CN110709091A

CN110709091A - 使用长效格拉替雷和脂肪源性干细胞治疗多发性硬化症

Info

Publication number: CN110709091A
Application number: CN201780091620.2A
Authority: CN
Inventors: 埃胡德·马罗姆; 纳达夫·布莱希·基梅尔曼; 弗里达·格里恩斯潘
Original assignee: Stem Cell Medicine Ltd; Mapi Pharma Ltd
Current assignee: Stem Cell Medicine Ltd; Mapi Pharma Ltd
Priority date: 2017-05-15
Filing date: 2017-05-15
Publication date: 2020-01-17
Also published as: JP7000458B2; US11413311B2; CA3062964A1; AU2017414803A1; EP3624815A1; WO2018211486A1; EP3624815A4; IL270355A; IL270355B2; JP2020519658A; IL270355B1; US20200147141A1

Abstract

提供一种治疗多发性硬化症的方法，包括在肠胃外以缓释库形式给予醋酸格拉替雷，并将脂肪源性干细胞给予中枢神经系统。根据一些方面，联合疗法提供协同效应。特别地，联合疗法对进展型多发性硬化症提供益处。

Description

使用长效格拉替雷和脂肪源性干细胞治疗多发性硬化症

技术领域

本发明涉及多发性硬化症(multiple sclerosis)的治疗方案，包括给予长效剂型(long acting dosage forms)的药学上可接受的格拉替雷(glatiramer)盐和给予脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cell)。特别地，本发明涉及一种联合疗法，包括肌肉内给予或皮下给予延长释放形式的醋酸格拉替雷以及脑室内给予(intra-ventricular)或鞘内给予(intrathecal administration)脂肪源性干细胞。

背景技术

多发性硬化症(Multiple sclerosis)(MS)是中枢神经系统(CNS)的一种慢性炎症疾病，通常发生于年轻人，女性比男性更普遍。MS影响了大脑和脊髓中的神经细胞相互沟通并控制身体功能的能力。临床失能与髓磷脂(myelin)炎症有关，髓磷脂是CNS轴突周围的保护鞘，由于自身免疫攻击和神经退行性过程而受损。结果，大脑和脊髓的白质(whitematter)会因局灶性病变(斑块)瘢痕化(scarred)，导致神经功能障碍。存在多种MS的症状。大部分患者在初始阶段会经历复发缓解型(relapsing-remitting)(RRMS)过程，其特征在于不可预测的复发，随后是部分或完全恢复(缓解)的时期，在某些时候变为进展型(progressive)(PMS)。这种进展型MS被分类为继发进展型MS(secondary progressive MS)(SPMS)。一些患者从症状发作就经历进展型过程，这种疾病模式被分类为原发进展型MS(primary progressive MS)(PPMS)。

患有复发缓解型MS的患者通常在急性发作(acute attacks)期(复发)使用皮质类固醇(corticosteroids)治疗，并使用免疫调节或免疫抑制药物以阻止新的复发和失能进展。在更严重情况下，这些药物包括干扰素β

醋酸格拉替雷

富马酸二甲酯

芬戈莫德(fingolimod)

那他珠单抗(natalizumab)

和化疗剂米托蒽醌(mitoxantrone)。有时使用类似药物治疗进展型MS，但治疗主要集中在管理症状和康复上。最近的综述强调进展型MS是一个目前缺乏有效的疾病修饰疗法(available disease-modifyingtreatments)的领域(Doshi和Chataway,2016,Clinical Medicine,16(6):s53–s59)。Ocrelizumab(奥美珠单抗)(OCREVUS^TM)是人源化抗CD20单克隆抗体，该药于2016年被食品和药品管理局(Food and Drug Administration)(FDA)授予PPMS的突破性治疗设计(Breakthrough Therapy Designation for PPMS)(2016年2月17日，Basel，Roche更新投资者)。

所有MS治疗选项仅是部分有效的。

醋酸格拉替雷(Glatiramer Acetate)：

共聚物-1(也被称为醋酸格拉替雷(GA)并以商品名

销售)，是一种无规聚合物(平均分子质量6.4kD)，由四个氨基酸，L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-酪氨酸和L-赖氨酸组成，在髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein)中被发现。氨基酸的平均摩尔分数分别是0.141、0.427、0.095和0.338，且共聚物-1的平均分子量是在4,700和11,000道尔顿之间。在化学上，醋酸格拉替雷被指定为与L-丙氨酸、L-赖氨酸和L-酪氨酸，乙酸盐(盐)的L-谷氨酸聚合物。其结构式为：(Glu，Ala，Lys，Tyr)xCH₃COOH或(C₅H₉NO₄_C₃H₇NO₂_C₆H₁₄N₂O₂_C₉H₁₁NO₃)xC₂H₄O₂[CAS-147245-92-9]，近似比率Glu₁₄Ala₄₃Tyr₁₀Lyz₃₄x(CH₃COOH)₂₀。

是一种透明、无色至浅黄色、无菌、无热源的溶液，用于皮下注射。每毫升包含20mg醋酸格拉替雷和40mg甘露醇。溶液的pH范围约为5.5至7.0。

用于患有复发型多发性硬化症患者的治疗。

醋酸格拉替雷的作用机制尚不明确，尽管该共聚物已出现一些重要的免疫学性质。醋酸格拉替雷的给予可将T细胞群从促炎性Th1细胞转移至抑制炎症反应的调节性Th2细胞(FDA

标签)。鉴于其类似于髓磷脂碱性蛋白，醋酸格拉替雷也可作为诱饵(decoy)，转移对髓磷脂的自身免疫反应。然而，血脑屏障的完整性并未显著受醋酸格拉替雷影响，至少在治疗的早期阶段未受影响。

醋酸格拉替雷的库系统(Depot systems)：

US 8,377,885公开了一种包含在治疗上有效量的格拉替雷的长效肠胃外药物组合物，并且特别地，一种以库形式包含在治疗上有效量的醋酸格拉替雷，适合于在治疗多发性硬化症时皮下或肌肉植入或注射的组合物。

US 8,796,226公开了包含醋酸格拉替雷和至少一种其它药物的库组合物。

用于自身免疫性和/或神经退行性疾病的治疗的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells)(MSCs)：

MSCs是一个多能自我更新细胞(multipotent self-renewing cells)的来源，最初在成年人骨髓中发现。自然地，它们分化产生骨细胞(osteoblasts)、软骨细胞(chondrocytes)和脂肪细胞(adipocytes)。MSCs为替代胚胎干(ES)细胞的多能干细胞提供了一个可用来源。MSCs潜在地规避了细胞治疗中免疫抑制的需要，因为其可从自体来源(autologous source)获得，还因为其特征在于有利于异体使用的免疫特权性质(immuno-privileged nature)。

以MSCs为基础的治疗已表明在临床前研究中对许多适应症(包括移植物抗宿主病(graft versus host disease)、中风、心肌梗塞(myocardial infarction)、肺纤维化和自身免疫性疾病)是有效的。还对MSCs作为对神经退行性疾病，比如阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、亨廷顿病(HD)和多发性硬化症(MS)的治疗工具进行广泛研究。在神经退行性疾病的背景下，本文从两个方面对MSCs进行了讨论：其在特定条件下转化为神经细胞的能力以及其神经保护和免疫调节作用。当移植到大脑中时，MSCs会产生神经营养因子和生长因子，从而保护和诱导受损组织再生。此外，MSCs还被探索为用作基因传递载体，例如，被基因改造(genetically engineered)以在大脑中过度表达胶质源性或脑源性神经营养因子。目前正在进行MS、ALS、脑外伤(traumatic brain injuries)、脊髓损伤和中风的涉及MSCs的临床试验。

脂肪源性干细胞(ADSCs)：

过去几十年的研究表明，除了作为能量库的主要功能外，脂肪组织还是多能基质细胞的丰富资源(Zuk等人，Mol Biol Cell 2002；13:4279-4295)。

WO 2010/045645公开了从脂肪组织中回收脂肪干细胞的方法。

US 8,021,882公开了一种通过提供脂肪干细胞培养物并收集其上清液来生产用于治疗神经损伤的干细胞条件培养基的方法。

Constantin等人的(2009)Stem Cells.，27(10):2624-35研究了在慢性实验性自身免疫性脑脊髓炎(encephalomyelitis)(EAE)中向小鼠静脉给予脂肪源性间充质干细胞。

Stepien等人的(2016)Mediators of Inflammation，vol.2016报告了通过鞘内注射自体脂肪干细胞来治疗的患有RRMS或SPMS的MS的患者的一年随访(one-year follow-up)。

WO 2006/057003特别公开了使用与格拉替雷联合的骨髓源性干细胞的干细胞治疗的方法。

Aharoni等人的(2009)J Neuroimmunol.，215(1-2):73-83报告了通过脑室内移植或腹腔内移植的肌肉祖细胞(MPCs)与醋酸格拉替雷联合治疗EAE诱导的小鼠。

本领域需要改进的治疗多发性硬化症的方法，特别是对于患有进展型疾病的患者。

发明内容

根据一些方面，本发明提供了使用包含在治疗上有效量的在药学上可接受的格拉替雷盐(例如，醋酸格拉替雷)的长效药物组合物与脂肪源性干细胞(ADSCs)对于多发性硬化症(MS)的联合疗法。在具体的实施方式中，本发明提供治疗多发性硬化症的方法，包含以缓释库形式在肠胃外给予醋酸格拉替雷，以及将脂肪源性干细胞给予至中枢神经系统。

本发明部分基于由库形式的醋酸格拉替雷和脂肪源性干细胞的联合在多发性硬化症动物模型中对临床评分的协同效应。研究发现，这种联合在降低疾病评分和延缓发病方面特别有效，而且还能显著减缓疾病的进展。出乎意料的是，发现与高剂量相比，低剂量的醋酸格拉替雷库制剂与细胞联合时更有效。因此，根据一些实施方式，与单独给予醋酸格拉替雷时所需的剂量相比，本文提供的方法和组合物允许减少给予患者的醋酸格拉替雷剂量。

根据一个方面，本发明提供了一种治疗多发性硬化症的方法，包含在肠胃外将包含醋酸格拉替雷的药物组合物给予对其有需要的受试者，该药物组合物处于缓释库形式，以及将人脂肪源性干细胞(hADSCs)给予受试者的中枢神经系统(CNS)。

根据另一个方面，本发明提供了一种包含醋酸格拉替雷的药物组合物，该药物组合物处于用于在肠胃外给予的缓释库形式，用于与给予至中枢神经系统(CNS)的人脂肪源性干细胞(hADSCs)联合来治疗多发性硬化症。

根据一些实施方式，在同一天给予包含醋酸格拉替雷的药物组合物和hADSCs。

根据其它实施方式，在不同的日期给予包含醋酸格拉替雷的药物组合物和hADSCs。

根据一些实施方式，包含醋酸格拉替雷的药物组合物的给予和hADSCs的给予之间的时间段在1至14天之间变化。根据其它实施方式，包含醋酸格拉替雷的药物组合物的给予和hADSCs的给予之间的时间段在1至2周之间变化。

根据一些实施方式，每1至15周给予一次包含醋酸格拉替雷的药物组合物。根据其它实施方式，每1至10周给予一次包含醋酸格拉替雷的药物组合物。根据又一其它实施方式，每2至6周给予一次包含醋酸格拉替雷的药物组合物。根据一些具体实施方式，每4周给予一次包含醋酸格拉替雷的药物组合物。

根据一些实施方式，给予一次hADSCs。

根据其它实施方式，给予多于一次hADSCs，例如，2次、3次、4次等。每种可能性代表本发明的单独实施方式。根据一些实施方式，每2至8个月给予一次hADSCs。根据其它实施方式，每3至12个月给予一次hADSCs。

根据一些实施方式，在给予hADSCs之前，首先给予包含醋酸格拉替雷的药物组合物。

根据其它实施方式，在给予hADSCs之后，第二次给予包含醋酸格拉替雷的药物组合物。

根据其它实施方式，包含醋酸格拉替雷的药物组合物被配置为皮下植入，且该给予为通过皮下注射。

根据一些实施方式，给予hADSCs为通过鞘内给予

根据其它实施方式，给予hADSCs为通过脑室内或侧脑室内(intracerebroventricular)(ICV)给予，即进入脑室(brain ventricle)。

根据一些实施方式，hADSCs源自通过吸脂抽吸(liposuction aspiration)获得的人皮下脂肪。

根据一些实施方式，hADSCs是自体的。

根据其它实施方式，hADSCs是异体的。

根据一些实施方式，hADSCs的特征在于CD44、CD73和CD90在至少95％的细胞中阳性表达，CD105在至少90％的细胞中阳性表达，以及CD45、CD19、CD11B和HLADR在至少95％的细胞中阴性表达。根据一些实施方式，hADSCs的特征还在于CD34在0.1-10％的细胞中阳性表达。

根据一些实施方式，给予hADSCs包含每次给予时给予约10⁵–3x10⁸个细胞。

根据一些实施方式，醋酸格拉替雷包含L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-赖氨酸和L-酪氨酸的醋酸盐，其摩尔比为约0.14谷氨酸，约0.43丙氨酸，约0.10酪氨酸和约0.33赖氨酸。

根据其它实施方式，醋酸格拉替雷包含约15至约100个氨基酸。

根据一些实施方式，包含醋酸格拉替雷的药物组合物包含20至500mg醋酸格拉替雷。根据其它实施方式，包含醋酸格拉替雷的药物组合物包含20至250mg醋酸格拉替雷。根据又一其它实施方式，包含醋酸格拉替雷的药物组合物包含20至100mg醋酸格拉替雷。

根据一些实施方式，包含醋酸格拉替雷的药物组合物包含在药学上可接受的可生物降解的或不可生物降解的载体。

根据一些实施方式，载体选自由聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(poly(D,L-lactide-co-glycolide))(PLGA)、聚(D,L-丙交酯)(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚己内酯、聚羟基丁酸酯、聚原酸酯、聚烷酸酐(polyalkaneanhydride)、明胶、胶原蛋白、氧化纤维素和聚磷腈组成的组。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

根据一些实施方式，包含醋酸格拉替雷的药物组合物为通过水-包油-包水(water-in oil-in water)双重乳化工艺制备的微粒形式。

根据一些实施方式，微粒包含含有在治疗上有效量的醋酸格拉替雷的内部水相，包含选自可生物降解的和不可生物降解的聚合物的载体的水不混溶的聚合物相，以及外部水相。在一些具体实施方式中，水不混溶的聚合物相包含选自PLA和PLGA的可生物降解的聚合物。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

在其它实施方式中，外部水相包含选自聚乙烯醇(PVA)、聚山梨酯、聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段聚合物和纤维素酯的表面活性剂。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

本文所述的待治疗的受试者通常是人。根据一些实施方式，本发明的方法和组合物用于进展型多发性硬化症(MS)的治疗。因此，根据一些具体实施方式，受试者是患有进展型MS的受试者。在一些具体实施方式中，进展型MS是继发性进展型MS。在其它具体实施方式中，进展型MS是原发性进展型MS。

从随后的详细描述，实施例和权利要求中，本发明的这些和其它方面以及特征将变得显而易见。

附图说明

图1：通过AUC临床评分分析测定GA Depot和ADSCs对EAE的影响直到第28天。在第0天单独或一起给予这些药剂(GA Depot，2mg或10mg，IM，ADSCs，2X10⁵细胞，ICV)。WFI和

(注射的SC)作为对照。*P<0.05，与除10mg GA Depot和2x10⁵ADSCs外的所有组对比；**P<0.05，与

(2mg/天)或WFI对比；***P<0.05，与WFI对比；单因素ANOVA随后是假设方差不等的单尾双样本T检验(one-tail two-sample T test assumingunequal variances)，n＝10/组，+/-标准误差。

图2：通过平均最高分分析测定GA Depot和ADSCs对EAE的影响直到第28天。在第0天单独或一起给予这些药剂(GA Depot，2mg或10mg，IM，ADSCs，2X10⁵细胞，ICV)。WFI和

(注射的SC)作为对照。*P<0.05，与除ADSCs以及10mg GA Depot和2x10⁵ADSCs外的所有组对比；**P<0.05，与除2x10⁵ADSCs以及2mg GA Depot和2x10⁵ADSCs外的所有组对比；***P<0.05，与除GA外的所有组对比；单因素ANOVA随后是假设方差不等的单尾双样本T检验，n＝10/组，+/-标准误差。

图3：通过平均发病日分析测定GA Depot和ADSCs对EAE的影响直到第28天。在第0天单独或一起给予这些药剂(GA Depot，2mg或10mg，IM，ADSCs，2X10⁵细胞，ICV)。WFI和

(注射的SC)作为对照。*P<0.05，与所有组对比；**P<0.05，与2x10⁵ADSCs和2mg GA Depot对比；***P<0.05，与2x10⁵ADSCs对比；单因素ANOVA随后是假设方差不等的单尾双样本T检验，n＝10/组，+/-标准误差。

图4：通过平均临床评分分析测定GA Depot和ADSCs对EAE的影响直到第28天。使用以下各项免疫后0至28天平均临床评分：对照组(SC注射用水)，GA Depot，2mg，IM；GADepot，10mg，IM；ADSCs 2x10^5细胞，ICV；GA Depot，10mg，IM和ADSCs 2x10^5细胞，ICV；GADepot，2mg，IM和ADSCs 2x10^5细胞，ICV；(立即释放的醋酸格拉替雷)2mg，SC。n＝10/组，+/-标准误差。统计分析见表4。

图5：GA Depot和ADSCs对MOG诱导的EAE小鼠的体重的影响直至第28天。从第0天至第28天每天测量体重。对于死亡动物，动物死亡前的最后一次体重测量被记录为最终体重。n＝10/组，+/-标准误差。统计分析参见表5。

图6：通过AUC临床评分分析测定GA Depot与指示剂量的ADSCs的联合对EAE的影响直到第28天。*P<0.05，与PBS对比。

图7：通过平均最高分分析测定GA Depot与指示剂量的ADSCs的联合对EAE的影响直到第28天。*P<0.05，与PBS对比。

图8：通过平均发病日分析测定GA Depot和指示剂量的ADSCs的联合对EAE的影响直到第28天。**P<0.05，与200K，Depot，PBS对比；*P<0.05，与PBS对比。

图9：通过平均临床评分分析测定GA Depot与指示剂量的ADSCs的联合对EAE的影响直到第28天。+/-标准误差。

图10：GA Depot与指定剂量的ADSCs的联合对MOG诱导的EAE小鼠的体重的影响。体重随访至第45天。从第0天至第45天每天测量体重。对于死亡动物，动物死亡前的最后一次体重测量被记录为最终体重。n＝10/组，+/-标准误差。

图11：作为传代数函数的ADSCs的细胞表面标记表达。从脂肪组织中分离细胞，按照实施例部分所述进行培养，分析所示标记物的表达。结果是九(9)个样本的平均数+/-标准偏差。

具体实施方式

根据一些方面，本发明提供使用与给予至中枢神经系统的脂肪源性干细胞联合的在长效注射制剂中的醋酸格拉替雷(或任何其他在药物上可接受的格拉替雷盐)用于治疗多发性硬化症的组合物和方法，。

之前已描述过醋酸格拉替雷长效制剂(GA depot)并在小鼠体外进行评估用于醋酸格拉替雷释放曲线的分析，并在小鼠体内使用髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MyelinOligodendrocyte Glycoprotein)(MOG)诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)。在那些研究中，GA depot在改善EAE症状方面显示出与

同等的疗效。一次给予10mg剂量的GAdepot在减少疾病症状方面持续有效，并在所有情况下，优于每天给予2mg

和一次给予2mg GA depot。此外，在另一组实验中，在4至10mg的剂量范围内，观察到GA depot的相似疗效。

本发明的发明者已经使用MOG诱导的EAE模型用于评估GA depot与脂肪源性间充质干细胞的联合治疗对疾病结果的影响。MOG是一种糖蛋白，被认为在中枢神经系统(CNS)的神经髓鞘化(myelinization)过程中是很重要的。使用MOG 35-55肽免疫通常用于C57BL/6小鼠中慢性EAE的诱导。将ADSCs注射入用MOG诱导EAE的小鼠的脑室(ICV)内。单独用干细胞，单独用GA depot或联合使用ADSCs和GA depot 2或10mg治疗小鼠。

本发明首次公开了令人惊讶的观察结果，证明了GA depot和人ADSCs的联合对EAE的协同效应，包括临床评分、平均发病日、最大平均疾病评分和疾病持续时间。

因此，本发明提供了包含在药学上可接受的格拉替雷盐(特别地醋酸格拉替雷)的药物制剂的给予，以通过肠胃外缓释给予，以及人间充质脂肪源性干细胞的给予的治疗方法和方案。这些联合治疗对于多发性硬化症的疗效优于单独用GA或干细胞治疗。根据不同的临床评分测定，这些联合治疗可改善和延长疗效。

目前尚无包含长效剂型的醋酸格拉替雷和脂肪源性干细胞的给予的用于治疗多发性硬化症的方法和方案。这种联合治疗将有益于许多患者，特别是对那些伴有神经症状或身体失能的晚期疾病患者。具体地，这一治疗将有益于患有进展型多发性硬化症的患者。

本文使用的术语“治疗”是指多发性硬化症发作后症状的抑制或缓解。“治疗”还包含降低疾病，或其至少一种症状的进展速率。多发性硬化症发作后的共同症状包括但不限于视力下降或丧失，步履蹒跚，说话含糊以及尿频和尿失禁。此外，多发性硬化症可引起情绪变化和抑郁，肌肉痉挛和严重瘫痪。特别地，该疾病的特征在于以下症状比如虚弱、麻木、震颤、视力丧失、疼痛、瘫痪、失去平衡、膀胱和肠功能障碍以及认知改变(一级症状(primary symptoms))；反复的尿路感染、废用性虚弱(disuse weakness)、姿势调整和躯干控制不良、肌肉不平衡、骨密度降低、呼吸微弱(shallow)，呼吸困难和褥疮(二级症状)；抑郁(三级症状)。在一些实施例中，治疗包括：(i)抑制病情，即阻止其发展；或(ii)缓解病情，即使病情消退。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些具体实施方式中，根据本发明治疗多发性硬化症包含减缓疾病进展，即缓解失能的进展。

给予该药物的“受试者”是哺乳动物，优选地但不限于人。受试者正患有多发性硬化症，即被诊断为患有多发性硬化症。

本文使用的术语“多发性硬化症”是指中枢神经系统的自身免疫疾病，伴随一种或多种上述的症状。在一些实施方式中，MS是复发缓解型MS。在其它实施方式中，MS是进展型MS。在一些实施方式中，进展型MS是继发性进展型MS。在其他实施方式中，进展型MS是原发性进展型MS。在其它实施方式中，进展型MS是进展复发型MS(progressive relapsing MS)。

根据一些实施方式，每2至6周给予醋酸格拉替雷组合物。根据一些实施方式，每4周给予醋酸格拉替雷组合物。

根据一些实施方式，给予一次ADSCs。根据一些实施方式，给予多次ADSCs，例如，每2至8个月，每3至12个月或不那么频繁。

根据一些实施方式，给予一次ADSCs，且每2至6周给予一次醋酸格拉替雷组合物，例如每4周一次。

根据其它实施方式，每3至12个月给予一次ADSCs，例如每3，4，5，6，7，8，9，10，11，12个月一次，且每2至6周给予一次醋酸格拉替雷组合物，例如每4周一次。

根据其它实施方式，根据交替时间表给予ADSCs和醋酸格拉替雷组合物。

脂肪源性干细胞

本发明使用脂肪源性间充质干细胞。如本文所用，术语“脂肪源性间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells)”或“脂肪源性干细胞(adipose-derivedstem cells)”，缩写为“ADSCs”或“hADSCs”(即，人脂肪源性干细胞)，是指从脂肪组织获得的塑料粘附，多能细胞群。细胞群的特征在于CD44、CD73和CD90在至少95％的细胞中阳性表达，CD105在至少90％的细胞中阳性表达，以及CD45、CD19、CD11B和HLADR在至少95％的细胞中阴性表达。

在一些实施方式中，细胞群的特征在于CD44、CD73和CD90在至少98％的细胞中阳性表达，CD105在至少90％的细胞中阳性表达，以及CD45、CD19、CD11B和HLADR在至少98％的细胞中阴性表达。

细胞群的特征还在于CD34在最高达10％至20％的细胞中阳性表达。在一些实施方式中，细胞群的特征在于CD34在最高达5％、6％、7％、8％、9％或10％的细胞中阳性表达。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

在一些实施方式中，至少50％的细胞对CD105、CD73、CD44和CD90呈阳性，且对CD45、CD19、CD11B和HLADR呈阴性。

根据一些实施方式，90至100％的人ADSCs对标记CD44、CD73和CD90呈阳性。根据其它实施方式，至少95％的人ADSCs对标记CD44、CD73和CD90呈阳性。根据另一其它实施方式，至少98％的人ADSCs对标记CD44、CD73和CD90呈阳性。

根据一些实施方式，65至100％的人ADSCs对CD105呈阳性。根据其它实施方式，80至100％的hADSCs对CD105呈阳性。根据又一其它实施方式，90至100％的hADSCs对CD105呈阳性。根据又一其它实施方式，80至95％的hADSCs对CD105呈阳性。

根据一些实施方式，0.1至20％的人ADSCs表达标记CD34。根据其它实施方式，0.1至10％的人ADSCs表达标记CD34。根据又一其它实施方式，0.1至5％的人ADSCs表达标记CD34。根据又一其它实施方式，0.5至2％的人ADSCs表达标记CD34。

根据其它实施方式，2至10％的hADSCs对标记CD34呈阳性。根据其它实施方式，2至5％的hADSCs对标记CD34呈阳性。根据一些实施方式，至少90％的细胞，例如至少95％的细胞，对标记CD34呈阴性。

根据一些实施方式，至少90％的给予的人ADSCs对标记CD45、CD19、CD11B和HLADR呈阴性。根据其它实施方式，至少95％的给予的人ADSCs对标记CD45、CD19、CD11B和HLADR呈阴性。根据又一其它实施方式，至少98％的给予的人ADSCs对标记CD45、CD19、CD11B和HLADR呈阴性。

根据一些实施方式，至少50％的注射的人ADSCs对CD105、CD73、CD44和CD90呈阳性，且对CD45、CD19、CD11B和HLADR呈阴性。根据其它实施方式，至少60％、70％、80％或90％的注射的人ADSCs对CD105、CD73、CD44和CD90呈阳性，且对CD45、CD19、CD11B和HLADR呈阴性。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

细胞表面标记表达的表征可以通过本领域已知的方法进行，例如使用荧光激活细胞分类(FACS)。FACS方案在例如Flow Cytometry Protocols、Methods in MolecularBiology Volume 699 2011,Editors:Teresa S.Hawley，Robert G.Hawley Humana Press中进行了概述。下面描述了示例性的步骤。

作为多能基质/干细胞的来源的脂肪组织比其它来源有多个优点(Baer PC、Geiger H.Stem Cells Int 2012；2012:812693)。例如，皮下脂肪在人体内无处不在，且通过吸脂抽吸很容易大量获取。吸脂术(Liposuction)是一种耐受性良好的手术，可产生大量的组织抽吸物。吸脂器(lipoaspirate)通常作为医疗废物丢弃，使其成为脂肪源性基质/干细胞(ASC)分离的良好起始材料。该组织包含大量的多能细胞，其可在培养物中分离和增殖。

根据一些实施方式，ADSCs源自人皮下脂肪。根据具体实施方式，细胞源自通过吸脂抽吸获得的人皮下脂肪。ADSCs可通过吸脂手术在身体的各个部位包括胃、髋、大腿、手臂、颈部和臀部中获取。根据本发明，任何吸脂手术均可用于获取ADSCs，包括但不限于本领域已知的激光器、超声和通过腹部整形术(abdominoplasty)去除脂肪。

处理脂肪组织以分离脂肪源性干细胞，例如，根据下面的实施例1中描述的过程。制备方法通常包括用缓冲液(比如PBS和盐水)和/或生长介质(比如DMEM、StemMACS^TM或Plasma-Lyte)清洗组织，并用组织离解酶(比如胶原酶)处理组织和/或使组织受到机械搅拌/破坏的步骤。还可以联合使用分散酶和胶原酶进行样品的消化。胶质体(liposome)通常聚集在一起，可通过离心法从游离基质细胞(包括干细胞)和其它细胞(比如红细胞、内皮细胞和成纤维细胞)中分离出来。可使用合适的裂解缓冲液从悬浮颗粒中裂解红细胞，并过滤或离心剩余的细胞。

可选地，可通过细胞分选或免疫组织化学进行分离。Bunnell等人，(2008)Methods.、45(2):115–120、review methods for isolation of ADSCs。

在一些优选的实施方式中，ADSCs在被提供给需要其的受试者之前(或在存储以供后续使用之前)进行培养。优选地，在无异种培养基(xeno-free medium)中培养细胞。在一些实施方式中，ADSCs在被给予受试者之前生长至80至100％融合度(confluency)，例如，约80％融合度，并传代培养(sub-cultured)至3至10的传代数，优选地在3至5，或3至4之间。因此，在一些实施方式中，给予的细胞的传代数在3至5之间。在一些实施方式中，ADSCs传代培养至传代数3。在一些实施方式中，ADSCs传代培养至传代数4。在一些实施方式中，ADSCs传代培养至传代数5。

在给予之前，对细胞进行计数，并准备在药学上可接受的稀释剂/载体中注射。通常，在给予受试者之前，将细胞浓缩。浓度范围通常在1.6x10⁴/ml至100x10⁶/ml之间。

在一些实施方式中，根据本发明的方法用于单次给予的干细胞组合物包含10⁵至3x10⁸个人ADSCs。根据一些实施方式，组合物包含10⁵至10⁸个人ADSCs。根据其它实施方式，在一次给予中注射10⁶至10⁷个人ADSCs。根据又一其它实施方式，在一次给予中注射200x10⁶至300x10⁶个人ADSCs。根据又一其它实施方式，在一次给予中注射10⁷至2x10⁸个人ADSCs。

根据一些实施方式，本发明的ADSC组合物用于全身给予。通常，给予是进入受试者的中枢神经系统(CNS)。这种给予可能旨在绕过血脑屏障。根据又一其它实施方式，ADSCs直接给予至大脑的特定区域。

根据一些实施方式，组合物给予至CNS，例如通过脊柱内给予。根据一些实施方式，组合物在鞘内给予。根据其它实施方式，组合物通过脑室内或侧脑室(ICV)途径，即进入脑室给予。

脑室内药物输送是在脑池(cistern)(C1-2椎骨)和颅内脑室(intracranialventricle)的脑脊液内的药物输送。与口服用药相比，通过直接给予药物，所需的药物更少，并且副作用更少。如本领域所知，药物通常通过与泵连接的植入导管输送。泵可以是可编程的，且可以是植入的或外部的。

鞘内给予是一种通过向椎管(spinal canal)内注射药物的给药途径，更具体地向蛛网膜下腔(subarachnoid space)注射药物，使其到达脑脊液(CSF)，可用于脊柱麻醉、化疗或疼痛管理应用。这一途径还被用来引入抗某些感染的药物，特别地在神经外科手术后。该药物需要以这种方式给予以避免血脑屏障。鞘内或硬膜外药物输送包含椎管内的给药途径。每个途径均将药物输送至脑髓液(CSF)。鞘内输送涉及将药物直接注射至脊柱鞘内间隙的CSF中，而硬膜外腔中注射的药物则必须穿过硬脑膜以到达CSF。因此，硬膜外给予的药物也可以达到全身循环，而鞘内给予的药物则局限于循环在脊柱和脑室内的CSF。

格拉替雷制剂

如本文所用的术语“醋酸格拉替雷(glatiramer acetate)”是指以前被称为共聚物1的化合物，该化合物以商品名

销售，由合成多肽的醋酸盐组成，包含四种天然存在的氨基酸：L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-酪氨酸和L-赖氨酸，平均摩尔分数分别是0.141、0.427、0.095和0.338。

中醋酸格拉替雷的平均分子重量是4,700至11,000道尔顿(FDA

标签)且氨基酸的数量在约15至约100个氨基酸之间。该术语还指化合物的化学衍生物和类似物。通常，按照美国专利号5,981,589、6,054,430、6,342,476、6,362,161、6,620,847和6,939,539中任一项详述的来制备和表征化合物，在此将这些参考文献的每一个的内容全部并入其中。

如本文所用的术语“在肠胃外”是指选自皮下(SC)、静脉内(IV)、肌肉内(IM)、皮内(ID)，腹膜内(IP)等的途径。每种可能性代表本发明的单独的实施例。

在一些实施方式中，格拉替雷制剂通过肌肉内、皮下、经皮、静脉内或吸入给予来给予。每种可能性代表本发明的单独的实施例。根据某些具体实施方式，格拉替雷制剂用于皮下或肌肉内植入。

如本文所用的术语“在治疗上有效量”旨在限定格拉替雷的量，以实现缓解多发性硬化症的症状或该疾病症状中至少一种的目的。每种剂型的合适的剂量包括但不限于20至750mg。然而，应当理解的是，给予的格拉替雷的量将由医生根据各种参数确定，包括所选的给予途径、年龄、体重和患者症状的严重程度。根据本发明的各种实施方式，格拉替雷在治疗上的有效量在约1mg/天至约500mg/天之间变化。可替代地，格拉替雷的这一在治疗上的有效量为从约20mg至约100mg/天。

如本文所用的术语“长效”是指向受试者的通常全身循环或受试者的局部作用部位提供格拉替雷盐的长期的、持续的或延长的释放的组合物。该术语还指在受试者中提供格拉替雷盐的长期的、持续的或延长的作用持续时间(药代动力学)的组合物。这些组合物在本文中也被称为“缓释库形式(sustained release depot form)”。在具体实施方式中，本发明的长效药物组合物提供了一种给予方案，从每周一次到每6个月一次。它在约一周至约6个月的时间内释放出在治疗上有效量的在药学上可接受的格拉替雷盐。根据目前更优选的实施方式，给予方案为从每周一次，每个月两次(大约每2周一次)到每个月一次。基于所需的作用持续时间，库制剂(depot formulation)通常包含约20至750mg的活性成分，被设计为在数周至数个月的时间内释放。

在某些实施方式中，以每1ml载体20至30mg GA的浓度给予格拉替雷制剂。在某些实施方式中，载体是注射用水(WFI)。如本文所用的术语“注射用水”或“WFI”通常指无菌的、纯水，符合例如颗粒物、溶解固体、有机物、无机物、微生物和内毒素污染物的管理标准。在某些实施方式中，在WFI或包含悬浮剂(比如，羧甲基纤维素，CMC)、缓冲剂(比如，柠檬酸盐)和/或张度剂(比如，NaCl)的缓冲液中给予格拉替雷制剂。

在某些实施方式中，格拉替雷制剂包含10％至40％的固体。在其它实施方式中，格拉替雷制剂包含20％至30％的固体。在某些实施方式中，格拉替雷制剂包含聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)共聚物。在某些实施方式中，PLGA共聚物是聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(50:50)共聚物。在一些实施方式中，格拉替雷制剂包含每40mg GA 150至1500mg PLGA共聚物。在一些具体实施方式中，格拉替雷制剂包含每40mg GA 550mg PLGA共聚物。在某些实施方式中，PLGA共聚物至少部分封装GA。在某些实施方式中，PLGA共聚物封装GA。

在某些实施方式中，在37℃的PBS中，在连续搅拌下，少于30％的GA在7天内从库制剂(depot formulation)中释放。在某些实施方式中，在37℃的PBS中，在连续搅拌下，多于20％的GA在75天内从库制剂中释放。在某些实施方式中，在37℃的PBS中，在连续搅拌下，少于45％的GA在14天内从库制剂中释放。在某些实施方式中，在37℃的PBS中，在连续搅拌下，多于90％的GA在28天内从库制剂中释放。

在一些实施方式中，本发明的方法中使用的库制剂包括但不限于在水相、油相或蜡相中格拉替雷或其在药学上可接受的盐的悬浮液；格拉替雷或其在药学上可接受的盐的难溶电解质络合物；基于水溶性溶剂与格拉替雷或其在药学上可接受的盐的结合的“原位”凝胶形成基质；以及掺入格拉替雷或其在药学上可接受的盐的可生物降解的聚合物微粒。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在具体的实施方式中，本发明的组合物为可注射的微粒的形式，其中，格拉替雷或其在药学上可接受的盐被捕获在可生物降解的或不可生物降解的载体中。本发明的微粒组合物可包含水-包油-包水双重乳液。在本发明的范围内是一种包含含有格拉替雷或其任何在药学上可接受的盐的内部水相、包含可生物降解的或不可生物降解的聚合物的油相或水不混溶相以及外部水相的微粒组合物。外部水相还可包含表面活性剂，优选地聚乙烯醇(PVA)、聚山梨酯、聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物或纤维素酯。术语“油相”和“水不混溶相”在本文可互换使用。

根据具体实施方式，本发明的长效药物组合物为由水-包油-包水双重乳化工艺制备的微粒形式。在目前优选的实施方式中，本发明的长效药物组合物包含含有在治疗上有效量的在药学上可接受的格拉替雷盐的内部水相、包含选自可生物降解的或不可生物降解的聚合物的载体的水不混溶聚合物相以及外部水相。在其它目前优选的实施方式中，水不混溶聚合物相包含选自PLA和PLGA的可生物降解的聚合物。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在其它实施方式中，外部水相包含选自聚乙烯醇(PVA)、聚山梨酯、聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物和纤维素酯的表面活性剂。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

在一些实施例中，组合物可包含任何其它在药学上可接受的格拉替雷盐，包括但不限于硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、醋酸盐、硝酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、生育酚琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1,4-二酸盐、己炔-1,6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、苯甲酸甲酯、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、苯二甲酸盐、对苯二甲酸盐、磺酸盐，二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、β-羟基丁酸盐、乙醇酸盐、酒石酸盐、甲烷磺酸盐、丙磺酸盐、萘-2-磺酸盐、对甲苯磺酸盐、扁桃酸盐等盐。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

可通过本领域技术人员可获得的任何过程制备共聚物。例如，可在缩合条件下使用溶液中所需摩尔比的氨基酸或通过固相合成法来制备共聚物。缩合条件包括合适的温度、PH和一种氨基酸的羧基与另一种氨基酸的氨基缩合形成肽键的溶剂条件。可使用缩合剂，例如二环己基碳二亚胺来促进肽键的形成。

阻断基团(blocking group)可用于保护官能基团，比如侧链部分和一些氨基或羧基，以防止不期望的副反应。美国专利号3,849,550中公开的方法(其内容在此通过引用文件全部并入)可用于制备本发明的共聚物。例如，以二乙胺为引发剂，在环境温度下在无水二恶胺中聚合酪氨酸、丙氨酸、γ-苄基谷氨酸和N、ε-三氟乙酰赖氨酸的N-羧酸酐。谷氨酸的γ-羧基可用在冰醋酸中的溴化氢解阻(deblock)。使用一摩尔哌啶将三氟乙酰基从赖氨酸中除去。本领域技术人员很容易理解，通过选择性地消除与谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸或赖氨酸中任一种相关的反应，调整该方法以制备包含所需氨基酸(即共聚物1中四种氨基酸中的三种)的肽和多肽。美国专利号6,620,847、6,362,161、6,342,476、6,054,430、6,048,898和5,981,589(其内容在此通过引用文件全部并入)公开了制备醋酸格拉替雷(共聚物1，Cop-1)的改进的方法。就本申请而言，术语“环境温度”和“室温”通常是指从约20℃至约26℃的温度。

例如，GA的长效和库制剂在US 8,377,885中公开。在非限制性实施例中，GA Depot是一种无菌冻干粉末，包含载有GA的聚乳酸(polyglactin)微粒。该制剂悬浮于注射用水中，并用于肌肉内给予，例如每4周一次。

可在多肽合成期间或在聚合物制备后调整共聚物的分子量。为了在多肽合成期间调整分子量，调整合成条件或氨基酸的量使得在多肽达到近似所需长度时停止合成。合成后，可通过任何可用的大小选择方法，比如分子量排阻柱或凝胶上的多肽层析分析，以及所需范围的分子量的收集来获得具有所需分子量的多肽。本发明的多肽还可部分水解以除去高分子量物质，比如通过酸或酶水解，然后纯化以除去酸或酶。

在一个实施方式中，可通过包括将受保护的多肽与氢溴酸反应以形成具有所需分子量曲线的三氟乙酰基-多肽的方法来制备具有所需分子量的共聚物。反应在由一个或多个测试反应所预定的时间和温度下进行。在测试反应中，改变时间和温度，并且确定给定批次的测试多肽的分子量范围。将为该批次多肽提供最佳分子量范围的测试条件用于该批次。因此，可通过包括将受保护的多肽与氢溴酸在由测试反应所预定的时间和温度下反应的方法来制备具有所需分子量曲线的三氟乙酰基-多肽。然后用哌啶水溶液对具有所需分子量曲线的三氟乙酰基-多肽做进一步处理以形成脱保护的具有所需分子量的多肽。

在目前优选的实施方式中，在约20至28℃的温度下将来自给定批次的受保护的多肽的测试样品与氢溴酸反应约10至50小时。该批次的最佳条件通过进行多个测试反应来确定。例如，在一个实施方式中，在约26℃的温度下将受保护的多肽与氢溴酸反应约17小时。

在某些实施方式中，剂型包括但不限于可生物降解的可注射的库系统，比如，基于PLGA的可注射的库系统；基于非PLGA的可注射的库系统以及可注射的可生物降解的凝胶或分散体。每种可能性代表本发明的单独实施方式。本文所用的术语“可生物降解的”是指随时间与周围组织液中发现的物质接触或通过细胞作用在其表面(至少部分)侵蚀或降解的组分。具体地，可生物降解的组分是聚合物，例如但不限于乳酸基聚合物，例如聚丙交酯(比如聚(D,L-丙交酯))，即PLA；乙醇酸基聚合物，例如聚乙交酯(PLA)(比如来自Durect的

聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯，即PLGA，(来自Boehringer的

RG-504、

RG-502、RG-504H、RG-502H、

RG-504S、

RG-502S，来自Durect的聚己内脂，例如聚(e-己内脂)，即PCL(来自Durect的

聚酸酐；聚癸二酸SA；聚糯米酸(poly(ricenolic acid))RA；聚富马酸，FA；聚(脂肪酸二聚体)，FAD；聚对苯二甲酸，TA；聚间苯二甲酸，IPA；聚(对{羧苯氧基}甲烷)，CPM；聚(对{羧苯氧基}丙烷)，CPP；聚(对{羧苯氧基}己烷)CPH；多胺；聚氨酯；聚酯酰胺；聚原酸酯{CHDM:顺式/反式-环己基二甲醇，HD:l,6-己二醇.DETOU:(3,9-二亚乙基-2,4,8,10-四氧杂螺十一烷)}；聚二恶烷；聚羟基丁酸酯；聚亚烷基草酸酯；聚酰胺；聚酯酰胺；聚氨酯；聚缩醛；聚缩酮；聚碳酸酯；聚原碳酸酯；聚硅氧烷；聚磷腈；琥珀酸盐；透明质酸；聚苹果酸；聚氨基酸；聚羟基戊酸盐；聚亚烷基琥珀酸盐；聚乙烯基吡咯烷酮；聚苯乙烯；合成纤维素酯；聚丙烯酸；聚丁酸；三嵌段共聚物(PLGA-PEG-PLGA)；三嵌段共聚物(PEG-PLGA-PEG)；聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)；聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)三嵌段共聚物(PEO-PPO-PEO)，聚戊酸，聚乙二醇，聚羟烷基纤维素，几丁质，壳聚糖，聚原酸酯和共聚物、三元共聚物、脂类例如胆固醇、卵磷脂、聚(谷氨酸-共-谷氨酸乙酯)等或其混合物。

在一些实施方式中，本发明的组合物包含选自但不限于PLGA、PLA、PGA、聚己内脂、聚羟基丁酸酯、聚原酸酯、聚烷酸酐、明胶、胶原、氧化纤维素、聚磷腈等的可生物降解的共聚物。每种可能性代表单独实施方式。

目前优选的可生物降解的聚合物是基于乳酸的共聚物，更优选地聚丙交酯或聚(D、L-丙交酯-共-乙交酯)，即PLGA。优选地，可生物降解的聚合物以组合物的约10％至约98％w/w的量存在。基于乳酸的聚合物的乳酸与乙醇酸的单体比在100:0至约0:100，优选地100:0至约10:90的范围内，平均摩尔重量为约1,000至200,000道尔顿。然而，应理解的是，可生物降解的聚合物的量由诸如使用持续时间等参数来确定。

本发明的组合物还可包含一种或多种选自但不限于辅助表面活性剂、溶剂/辅助溶剂、水不混溶溶剂、水、水混溶溶剂、油性组分、亲水性溶剂、乳化剂、防腐剂、抗氧化剂、消泡剂、稳定剂、缓冲剂、pH调节剂、渗透剂、通道形成剂、渗透调节剂的在药学上可接受的赋形剂或本领域已知的任何其它赋形剂。合适的辅助表面活性剂包括但不限于聚乙二醇、称为“泊洛沙姆(poloxamer)”的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、聚甘油酯肪酸酯,例如十甘油单月桂酸酯和十甘油单肉蔻酸酯、山梨聚糖脂肪酸酯，例如山梨聚糖单硬脂酸酯，聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯，例如聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯

聚乙二醇脂肪酸酯，例如聚氧乙烯单硬脂酸酯，聚氧乙烯烷基醚，例如聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯蓖麻油和硬化蓖麻油，例如聚氧乙烯硬化蓖麻油等，或其混合物。每种可能性代表本发明的单独实施方式。合适的溶剂/辅助溶剂包括但不限于醇、三醋精(triacetin)、二甲基异山梨醇、糖原质(glycofurol)、碳酸丙烯酯、水、二甲基乙酰胺等或其混合物。每种可能性代表本发明的单独实施方式。合适的消泡剂包括但不限于硅乳液或山梨聚糖倍半油酸酯。防止或减少本发明组合物中组分劣化的合适的稳定剂包括但不限于抗氧化剂，例如甘氨酸、α-生育酚或抗坏血酸，BHA，BHT等，或其混合物。每种可能性代表本发明的单独实施方式。合适的张力调节剂包括但不限于甘露醇、氯化钠和葡萄糖。每种可能性代表本发明的单独实施方式。合适的缓冲剂包括但不限于具有合适阳离子的乙酸盐、磷酸盐和柠檬酸盐。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

本发明的组合物可通过本领域已知的任何方式制备。目前优选的是将格拉替雷或其盐共聚物并入胶体输送系统，比如可生物降解的微粒，从而允许通过微粒的聚合物壁扩散和通过在体内的水介质或生物流体中的聚合物降解来延迟释放(releaseretardation)。本发明的组合物可通过称为“双重乳化”的方法以可注射微粒的形式来制备。简要地，将水溶性共聚物的浓缩溶液分散在水不混溶的挥发性有机溶剂(比如二氯甲烷、氯仿等)中的可生物降解的或不可生物降解的聚合物的溶液中。然后将由此所得的“水包油”(w/o)乳液分散在包含表面活性剂(比如，聚乙烯醇-PVA，聚山梨酯、聚环氧乙烷-聚环氧丙烷嵌段共聚物、纤维素酯等)的连续的外部水相中以形成“水-包油-包水(w/o/w)双重乳液”液滴。有机溶剂蒸发后，微粒固化并通过过滤或离心收集。用纯化水洗涤收集到的微粒(MPs)以除去大部分表面活性剂和未结合的肽，并再次离心。洗涤后的MPs在无添加剂或添加冷冻保护剂(甘露醇)下收集并冻干，以促进其随后的重构。

“水-包油-包水(w/o/w)双重乳液”的粒径可通过包括但不限于在这一步施加的力的大小，混合速度，表面活性剂类型和浓度等的各种参数确定。合适的粒径的范围为约1至100μm。

本发明的库系统包含本领域技术人员已知的任何形式。合适的形式包括但不限于可生物降解的或不可生物降解的微球，任何合适几何形状的植入物，包括可植入棒、可植入胶囊和可植入环。每种可能性代表本发明的单独实施方式。进一步考虑的是延长的释放凝胶库和可腐蚀基质。每种可能性代表本发明的单独实施方式。例如，US 2008/0063687中描述了合适的可植入系统，其内容在此全部并入。如本领域已知的，可使用合适的微挤压机制备可植入棒。

根据本发明的原理，本发明的长效药物组合物提供了与市售的每日可注射剂型相同或更好的治疗效果，在局部和/或全身水平上降低了副作用的发生率和副作用的严重程度。在一些实施方式中，与基本上相似剂量的醋酸格拉替雷的速释制剂相比，本发明的组合物提供了格拉替雷在受试者中的延长释放或延长作用。

本发明包括醋酸格拉替雷或任何其他在药学上可接受的格拉替雷盐与脂肪源性干细胞和可选地至少一种其他活性剂的联合疗法。本发明范围内的活性剂包括但不限于干扰素，比如聚乙二醇化或非聚乙二醇化的α-干扰素，或β-干扰素，比如干扰素β-1a或干扰素β-1b，或τ-干扰素；具有可选地抗增殖/抗肿瘤活性的免疫抑制剂，比如米托蒽醌(mitoxantrone)、甲氨蝶呤(methotrexate)、硫唑嘌呤(azathioprine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)，或类固醇，比如甲泼尼龙(methylprednisolone)、泼尼松(prednisone)或地塞米松(dexamethasone)，或类固醇分泌剂，比如ACTH；腺苷脱胺酶抑制剂，比如克拉屈滨(cladribine)；IV免疫球蛋白G(比如，如Neurology、1998、May 50(5):1273-81中公开的)，对各种T细胞表面标志物的单克隆抗体，比如纳他珠单抗

或阿伦单抗(alemtuzumab)；TH2促进细胞因子，比如IL-4，IL-10，或抑制TH1促进细胞因子表达的化合物，比如磷酸二酯酶抑制剂(比如己酮可可碱(pentoxifylline))；抗痉挛药(antispasticity agents)，包括巴氯芬(baclofen)、地西泮(diazepam)、吡拉西坦(piracetam)、丹曲林(dantrolene)、拉莫三嗪(lamotrigine)、利氟唑(rifluzole)、替扎尼定(tizanidine)、可乐定(clonidine)、β阻断剂(beta blockers)、赛庚啶(cyproheptadine)、邻甲苯海明(orphenadrine)或大麻素(cannabinoids)；AMPA谷氨酸受体拮抗剂，比如2,3-二羟基-6-硝基-7-氨磺酰苯并(f)喹喔啉、[1,2,3,4,-四氢-7-吗啉基-2,3-二氧基-6-(三氟甲基)喹喔啉-基]甲基膦酸盐、1-(4-氨苯基)-4-甲基-7,8-亚甲基-二氧-5H-2,3-苯并二氮卓，或(-)1-(4-氨苯基)-4-甲基-7,8-亚甲基-二氧-4,5-二氢-3-甲基氨甲酰-2,3-苯并二氮卓；VCAM-1表达抑制剂或其配体的拮抗剂，比如α4βl整合素VLA-4和/或α-4-β-7整合素的拮抗剂，比如纳他珠单抗

抗巨噬细胞迁移抑制因子(抗MIF)；xii)组织蛋白酶S抑制剂；xiii)mTor抑制剂。每种可能性代表本发明的单独实施方式。目前优选的另一活性剂是FTY720(2-氨基-2-[2-(4-辛基苯基)乙基]丙烷-1,3-二醇；芬戈莫德(fingolimod))，属于免疫抑制剂类。

本发明包括适于植入对其有需要的个体的库形式的醋酸格拉替雷或任何其他在药学上可接受的格拉替雷盐与ADSCs一起给予的用途。

本发明包括包含醋酸格拉替雷或任何其他在药学上可接受的格拉替雷盐的药物组合物，该药物组合物为缓释库形式，与hADSCs一起用于多发性硬化症的治疗。

本发明还包括醋酸格拉替雷和ADSCs，与至少一种附加药物，优选地，免疫抑制剂，特别地，芬戈莫德的联合。

本发明还包括适于给予或植入对其有需要的受试体的缓释库形式的醋酸格拉替雷，与hADSCs一起用于制造治疗多发性硬化症的药物的用途。

提出以下实施例，以更充分地说明本发明的某些实施例。然而，它们绝不应该被解释为限制本发明的广泛的范围。本领域技术人员可以在不脱离本发明范围的情况下容易地设计本文公开的原理的许多变形和修改。实施例

实施例1-GA Depot和人ADSCs对C57BL/6小鼠的MOG诱导的慢性EAE的影响

材料和方法

醋酸格拉替雷：(商品名

20mg/ml在预充注射器(TevaPharmaceuticalIndustries Ltd.,Petah-Tikva,以色列)中。皮下注射(SC)。

醋酸格拉替雷(GA)Depot生产和GA释放曲线：按照美国专利号US8377885中描述的制备、冻干并保存GA Depot。来自GA Depot制剂的GA的释放曲线测定如下：将已知量的冻干的GA Depot粉末悬浮在磷酸盐缓冲盐(PBS)中，并在37℃下搅拌34天。定期从搅拌的悬浮液中回收样品，并使用凝胶渗透色谱法(GPC)测定GA的量。GA的百分比含量是基于悬浮液中GADepot的已知量来计算的。为了给予(肌肉内注射，IM)，将冻干的GA Depot粉末悬浮在无菌注射用水(WFI)中。

人脂肪源性干细胞(ADSCs)的分离、表征、培养和制备，用于脑室内(ICV)注射：

细胞制备方案：

ADSCs的分离：

在室温(RT)下，用等体积的PBS对源自人体组织的脂肪吸出物(lipoaspirate)洗涤4次。然后，在37℃下用胶原酶(NB4、Serva)振荡消化脂肪吸取物30分钟。随后，在RT，300至500g下将消化后的样品离心10分钟，并除去包括未消化脂肪的上层液体。通过添加等体积的无外源物延伸介质(xeno-free expansion medium)(StemMACS^TM、Miltentyi)，然后在RT，500g下再次离心，持续10分钟，停止反应。将所得的沉淀颗粒(pellet)转移至50ml离心管中，用培养基洗涤，并在相同条件下离心。除去上清液并在RT下将沉淀颗粒用25ml红细胞裂解缓冲液(Sigma-Aldrich、St.Louis、MO、美国)重悬10分钟。加入二十五(25)ml PBS，并将样品在500g下离心5分钟。用10ml培养基重悬沉淀颗粒，并通过100μm过滤器过滤，随后添加额外的10ml培养基。将溶液在500g下离心5分钟。用40μm过滤器重复该过程，并计数细胞。由此产生的细胞称为基质血管部分(stromal vascular fraction)(SVF)。

细胞培养：

将SVF以每75cm²约2x10⁶细胞的密度铺板。使细胞生长至约80％的融合率，用胰蛋白酶处理并继代培养最高至3至4代。然后收集细胞并通过FACS分析标记物：CD105、CD73、CD90、CD45、CD44、CD19、CD11B、HLADR和CD34。将细胞冷冻保存在液氮中直至使用。为了使用，将冷冻细胞解冻，并以50,000细胞/cm²的浓度铺板，并且孵育过夜。在细胞ICV注射之前，用胰蛋白酶处理细胞，计数以及制备以2x10⁵细胞/4μl PBS的浓度进行注射，并在冰中保存直至使用，时间不超过30分钟。使用立体定向系统(stereotactic system)进行ICV注射，注意不要损伤小鼠脑。

动物：所有动物研究均已获得当地伦理委员会的批准。将7至9周大的C57BL/6雌性小鼠随机分为平均重量相似的对照组和治疗组。在整个实验中，无限制地给动物食物和水。

实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的诱导：为了诱导EAE，髓磷脂-少突胶质细胞-糖蛋白(MOG)33-35(GL Biochem co.Ltd,Shanghai,中国)在改良的完全弗氏佐剂(CFA)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,美国)中的乳液制备如下：将热杀死的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)菌株H37RA(Sigma)添加至CFA，达到4mg/mL的最终浓度。随后，用等量的改良的CFA乳化2mg/mL的MOG 35-55。通过将该乳剂皮下注射(SC)至小鼠的在同一个位置的剃光的背部，随后在第0天和MOG免疫后48小时腹腔内注射在PBS中的百日咳杆菌毒素(Bordetella pertussis toxin)(Sigma)来诱导EAE。

测量：

从疾病症状发作时到第28天，每天测量体重。从免疫后第0天至第28天，通过每天一次的小鼠临床评分来评估EAE(表1)。死亡动物的临床评分为5，且在动物死亡前的最后一次体重测量被记录为最终体重。

表1：EAE临床评分

评分	临床体征
		0	正常小鼠；没有明显的疾病体征
1	尾巴无力(limp tail)
		2	后肢瘫痪
3	后肢和前肢瘫痪
		4	完全瘫痪：出于人道原因而处死
5	濒死状态；死于EAE

以下计算源自临床评分原始数据：

平均最高分：

是直至指定的分析日，特定组中每只小鼠的最高得分的平均值。

平均病程(Mean disease duration)：

平均发病日：

临床评分曲线下面积(AUC)：

使用Microsoft Excel计算得出并表示疾病负担(disease burden)。

实验设计：

EAE模型的实验设计详见表2(每组n＝10)。

表2：实验设计

*根据活性成分的量给予GADepot的剂量，即，GADepot 10mg包含10mg GA；

**出于技术考虑，该剂量被分为两个5mg剂量，在第0天和第1天给予。

统计分析：采用单因素方差分析(ANOVA)，随后通过假设方差不等的双尾双样本学生T检验(n＝10/组，+/-标准误差)对每个数据集进行分析。

结果

表3和图1至图5中描述了从测试物品的第一次注射直到第28天计算得出的试验结果。

细胞表型：

标记物(染料)	％表达
		CD73(PE*)	100
CD90(PE)	100
		CD105(PE)	100
CD44(FITC**)	100
		HLADR(PE)	0.1
CD34(PE)	1.5
		CD45(PE)	0.5
CD11b(PE)	0.2
		CD19(PE)	0.1
IgG1(PE)	0.2
		IgG2a(PE)	0.1
IgG1(FITC)	0

表3：GA Depot和ADSCs对EAE的影响

统计分析详见如下。

表4：平均临床评分的统计分析(图4)

表5：平均临床评分的统计分析(图5)

如与对照(WFI)相比，临床评分的较低的平均最高分和AUC所反映的，单独的ADSCs表现出对最大疾病评分和疾病负担的有利影响。仅在第20天左右开始对疾病评分产生有利影响。与对照相比，单独的ADSCs并未表现出对疾病发作的影响。

与对照相比，单独的GADepot 2mg/10mg表现出对疾病发作的有利影响。单独的Depot并未表现出对最大疾病评分或疾病负担的影响。

与对照相比，ADSCs和GADepot 2mg/10mg的联合表现出对最大疾病评分和疾病负担的有利影响，以及延缓了疾病的发作。重要的是，在某些方面与所有其他组相比，该联合在整个实验中表现出临床评分的更缓慢的增加(比如，疾病进展更缓慢)，表明各组分之间的协同作用。出乎意料的是，ADSCs和更低剂量的GADepot(2mg Depot)的联合在这一方面特别有利。

实验数据表明IM注射的GADepot与ICV注射的ADSCs一起进行的明显的优势。GADepot和ADSCs的联合使用对EAE症状的缓解产生了长期影响，从而导致显著减轻疾病负担。

实施例2-ADSCs的剂量反应

为了评估ADSCs在MOG诱导的EAE中的细胞剂量治疗效果(如上所述)，不同量(1x10⁵或2x10⁵)的ADSCs单独或与IM注射的2mg GAdepot联合用于ICV给予。实验设计详见表6(每组中n＝10)。

表6：实验设计

*GA depot被分为两个剂量，它们在第0天和第1天给予。

结果

图6至图10中描述了从试验样品的第一次注射直到第28天计算得出的试验结果。

观察到细胞剂量效果，其中较高剂量的2x10⁵细胞比1x10⁵剂量在减轻疾病负担和疾病评分方面更有效。

重要的是，与所有其他组相比，ADSCs和GA Depot的联合表现出明显的协同作用，显著延缓了疾病的发作，减缓了疾病的进展。

实施例3-ADSCs细胞表面标记物分析

表7至15总结了1至5代后，如以上实施例1所述制备的九(9)个ADSCs样品的FACS分析。表16至17和图11显示了平均和标准偏差值(“StDev”)。从表和图中可以看出，P3之后，标记物稳定。传代数P3至P4相当于不超过大约14群体倍增(population doubling)。

表7

*藻红蛋白

**FITC-异硫氰酸荧光素

表8

表9

表10

表11

表12

表13

表14

表15

表16-平均数

表17-标准误差

虽然已经具体描述了本发明，但是本领域技术人员将理解，可以做出许多变型和修改。因此，本发明不应被解释为限制于特别描述的实施例，并且通过参考所附的权利要求书将更容易理解本发明的范围和概念。

Claims

1.一种治疗多发性硬化症的方法，包括在肠胃外将包含醋酸格拉替雷的药物组合物给予对其有需要的受试者，所述药物组合物为缓释库形式，并将人脂肪源性干细胞(hADSCs)给予所述受试者的中枢神经系统(CNS)。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在同一日给予包含醋酸格拉替雷的所述药物组合物和所述hADSCs。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，在不同日给予包含醋酸格拉替雷的所述药物组合物和所述hADSCs。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，给予包含醋酸格拉替雷的所述药物组合物与给予所述hADSCs之间的时间段在1至14天的范围内。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，每1至6周给予一次包含醋酸格拉替雷的所述药物组合物。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，每4周给予一次包含醋酸格拉替雷的所述药物组合物。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，给予一次所述hADSCs。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，给予多于一次所述hADSCs。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，每2至8个月给予一次所述hADSCs。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述hADSCs之前给予包含醋酸格拉替雷的所述药物组合物。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述hADSCs之后给予包含醋酸格拉替雷的所述药物组合物。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，包含醋酸格拉替雷的所述药物组合物被配置为肌肉内给予，且所述给予为通过肌肉内注射。

13.根据权利要求1所述的方法，其中，包含醋酸格拉替雷的所述药物组合物被配置为皮下植入，且所述给予为通过皮下注射。

14.根据权利要求1所述的方法，其中，给予所述hADSCs是通过鞘内给予。

15.根据权利要求1所述的方法，其中，给予所述hADSCs是通过脑室内或侧脑室内(ICV)给予。

16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述hADSCs是通过吸脂抽吸由人皮下脂肪获得。

17.根据权利要求1所述的方法，其中，所述hADSCs是自体的。

18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述hADSCs是异体的。

19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述hADSCs的特征在于CD44、CD73和CD90在至少95％的细胞中阳性表达，CD105在至少90％的细胞中阳性表达，以及CD45、CD19、CD11B和HLADR在至少95％的细胞中阴性表达。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述hADSCs的特征还在于CD34在0.1至10％的细胞中阳性表达。

21.根据权利要求1所述的方法，其中，给予所述hADSCs包括给予约10⁵-3x10⁸细胞每一次给予。

22.根据权利要求1所述的方法，其中，所述醋酸格拉替雷包含L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-赖氨酸、和L-酪氨酸的醋酸盐，其摩尔比为约0.14谷氨酸、约0.43丙氨酸、约0.10酪氨酸和约0.33赖氨酸。

23.根据权利要求1所述的方法，其中，所述醋酸格拉替雷包含约15至约100个氨基酸。

24.根据权利要求1所述的方法，其中，包含醋酸格拉替雷的所述药物组合物包含在药学上可接受的可生物降解的或不可生物降解的醋酸格拉替雷的载体。

25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述载体选自由聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚(D,L-丙交酯)(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚己内酯、聚羟基丁酸酯、聚原酸酯、聚烷酸酐、明胶、胶原蛋白、氧化纤维素、和聚磷腈组成的组。

26.根据权利要求1所述的方法，其中，包含醋酸格拉替雷的所述药物组合物为通过水-包油-包水双重乳化过程制备的微粒形式。

27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述微粒包含含有在治疗上有效量的醋酸格拉替雷的内部水相，包含选自可生物降解的和不可生物降解的聚合物的载体的水不混溶的聚合物相，以及外部水相。

28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述水不混溶的聚合物相包含选自PLA和PLGA的可生物降解的聚合物。

29.根据权利要求27所述的方法，其中，所述外部水相包含选自聚乙烯醇(PVA)、聚山梨酯、聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物和纤维素酯的表面活性剂。

30.根据权利要求1所述的方法，其中，包含醋酸格拉替雷的所述药物组合物包含约20-500mg的醋酸格拉替雷。

31.根据权利要求1所述的方法，其中，所述受试者患有进展型多发性硬化症。

32.一种包含醋酸格拉替雷的药物组合物，所述药物组合物为用于在肠胃外给予的缓释库形式，用于与给予至中枢神经系统(CNS)的人脂肪源性干细胞(hADSCs)联合来治疗多发性硬化症中应用。