et al.，2000b)。为确定非机械损伤后是否发生这种免疫性神经保护作用，首先检查主动免疫接种髓鞘相关抗原或被动转移对这些抗原反应性的T细胞是否提供抗玻璃体内注射谷氨酸诱导毒性的神经保护作用。对大鼠和小鼠视神经实施挤压损伤。用本发明人实验室建立的免疫性神经保护方法，对小鼠主动免疫MOG衍生肽(Fisher et al.，2000)以及向大鼠被动转移抗MBP的T细胞(Moalem et al.，1999)。通过玻璃体内注射谷氨酸实施谷氨酸刺激，所用浓度之前已显示可导致小鼠和大鼠中一周后可测量的RGC死亡(Yoles et al.，2000)。

玻璃体内注射谷氨酸(200nmol)之前用pMOG免疫小鼠。注射谷氨酸后一周评估RGC存活率，没有发现pMOG免疫具有有益作用的证据(图5A)。与之相似，大鼠注射谷氨酸后立即被动转移抗MBP的T细胞也没有检测到有益作用(图5B)。因此，尽管最近显示视神经挤压损伤后接种pMOG(1-22)可诱导小鼠神经保护反应(Fisher et al.，2000)，在本研究中对接种pMOG小鼠实施谷氨酸刺激后没发现这种神经保护作用。

这些发现使本发明人考虑两种可能性：或者谷氨酸毒性后RGC损失与免疫性神经保护无关，这意味着谷氨酸诱导的RGC死亡不涉及免疫系统，或者髓鞘相关的抗源如pMOG和MBP不是防止谷氨酸毒性的真正抗原。本发明人实验室最近的结果(Kipnis et al.，2000)显示，谷氨酸引起的细胞死亡率在缺乏成熟T细胞的大鼠或小鼠中比正常动物更高，这强烈暗示对CNS刺激的有益生理反应与T细胞有关。因此，加强这种内源性谷氨酸诱导的T细胞应答可能对损伤视网膜有益。

Cop-1免疫防止谷氨酸毒性。可能诱导对谷氨酸诱导毒性的有益免疫应答的生理性抗原研究仍然是此阶段的主要目的，然而本发明人试图发现一种抗原，它有可能用于对谷氨酸免疫应答的外源性免疫系统操作。首先检验注射谷氨酸是否引起RGC变得可以接近淋巴细胞。已经发现注射谷氨酸24小时内大量淋巴细胞侵入注射谷氨酸的眼睛(图6A和6B)，这提示免疫操作可以影响局部暴露于谷氨酸的RGC存活。结合这两种现象，本发明人认为谷氨酸毒性活化T细胞介导的保护作用，并鼓励本发明人研究加强这种有益免疫应答的方法。在寻找合适抗原中，合成聚合物共聚物-1(Cop-1)被认为是可能的候选者，它是多发性硬化症患者使用的寡肽药物，最近发现在成年大鼠视神经挤压损伤模型中可以加强神经保护作用(Kipnis et al.，2000a)。

首先，检验小鼠、而不仅是大鼠，视神经挤压损伤后Cop-1免疫是否对RGC存活具有益作用。在此研究中使用Balb/c小鼠。用已发现的对大鼠视神经挤压损伤后有益的方法，接种Cop-1对小鼠视神经损伤也有益(图7)。

其次，观察同样的方法是否能导致防止谷氨酸诱导毒性的神经保护作用。在此研究中使用C57b1/6小鼠，其中谷氨酸刺激后的视网膜神经节损失高于Balb/c小鼠(Kipnis et al.，2000b)。玻璃体内注射谷氨酸10天前，C57b1/6小鼠免疫接种Cop-1，它乳化于含5mg/ml细菌的佐剂中。该株系的选择是根据本发明人实验室最近的发现，由于遗传连锁神经元损失和自身免疫病抗性，这类小鼠中注射谷氨酸引起的RGC损失大于Balb/c小鼠(Kipnis et al.，2000b)。Cop-1免疫导致谷氨酸毒性显著降低(图8A)。在试图在该模型中建立Cop-1免疫治疗窗的研究中，试验中Cop-1用含两种不同浓度细菌(0.5或5mg/ml)的佐剂乳化，重复该试验，并在相对谷氨酸刺激不同的时间免疫小鼠。与注射相应佐剂乳化PBS的小鼠相比，注射谷氨酸当天免疫的小鼠仍表现出明显更高的RGC存活率(图8B和8C)。两种佐剂都产生显著作用。Cop-1的保护效力随免疫接种和谷氨酸刺激之间的时间而消弱：注射谷氨酸后立即或24小时后进行Cop-1免疫时RGC平均百分存活率显著高于注射PBS的视网膜，但注射谷氨酸后48小时给予Cop-1则不显著(图8D)。有趣的是，为在此体内模型中引起不同于典型凋亡特性的RGC死亡，最近由本发明人实验室发现，Cop-1免疫不能保护小鼠免受NMDA引起的毒性(图9)。

过继转移Cop-1反应性T细胞防止谷氨酸毒性。为确定所观察的Cop-1免疫是否导致T细胞介导的抗谷氨酸毒性神经保护，注射谷氨酸(200nmol)后立即将5×10⁶个Cop-1反应性T细胞(250μl腹膜内注射)被动转移入小鼠。一周后，与腹膜内注射PBS的对照小鼠(1238±2，n＝3)相比，注射Cop-1反应性T细胞的小鼠RGC存活率明显更高(1978±86，n＝6)(图10)。

Cop-1免疫防止大鼠眼压过高引起的视网膜神经节细胞死亡。间隔一周对路易氏大鼠作两次激光处理以增加IOP。随后在3周内的指定时间点进行测量，其中显示激光处理后2周，IOP增加到30±0.4mmHg(平均值±SEM)，并在此后保持在大致这个水平(图11A)。初次激光处理后3周检测这些大鼠，与未受激光的对照大鼠相比显著降低(下降19.9％±0.51％，平均值±SEM)(图11B)。为检验Cop-1免疫对视网膜神经节细胞存活率的影响，在第一次激光处理当天用CFA乳化的Cop-1免疫大鼠。对照大鼠注射相同佐剂的PBS。3周后逆行标记视网膜神经节细胞，并在24小时后切除视网膜，做成整体标本，并对标记视网膜神经节细胞进行计数。Cop-1免疫大鼠中视网膜神经节细胞存活数目显著高于注射PBS/CFA的对照(图11C)。两组大鼠的IOP保持与没接受注射的激光处理组大鼠同样高的水平(图11 A)。Cop-1免疫大鼠中具有尽管稍小但相似的作用，这时其IOP仍然很高(图11D)。

(7)结果讨论

对于脊髓损伤，工业社会最常见的但破坏性的创伤之一，仍没有发现治愈方法。40多年来已知，不同于周围神经系统神经元，CNS神经元仅具有有限的损伤后再生能力。最近的二十年间，促进再生的努力已经产生导致部分恢复的方法。最近几年已变得很明显，尽管人脊髓所受的大多数创伤性损伤是局部的，然而其导致的功能损失远远超过初次破坏造成的程度；继发性退化的自我扩展过程看起来起决定作用。

大量研究努力最近已定位于阻止损伤诱导的继发性退化。至今所有努力已有药理学基础。并且其中一些已可以导致脊髓休克的进一步恢复。相对而言本研究描述了一种细胞疗法，它加强一种好像是天然机制的自我修复并导致在一次治疗后可长期持续性恢复。其恢复程度看起来超过已报道的药理学方法。

大多数组织中，损伤诱导的破坏启动细胞免疫应答，从而保护组织并维持其动态平衡。该应答可归因于巨噬细胞和含免疫系统固有部分的其它细胞。淋巴细胞负责适应性免疫，以前认为其不参与组织维持。根据传统观念，适应性免疫用于对抗外来危险。然而，本研究现已表明，即使当没有外来病源时适应性T淋巴细胞免疫应答也可有保护作用。在组织维持的情况下，T细胞特异性针对组织自身抗原。

以上实施例的结果证明挤压损伤的CNS神经及暴露于谷氨酸毒性的视神经中Cop1反应性T细胞的神经保护作用。在局部视神经损伤大鼠模型中，在CNS损伤当天过继给予Cop1反应性T细胞或用Cop1接种对神经纤维继发性退化有显著预防作用。这是第一次表明，接种是防止视神经创伤性损伤后继续扩散的可能方法。

大鼠视神经挤压损伤后，注射Cop1反应性T细胞导致显著防止继发性退化的破坏性作用。正如预期，T细胞积聚于损伤位点，但它们也在非损伤神经中积聚。只有T细胞受体被呈递的抗原识别时，T细胞才有可能积聚于非损伤CNS。无论其特异性，活化T细胞可穿过血脑屏障(BBB)，但只有对CNS抗原有反应的活化T细胞可积聚于非损伤神经(Hickey，1991)。因此本发现第一次证明Cop1反应性T细胞与CNS髓鞘成分间的体内交叉识别。损伤位点的这种识别可能起触发T细胞活化的作用，导致T细胞转变成保护性表型，这可能是通过活化T细胞分泌合适的神经营养因子或其它仍未发现的因子。本研究证明被其特异性抗原活化的Cop1反应性T细胞分泌显著量的BDNF，即一种在神经元存活中起主要作用的神经营养因子(Yan et al，1992；Sendtner et al，1992)。

Cop-1原本设计用于模拟髓鞘碱性蛋白(MBP)的活性并诱导啮齿动物炎症性脱髓鞘疾病EAE。然而发现它没有致脑炎作用并且甚至抑制MBP(Teitelbaum et al.，1971)、蛋白脂蛋白(PLP)(Teitelbaumet al.，1996)、或MOG(Ben-Nun et al.，1996)诱导的EAE。Cop-1阻止啮齿动物中EAE发展并改善人类的多发性硬化症。研究已证明Cop-1和MBP抗体间或针对这些抗原的T细胞间的部分交叉反应(Webbet al.，1973 and Teitelbaum et al.，1988)。Cop-1可作为针对免疫优势MBP表位的T细胞抗原受体的拮抗剂(Aharoni et al.，1998)。它也可结合多种主要组织相容性复合物(MHC)II类分子并阻止它们结合到具有特异性抗原识别特性的T细胞(Fridkis-Hareliet al.，1998)。啮齿动物中Cop-1诱导抑制致脑炎T细胞的调节细胞表达。已发现在啮齿动物中过继转移这种T细胞可阻止MBP(Aharoniet al.，1993)、PLP(Teitelbaum et al.，1996)、或全脊髓匀浆(Aharoni et al.，1997)诱导的EAE发展。

因此，不同于MBP和其它髓鞘相关蛋白免疫，Cop1免疫不诱导EAE，并且缺乏佐剂的Cop1诱导的T细胞具有调节特性。损伤后立即免疫接种含Cop1的IFA，两天后再加强一次，产生强烈的神经保护作用。这种免疫可能在大约一周内达到其细胞应答的顶峰，但可以合理假设即使在这之前CNS中的T细胞数目将明显大到足以发挥至少一些神经保护活性。已知在MBP免疫后，EAE症状在10天后出现，表明到那时免疫应答强到足以使致脑炎T细胞积聚于损伤位点，造成破坏，并产生EAE症状。本研究提示，用含Cop1的IFA免疫，并在两天后加强后，视神经的免疫应答足以阻止继发性退化。相对于被动转移T细胞所获得的应答，这种应答可能有一定程度的延迟，但它仍在逃过原发性损伤的神经纤维保护所需的时间窗内。先前对大鼠视神经的研究已经表明，在轻度挤压损伤后一周，由继发性退化导致的神经元损失大约是25％，损伤后两周大约是55％(Yoles，1998)。因而，即使应答需要一周达到所需强度，那时仍有神经纤维需要保护。比较过继转移活化的Cop1反应性T细胞和Cop1主动免疫所得的结果，提示在达到最大有效需要的时间内两种治疗间没有显著性差异，因为二者阻止继发性退化的程度几乎相同。应该强调，Cop1在此处表现出与其已知作用相反的作用；已知Cop1是一种设计用于抑制T细胞自身免疫的药物，然而此处它具有的作用要求活化特异性抗髓鞘T细胞自身免疫。

总之，早期研究已经表明大鼠CNS轴突损伤诱导对抗髓鞘蛋白的自身免疫性T细胞应答，但这太弱不能阻止神经纤维的继发性退化。本研究中通过使用被CNS交叉识别但无致脑炎性的共聚物，达到加强这种免疫应答而不伴随自身免疫病的危险。对该共聚物的T细胞免疫应答通过损伤时的被动转移或免疫接种获得，它提供创伤后维持的有效方法。此处证明的T细胞介导的神经保护作用可用于慢性和急性CNS神经损伤，其中神经元易于退化并需要神经保护。它也可用于防止谷氨酸毒性引起的原发性和继发性退化。T细胞依赖的免疫性神经保护通过被动或主动Cop-1免疫获得，此处结果也表明它可有效治疗小鼠和大鼠中慢性高IOP模型中的谷氨酸诱导的毒性。

作为本研究结果，实施例3表明被动和主动Cop-1免疫都提供对谷氨酸毒性的有效神经保护，可将接种开发为一种降低谷氨酸相关神经元毒性的方法。这些观察有许多有趣的提示：(i)作为一种自身免疫病多发性硬化症患者的免疫抑制药，Cop-1可有效作为对抗谷氨酸诱导的神经毒性的接种；(ii)局部应激信号引起的CNS神经元损失可从系统性免疫操作中受益；(iii)同样的神经元，在此情况下是RGC，无论破坏的性质和位点，都可从系统性免疫应答中受益，尽管该应答的抗原特异性可以变化；(iv)尽管明显不依赖于破坏类型(机械或生化)，Cop-1的有益活性显示关键依赖于破坏活化的死亡机理。实施例3中，诱导的免疫活性保护细胞对抗谷氨酸引起的死亡，但不对抗NMDA引起的死亡；(v)作为一种免疫原，Cop-1可诱导神经保护，其机制不必需要髓鞘蛋白的交叉识别。

应该强调在抗继发性退化的免疫神经保护和自身免疫病的免疫治疗之间有重要区别。前者要求有益T细胞的主动参与，而后者可受益于致脑炎性T细胞的免疫调节或其抑制。作为一种免疫原，Cop-1在两种目的中都起作用：神经元破坏的神经保护作用和自身免疫病治疗。可假定其通过诱导“安全”的T细胞应答来完成，一方面它提供神经保护需要的有益的自身免疫性T细胞应答(Moalem et al.，1999a；Moalem et al.，1999b；Kipnis et al.，2000a；Moalem et al.，2000c；and Schwartz et al.，1999)，另一方面该免疫调节需要避免自身免疫病(Neuhaus et al.，2000)。

本发明人实验室中表明，在部分挤压视神经的大鼠模型中(Moalemet al.，1999；and Schwartz et al.，1999)和脊髓挫伤中(Haubenet al.，2000a)MBP反应性T细胞具有神经保护作用。本发明人实验室以前的发现证明在Cop-1反应性T细胞和CNS髓鞘成分间有体内交叉识别(Kipnis et al.，2000a)。本发明人建议，通过引发T细胞重新活化并因此引起T细胞转变成保护表型，这种识别可能代表一种可能机制，解释轴突损伤后的T细胞神经保护。本发明人进一步表明，像MBP反应性T细胞一样(Moalem et al.，2000)，当Cop-1反应性T细胞(实施例1和2；Kipnis et al.，2000a)被其特异性抗原活化时分泌显著量的脑衍生的神经营养因子，即一种在神经元存活中起主要作用的神经营养因子(Sendtner et al.，1992 and Yan et al.，1992)。实施例1中，本发明人实验室检验了白质物理创伤后T细胞对Cop-1的免疫，其中抗Cop-1 T细胞可与暴露的髓鞘蛋白表位交叉反应。实施例3中本发明发现，Cop-1免疫可以对抗谷氨酸毒性，在没有髓鞘抗原可能参与的条件下这直接影响神经元细胞体，这暗示由于其异源性，抗Cop-1 T细胞可应答多种抗原，其中包括与视网膜相关的抗原。Cop-1反应性T细胞可直接与谷氨酸自身相互作用。这种相互作用可将Cop-1反应性T细胞、或内源性T细胞转变为保护性表型。

Cop-1反应性T细胞可能与玻璃体内注射的谷氨酸或视网膜内的小胶质细胞活化的细胞相互作用，谷氨酸注射后24小时在玻璃体内观察到大量侵入的淋巴细胞支持这种可能性。注射Cop-1的小鼠中，侵入的淋巴细胞可能包括一些对Cop-1特异的细胞。结合Cop-1反应性T细胞被动转移与Cop-1主动免疫有相似作用的发现，本观察结果提示接种作用实际上由T细胞介导，而不是体液免疫或Cop-1本身。作为继发性退化的载体，因为谷氨酸在原发性攻击一段距离处及时出现(Yoles et al.，1998)，在直接谷氨酸毒性中24小时治疗窗可能意味着在CNS创伤情况下Cop-1治疗窗大大加宽。有趣的是要注意当由NMDA诱导毒性攻击时，Cop-1没有保护作用。这与本发明人实验室的研究相一致，其中显示NMDA导致几乎立即的死亡信号，而没有凋亡的明显迹象。并且除了NMDA受体拮抗剂外也没有明显的治疗机会。因此Cop-1免疫对NMDA诱导毒性无效不让人惊奇。Cop-1活化作为神经保护剂而非抑制剂是否依赖于其给药途径仍有待确认。对CNS抗原特异的T细胞、或对交叉反应性抗原如Cop-1特异的T细胞局部积聚如何介导CNS攻击后的神经保护也还未知。

实施例3中的研究中证明的T细胞介导的神经保护作用有可能用于这种CNS神经的急性和慢性损伤，其中神经元容易退化并且可进行神经保护(Schwartz et al.，2000a；Schwartz et al.，2000b；Dobleet al.，1999；和Grunblatt et al.，2000)。慢性疾病青光眼经常伴随IOP，并且是失明的主要原因。然而经常看到即使IOP保持在正常范围内疾病仍可继续发展，这提示机械压缩可能不是视神经破坏的唯一原因，因此除降低眼内压外，治疗也应包括神经保护性治疗(综述见Osborne et al.，1999；Schwartz et al.，2000c；和Weinrebet al.，1999)。例如最近研究表明，大鼠眼内压升高模型中，谷氨酸拮抗剂(Chaudhary et al.，1998)或一氧化氮合酶抑制剂(Neufeldet al.，1999)处理减弱视网膜神经节细胞死亡。然而，尽管在病变位点可能有益，但这些药剂对生理反应的干扰可能对正常组织有害，导致不期望的副作用。因此从临床观点来看，更好的方法是利用并增强组织自身的防御机制。

从临床观点来看，即使当压力仍保持很高时也能获得神经保护的本发现潜在有很大优点。这是因为即使压力降到正常水平，对于青光眼患者来说也不一定安全，其中残存的神经元比正常神经元更敏感(Agis，2000)。进一步，将IOP降到这些患者可能认为安全的水平，即12mmHg，不一定可行。

此处已完全描述本发明，本领域技术人员将认识到，在不偏离本发明精神和范围以及无不当实验的情况下，在宽范围的等价参数、浓度和条件内可同样进行。

与此处具体实施方案相联系本发明已经描述，同时应该明白它可以进一步修改。本申请意味着覆盖本发明的任何变化、用途或改编，一般地，在遵循本发明原理的情况下并包括那些偏离于本公开的，如本发明所属领域内的、已知或常规实践所包括的，以及附属权利要求范围内、前已阐明的基本特征所适用的内容，这些都在本申请范围内。

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序列表

<110>M.埃斯森巴奇-施瓦尔茨

E.约勒斯

J.基普尼斯

<120>共聚物1和相关肽和多肽及其处理过的T细胞在神经保护性治疗中的用途

<130>EIS-SCHWARTZl8 PCT

<150>06/209,799

<151>2000-06-07

<150>09/620,216

<151>2000-07-20

<160>33

<170>人工序列：合成构建体

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<212>PRT

<213>人工序列：合成构建体

<400>32

Ala Lys Tyr Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala

1               5                   10                  15

<210>33

<211>22

<212>PRT

<213>人

<400>33

Gly Gln Phe Arg Val Ile Gly Pro Gly His Pro Ile Arg Ala Leu Val

1               5                   10                  15

Gly Asp Glu Ala Glu Leu

            20

Claims (16)

1.Cop1在制备用于预防或抑制中枢神经系统或周围神经系统中由损伤导致的神经元退化，或促进中枢神经系统或周围神经系统中损伤后的神经再生的药物组合物中的用途。

2.Cop1在制备用于预防或抑制中枢神经系统或周围神经系统中由损伤导致的继发神经元退化的药物组合物中的用途。

3.Cop1在制备用于促进中枢神经系统或周围神经系统中损伤后的神经再生的药物组合物中的用途。

4.Cop1在制备用于治疗选自下组的损伤的药物组合物中的用途：脊髓损伤、闭合性头部损伤、钝器伤、穿透性创伤、出血性中风、缺血性中风、脑缺血或手术导致的损伤。

5.Cop1在制备用于治疗脊髓损伤中的神经元变性的药物组合物中的用途。

6.Cop1活化的T细胞在制备用于预防或抑制中枢神经系统或周围神经系统中由损伤导致的神经元退化，或促进中枢神经系统或周围神经系统中损伤后的神经再生的药物组合物中的用途。

7.Cop1活化的T细胞在制备用于预防或抑制中枢神经系统或周围神经系统中由损伤导致的继发神经元退化，或促进中枢神经系统或周围神经系统中损伤后的神经再生的药物组合物中的用途。

8.Cop1活化的T细胞的在制备用于促进中枢神经系统或周围神经系统中损伤后的神经再生的药物组合物中的用途。

9.根据权利要求6-8的任一项的用途，其中所述活化的T细胞是自体T细胞。

10.根据权利要求6-8的任一项的用途，其中所述活化的T细胞是来自有亲缘关系的供体、或HLA匹配或部分匹配的、半异体或全异体供体的异体T细胞。

11.根据权利要求9的用途，其中所述活化的T细胞是用于治疗选自下组的损伤：脊髓损伤、闭合性头部损伤、钝器伤、穿透性创伤、出血性中风、缺血性中风、脑缺血或手术导致的损伤。

12.根据权利要求10的用途，其中所述活化的T细胞是用于治疗选自下组的损伤：脊髓损伤、闭合性头部损伤、钝器伤、穿透性创伤、出血性中风、缺血性中风、脑缺血或手术导致的损伤。

13.Cop1活化的T细胞在制备用于治疗脊髓损伤中的神经元变性的药物组合物中的用途。

14.用于预防或抑制中枢神经系统或周围神经系统中由损伤导致的神经元退化，或促进中枢神经系统或周围神经系统中损伤后的神经再生的药物组合物，其中含有Cop1活化的T细胞和可药用载体。

15.根据权利要求14的药物组合物，其中所述活化的T细胞是自体T细胞。

16.根据权利要求14的药物组合物，其中所述活化的T细胞是来自有亲缘关系的供体、或HLA匹配或部分匹配的、半异体或全异体供体的异体T细胞。

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