KR102084476B1 - 내피 및 상피 세포가 동시배양된 인공 생체막 및 이의 제조 방법 - Google Patents

내피 및 상피 세포가 동시배양된 인공 생체막 및 이의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 내피 및 상피 세포가 동시배양된 인공 생체막 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 콜라겐 및 폴리카프로락톤을 포함하는 나노섬유가 네트워크를 형성하는 지지체, 상기 지지체의 일 면에 형성된 내피 세포층 및 상기 지지체의 타 면에 형성된 상피 세포층을 포함하는, 인공 생체막; 이의 제조방법 및 관련 제조장치에 관한 것이다.

Description

내피 및 상피 세포가 동시배양된 인공 생체막 및 이의 제조 방법{ARTIFICIAL BIOMEMBRANE HAVING COCULTURED ENDOTHELIAL CELL AND EPITHELIAL CELL AND METHOF FOR PREPARING THE SAME}
본 발명은 내피 및 상피 세포가 동시배양된 인공 생체막 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 선행 배양 세포에 가중되는 스트레스가 경감될 수 있도록 내피 및 상피 세포가 동시배양된 인공 생체막 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
조직공학 분야는 공학과 생명과학의 주요 요소 즉, 생체 세포, 공학, 재료 및 적절한 생화학적/생리-화학적 인자 등을 복합적으로 사용하여 임상적 치료를 위한 응용과학분야이다. 특히 조직공학에서는 세포, 세포가 부착되어 자랄 수 있는 지지체(scaffold) 및 세포의 성장 및 분화를 조절할 수 있는 각종 인자를 적절히 이용하여 손상된 조직의 재생과 장기의 복구에 관한 연구가 중점적으로 수행되고 있다.
세포 배양은 바이오 분야의 연구에서 가장 기본이 되는 연구 방법으로서 생명체의 기능 연구뿐만 아니라 인체 질환을 연구하는데 매우 광범위하게 이용되고 있다. 현재까지 가장 흔히 사용되고 있는 방법은 폴리스티렌(polystyrene) 혹은 유리(glass)로 된 기질(substrate)로 이루어진 2차원 표면에서 세포를 배양하는 것이다.
한편, 인공 장기 제조 기술에 있어서, 공배양 기술이 요구되며, 공배양 기술의 핵심은 원하는 곳에 원하는 세포를 위치시키는 기술로써, 보통 공배양을 위해서 막(membrane)을 이용하는 공간적 공배양 법이 선호되고 있으며, 이 경우 트랜스웰(trans well)이라고 불리는 막(membrane)을 사용하여 상부와 하부에 각각 다른 세포를 키우는 방법이다. 다만, 이와 같은 트랜스 웰을 이용하는 경우 실리콘 웨이퍼를 이용하여 정확한 크기와 개수를 얻을 수 있다는 장점이 있는 반면에, 광 패턴과 DRIE 식각 공정이 요구되기 때문에, 가격이 상승하는 단점이 있다. 또한, 트랜스웰을 이용하는 방법의 경우 멀티 플레이트 구조로 인해 단순히 두 종류의 세포를 동시 공배양하는 공정은 수행이 가능하지만 인체 장기의 막 형태의 모사 및 세포 고정이 어려운 문제가 있다.
인체 장기의 막 형태의 모사를 위한 기술로, 미국 특허출원 US 5695996 A는 내피 세포층, 상피 세포층 및 이들 사이에 배치된 인공의 미세다공막을 개시하고 있으며, 이때 상기 발명은 내피세포를 먼저 공급하여 멤브레인 상에 자리를 잡도록 하고 세포를 배양한 후, 멤브레인의 상하를 뒤집어서 반대편에 상피세포를 공급하여 자리를 잡도록 한 후 세포를 배양하여 내피 세포와 상피 세포를 동기화(synchronize)하는 공정을 개시하고 있다.
그러나, 이와 같은 각 세포를 유동시키는 경우 멤브레인의 원하는 위치에 정확하게 원하는 세포 수를 고정시키기가 매우 어려우며, 내피 세포를 배양한 후 속적으로 상피 세포를 배양하고, 그 시간 간격에 수일이 소요되므로 세포의 수명에 영향을 주고, 선행 세포에 대한 스트레스 요인으로 작용하는 문제가 있다.
이에 종래의 동시 배양 공정이 갖는 문제점을 해결하고, 이에 적용될 수 있는 내피 및 상피 세포가 동시배양된 인공 생체막 관련 기술이 개발되는 경우, 생체 칩, 인공장기 분야 등 관련 분야에서 널리 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
이에 본 발명의 한 측면은, 내피세포와 상피세포가 동시에 배양된 인공 생체막을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 측면은, 내피세포와 상피세포가 동시에 배양된 인공 생체막의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 본 발명의 인공 생체막을 제조할 수 있는 인공 생체막의 제조장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 견지에 의하면, 콜라겐 및 폴리카프로락톤을 포함하는 나노섬유가 네트워크를 형성하는 지지체; 상기 지지체의 일 면에 형성된 내피 세포층; 및 상기 지지체의 타 면에 형성된 상피 세포층을 포함하는, 인공 생체막이 제공된다.
본 발명의 다른 견지에 의하면, 콜라겐 및 폴리카프로락톤을 포함하는 나노섬유가 네트워크를 형성하는 지지체의 일 영역에 내피 세포를 배양하는 단계; 상기 내피 세포를 배양하는 단계와 동시에, 콜라겐 및 폴리카프로락톤을 포함하는 나노섬유가 네트워크를 형성하는 지지체의 타 영역에 상피 세포를 동시 배양하는 단계; 및 내피 세포가 배양된 지지체와 상피 세포가 배양된 지지체를 각각 세포가 배양된 세포층이 외부를 향하도록 배치하여 적층하는 단계를 포함하는, 내피 및 상피 세포가 동시배양된 인공 생체막의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 견지에 의하면, 내피 세포를 배양하는 일 영역 및 임의의 직선을 기준으로 상기 일 영역과 대칭으로 배치된 상피 세포를 배양하는 타 영역을 포함하며, 콜라겐 및 폴리카프로락톤을 포함하는 나노섬유가 네트워크를 형성하는 지지체; 상기 임의의 직선 위치의 지지체 하부에 배치된 이동 막대; 상기 일 영역의 내피 세포를 배양하기 위한 제1 세포 배양 접시; 및 상기 타 영역의 상피 세포를 배양하기 위한 제2 세포 배양 접시를 포함하며, 상기 이동 막대는 상하 이동의 수행이 가능한, 인공 생체막의 제조장치가 제공된다.
본 발명에 의하면, 생체막 제조 시 내피세포와 상피세포를 동시에 배양할 수 있으므로, 동기화된 내피세포 및 상피세포를 포함하는 인공 생체막의 제조 수율이 현저하게 향상될 수 있으며, 종래 디쉬 기반의 세포 배양 기술의 활용이 가능하므로 종래 세포 배양 기술의 노하우를 활용할 수 있으며, 본 발명의 인공 생체막을 적용한 생체 칩, 인공 장기 등을 제작하는데 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 나노섬유를 제조하는 장치 및 공정을 예시적으로 도시한 것이며(도 1 우측), 도 1 중간의 그림은 나노섬유의 코어부와 시스부를 나타내고 있으며, 도 1 좌측의 사진은 상기와 같은 방사조건으로 제조하여 만든 섬유의 시차현미경 사진(위: 약1000배, 아래 약5000배)을 나타낸 것이다.
도 2는 폐암 상피세포(Lung cancer epithelial cells) 및 제대정맥 내피세포(HUVECs: human umbilical vein endothelial cells)를 실시예 1의 지지체를 이용하여 각각 배양한 후에 세포가 배양된 두 지지체를 접합하여 3일에서 6일 정도 공배양 후 공 초점 현미경(Confocal microscopy)을 이용하여 폐암 상피세포(2번의 동일 조건 실험 결과인 도 2(a)의 좌측 및 우측)와 제대정맥 내피세포(2번의 동일 조건 실험 결과인 도 2(b)의 좌측 및 우측)를 확인한 것이다. 상피세포와 내피세포들이 지지체 표면 및 지지체를 구성하는 나노섬유 사이 내부에 존재하는 것을 확인할 수 있다.
도 3 (a)는 비교예 1의 지지체를 이용하여 유방암 상피세포(MCF-7, breast cancer epithelial cell)를 세포배양 첫날과 배양 4일 후, 도립현미경(Inverted microscope)로 확인하여 나타낸 결과이며, 도 3(b)는 실시예 1의 지지체를 이용하여 유방암 상피세포(MCF-7, breast cancer epithelial cell)를 배양 첫날과 배양 4일 후 도립현미경(Inverted microscope) 로 확인한 결과로 세포 배양이 잘 이루어 진 것을 확인할 수가 있다.
도 4 (a)는 비교예 3의 포어 사이즈가 10 um 인 지지체를 이용하여 제대정맥 내피세포(HUVECs: human umbilical vein endothelial cells)를 4일간 배양 후 도립현미경(Inverted microscope)과 공 초점 현미경(Confocal microscopy)으로 확인한 세포 배양 상태로 세포 배양이 원활하게 이루어지지 않았으며, 도 4 (b)는 실시예 1의 포어 사이즈가 5 um인 지지체를 이용하여 제대정맥 내피세포(HUVECs: human umbilical vein endothelial cells)를 4일간 배양 후 도립현미경(Inverted microscope)와 공 초점 현미경(Confocal microscopy)으로 확인 한 세포 배양 상태로서 세포 배양이 잘 된 것으로 확인이 되었다.
도 5는 비교예 3의 지지체를 이용하여 HK-2 콩팥 상피세포(HK-2 kidney epithelial cells)(도 5(a)), 제대정맥 내피세포(HUVECs: human umbilical vein endothelial cells) (도 5(b))를 배양한 결과를 도립현미경(Inverted microscope)과 공 초점 현미경(Confocal microscopy)을 이용하여 확인한 것이다.
도 6(a)는 비교예 4의 지지체를 이용하여 유방암 상피세포(MCF-7, breast cancer epithelial cell)를 세포배양 48시간 후, 도립현미경(Inverted microscope)로 확인하여 나타낸 결과이며, 도 6(b)는 비교예 5의 지지체를 이용하여 유방암 상피세포(MCF-7, breast cancer epithelial cell)를 세포배양 48시간 후 후 도립현미경(Inverted microscope)로 확인하여 나타낸 결과로, 두 지지체는 세포 배양이 원활히 이루어 지지 않음을 확인했다.
도 7는 본 발명에 의한 상피세포 및 내피세포 동시 배양 기술의 원리를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 8는 본 발명에 의한 상피세포 및 내피세포 동시 배양 기술의 원리가 적용된 예시적인 상피세포 및 내피세포 동시 배양 시스템을 도식적으로 나타낸 것이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 의하면, 내피 세포 및 상피 세포가 동시배양된 인공 생체막이 제공된다.
보다 상세하게, 본 발명의 내피 세포 및 상피 세포가 동시배양된 인공 생체막은 콜라겐 및 폴리카프로락톤을 포함하는 나노섬유가 네트워크를 형성하는 지지체; 상기 지지체의 일 면에 형성된 내피 세포층; 및 상기 지지체의 타 면에 형성된 상피 세포층을 포함하는 것이다.
본 발명에 사용되는 지지체는 세포 배양 시 세포의 부착 및 배양능이 우수한 것으로, 그 제조에 사용될 수 있는 나노섬유는 콜라겐 및 폴리카프로락톤을 포함하는 복합재료로 이루어진 것이 바람직하다.
즉, 본 발명의 세포 배양용 나노섬유는 상기 콜라겐 및 폴리카프로락톤을 포함하는 복합재료의 혼합물로 제조되거나, 바람직하게는 상기 나노섬유는 폴리카프로락톤으로 이루어진 코어부 및 콜라겐으로 이루어진 시스(sheath)부의 이중층 나노 섬유인 것이다.
본 발명의 나노섬유는 특히 콜라겐으로 이루어진 시스부에 의해 나노파이버 멤브레인에 세포 부착 및 세포 성장의 효과를 획득할 수 있고, 폴리카프로락톤으로 이루어진 코어부에 의해 생체적합성 재료로 세포에 무해한 효과와 세포 부착 및 성장에 적합한 지지체를 획득할 수 있다. 한편, 콜라겐이 코어부, 폴리카프로락톤이 시스부로 형성되는 경우에는 나노섬유 지지체가 형성이 어려우며, 세포 부착 및 세포 성장의 문제가 있고, 이들 성분을 구분되는 층으로 구성하지 않고 혼합물로 섬유를 제조하는 경우에는 콜라겐 및 폴리카프로락톤의 분산성이 낮아서 나노섬유 제조 시 토출이 원활하게 이루어 지지 않으며, 나노섬유에 콜라겐이 코팅을 구현할 수 없고, 콜라겐의 입자가 포어를 막는 현상이 발생하여 세포 안착 및 성장 효율이 떨어지는 문제가 있다.
예를 들어, 상기 나노섬유의 직경은 50nm 내지 500nm 이하인 것이며, 바람직하게는50nm 내지 300nm인 것이다. 상기 나노섬유의 직경이 50nm 미만인 경우에는 나노섬유의 직경이 과도하게 얇아 원하는 포어 사이즈 확보를 위한 공정 시간이 증가하고, 수 um급 기공도 제어의 문제가 있으며, 500nm를 초과하는 경우에는 나노섬유의 막 두께가 증가하고 미세한 포어 사이즈 (5~10um 미만) 제작에 문제가 있다.
이때, 상기 나노섬유의 코어부의 직경은 전체 나노섬유 직경의 30 내지 90%인 것이 바람직하며, 60 내지 80%인 것이 보다 바람직하고, 30% 미만인 경우에는 요구되는 지지체의 포어 사이즈 조절에 문제가 있으며, 90%를 초과하는 경우에는 셀 배양의 효율에 문제가 있다.
본 발명의 세포 배양용 나노섬유의 제조 방법은 특히 제한되는 것은 아니나, 상기 이중층 나노 섬유는 동축 전기 방사에 의해 형성되는 것일 수 있다.
보다 상세하게, 본 발명의 세포 배양용 나노섬유의 제조 방법은 콜라겐을 제1 용매에 용해시켜 시스부 방사액을 제조하는 단계; 폴리카프로락톤을 제2 용매에 용해시켜 코어부 방사액을 제조하는 단계; 및 내부 노즐을 통해 코어부 방사액을, 외부 노즐을 통해 시스부 방사액을 동시에 동축전기방사 하여 나노섬유를 제조하는 단계를 포함하는 것이다.
이때, 상기 제1 용매는 아세트산 및 물로부터 선택되는 적어도 하나인 것으로, 바람직하게는 아세트산 수용액, 예를 들어 아세트산과 탈이온수의 혼합물을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 아세트산 수용액은 아세트산이 0.05 몰 내지 0.2몰 농도로 포함된 것일 수 있다.
한편, 상기 제2 용매는 메탄올(methanol), 클로로포름(Cloroform) 또는 이의 혼합물을 사용할 수 있으며, 메탄올과 클로로포름의 혼합물을 사용하는 경우 예를 들어 상기 메탄올과 클로로포름을 1:3 내지 1:1의 중량비로 혼합할 수 있다.
나아가, 상기 제1용매 및/또는 제2 용매의 전기적 특성 확보를 위해 소량의 LiCl(Lithium chloride), 그래핀, CNT 등을 첨가제로 첨가하여 사용할 수 있으며, 상기와 같은 첨가제를 추가로 포함하는 경우 균일한 코팅을 획득할 수 있다.
상술한 제1용매 및 제2용매를 사용하는 경우 콜라겐과 PCL의 분산성 및 방사 효율을 현저하게 향상시킬 수 있다.
상기 시스부 방사액은 0.1 내지 5 중량%의 콜라겐 용액인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 0.3 내지 3 중량%, 더욱 바람직하게는 약 0.5 중량%의 콜라겐 용액인 것이다. 상기 콜라겐 용액의 농도가 0.1 중량% 미만인 경우에는 콜라겐의 코팅이 잘 이루어지지 않아 나노섬유 지지체에 대한 세포부착 및 세포배양에 문제가 있고, 5 중량%를 초과하는 경우에는 콜라겐 코팅이 심하게 생겨서 지지체 포어 사이즈의 확보가 어려우며, 나노섬유가 굳어지는 현상이 발생하여 지지체를 접어서 진행하는 공배양 방식을 수행하는 경우 접합 등에 문제가 있을 수 있다.
상기 코어부 방사액은 5 내지 40중량%의 폴리카프로락톤 용액인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 10 내지 30중량%의 폴리카프로락톤 용액인 것이다. 상기 폴리카프로락톤 용액의 농도가 5 중량% 미만인 경우에는 나노섬유 직경이 작아지며 이로 인하여 요구되는 지지체 포어 사이즈 확보를 위해 장시간 공정이 요구되며, 또한 정확한 포어 사이즈 확보가 어렵고, 심한 경우 방사 토출이 이루어지지 않아 나노섬유 형성이 수행되지 않는 문제가 있고, 40 중량%를 초과하는 경우에는 나노 섬유의 직경이 크게 형성이 되어 원하는 지지체 포어 사이즈와 두께를 확보하는데 문제가 있다.
동축전기방사 시 멤브레인 회전속도는 1 RPM 내지 20 RPM, 및 유량은 0.5 내지 2 ml/hr, 온도 범위 15 ~ 40℃, 습도 10~ 60% 범위를 조건으로 하여 수행되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게 회전속도는 3 내지 10 RPM, 및 유량은 1 내지 1.5 ml/hr, 온도 범위 20 ~ 25℃, 습도 20~ 40% 범위의 조건으로 하여 수행되는 것이다.
상기 동축전기방사 시 회전속도가 1 RPM 미만인 경우에는 지지체의 포어 사이즈가 너무 커지는 문제가 있으며, 20RPM 을 초과하는 경우에는 지지체의 포어 사이즈가 너무 작아지고, 두께가 너무 커지는 문제가 있다. 한편, 유량이 0.5 mm/s 미만인 경우에는 방사 토출 공정 조건 형성이 안되는 문제가 있으며, 2 ml/hr를 초과하는 경우에는 방사 토출과 액체 상태가 동사에 토출되는 문제가 있다.
또한, 동축전기방사 시 온도가 15℃ 미만인 경우에는 방사된 나노섬유의 콜라겐이 미리 굳어져서 기공 형성에 문제가 있으며, 40℃를 초과하는 경우에는 용매의 건조속도가 빨라져서 나노 섬유 형성에 문제가 있다. 한편, 습도가 10% 미만인 경우에는 용매의 건조 속도가 빨라져서 나노섬유 형성에 문제가 있으며, 60%를 초과하는 경우에는 용매가 건조되는 속도가 늦어서 나노섬유 형성 후 용매의 건조로 안한 나노섬유의 포어 사이즈 확보에 문제가 있다. 이때 습도는 상대습도를 의미한다.
세포 배양에 적합한 나노 섬유를 제조하기 위해 동축전기방사 시 사용되는 내부 노즐의 내부 직경은 18 내지 26 G이고, 바람직하게는 20 내지 24 G인 것이다. 내부 노즐의 내부 직경이 18 G 미만인 경우에는 나노섬유의 직경이 커져서 지지체의 포어 사이즈가 작아지고 두께가 두꺼워지는 문제가 있으며, 26 G를 초과하는 경우에는 나노 섬유의 직경이 너무 작게 형성이 되어 적절한 지지체의 포어 사이즈 확보가 어려우며, 심한 경우 토출이 어려워지는 문제가 있다.
한편, 세포 배양에 적합한 나노 섬유를 제조하기 위해 동축전기방사 시 사용되는 외부 노즐의 내부 직경은 12 G 내지 20 G이고, 바람직하게는 14 내지 18 G 인 것이다. 외부 노즐의 내부 직경이 12 G 미만인 경우에는 콜라겐의 분사가 균일하지 않아서 지지체의 균일한 콜라겐 코팅이 형성되지 않아 셀 배양능이 떨어지는 문제가 있으며, 20 G를 초과하는 경우에는 콜라겐 분사 토출 공정이 원활하게 수행되지 않는 문제가 있다.
상기 범위 내에서 외부 노즐의 직경은 내부 노즐의 직경에 비하여 크게 설정하며, 예를 들어 2G 내지 7G 정도 큰 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 4G 내지 6G, 예를 들어 5G 정도 큰 것이 바람직하다.
이때, 동축전기 방사는 노즐을 멤브레인으로부터 5 내지 20cm 이격하여 수행되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 10 내지 15 cm 이격하여 수행되는 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
동축전기 방사는 노즐에 5 KV 내지 20 KV의 전압을 부여하여 수행되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 8 내지 12 kV의 전압을 부여하여 수행되는 것으로, 인가 전압이 5kv 미만일 경우 나노섬유의 토출 모드가 형성이 안되면서 나노 파이버의 직경 크기가 일정하지 않는 문제가 있다. 인가 전압이 20KV를 초과하는 경우에는 안정적인 토출 모드가 변경되어 토출이 원활이 이루어지지 않고 고전압으로 인해 용매가 빠르게 증발하여 노즐 막힘 및 스파크 현상이 일어나는 문제가 있다.
동축 전기 방사 시 기판은 특히 제한되지 않으나, 나노 섬유 및 지지체가 포함되는 최종 제품의 필요에 따라 예를 들어 유기 기판인 멤브레인 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 의하면, 상술한 바와 같은 본 발명의 나노 섬유가 네트워크를 형성하여 제조된 세포 배양용 지지체가 제공된다.
상기 세포 배양용 지지체는 나노섬유 제조 공정에 연속적으로 나노섬유를 적층하여 수행될 수 있다.
상기 지지체는 배양이 예정된 세포의 크기에 따라 평균 포어 사이즈를 조절할 수 있으며, 예를 들어 배양이 예정된 세포의 크기(평균 직경)를 기준으로 50% 내지 150%, 바람직하게는 70% 내지 130%의 평균 직경을 갖는 포어 사이즈인 것이 바람직하다. 예를 들어 2μm 내지 10μm 미만, 바람직하게는 3μm 이상 내지 9μm 의 평균 포어 사이즈를 가질 수 있다.
상기 포어 사이즈가 배양이 예정된 세포의 크기(평균 직경)를 기준으로 50 % 미만인 경우에는 세포가 지지체 내부로 유입되지 못하고 표면에서 대부분 이탈되는 문제가 발생할 수 있으며, 150%를 초과하는 경우에는 구멍의 크기가 커지므로 배양이 예정된 세포가 지지체를 통과하여 빠져나가는 문제가 있다.
한편, 상기 지지체는 5 내지 500 μm의 평균 두께를 갖는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 10 내지 100μm의 평균 두께를 갖는 것이다. 두께가 5μm미만인 경우에는 세포가 지지체의 밑면까지 도달하여 세포 배양에 문제가 있으며, 500 μm초과인 경우에는 세포 배양 후 공배양 단계에서 동기화 문제가 발생할 가능성이 있다.
본 발명에 의하면, 세포 배양 시 세포의 부착 및 배양능이 우수한 지지체를 제조할 수 있는 나노섬유가 제공되며, 본 발명의 나노섬유를 이용하여 세포 배양에 적합한 지지체의 제공이 가능하게 된다. 상기와 같은 지지체를 이용하여 제조된 본 발명의 인체 조직 모방 칩은 다양한 세포층을 효과적으로 장치 내에 구현할 수 있다.
한편, 상기와 같은 지지체를 이용하여 제조된 본 발명의 상기 인공 생체막은 내피 세포가 배양된 지지체와 상피 세포가 배양된 지지체를 각각의 세포층이 외부를 향하도록 배치되어 적층된 것이 바람직하다. 이때, 상기 내피 세포가 배양된 지지체와 상피 세포가 배양된 지지체는 동일 지지체의 상이한 영역일 수 있거나, 또는 상이한 지지체일 수 있다.
본 발명의 지지체에서 배양될 수 있는 세포는 포유류 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 일종일 수 있으며, 제1 세포, 제2 세포는 각각 독립적으로 상피 세포, 내피 세포, 간엽 세포, 근육 세포, 면역 세포, 신경 세포, 및 조혈 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 일종일 수 있으며, 목적으로 하는 인체 조직의 구조에 따라 적합한 세포를 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 제1 세포는 모세혈관 내피세포 등의 내피세포이고, 제2 세포는 폐포 상피 세포 등의 상피세포일 수 있다.
보다 상세하게, 다세포 유기체로부터의 임의의 세포를 사용할 수 있다. 예를 들어, 인체는 적어도 210개의 알려진 세포 유형을 포함하며, 본 발명에 사용될 수 있는 세포 유형(예를 들어, 사람)에는 제한 없이, 외피계(integumentary system)의 세포, 이에는 제한 없이, 각화 상피 세포, 표피 각질 세포(분화 표피 세포), 표피 기저 세포(줄기 세포), 손톱 및 발톱의 각질 세포, 손발톱바닥 기저 세포(줄기 세포), 수질 모간 세포, 수질 모간 세포, 피질 모간 세포, 표피 모간 세포, 표피 모근 초세포, 헉슬리층의 모근 초세포, 헨레층의 모근 초세포, 외부 모근 초세포, 모기질 세포(줄기 세포)가 포함됨]; 습윤 중층 장벽 상피 세포, 예를 들어 각막, 혀, 구강, 식도, 항문관, 원위 요도 및 질의 중층 편평 상피의 표면 상피 세포, 각막, 혀, 구강, 식도, 항문관, 원위 요도 및 질의 상피의 기저 세포(줄기 세포), 요로 상피 세포(방광 및 요관의 내막을 형성함); 외분비 상피 세포, 예를 들어 타액선 점액 세포(다당류-풍부 분비), 타액선 장액 세포(당단백질 효소-풍부 분비), 혀의 본 에브너(Von Ebner) 선 세포(미뢰를 세척함), 유선 세포(젖 분비), 누선 세포(눈물 분비), 귀의 이도선 세포(왁스 분비), 에크린 한선 어두운 세포(당단백질 분비), 에크린 한선 투명 세포(소분자 분비), 아포크린 한선 세포(냄새 분비, 성호르몬 감수성), 안검의 몰(Moll) 선 세포(특수화된 한선), 피지선 세포(지질-풍부 피지 분비), 코의 바우만 선 세포(후각 상피를 세척함), 십이지장의 브루너 선 세포(효소 및 알칼리성 점액), 정낭 세포(수영하는 정자를 위한 프룩토오스를 비롯한 정액 성분을 분비함), 전립선 세포(정액 성분을 분비함), 구요도선 세포(점액 분비), 바톨린 선 세포(질액 분비), 리트레 선 세포(점액 분비), 자궁 내막 세포(탄수화물 분비), 기도 및 소화관의 분리된 배상 세포(점액 분비), 위 내막 점액 세포(점액 분비), 위선 효소원세포(펩시노겐 분비), 위선 산 분비 세포(염산 분비), 췌장 선방 세포(중탄산염 및 소화 효소 분비), 췌장 내분피 세포, 소장의 파네트 세포(리소짐 분비), 장 상피 세포, 폐의 I형 및 II형 폐포 세포(계면활성제 분비), 및/또는 클라라 세포가 포함된다.
또한, 호르몬 분비 세포, 예를 들어 췌장의 랑게르한스섬의 내분비 세포, 뇌하수체 전엽 세포, 성장자극세포, 프로락틴 분비세포, 갑상선 자극세포, 성선자극세포, 부신피질 자극세포, 뇌하수체 중엽 세포, 멜라닌세포 분비-자극 호르몬; 및 옥시토신 또는 바소프레신을 분비하는 대세포성 신경분비 세포; 세로토닌, 엔도르핀, 소마토스타틴, 가스트린, 세크레틴, 콜레시스토키닌, 인슐린, 글루카곤, 봄베신을 분비하는 장관 및 기도 세포; 티로이드 선 세포, 예를 들어 티로이드 상피 세포, 소포방 세포, 파라티로이드 선 세포, 파라티로이드 주세포, 호산성 세포, 부신 세포, 스테로이드 호르몬(미네랄 코르티코이드 및 글루코 코르티코이드)을 분비하는 크롬 친화성 세포, 테스토스테론을 분비하는 고환의 라이디히 세포, 에스트로겐을 분비하는 난포의 속난포막 세포, 프로게스테론을 분비하는 파열된 난포의 황체 세포, 과립층 황체 세포, 난포막 황체 세포, 방사구체 세포(레닌 분비), 신장의 밀집 반세포, 신장의 극 주위 세포, 및/또는 신장의 혈관간 세포도 적용될 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 대사 및 저장 세포, 예를 들어 간세포, 백색 지방 세포, 갈색 지방 세포, 간 지방 세포로 막의 적어도 한면을 처리할 수 있다. 또한, 장벽 기능 세포(폐, 장, 외분비선 및 비뇨생식기관) 또는 신장 세포, 예를 들어 신장 사구체 벽세포, 신장 사구체 족세포, 신장 근위 세관 솔 가장자리막, 헬레 루프 얇은 세그먼트 세포, 신장 원위 세관 세포, 및/또는 신장 집합관 세포를 사용할 수 있다.
사용될 수 있는 다른 세포에는 I형 폐포 세포(폐의 공기 공간 내막을 형성함), 췌장관 세포(선방중심 세포), (한선, 타액선, 유선 등의) 민무늬 관 세포, 주세포, 개재 세포, (정낭, 전립선 등의) 관 세포, (미세융모를 갖는) 장 솔 가장자리 세포, 외분비선 횡문 관 세포, 담낭 상피 세포, 수출 소관 무섬포 세포, 부고환 주세포, 및/또는 부고환 기저 세포가 포함된다.
또한, 폐쇄 내부 체강의 내막을 형성하는 상피 세포, 예를 들어 혈관 및 림프관 내피 유창 세포, 혈관 및 림프관 내피 연속 세포, 혈관 및 림프관 내피 비장 세포, 활막 세포(관절강의 내막을 형성함, 히알루론산 분비), 장막 세포(복막강, 흉막강, 및 심막강의 내막을 형성함), 편평 세포(귀의 외림프 공간의 내막을 형성함), 편평 세포(귀의 내림프 공간의 내막을 형성함), 미세융모를 갖는 내림프낭의 원주 세포(귀의 내림프 공간의 내막을 형성함), 미세융모를 갖지 않는 내림프낭의 원주 세포(귀의 내림프 공간의 내막을 형성함), 어두운 세포(귀의 내림프 공간의 내막을 형성함), 전정막 세포(귀의 내림프 공간의 내막을 형성함), 혈관조 기저 세포(귀의 내림프 공간의 내막을 형성함), 혈관조 연변 세포(귀의 내림프 공간의 내막을 형성함), 클라우디우스의 세포(귀의 내림프 공간의 내막을 형성함), 보에처의 세포(귀의 내림프 공간의 내막을 형성함), 맥락막총 세포(뇌척수액 분비), 연막거리막 편평 세포, 눈의 색소 섬모 상피 세포, 눈의 비색소 섬모 상피 세포, 및/또는 각막 내피 세포를 사용할 수 있다.
추진 기능을 갖는 섬모 세포, 예를 들어 기도 섬모 세포, (여성의) 난관 섬모 세포, (여성의) 자궁 내막 섬모 세포, (남성의) 고환망 섬모 세포, (남성의) 수출 소관 섬모 세포, 및/또는 중추 신경계의 섬모 뇌실막 세포(뇌강의 내막을 형성함)와 같은 세포가 포함된다.
또한, 특수화된 ECM을 분비하는 세포를 플레이팅 할 수 있으며, 예를 들어 사기질 상피 세포(치아 에나멜 분비), 귀의 전정 기관의 반월 평면 상피 세포(프로테오글리칸 분비), 코르티 기관 치간 상피 세포(유모세포를 덮는 피개막을 분비함), 성긴 결합 조직 섬유모세포, 각막 섬유모세포(각막 각질 세포), 힘줄 섬유모세포, 골수 망상 조직 섬유모세포, 다른 비상피 섬유모세포, 외막 세포, 추간판의 수질핵 세포, 시멘트질 모세포/시멘트질 세포(치근 골유사 시멘트질 분비), 상아질 모세포/상아질 세포(치아 상아질 분비), 유리연골 연골세포, 섬유연골 연골세포, 탄력연골 연골세포, 골모세포/골세포, 골조상 세포(골모세포의 줄기 세포), 눈의 유리체의 유리체 세포, 귀의 외림프 공간의 성상 세포, 간 성상 세포(이토 세포), 및/또는 췌장 성상 세포이다.
추가적으로 또는 대안적으로, 수축 세포, 예를 들어 골격근 세포, 적색 골격근 세포(느림), 백색 골격근 세포(빠름), 중간 골격근 세포, 근방추의 핵낭 세포, 근방추의 핵사슬 세포, 위성 세포(줄기 세포), 정상 심장근 세포, 결절 심장근 세포, 푸르키네에 섬유 세포, 평활근 세포(다양한 종류), 홍채의 근상피 세포, 외분비선의 근상피 세포가 본 발명의 장치에 사용될 수 있다.
하기의 세포들이 또한 사용될 수 있다: 혈액 및 면역계 세포, 예를 들어 적혈구, 거핵구(혈소판 전구체), 단핵구, 결합 조직 대식세포(다양한 유형), 표피 랑게르한스 세포, (뼈의) 파골세포, (림프양 조직의) 수지상 세포, (중추 신경계의) 미세아교 세포, 호중성 과립구, 호산성 과립구, 호염기성 과립구, 비만 세포, 보조 T 세포, 억제 T 세포, 세포독성 T 세포, 자연 살해 T 세포, B 세포, 자연 살해 세포, 망상적혈구, 혈액 및 면역계를 위한 줄기 세포 및 수임 전구세포(다양한 유형). 조직 배양 시스템 내의 면역 세포의 효과를 측정하기 위하여 이들 세포를 단일 세포 유형으로서 또는 혼합물로 사용할 수 있다.
또한, 하나 이상의 신경계 세포, 감각 변환기 세포, 예를 들어 코르티 기관의 청각 내유모세포, 후각 상피의 기저 세포(후각 신경을 위한 줄기 세포), 냉-감수성 1차 감각 신경, 열-감수성 1차 감각 뉴런, 상피의 머켈 세포(촉각 센서), 후각 수용체 신경, 통증-감수성 1차 감각 뉴런(다양한 유형); 광수용체 간상 세포, 눈의 광수용체 청색-감수성 원추 세포, 눈의 광수용체 녹색-감수성 원추 세포, 눈의 광수용체 적색-감수성 원추 세포를 비롯한 눈의 망막의 광수용체 세포, 고유감각 1차 감각 뉴런(다양한 유형); 촉각-감수성 1차 감각 뉴런(다양한 유형); I형 경동맥 소체 세포(혈액 pH 센서); II형 경동맥 소체 세포(혈액 pH 센서); 귀의 전정 기관의 I형 유모세포(가속 및 중력); 귀의 전정 기관의 II형 유모세포(가속 및 중력); 및/또는 I형 미뢰 세포로 처리할 수 있다.
본 발명에 콜린성 신경 세포(다양한 유형), 아드레날린성 신경 세포(다양한 유형), 펩티드성 신경 세포(다양한 유형)와 같은 자율 신경 세포를 추가로 사용할 수 있다. 또한, 감각 기관 및 말초 신경 지지 세포가 또한 사용될 수 있다. 이들에는, 예를 들어, 코르티 기관의 내주 세포, 코르티 기관의 외주 세포, 코르티 기관의 내지상 세포, 코르티 기관의 외지상 세포, 코르티 기관의 경계 세포, 코르티 기관의 한센 세포, 전정 기관 지지 세포, I형 미뢰 지지 세포, 후각 상피 지지 세포, 슈반 세포, 위성 세포(말초 신경 세포체를 피막화함) 및 장 아교세포가 포함된다. 일부 실시 형태에서, 또한 중추 신경계 신경 및 아교세포, 예를 들어 별아교세포(다양한 유형), 신경 세포(매우 다양한 유형, 여전히 불충분하게 분류됨), 희소돌기아교세포, 및 방추 뉴런을 사용할 수 있다.
렌즈 세포, 예를 들어 전방 렌즈 상피 세포 및 결정-함유 렌즈 섬유 세포가 또한 본 발명의 장치에 사용될 수 있다. 추가적으로, 색소 세포, 예를 들어 멜라닌 세포 및 망막 색소 상피 세포; 및 배아 세포, 예를 들어 난조 세포/난모 세포, 정자 세포, 정모 세포, 정조 세포(정모 세포를 위한 줄기 세포), 및 정자를 사용할 수 있다.
예를 들어, 보모(nurse) 세포들인 난포 세포, (조직의) 세르톨리 세포, 흉선 상피 세포를 사용할 수 있다. 또한, 간질 세포, 예를 들어 간질 신장 세포를 사용할 수 있다.
다른 예로써, 지지체의 적어도 한 면에 상피 세포를 배치할 수 있다. 상피는 신체 전체를 통하여 구조물의 강(cavity) 및 표면의 내막을 형성하는 세포로 구성된 조직이다. 많은 샘이 또한 상피 조직으로부터 형성된다. 그것은 결합 조직의 상부에 놓여지며, 기저막에 의해 2개의 층이 분리된다. 사람에서, 상피는 1차 체조직으로 분류되며, 나머지 다른 것들은 결합 조직, 근육 조직 및 신경 조직이다. 상피는 흔히 접착 분자 e-카드헤린(결합 조직의 신경 및 세포에 사용되는 n-카드헤린의 반대어로서)의 발현으로 정의된다.
상피 세포의 기능에는 분비, 선택적 흡수, 보호, 세포횡단 수송 및 감각의 검지가 포함되며, 그들은 일반적으로 결과로서 광범위한 정단-기저외측 극성(예를 들어, 발현된 상이한 막 단백질) 및 특수화를 나타낸다. 상피 세포의 예에는 얇고 편평한 혈소판의 외관을 갖는 편평 세포가 포함된다. 그들은 조직 내에 함께 꼭 맞게 끼워져; 평활한 저마찰 표면을 제공하며, 이 위로 유체가 용이하게 이동할 수 있다. 핵의 형상은 통상 세포 형태에 대응하며, 상피 유형을 확인하는 데 도움이 된다. 편평 세포는 세포의 얇고 편평한 형태로 인해 수평으로 편평한 타원형 핵을 갖는 경향이 있다. 고전적으로, 편평 상피는 단순 수동 확산을 이용하여 표면의 내막을 형성함이 확인되는데, 예를 들어 폐의 폐포 상피이다. 특수화된 편평 상피는 또한 혈관(내피) 및 심장(중피)과 같은 강 및 체내에서 발견되는 주요 강의 내막을 형성한다.
상피 세포의 다른 예는 입방 세포이다. 입방 세포는 대략 입방 형상이며, 단면이 사각형을 나타낸다. 각각의 세포는 중심에 구형 핵을 갖는다. 입방 상피는 일반적으로 분비 또는 흡수 조직, 예를 들어 (분비) 외분비선 및 췌장, 및 세뇨관의 (흡수) 내막에서뿐만 아니라, 이들 샘의 관에서도 발견된다. 그들은 또한 여성 난소 내에서 난세포, 그리고 남성 고환 내에서 정자 세포를 생성하는 배아 상피를 구성한다.
상피 세포의 또 다른 유형은 세장형이고 기둥 형상인 원주 상피 세포이다. 그들의 핵은 세장형이고 통상 세포의 기저 가까이에 위치된다. 원주 상피는 위 및 장의 내막을 형성한다. 일부 원주 세포가 코, 귀 및 혀의 미뢰 등에서의 감각 수용을 위하여 특수화된다. 배상 세포(단세포선)가 십이지장의 원주 상피 세포들 사이에서 발견된다. 그들은 윤활제로서 작용하는 점액을 분비한다.
상피 세포의 또 다른 예는 거짓중층 세포(pseudostratified epithelium)이다. 이것은 단순 원추 상피 세포로, 이의 핵이 상이한 높이에서 나타나서, 이 세포의 단면을 관찰할 때 상피가 중층이라는 오해를 초래하는(따라서 "거짓") 느낌을 제공한다. 거짓중층 상피는 또한 섬모라 불리는 그의 정단(관강)막의 미세한 모-유사 확장(hair-like extension)을 가질 수 있다. 이 경우에, 상피는 "섬모(ciliated)" 거짓중층 상피로 표현된다. 섬모는 세포골격 미세소관의 상호작용을 통하여 소정의 방향으로 에너지 의존성 박동을 할 수 있거나, 구조 단백질 및 효소를 결합시킬 수 있다. 생성되는 퍼짐 효과(wafting effect)는 (병원체 및 입자를 윤활시키고 포획하기 위하여) 배상 세포에 의해 국소적으로 분비되는 점액을 그 방향으로(통상적으로 체외로) 흐를 수 있게 한다. 섬모 상피는 기도(코, 기관지)에서 발견되지만, 여성의 자궁 및 난관에서도 발견되는데, 여기서 섬모는 난자를 자궁으로 밀어낸다. 상피는 신체의 외부(피부) 및 내부 강과 루멘 둘 모두의 내막을 형성한다. 우리 피부의 최외층은 죽은 중층 편평 각질화 상피 세포로 구성된다.
입, 식도 및 직장 일부의 내부의 내막을 형성하는 조직은 비각질화 중층 편평 상피로 구성된다. 체강을 외부 환경과 분리하는 다른 표면은 단순 편평 원주, 또는 거짓중층 상피 세포에 의해 내막이 형성된다. 다른 상피 세포는 폐, 위장관, 생식기관 및 요로 내부의 내막을 형성하며, 외분비선 및 내분비선을 구성한다. 각막의 외부 표면은 빠르게 성장하고 용이하게 재생되는 상피 세포로 덮힌다. 내피(혈관, 심장 및 림프관의 내막)는 외피의 특수화된 형태이다. 또 하나의 다른 유형인 중피는 심막강, 흉막강, 및 복막강의 벽을 형성한다.
따라서, 본 발명에 있어서 지지체 상에 적용가능한 세포 유형을 플레이팅하고 적용가능한 진공을 인가하여 세포 상에 생리학적 또는 인공적인 역학적 힘을 제공하여 피부 상에의 인장 또는 폐 상에의 역학적 변형과 같은 생리학적 힘을 모방함으로써, 개시된 세포 배양 장치 내에서 이들 조직 중 임의의 것을 재현할 수 있다. 일 실시 형태에서, 지지체의 한 면은 상피 세포가 배치되고, 나머지 다른 한 면은 내피 세포가 배치된다.
내피는 혈관의 내부 표면의 내막을 형성하는 세포들의 얇은 층으로, 루멘 내에서와 혈관벽의 나머지 부분 내에서 순환하는 혈액 사이의 계면을 형성한다. 내피 세포는 심장으로부터 가장 작은 모세혈관까지의 전체 순환계의 내막을 형성한다. 이들 세포는 혈액 유동의 와류를 감소시키며, 이는 혈액이 더 멀리 펌핑될 수 있게 한다. 내피 조직은 상피 조직의 특수화된 유형(동물의 생물학적 조직의 네 가지 유형 중 하나)이다. 보다 구체적으로, 그것은 단순 편평 상피이다.
해부학의 기초 모델은 내포 세포와 외피 세포 사이를 그들이 생성되는 조직에 기초하여 구별하며, 케라틴 섬유라기보다는 비멘틴의 존재가 이들을 상피 세포와 분리함을 명시한다. 심실(heart chamber)의 내부 표면의 내피는 심내막이라 불린다. 혈액 모세혈관 및 림프 모세혈관 둘 모두는 단층이라 불리는 내피 세포의 단일층으로 구성된다. 내피 세포는 혈관 생물학의 많은 측면에 관여하며, 이러한 측면에는 혈관수축 및 혈관확장, 및 따라서 혈압의 제어; 혈액 응고(혈전 형성 및 피브린 용해); 죽상경화; 새로운 혈관의 형성(혈관 신생); 염증 및 장벽 기능이 포함되며, 내피는 혈관 루멘과 주위 조직 사이의 선택적 장벽으로서 작용하여 혈류 내외로의 백혈구의 이행 및 물질의 통과를 제어한다. 만성 염증의 경우에서와 같이, 내피 단층의 투과성의 과도하거나 연장된 증가는 조직 부종/종창으로 이어질 수 있다. 일부 기관에서는, 특수화된 '여과' 기능을 수행하기 위한 매우 분화된 내피 세포가 있다. 그러한 독특한 내피 구조물의 예에는 신장 사구체 및 혈액-뇌 장벽이 포함된다.
본 발명의 지지체에서 배양될 수 있는 내피 세포는 바람직하게는 폐혈관 내피세포,심장 내피세포, 간 내피세포, 신장 내피세포 등 모든 장기의 내피세포일 수 있으며, 이루어진 그룹으로 선택되는 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 지지체에서 배양될 수 있는 상피 세포는 바람직하게, 폐포 상피세포, 심장 상피세포, 간 상피세포, 신장 상피세포 등 모든 장기의 상피세포일 수 있으며, 이루어진 그룹으로 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니다.
이때, 상기 내피 세포층의 내피 세포 및 상기 상피 세포층의 상피 세포는 각각의 지지체에 5000 내지 20000 세포 수 범위로 세포를 분주하는 것이 바람직하다. 한편, 각 세포의 배양 방법은 특히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에 알려진 배지, 배양 조건 등의 배양 기술을 적용할 수 있다.
본 발명의 다른 견지에 의하면, 상술한 내피 세포 및 상피 세포가 동시배양된 인공 생체막의 제조방법이 제공된다.
보다 상세하게, 본 발명의 내피 및 상피 세포가 동시배양된 인공 생체막의 제조방법은 콜라겐 및 폴리카프로락톤을 포함하는 나노섬유가 네트워크를 형성하는 지지체의 일 영역에 내피 세포를 배양하는 단계; 상기 내피 세포를 배양하는 단계와 동시에, 콜라겐 및 폴리카프로락톤을 포함하는 나노섬유가 네트워크를 형성하는 지지체의 타 영역에 상피 세포를 동시 배양하는 단계; 및 내피 세포가 배양된 지지체와 상피 세포가 배양된 지지체를 각각 세포가 배양된 세포층이 외부를 향하도록 배치하여 적층하는 단계를 포함하는 것이다.
바람직하게, 본 발명의 인공 생체막은 예를 들어 제 1 세포를 지지체 상에서 배양함과 동시에 제 2 세포를 동일 지지체의 다른 영역 또는 별도의 지지체 상에서 배양한 후 각각의 세포층이 외부를 향하도록 적층하여 획득할 수 있으며, 바람직하게 상기 일 영역과 타 영역은 단일 지지체 상에서 이격된 영역인 것이다.
상기 일 영역과 타 영역이 단일 지지체 상에서 이격된 영역인 경우, 도 8(a)에 도시된 바와 같이 상기 일 영역과 타 영역은 일 영역과 타 영역 사이의 임의의 직선을 기준으로 대칭이 되도록 형성되는 것이 바람직하다.
이 경우, 상기 적층하는 단계는 일 영역과 타 영역 사이에 형성된 상기 임의의 직선을 기준으로 내피 세포가 배양된 지지체와 상피 세포가 배양된 지지체를 각각 세포가 배양된 세포층이 외부를 향하여 대칭이 되도록 접어서(folding) 수행될 수 있다.
예를 들어, 도 8(b)에 도시된 바와 같이 단일 지지체 상에서 이격된 일 영역과 타 영역에서 각각 내피 세포와 상피 세포를 배양하고, 일 영역과 타 영역 사이에 형성된 상기 임의의 직선을 기준으로 내피 세포가 배양된 지지체와 상피 세포가 배양된 지지체를 각각 세포가 배양된 세포층이 외부를 향하여 대칭이 되도록 접는 단계를 수행할 수 있으며, 상기 접는 단계는 예를 들어 도 8(b)에 도시된 바와 같이 지지체의 기준 선 아래에 봉을 배치한 후 봉을 상부로 들어올려 수행될 수 있다.
한편, 상기 적층하는 단계는 내피 세포가 배양된 지지체와 상피 세포가 배양된 지지체를 각각의 세포가 배양된 세포층이 외부를 향하도록 배치하고 지지체를 서로 접합하여 수행될 수 있다.
이러한 공정에 의하면, 세포를 동시에 배양하여 사용할 수 있으므로, 인체 조직 모방 칩의 제조 수율이 현저하게 향상될 수 있으며, 종래 디쉬 기반의 세포 배양 기술의 활용이 가능하므로 종래 세포 배양 기술의 노하우를 활용할 수 있다.
본 발명의 다른 견지에 의하면, 상술한 본 발명의 인공 생체막을 제조할 수 있는 제조장치가 제공된다.
보다 상세하게, 본 발명의 인공 생체막의 제조장치는 내피 세포를 배양하는 일 영역 및 임의의 직선을 기준으로 상기 일 영역과 대칭으로 배치된 상피 세포를 배양하는 타 영역을 포함하며, 콜라겐 및 폴리카프로락톤을 포함하는 나노섬유가 네트워크를 형성하는 지지체; 상기 임의의 직선 위치의 지지체 하부에 배치된 이동 막대; 상기 일 영역의 내피 세포를 배양하기 위한 제1 세포 배양 접시; 및 상기 타 영역의 상피 세포를 배양하기 위한 제2 세포 배양 접시를 포함하며, 상기 이동 막대는 상하 이동의 수행이 가능한 것일 수 있다.
이때, 상기 제1 세포 배양 접시 및 제2 세포 배양 접시의 종류는 특히 제한되는 것은 아니며, 각각 내피 세포 및 상피 세포의 배양에 적절한 배지를 포함하는 것일 수 있다.
상기 상하 이동의 수행이 가능한 이동 막대는 수동으로 이동되거나, 또는 일정한 배양 시간 경과 후 이동하도록 설정되어 자동으로 이동될 수 있다.
본 발명에 의하면, 내피세포와 상피세포를 동시에 배양할 수 있으므로, 동기화된 내피세포 및 상피세포를 포함하는 인공 생체막의 제조 수율이 현저하게 향상될 수 있으며, 종래 디쉬 기반의 세포 배양 기술의 활용이 가능하므로 종래 세포 배양 기술의 노하우를 활용할 수 있다.
나아가 본 발명의 인공 생체막을 적용한 생체칩, 인공 장기 등을 제작하여 약물 거동 등을 확인 등 관련 분야에서 널리 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 나노 섬유 및 세포 배양용 지지체의 제조
실시예 1
(1) 나노 섬유 및 세포 배양용 지지체의 제조
콜라겐을 아세트산이 0.1몰 농도로 포함된 탈이온수에 용해시켜 0.5 wt%의 농도를 갖는 시스부 방사액을 제조하였다. 한편, 폴리카프로락톤을 메탄올 중량 25%, 클로로포름 중량 75%의 혼합 용매에 용해시켜 15wt%의 농도를 갖는 코어부 방사액을 제조하였다. 상기 제조된 방사액을 이용하여 전기방사법에 의해 섬유를 제조하였다(도 1 우측 참조).
전기 방사기는 Trek사(미국)에서 제조한 고전압 발생기(모델명: 10/10B-HS) 를 사용하였고, 이때 내부 노즐의 내부 직경은 22G (0.41mm), 외부 노즐의 내부 직경은 16G (1.26mm)인 노즐을 사용하였으며, 전기 방사의 자세한 방법은 하기와 같다.
상기의 농도를 갖는 코어부 및 시스부 방사액을 각각 별도의 방사액 저장소에 충전하였다. 방사 시 방사액의 방출 속도는 1 mm/s로 조절하였다. 전압은 10 kV로 조절하였으며, 노즐을 유기 기판인 멤브레인으로부터 100mm 거리로 이격되도록 조절하였다. 원하는 섬유를 제조하기 위해서는 컬렉터 상에 섬유가 집적되기 전에 용매가 전부 휘발되어야 하므로 적절한 온도와 습도의 유지가 중요므로, 온도는 약 20℃, 습도는 약 25%로 설정하였다. 여기서 얻은 나노섬유의 직경은 약 300 nm인 것을 확인하였다.
도 1 중간의 사진은 상기와 같은 방사조건으로 제조하여 만든 섬유의 시차현미경 사진(위: 약1000배, 아래: 약5000배)을 나타낸 것이다.
상기에서 설정된 조건으로 나노섬유를 제조하면서 나노섬유를 적층하여 평균 약 5 μm 의 포어 사이즈 및 300 nm의 평균 두께를 갖는 지지체를 제조하였다.
비교예 1
폴리카프로락톤을 메탄올 중량25%, 클로로포름 중량 75%의 혼합 용매에 용해시켜 15wt%의 농도를 갖는 방사액을 제조하여 단독 방사하여 나노섬유를 제조한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 조건 하에서 세포 배양용 지지체를 제조하였다.
비교예 2
콜라겐을 아세트산이 0,1 몰 농도로 포함된 탈이온수에 용해시켜 0.5 wt%의 농도를 갖는 방사액을 제조하여 단독 방사하여 나노섬유를 제조한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 조건 하에서 나노섬유 및 세포 배양용 지지체를 제조하는 경우에는 나노섬유를 형성하는 섬유의 방사가 없기 때문에 지지체 매트리스의 제조가 불가능하였다.
비교예 3
실시예 1과 동일한 조건 하에서 나노 섬유를 제조하되, 멤브레인의 회전속도를 8 RPM에서 3 RPM으로 변경하여 평균 포어 사이즈를 평균 약 10 μm으로 형성한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 조건 하에서 세포 배양용 지지체를 제조하였다. 도 4 (a)에 상기 조건으로 지지체를 제조 후 내피 세포를 배양한 결과 사진이 나타나 있다.
비교예 4
콜라겐을 5wt% 포함하는 제 1 용매와 폴리카프로락톤을 15wt% 포함하는 제 2용매를 4:6의 중량비로 분산하여 실시예 1 과 동일한 조건 하에서 단독 방사하여 두 성분이 단순히 혼합된 나노섬유 및 세포 배양용 지지체를 제조하였다.
비교예 5
실시예 1에서 제조된 콜라겐을 아세트 산과 증류수(DI water) 용액 0.1㎖에 용해시켜 0.5 wt%의 농도를 갖는 방사액을 시스부 방사액으로 이용하고, 한편 폴리카프로락톤을 DMF, DMSO, 아세톤 용액을 2.5:2.5:5 비율로 혼합한 20 ㎖에 용해시켜 15wt%의 농도를 갖는 방사액을 제조하여 코어부로 이용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 조건 하에서 세포 배양용 지지체를 제조하였다.
2. 세포 부착 및 배양 실험
상기 1.에서 각각 제조된 세포 배양용 지지체를 이용하여, 세포를 배양하고 그 결과를 확인하였다.
실험예 1
폐암 상피세포(Lung cancer epithelial cells)(도 2(a)) 및 제대정맥 내피세포(HUVECs: human umbilical vein endothelial cells)(도 2(b))를 실시예 1의 지지체에 각각 세포를 동시 배양을 한 후, 두 지지체를 접합하여 4일동안 공배양을 한 후, 두 지지체를 분리하여 각 세포를 70% 에탄올을 사용하여 -20도에서 1시간 동안 세포를 지지체에 유지시켰다. 지지체를 30분 내 각각 1xDPBS로 3회 세척하였고, DAPI 핵 염색액을 지지체 첨가하였다. 지지체를 1시간 동안 암실에서 배양하고, 30분 동안 1xDPBS 용액으로 3회 세척하고 공 초점 현미경을 사용하여 이미지를 획득 하였다.
그 결과, 도 2에서 확인 할수 있는 바와 같이 두 번의 동일한 조건에서 실험을 수행한 결과 내피 세포와 상피 세포의 공배양이 원활하게 이루어진 것을 확인 할 수 있었다.
실험예 2
한편, 실시예 1의 지지체를 이용하여 폐암 상피세포(Lung cancer epithelial cells)를 세포배양 첫날과 배양 4일 후 도립현미경(Inverted microscope) 로 확인하여 도 4(b)에 나타내었으며, 도 4(b)에서 나타난 바와 같이, 세포 배양이 원활하게 수행된 것을 확인할 수 있었다.
실험예 3
실시예 1의 지지체를 이용하여 유방암 상피세포(MCF-7, breast cancer epithelial cell)를 배양 첫날과 배양 4일 후 도립현미경(Inverted microscope) 로 확인한 결과 도 3(b) 과 같이 세포 배양이 잘 이루어 진 것을 확인할 수가 있었다.
비교실험예 1
비교예 3의 포어 사이즈가 10 um 인 지지체를 이용하여 제대정맥 내피세포(HUVECs: human umbilical vein endothelial cells)를 세포배양 첫날과 배양 4후, 도립현미경(Inverted microscope)과 공 초점 현미경(Confocal microscopy)으로 확인하여 도 4(a)에 나타내었으며, 도 4(a)에서 나타난 바와 같이, 세포의 부착 및 배양이 이루어지지 않는 것을 확인할 수 있었다.
비교실험예 2
비교예 1의 지지체를 이용하여 유방암 상피세포(MCF-7, breast cancer epithelial cell)를 세포배양 첫날과 배양 4일 후, 도립현미경(Inverted microscope)으로 확인한 결과, 도 3 (a)에 나타난 바와 같이 세포의 부착 및 배양이 이루어지지 않는 것을 확인할 수 있었다.
비교실험예 3
비교예 3의 지지체를 이용하여 HK-2 콩팥 상피세포(HK-2 kidney epithelial cells)를 인큐베이터에서 37도, 5% CO2, 48시간 동안 배양하고 도립현미경(Inverted microscope)과 공 초점 현미경(Confocal microscopy)으로 확인하여 도 5(a)에 나타내었다. 세포의 부착 및 배양이 이루어지지 않는 것을 확인할 수 있었다.
비교실험예 4
비교예 3의 지지체를 이용하여 제대정맥 내피세포(HUVECs: human umbilical vein endothelial cells)를 인큐베이터에서 37도, 5% CO2, 48 시간 동안 배양하고 도립현미경(Inverted microscope)과 공 초점 현미경(Confocal microscopy)으로 확인하여 도 5(b)에 나타내었다. 세포의 부착 및 배양이 이루어지지 않는 것을 확인할 수 있었다.
비교실험예 5
비교예 4의 지지체를 이용하여 유방암 상피세포(MCF-7, breast cancer epithelial cell)를 세포배양 48시간 후, 도립현미경(Inverted microscope)로 확인하여 도 6(a)에 나타내었다. 그 결과 세포 배양이 원활하게 이루어지지 않는 것을 확인할 수 있었다.
비교실험예 6
비교예 5 의 지지체를 이용하여 유방암 상피세포(MCF-7, breast cancer epithelial cell)를 세포배양 48시간 후 도립현미경(Inverted microscope)로 확인하여 도 6(b)에 나타내었다. 그 결과 세포 배양이 원활하게 이루어지지 않는 것을 확인할 수 있었다.
3. 인공 생체막의 제조
상기 실험예 1 및 실험예 2에서 수행한 공정과 동일하게, 실시예 1의 지지체를 이용하여 일 영역에는 폐암 상피세포(Lung cancer epithelial cells)를 인큐베이터에서 37도, 5% CO2, 48 시간 동안 배양하고 이와 동시에 동일한 지지체를 이용하여 다른 영역에는 제대정맥 내피세포(HUVECs: human umbilical vein endothelial cells)를 인큐베이터에서 37도, 5% CO2, 48 시간 동안 배양하였다.
내피 세포와 상피 세포의 배양이 완료된 후에는 상기 일 영역과 타 영역 사이의 지지체 하부에 직경 2 내지 5 mm, 길이 10 cm 의 스테인레스 재질의 막대를 배치하고, 이를 상부로 들어올려 내피 세포가 배양된 지지체와 상피 세포가 배양된 지지체가 각각의 세포층이 외부를 향하도록 배치되어 적층된 형태를 획득하였다. 이때 접촉된 지지체는 끝 단에서 누르는 압력에 의해 서로 접합하였다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

Claims (13)

  1. 폴리카프로락톤으로 이루어진 코어부 및 콜라겐으로 이루어진 시스(sheath) 부의 이중층 나노 섬유로 이루어지며, 상기 나노섬유의 직경은 50nm 내지 300nm이고, 상기 나노섬유의 코어부의 직경은 전체 나노섬유 직경의 60 내지 80%인 나노섬유가 2μm 내지 10μm 미만의 평균 포어 사이즈를 갖는 네트워크를 형성하는 지지체;
    상기 지지체의 일 면에 형성된 내피 세포층; 및
    상기 지지체의 타 면에 형성된 상피 세포층
    을 포함하는, 인공 생체막.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인공 생체막은 내피 세포가 배양된 지지체와 상피 세포가 배양된 지지체가 각각의 세포층이 외부를 향하도록 배치되어 적층된, 인공 생체막.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 지지체는 5 내지 500μm의 평균 두께를 갖는, 인공 생체막.
  7. 제1항에 있어서, 상기 내피 세포층의 내피 세포 및 상기 상피 세포층의 상피 세포는 각각의 지지체에 5,000 내지 20,000 세포 수 범위로 세포가 분주된, 인공 생체막.
  8. 폴리카프로락톤으로 이루어진 코어부 및 콜라겐으로 이루어진 시스(sheath) 부의 이중층 나노 섬유로 이루어지며, 상기 나노섬유의 직경은 50nm 내지 300nm이고, 상기 나노섬유의 코어부의 직경은 전체 나노섬유 직경의 60 내지 80%인 나노섬유가 2μm 내지 10μm 미만의 평균 포어 사이즈를 갖는 네트워크를 형성하는 지지체의 일 영역에 내피 세포를 배양하는 단계;
    상기 내피 세포를 배양하는 단계와 동시에, 콜라겐 및 폴리카프로락톤을 포함하는 나노섬유가 네트워크를 형성하는 지지체의 타 영역에 상피 세포를 동시 배양하는 단계; 및
    내피 세포가 배양된 지지체와 상피 세포가 배양된 지지체를 각각 세포가 배양된 세포층이 외부를 향하도록 배치하여 적층하는 단계
    를 포함하는, 내피 및 상피 세포가 동시배양된 인공 생체막의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 일 영역과 타 영역은 단일 지지체 상에서 이격된 영역인, 인공 생체막의 제조방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 일 영역과 타 영역은 일 영역과 타 영역 사이의 임의의 직선을 기준으로 대칭이 되도록 형성되는, 인공 생체막의 제조방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 적층하는 단계는 내피 세포가 배양된 지지체와 상피 세포가 배양된 지지체를 각각 세포가 배양된 세포층이 외부를 향하도록 배치하고 지지체를 서로 접합하여 수행되는, 인공 생체막의 제조방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 적층하는 단계는 일 영역과 타 영역 사이에 형성된 임의의 직선을 기준으로 내피 세포가 배양된 지지체와 상피 세포가 배양된 지지체를 각각 세포가 배양된 세포층이 외부를 향하여 대칭이 되도록 배치하여 수행되는, 인공 생체막의 제조방법.
  13. 내피 세포를 배양하는 일 영역 및 임의의 직선을 기준으로 상기 일 영역과 대칭으로 배치된 상피 세포를 배양하는 타 영역을 포함하며, 콜라겐 및 폴리카프로락톤을 포함하는 나노섬유가 네트워크를 형성하는 지지체;
    상기 임의의 직선 위치의 지지체 하부에 배치된 이동 막대;
    상기 일 영역의 내피 세포를 배양하기 위한 제1 세포 배양 접시; 및
    상기 타 영역의 상피 세포를 배양하기 위한 제2 세포 배양 접시
    를 포함하며, 상기 이동 막대는 상하 이동의 수행이 가능한, 인공 생체막의 제조장치.
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