BR122019012478B1

BR122019012478B1 - método para produção de um indicador de esterilização

Info

Publication number: BR122019012478B1
Application number: BR122019012478-7A
Authority: BR
Inventors: Phillip P. Franciskovich; Tricia A. Cregger
Original assignee: American Sterilizer Company
Priority date: 2010-07-20
Filing date: 2011-06-16
Publication date: 2021-01-26
Also published as: AU2011280113A1; ES2524890T3; JP2015037432A; WO2012012055A3; ES2606309T3; JP2013530723A; EP2596120B1; EP2746401B1; MX2013000654A; US9012173B2; CN104263805B; CA2962159C; CN103119173B; CA2805166A1; US20120021406A1; AU2014224078B2; CA2962159A1; EP2746401A3; EP2746401A2; AU2011280113B2

Abstract

A presente invenção refere-se a um método de monitoramento de processos de esterilização. O método compreende: (A) exposição de um artigo a ser esterilizado e um indicador biológico a um meio de esterilização durante um processo de esterilização, em que o indicador biológico compreende uma célula com membrana de plasma; e (B) medição do potencial de membrana da célula para detectar a viabilidade da célula.

Description

Referência Cruzada a Pedido Relacionado

[001] O presente pedido refere-se ao Pedido Provisório Norte-Americano n° 61/355.307, com data oficial de depósito de 20 de julho de 2010, que é integralmente incorporado ao presente como referência, e reivindica o seu benefício com base em 35 U. S. C. §119 (e). Campo da Técnica

[002] A presente invenção refere-se a um método de monitoramento de processos de esterilização. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um método de monitoramento de processos de esterilização em que um indicador biológico que compreende uma célula com uma membrana de plasma é exposto ao meio de esterilização. O potencial de membrana do indicador biológico é medido em seguida para detectar a viabilidade da célula.

Antecedentes

[003] É comum empregar indicadores biológicos tais como bactérias em processos de esterilização para determinar se um artigo a ser esterilizado foi exposto a um nível eficaz do(s) ingrediente(s) ativo(s) do esterilizante. Podem ser utilizados indicadores biológicos para fornecer a garantia de que as condições de esterilização são atendidas no interior do processador ou na própria carga processada. Podem ser utilizados indicadores biológicos para representar o pior caso do sistema de processamento, fornecendo uma quantidade extremamente grande de organismos altamente resistentes àquele processo específico no indicador ou sobre ele. Esporos são frequentemente utilizados como organismo selecionado para o monitoramento desses processos de esterilização. Tipicamente, os usuários de indicadores biológicos dependem dos efeitos visíveis que se seguiriam à multiplicação de qualquer organismo viável sobrevivente para determinar a eficácia do processo de esterilização no qual são empregados os indicadores biológicos. Este processo pode levar de horas a dias para produzir uma alteração visível tal como turvação em um meio de incubação ou alteração de cor em um indicador de pH caso seja utilizado esse indicador.

[004] Foram propostos indicadores biológicos que correlacionam a atividade de uma enzima termoestável endógena (derivada internamente, previamente existente) dentro de um revestimento de esporo com a viabilidade real do organismo. Isso resultou em tempos de leitura biológica que variam de minutos até horas com um fluorômetro ou colorímetro. Embora esses indicadores biológicos forneçam correlação entre a atividade da enzima e a viabilidade do organismo, os resultados reais obtidos devem-se inteiramente à atividade da enzima e não possuem ligação direta com a viabilidade do organismo.

[005] Foram propostos indicadores biológicos que correlacionam a atividade de uma enzima exógena (derivada externamente, não existente previamente) que é produzida mediante indução química de um gene recombinante caso sejam organismos de teste viáveis presentes após o evento de esterilização em avaliação que contêm aquele gene. Isso fornece tempos de leitura biológica que variam de minutos até horas com leitura fluorométrica e fornece ligação direta com a viabilidade do organismo.

Resumo da Invenção

[006] Um problema com essas tecnologias anteriores refere-se ao fato de que o estado da técnica dependeu, na maior parte, do crescimento e divisão de organismos ou da presença de atividade enzimática para detectar a viabilidade. O crescimento e a divisão de organismos podem levar horas até dias para serem detectados. A atividade enzimática pode levar minutos até horas para gerar sinais suficientemente altos para detecção fluorométrica ou colorimétrica. Desta forma, existe a necessidade de um método para atingir resultados rápidos que sejam tão definitivos quanto aqueles que são atingidos utilizando métodos de crescimento e divisão. A presente invenção fornece uma solução para este problema.

[007] A presente invenção refere-se a um método que compreende: (A) exposição de um artigo a ser esterilizado e um indicador biológico a um meio de esterilização durante um processo de esterilização, em que o indicador biológico compreende células com membranas de plasma; e (B) medição do potencial de membrana das células processadas de detectar qualquer viabilidade restante dentro da população de células após o término do processo de esterilização. Essa viabilidade pode ser exemplificada, sem limitações, pelas alterações de potencial de membrana associadas a eventos de fluxo de íons ou à germinação dos esporos indicadores.

[008] A presente invenção refere-se a um indicador de esterilização que compreende um material condutor de eletricidade posicionado sobre um substrato e um indicador biológico (tal como esporos) posicionado sobre o material condutor de eletricidade, no todo ou em parte.

[009] A presente invenção refere-se a um método de elaboração de um indicador de esterilização que compreende: depósito de um material condutor de eletricidade sobre um substrato (utilizando, por exemplo, um método de impressão conforme exemplificado, mas sem limitações, por impressão a jato de tinta) e depósito de um indicador biológico (tal como esporos) sobre o material condutor de eletricidade, no todo ou em parte, utilizando, por exemplo, uma impressora a jato de tinta. Breve Descrição das Figuras - A Fig. 1 é uma plotagem que exibe as potenciais alterações de membrana para os esporos testados no Exemplo 1. - A Fig. 2 é uma ilustração esquemática de um polarizador de fluorescência. - A Fig .3 é uma ilustração esquemática de um indicador biológico utilizado em conjunto com o monitoramento eletrônico de germinação. - As Figs. 4 e 5 são ilustrações de indicadores biológicos alternativos para avaliação do potencial de membrana por meio de sinais elétricos. - A Fig. 6 é uma ilustração esquemática de um elemento inferior de uma realização elétrica de um indicador de esterilização de acordo com a presente invenção. - A Fig. 7 é uma ilustração esquemática de um elemento superior de uma realização elétrica de um indicador de esterilização de acordo com a presente invenção, tal como o da Fig. 6. - A Fig. 8 é uma vista plana superior esquemática de uma camada de vedação superior para uso com uma realização da presente invenção, tal como as das Figs. 4 e 7. - A Fig. 9 é uma vista plana superior esquemática de um elemento inferior 700 de outra realização da presente invenção, que é uma realização com base fluorescente de um indicador de esterilização. - A Fig. 10 é uma vista frontal esquemática de um leitor para uso com uma versão com base eletrônica de um indicador de esterilização de acordo com uma realização da presente invenção, em conjunto com vistas frontais e traseiras de um exemplo de cartão eletrônico indicador de esterilização. - As Figs. 11A e 11B são vistas frontais esquemáticas de um leitor para uso com uma versão com base em fluorescência de um indicador de esterilização de acordo com uma realização da presente invenção, em posição fechada e aberta, respectivamente. - A Fig. 12 é uma vista em perspectiva esquemática de componentes internos de um leitor de fluorescência tal como o da Fig. 11, em conjunto com vistas frontal e traseira de um exemplo de cartão indicador da esterilização com base em fluorescência. - A Fig. 13 é uma vista frontal esquemática de um leitor para uso com um indicador biológico autocontido FABI.

Descrição Detalhada

[0010] O termo “esterilização” refere-se a tornar uma substância incapaz de reprodução, metabolismo e/ou crescimento. Embora isso seja frequentemente considerado como indicando total ausência de organismos vivos, o termo pode ser utilizado no presente para indicar uma substância livre de organismos vivos até um grau previamente definido ou determinado como sendo aceitável. A menos que indicado em contrário, o termo esterilização pode ser empregado no presente para também indicar métodos e procedimentos menos rigorosos que esterilização, tais como desinfecção, sanitização e similares.

[0011] Os processos e aparelhos descritos no presente podem ser utilizados nos campos de cuidado com a saúde, campos científicos e similares. Estes podem ser empregados em aplicações comerciais e industriais, nas quais podem ser desejadas esterilização, desinfecção, sanitização, descontaminação, limpeza e similares. As aplicações comerciais e industriais podem incluir processos tais como processamento de alimentos, pasteurização, remediação de solo, remediação de água e similares.

[0012] O processo de esterilização com o qual pode ser utilizado o método de acordo com a presente invenção pode compreender qualquer processo de esterilização. O processo de esterilização pode incluir processos de esterilização nos quais o meio de esterilização ou esterilizante pode compreender vapor, calor seco, radiação e plasma, bem como um ou mais esterilizantes gasosos, um ou mais esterilizantes líquidos e similares. Os processos com base em radiação utilizados podem compreender um feixe de elétrons ou qualquer espectro eletromagnético, incluindo radiação de ionização, luz ultravioleta ou branca pulsada, micro- ondas e similares. A radiação pode compreender radiação gama ou beta. Os esterilizantes gasosos podem compreender óxido de etileno, peróxido de hidrogênio gasoso e similares. Os esterilizantes líquidos podem compreender formalina (gás formaldeído dissolvido em água e contendo opcionalmente metanol para inibir a formação de substâncias tóxicas), glutaraldeído, ácido peracético, peróxido de hidrogênio líquido e similares. O indicador biológico pode ser utilizado para examinar a letalidade de esterilizantes contra qualquer micro-organismo com menos resistência ao processo de esterilização que o organismo de teste fornecido com o indicador biológico. Esses micro-organismos podem incluir bactérias tais como Escherichia coli, Legionella sp, Campylobacter sp e outras bactérias entéricas, bem como espécies de Staphylococcus e Streptococcus e outros micro-organismos patogênicos humanos, tais como Cryptosporidium. O indicador biológico pode compreender um ou mais organismos de teste. O organismo de teste pode compreender qualquer célula com membrana de plasma cuja resistência ao processo de esterilização pretendido exceda a de outros organismos que o processo de esterilização destine-se a destruir. O tipo de organismo de teste utilizado como indicador biológico pode ser dependente de uma série de fatores exemplificados, mas sem limitações, pelo tipo de processo de esterilização sendo empregado. O organismo de teste pode ser um micro-organismo. As linhagens que podem ser utilizadas podem ser aquelas que são as mais resistentes ao processo empregado para esterilização. O micro-organismo de teste pode compreender bactérias. Os microorganismos bacterianos podem ser aqueles que formam endoesporos, ou seja, esporos bacterianos. O organismo de teste pode compreender bactérias dos gêneros Bacillus ou Clostridia. O organismo de teste pode incluir Geobacillus stearothermophilus, Bacillus atrophaeus, Bacillus subtilis, Bacillus sphaericus, Bacillus anthracis, Bacillus pumilus, Bacillus coagulans, Clostridium sporogenes, Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Bacillus subtilis globigii, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Escherichia coli ou uma mistura de dois ou mais destes.

[0013] O organismo de teste pode compreender fungos, micobactérias, protozoários, bactérias vegetais, células vegetais e/ou seus componentes e similares. Exemplos de fungos que podem ser utilizados podem incluir Aspergillus niger, Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes, Wangiella dermatitis e similares. Exemplos de micobactérias que podem ser utilizadas podem incluir Mycobacterium chelonae, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium terrae e similares. Exemplos de protozoários que podem ser utilizados podem incluir Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum e similares. Exemplos de bactérias vegetais que podem ser utilizadas podem incluir Aeromonas hydrophila, Enterococcus faecalis, Streptococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus pyrogenes, Escherichia coli, Klebsiella (pneumoniae), Legionella pneumophila, Methylobacterium, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella choleraesuis, Helicobacter pylori, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Stenotrophomonas maltophilia e similares. Organismos tais como Geobacillus stearothermophilus, Bacillus atrophaeus, Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Clostridium sporogenes e similares podem ser utilizados para determinar a eficácia da esterilização a quente úmida (autoclave), em que Geobacillus stearothermophilus é especialmente útil.

[0014] O organismo de teste pode compreender Aspergillus niger, Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes, Wangiella dermatitis, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium terrae, Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum, Aeromonas hydrophila, Enterococcus faecalis, Streptococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus pyrogenes, Escherichia coli, Klebsiella (pneumoniae), Legionella pneumophila, Methylobacterium, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella choleraesuis, Helicobacter pylori, Micrococcus radiodurans, Deinococcus radiodurans, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Stenotrophomonas maltophilia ou uma mistura de dois ou mais destes.

[0015] Além dos organismos de teste selecionados com base na sua aceitação como representando o organismo mais resistente (tal como Geobacillus stearothermophilus e Bacillus atropheaus), o indicador biológico pode compreender adicionalmente agentes de bioterrorismo ou guerras biológicas, tais como Bacillus anthracis e similares. Esses organismos resistentes podem também compreender linhagens que se tornaram resistentes a meios anteriormente eficazes de tratamento antibiótico ou desinfecção química devido a modificações naturais ou feitas pelo homem. Exemplos do tipo anterior podem incluir VREs (enterococci resistente a vancomicina), MSRAs (Staphylococcus aureus resistente a meticilina), Mycobacterium cheloni e similares. Esses organismos resistentes podem ser desejáveis porque os VREs e MRSAs desenvolveram recentemente resistência a medidas de combate terapêutico (tais como resistência a antibióticos) e M. cheloni desenvolveu resistência a alguns modos de desinfecção (tal como resistência a glutaraldeído) e, desta forma, fornecem organismos de teste apropriados como modelos de “pior caso”.

[0016] Em organismos viáveis tais como bactérias, desenvolve-se um potencial elétrico através da membrana de plasma da célula. Esse potencial de membrana desempenha um papel vital nas forças próton-motoras de organismo necessárias para atividades tais como a geração de trifosfato de adenosina (ATP), quimiotaxia, transporte de glicose e sobrevivência do organismo sob baixo pH. O estabelecimento de um potencial de membrana é um dos primeiros eventos que têm lugar quando um organismo começa a germinar ou reagir de outra forma a alterações do ambiente. O estabelecimento de um potencial de membrana permite que a célula troque material/informações com o seu ambiente. Desta forma, ao medir o potencial de membrana, o método de acordo com a presente invenção fornece leitura rápida ou instantânea sobre a viabilidade celular.

[0017] O potencial de membrana em organismos viáveis e metabolizadores ativos pode ser alto e células com alto potencial de membrana são frequentemente denominadas energizadas ou hiperpolarizadas. Organismos inviáveis e organismos dormentes podem exibir potencial de membrana baixo a zero e frequentemente são denominados desenergizados ou despolarizados.

[0018] O método de acordo com a presente invenção pode depender de alterações do potencial de membrana que ocorrem mediante germinação e crescimento do organismo de teste como meios de detecção da viabilidade do organismo de teste. Quando um organismo viável for colocado em condições que favoreçam a germinação e o crescimento, o potencial de membrana do organismo pode mudar. Se, por outro lado, o organismo não for viável, ele seria incapaz de germinar e não haveria mudança do seu potencial de membrana.

[0019] O indicador biológico pode compreender um indicador biológico geneticamente elaborado que pode compreender adicionalmente um gene relator apropriado para aumentar o potencial de membrana absorvido por um organismo de teste (tal como um micro-organismo bacteriano) utilizando um veículo apropriado (tal como plasmídeo ou vírus). A expressão do gene relator pode ser ativamente bloqueada por um gene repressor. A expressão do gene relator pode permanecer bloqueada até que o gene repressor seja exposto a um indutor que pode estar presente em um meio de recuperação. O organismo de teste para uso em um indicador biológico geneticamente elaborado pode compreender qualquer um dos organismos de teste descritos acima. Em uma realização, o organismo de teste não será exposto ao indutor até o término do processo de esterilização e, consequentemente, a enzima indicadora não existirá antes da esterilização nem durante ela. O que pode ser exposto ao processo de esterilização são os diversos mecanismos vitais utilizados pelo organismo de teste para sobreviver e crescer e que também são empregados para a produção da enzima indicadora. Estes podem incluir as polimerases de DNA utilizadas para o crescimento celular (e reprodução do plasmídeo), polimerases de RNA para transcrição das necessidades metabólicas dos organismos de teste (e o gene relator contido em vírus ou plasmídeo) e os polissomos ribossomais necessários para a tradução de proteínas celulares (bem como a expressão da enzima indicadora e/ou mecanismos de transporte de íons).

[0020] Existem duas classes principais de tinturas fluorescentes de potencial de membrana, em que cada classe difere no seu método de ligação à célula. A primeira classe de tinturas de potencial de membrana, carbocianinas, pode acumular-se sobre membranas hiperpolarizadas e pode ser translocada para a bicamada de lipídios. Uma carbocianina útil é iodeto de 3,3’-di-hexiloxacarbocianina [DiOC6(3)]. A segunda classe de tinturas de potencial de membrana que pode ser utilizada compreende os oxonóis. As tinturas de oxonol podem entrar em células despolarizadas e ligar-se a membranas ou proteínas intracelulares. Uma tintura de oxonol útil é trimetina oxonol de ácido (bis)-1,3-dibutilbarbitúrico [DiBAC4(3)]. Com tinturas de carbocianina, a fluorescência pode aumentar com o tempo e potencial de membrana, enquanto, com as tinturas de oxonol, a fluorescência pode cair com o tempo e potencial de membrana reduzido. A presença ou ausência de um potencial de membrana pode ser diretamente associada em seguida à fluorescência ao longo do tempo.

[0021] O meio de incubação pode ser indicado como um meio de crescimento ou meio de recuperação. O meio de incubação pode apresentar-se na forma de sólido ou líquido. O meio de incubação pode compreender uma solução aquosa tamponada específica, de tal forma que o indicador biológico possa ser mais sensível a alterações de pH, potenciais redox, atividade enzimática e similares.

[0022] O indicador de esterilização pode ser utilizado em qualquer processo em que o indicador de esterilização seja exposto a um meio de esterilização durante um processo de esterilização e, em seguida, a recuperação e indução. O meio de incubação pode compreender uma ou mais fontes de nutrientes. A fonte de nutriente pode ser utilizada para fornecer energia para o crescimento de qualquer um dos organismos de teste que podem sobreviver ao processo de esterilização. Exemplos das fontes de nutrientes podem incluir a digestão pancreática de caseína, digestão enzimática de massa de soja, sacarose, dextrose, extrato de levedura, L-cistina e mistura de dois ou mais destes. Um indicador do crescimento microbiano, que muda de coloração ou estado nativo, na presença de organismos de teste viáveis, pode ser utilizado com o meio de incubação.

[0023] Os meios de incubação (recuperação/indução) podem conter, por exemplo, uma tintura de potencial de membrana ou tintura sensível à voltagem. O uso desses indicadores de crescimento microbiano pode resultar em alteração da fluorescência em resposta a um fenômeno de crescimento de micro-organismos, tal como alterações do pH, potenciais de redução da oxidação e atividade enzimática, bem como outras indicações de crescimento.

[0024] O meio de incubação pode compreender adicionalmente um ou mais tampões de pH, um ou mais neutralizadores, um ou mais agentes de manutenção do equilíbrio osmótico ou uma mistura de dois ou mais destes. Os tampões de pH podem incluir K2HPO4, KH2PO4, (NH4)2HPO4, 2,2-bis(hidroximetil)-2,2’,2”-nitrilotrietanol (bis tris), 1,3-bis[tris(hidroximetil)- metilamino]propano (bis-tris propano), ácido 4-(2-hidroxietil)piperazinoetanossulfônico (HEPES), 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol (Trizma, base Tris), N- [tris(hidroximetil)metil]glicina (tricina), diglicina (Gly-Gly), N,N-bis(2-hidroxietil)glicina (bicina), ácido N-(2-15 acetamido)iminodiacético (ADA), ácido N-(2-acetamido)-2- aminoetanossulfônico (aces), ácido 1,4-piperazinodietanossulfônico (PIPES), ácido β- hidróxi-4-morfolinopropanossulfônico (MOPSO), ácido N,N-bis(2-hidroxietil)-2- aminoetanossulfônico (BES), ácido 3-(N-morfolino)propanossulfônico (MOPS), ácido 2-[(2- hidróxi-1,1-bis(hidroximetil)etil)amino]etanossulfônico (TES), ácido 3-[N,N-bis(2- hidroxietil)amino]-2-hidróxi-1-propanossulfônico (DIPSO), ácido 4-(N- morfolino)butanossulfônico (MOBS), ácido 2-hidróxi-3-[tris(hidroximetil)metilamino]-1- propanossulfônico (TAPSO), hidrato de ácido 4-(2-hidroxietil)piperazino-1-(2- hidroxipropanossulfônico (HEPPSO), di-hidrato de ácido (piperazino-1,4-bis)2- hidroxipropanossulfônico (POPSO), ácido 4-(2-25 hidroxietil)-1-piperazino propanossulfônico (EPPS), ácido N-(2-hidroxietil)-piperazino-N’-(4-butanossulfônico) (HEPBS), ácido [(2-hidróxi-1,1-bis(hidroximetil)etil)amino]-1-propanossulfônico (TAPS), 2- amino-2-metil-1,3-propanodiol (AMPD), ácido N-tris(hidroximetil)metil-4- aminobutanossulfônico (TABS), ácido N-(1,1-dimetil-2-hidroxietil)-3-amino-2- hidroxipropanossulfônico (AMPSO), ácido 2-(ciclo-hexilamino)etanossulfônico (CHES), ácido 3-(ciclo-hexilamino)-2-hidroxil-1-propanossulfônico (CAPSO), 2-amino-2-metil-1-propanol (AMP), ácido 3-(ciclo-hexilamino)-1-propanossulfônico (CAPS), ácido 4-(ciclo-hexilamino)-1- butanossulfônico (CABS), hidrato de ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico (MES), ácido N- (2-acetamido)-2-aminoetanossulfônico (ACES) e misturas de dois ou mais destes.

[0025] Os neutralizadores podem incluir, mas sem limitações, tioglicolato de sódio, tiossulfato de sódio, catalase, bissulfato de sódio, bissulfato de sódio lecitina, polissorbato 20, polissorbato 80, bicarbonato de cálcio e misturas de dois ou mais destes.

[0026] Os agentes de manutenção do equilíbrio osmótico podem incluir sais de sódio, sais de potássio, sais de magnésio, sais de manganês, sais de cálcio, outros sais, tais como de metais de transição, cloreto de sódio, cloreto de potássio, sulfato de magnésio, cloreto de ferro e misturas de dois ou mais destes.

[0027] Em uma realização, o meio de incubação compreende uma composição aquosa que compreende: água; cerca de 0,01 a cerca de 100 gramas por litro de água (g/l) e, em uma realização, cerca de 0,1 a cerca de 50 g/l, de uma ou mais fontes de nutrientes; cerca de 1,0 x 10-5 a cerca de 1,0 g/l e, em uma realização, cerca de 1,0 x 10-4 a cerca de 1,0 g/l de um ou mais indicadores do crescimento microbiano; até cerca de 5000 g/l, em uma realização, cerca de 0,001 a cerca de 5000 g/l e, em uma realização, cerca de 0,1 a cerca de 1000 g/l de um ou mais tampões de pH; até cerca de 100 g/l, em uma realização cerca de 0,01 a cerca de 100 g/l e, em uma realização, cerca de 0,1 a cerca de 50 g/l de um ou mais neutralizadores; até cerca de 50 g/l, em uma realização cerca de 0,1 a cerca de 50 g/l e, em uma realização, cerca de 0,1 a cerca de 25 g/l de um ou mais agentes de manutenção do equilíbrio osmótico.

[0028] O meio de incubação pode compreender um caldo de nutrientes, caldo neutralizador D/E, meio mínimo de Davis, caldo de teste de esterilidade, bem como qualquer mistura de soja e caseína ou meio com base em extrato de carne de boi. Estes podem incluir uma solução aquosa de caldo de mistura de soja e caseína, tioglicolato fluido e triptona dextrose (Difco Laboratories, Inc.). Pode ser utilizada uma base de caldo de soja tríptico modificada, sem glicose. Pode também ser adicionada uma tintura de potencial de membrana ou tintura sensível à voltagem.

[0029] Um exemplo de meio de incubação que pode ser utilizado é Caldo de Soja Tríptico Bacto® que contém digestão pancreática de caseína (17,0 g/l), digestão enzimática de massa de soja (3,0 g/l), cloreto de sódio (5,0 g/l), fosfato dipotássico (2,5 g/l) e dextrose (2,5 g/l). Estes ingredientes podem ser dispersos ou dissolvidos em água. As concentrações expressas em termos de g/l indicam gramas de ingrediente por litro de água. A digestão pancreática de caseína, digestão enzimática de massa de soja e dextrose fornecem fontes de energia para o crescimento do micro-organismo. Estas podem ser indicadas como fontes de nutrientes. Pode-se utilizar cloreto de sódio para manter equilíbrio osmótico no meio líquido. Fosfato dipotássico pode agir como tampão de pH. DiOC6(3), por exemplo, que é uma tintura de potencial de membrana, pode ser adicionado (3 μg/l) à formulação de Caldo de Soja Tríptico Bacto®.

[0030] O meio de incubação pode compreender uma formulação muito básica que pode servir apenas para aumentar os eventos de fluxo de íons e/ou iniciar a germinação de esporos.

[0031] Este meio pode compreender aminoácidos, sais e/ou açúcares. Exemplos de aminoácidos incluem L-alanina, L-leucina, L-cisteína, L-valina, L-lactato, L-treonina, ácido L- tartárico, ácido fólico, L-tirosina, L-prolina e asparagina. Exemplos de sais são cloreto de sódio e cloreto de potássio. Exemplos de açúcares incluem glicose, sacarose, frutose e xilose. Eventos de fluxo de íons adicionais ou eventos de germinação podem ser acionados por componentes encontrados no sobrenadante de organismos em crescimento, tais como peptidoglicano e muropeptídeos.

[0032] Tinturas de potencial de membrana são fluorescentes e, portanto, o método de detecção selecionado deve possuir a capacidade de diferenciar entre a fluorescência das moléculas de tintura que são unidas no interior da membrana e a fluorescência de moléculas de tintura livres. Dois métodos particularmente apropriados para diferenciar entre as emissões de fluorescência e essas duas fontes são a polarização de fluorescência (também conhecida como anisotropia de fluorescência e métodos com base em transferência de energia de ressonância de fluorescência (com base em FRET), incluindo FRET resolvido ao longo do tempo.

[0033] Polarização de fluorescência é um método de detecção que depende de alterações do tamanho aparente de uma molécula fluorescente para detecção. Medições de polarização podem ser baseadas no princípio de excitação seletiva de fluoroforos por luz polarizada. Fluoroforos possuem momentos de transição para absorção e emissão que repousam ao longo de orientações específicas com relação aos eixos moleculares do fluoroforo e preferencialmente absorverão fótons cujos vetores elétricos são alinhados paralelamente a esses momentos de transição. Em uma solução isotrópica, os fluoroforos podem ser orientados aleatoriamente. Mediante excitação com luz polarizada, essas moléculas de fluoroforo cujo dipolo de transição de absorção é paralelo ao vetor elétrico da excitação podem ser preferencialmente excitadas. Essa excitação seletiva pode resultar em uma população parcialmente orientada de fluoroforos e resulta adicionalmente em uma emissão de fluorescência parcialmente polarizada. A emissão também ocorre com a luz polarizada ao longo de um eixo fixo no fluoroforo. Polarização de fluorescência pode excitar moléculas com luz polarizada plana. A luz emitida pode ser medida na posição polarizada plana inicial e em uma posição compensada da luz polarizada plana, normalmente compensada em 90°. Caso o vetor elétrico da luz de excitação seja polarizado plano verticalmente, a luz emitida pode ser medida nas posições vertical e horizontal. Fluoroforos que são “alinhados” com o vetor elétrico da luz de excitação preferencialmente absorverão a luz. A luz emitida pode ser medida em seguida na posição polarizada horizontalmente e na posição polarizada verticalmente. A polarização pode ser expressa como razão das intensidades de luz e é uma medida da extensão da rotação molecular durante o período entre a excitação e a emissão. Moléculas pequenas podem girar mais rapidamente e teriam valor de polarização intrínseca mais baixo que moléculas maiores. Moléculas maiores, por outro lado, podem girar menos e, portanto, possuem valor de polarização intrínseca mais alto. Utilizando polarização de fluorescência, pode ser possível diferenciar entre tinturas de potencial de membrana unidas e tinturas de potencial de membrana não unidas.

[0034] Um incubador/leitor com base em polarização de fluorescência pode ser projetado conforme exibido na Fig. 2. A Fig. 2 é uma ilustração esquemática de um polarizador de fluorescência. Com referência à Fig. 2, o incubador/leitor 100, que proporciona o teste da amostra 110, inclui fonte de luz monocromática 120, divisor de feixe 130 e polarizadores 140, 150 e 160. A luz monocromática da fonte de luz monocromática 120 passa através do polarizador 140, de tal forma que toda a luz de excitação seja polarizada. Essa luz polarizada excita preferencialmente em seguida apenas as moléculas da amostra 110 que se encontram no mesmo estado de polarização do filtro. À medida que essas moléculas giram, elas se movem para fora da posição polarizada plana. A luz emitida é dividida pelo divisor de feixe 130. O divisor de feixe divide a luz e passa aproximadamente a metade da luz através do polarizador 150 orientado no mesmo plano da luz de excitação e a outra metade através do polarizador 160 orientado em um ângulo para a luz de excitação inicial. A luz passada através de cada polarizador 150 e 160 é medida e comparada.

[0035] Transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) é a transferência de energia de um fluoroforo doador inicialmente excitado para um fluoroforo receptor. O fluoroforo doador tipicamente emite em um comprimento de onda mais curto que se sobrepõe ao espectro de absorção do receptor. A transferência de energia de ressonância ocorre sem o aparecimento de fótons e é o resultado de interações entre dipolos de faixa longa entre os fluoroforos doador e receptor.

[0036] Para monitorar alterações do potencial de membrana com FRET, são necessários dois fluoroforos. O doador de FRET poderá ser qualquer fluoroforo que forneça espectro de absorção suficiente para o receptor. O fluoroforo receptor seria a tintura de potencial de membrana. Preferencialmente, o fluoroforo doador ligar-se-ia ou aderir-se-ia à parede de esporos, permitindo boa proximidade da tintura de potencial de membrana. Caso contrário, a opção de detecção de fluorescência (FRET) seria monitorada pelo mesmo tipo de fluorômetro descrito em outros pontos do presente e nos exemplos fornecidos.

[0037] Além das tinturas de potencial de membrana, tinturas de verificação de voltagem ou sensíveis à voltagem podem detectar as mesmas alterações do potencial de membrana de organismos utilizando ainda outro conjunto de princípios. O uso de tinturas sensíveis à voltagem para detecção de potencial de membrana é baseado no mecanismo físico conhecido como eletrocromismo. Os espectros de excitação e de emissão dessas tinturas exibem alterações significativas devido a alterações de voltagem. Essas alterações de espectro surgem de redisposições de carga que refletem alterações de potencial de membrana. A classe mais comumente utilizada de tinturas sensíveis à voltagem são as tinturas estiril, cujos exemplos específicos incluem propilsulfonato de di-8- butilaminonaftiletilenopiridínio (di-8-ANEPPS) e propilsulfonato de di-4- butilaminonaftiletilenopiridínio (di-4-ANEPPS).

[0038] O uso de tinturas sensíveis à voltagem em combinação com um método do tipo FRET permite a detecção fácil de alterações de potencial de membrana. À medida que ocorrem redisposições de carga na membrana de organismos germinativos tais como esporos, por exemplo, o comprimento de onda de emissão das tinturas sensíveis a voltagem começará a mudar. Essa mudança de comprimento de onda pode ser detectada por um segundo fluoroforo localizado no meio de cultivo. A emissão desse segundo comprimento de onda pode ser detectada pelo detector. O pico no espectro de excitação para de di-8-ANEPPS varia de 450 nm a 520 nm, por exemplo, dependendo das características de carga e voltagem. Isso resulta em uma mudança de pico correspondente no espectro de emissão de 530 nm para 640 nm. O fluorômetro/incubador pode ser projetado para excitar di-8- ANEPPS a 450 nm ou 520 nm e, em seguida, detectar um segundo fluoroforo que possui pico de excitação no pico de emissão correspondente do di-8-ANEPPS.

[0039] Um método de detecção alternativo para detecção de alterações do potencial de membrana é o uso de sinais eletrônicos. À medida que organismos tais como esporos começam a germinar, o potencial de membrana aumentará, permitindo maior fluxo de corrente e maiores quedas de voltagem, o que resulta em aumento do transporte de íons, que é observado na forma de aumento do fluxo de corrente, do potencial de membrana mais alto. Condutores eletrônicos podem ser colocados nos meios ou através/no meio de um substrato indicador biológico para medir eletricamente o potencial de membrana. Três projetos potenciais de indicadores biológicos que medem sinais elétricos são exibidos abaixo nas Figs. 3 a 5. Com referência à Fig. 3, um indicador biológico 200 é colocado em meios 202 que são contidos em um recipiente 204. Condutores eletrônicos 206 e 208 são colocados no meio 202 e utilizados para medir o potencial de membrana. Com referência à Fig. 4, são utilizados condutores eletrônicos 210 e 212 para medir o potencial de membrana através de um indicador biológico 214. Com referência à Fig. 5, são utilizados condutores eletrônicos 220 e 222 para medir o potencial de membrana em um indicador biológico 224.

[0040] O indicador de esterilização pode compreender um material condutor de eletricidade posicionado sobre um substrato (tal como um material condutor de eletricidade como um circuito de cobre formado sobre um substrato não condutor tal como silício) e um indicador biológico (tal como esporos) posicionado sobre o material condutor, no todo ou em parte. O indicador biológico (tal como esporos) e um circuito eletrônico ou padrão digital condutor que compreende um material condutor (tal como cobre) podem ser depositados, por exemplo, sobre um substrato não condutor (tal como um substrato de silício) utilizando uma impressora a jato de tinta tal como uma impressora Dimatix Materials DMP-2800 que é disponível por meio da Fuji Film. O circuito eletrônico ou padrão digital condutor pode ser depositado sobre o substrato utilizando qualquer padrão desejado. O indicador biológico pode ser depositado em seguida sobre o circuito eletrônico ou padrão digital condutor, no todo ou em parte, utilizando a impressora a jato de tinta. O indicador biológico pode ser disperso em um meio ou veículo líquido (tal como água) que pode ser depositado em seguida sobre o circuito eletrônico ou padrão digital, no todo ou em parte, com gotículas pequenas de até cerca de 5 picolitros ou cerca de 10 picolitros. Os volumes de esporos típicos podem ser de cerca de 3 picolitros por esporo.

[0041] O indicador biológico pode ser avaliado eletricamente por meio do monitoramento da voltagem (potencial), fluxo de corrente, resistência e/ou impedância à medida que começam a germinar organismos viáveis (tais como esporos). A seleção do método de medição determinará o projeto eletrônico. Uma vantagem inclui uma redução do tempo necessário para ler o indicador biológico. Como o método de detecção depende de uma das etapas iniciais do conjunto de eventos de germinação de organismos e não do crescimento natural ou enzimas relatoras específicas, o tempo de detecção pode ser grandemente reduzido.

[0042] A Fig. 6 é uma ilustração esquemática do elemento inferior 600 de uma versão eletrônica de um indicador de esterilização de acordo com uma realização da presente invenção, tal como exibido nas Figs. 4 e 5. A Fig. 6 exibe os elementos do elemento inferior 600 do indicador de esterilização com mais detalhes. O elemento inferior 600 inclui um material condutor de eletricidade 602, tal como uma monocamada de poliacrilamida e polianilina, posicionada sobre um substrato não condutor 604. O material condutor de eletricidade 602 pode incluir qualquer material apropriado, desde que o material seja apropriado para uso com as condições de esterilização com as quais o indicador de esterilização será utilizado. O substrato não condutor 604 pode ser qualquer material de substrato impermeável a líquido/gás apropriado tal como PET ou outro material apropriado que seja adequado para uso nas condições de esterilização com as quais será empregado o indicador de esterilização. Conforme exibido na Fig. 6, posicionada entre o material condutor 602 e a camada 604, encontra-se uma camada inferior condutora 606, que se encontra em comunicação elétrica com o material condutor 602 e o circuito de detecção. O circuito de detecção inclui uma série de pré-amplificadores de transistores em série 608, que são conectados eletricamente a conectores elétricos 610 e ao conector de terra 611. Os conectores elétricos 610 fornecem comunicação elétrica do elemento inferior 600 para um dispositivo leitor descrito abaixo. Os pré-amplificadores 608 fornecem amplificação em etapas de alterações da corrente elétrica que passa através do indicador de esterilização, conforme descrito com mais detalhes abaixo. Ao ter uma série de amplificadores, um sinal do cartão indicador biológico pode ser adequadamente amplificado sem a introdução de ruído excessivo. O circuito é completado pelo conector de terra 611.

[0043] Conforme exibido na Fig. 6, esporos 612 de um organismo de teste apropriado podem ser depositados ou embutidos na monocamada condutora 602. Os esporos 612 podem ser depositados na forma de esporos individuais ou múltiplos esporos. Os esporos 612 podem ser depositados, por exemplo, em uma mistura de poliacrilamida e tampão e, neste caso, o esporo é considerado estando dentro de uma “bolha” do material tampão, em que essa “bolha” é embutida em uma matriz tal como poliacrilamida. Alternativamente, os esporos 612 podem ser embutidos diretamente em uma camada, por exemplo, de polianilina.

[0044] Com referência agora à Fig. 7, que é uma vista plana superior de um elemento superior 614 para o indicador de esterilização, são exibidos detalhes adicionais desta realização da presente invenção. O lado do elemento superior 614 exibido na Fig. 7 é o lado que será frontal para a camada superior da estrutura exibida na Fig. 6 e ficará em contato com ela. O elemento superior 614 inclui uma membrana protetora impermeável a gás e líquido removível 616, sobre a qual é formada uma camada permeável a gás e vapor 618. Sobrepõe-se à camada permeável 618 uma camada condutora 620. Ao montar-se o indicador de esterilização, a camada condutora 620 estará em comunicação elétrica com os esporos 612 e qualquer material condutor circunvizinho tal como a monocamada condutora 602 também estará em comunicação elétrica com um conector 622 por meio do condutor 626. Conforme exibido na Fig. 7, o conector 622 é posicionado abaixo de uma almofada isolante 624. O conector 622, por meio do fio 626, completará o circuito elétrico formado pela camada condutora 620, os esporos 612, a camada inferior condutora 606, os pré- amplificadores 608 e os conectores 610. Alterações do fluxo de corrente através desse circuito elétrico serão utilizadas para detectar se quaisquer organismos de teste sobreviveram ao processo de esterilização no qual será utilizado o indicador de esterilização 600. Conforme exibido na Fig. 7, o elemento superior 614 inclui uma linha adesiva 628, por meio da qual o elemento superior 614 será fixado de forma vedante ao elemento inferior 600, de maneira a formar o indicador de esterilização de acordo com a presente realização.

[0045] Antes do uso do indicador de esterilização, a membrana protetora impermeável a gás e líquido 616 permanecerá no lugar para proteger o indicador de esterilização 600 contra exposição ao ambiente. Pouco antes do uso do indicador de esterilização em um processo de esterilização, a membrana 616 será removida para permitir que o meio de esterilização atinja os esporos 612 no indicador de esterilização.

[0046] A Fig. 8 é uma vista plana superior esquemática de uma camada de vedação superior 630 para uso com uma realização da presente invenção, tal como as das Figs. 4-7. Na realização exibida na Fig. 8, a vedação superior 630 inclui uma câmara cheia de fluido 632 que contém um indutor termicamente estável e meios para ativar e sustentar os esporos subjacentes 612. A câmara cheia com fluido 632 é conectada ao restante da camada de vedação superior 630 por uma zona de rompimento destacável 634, por meio da qual a câmara pode ser removida do restante da vedação superior 630. A vedação superior 630 inclui adicionalmente uma janela 636 que se comunica com a camada permeável de gás e líquido 618 do elemento superior 614. A vedação superior 630 inclui adicionalmente uma solda térmica 638 e uma zona adesiva protegida com película 640 para fixação da vedação superior 630 ao elemento superior 614. A solda térmica 638 fixa a câmara 632 ao elemento superior 630.

[0047] A Fig. 9 é uma vista plana superior esquemática de um elemento inferior 700 de outra realização da presente invenção, que é uma realização com base fluorescente de um indicador de esterilização. O indicador de esterilização exibido na Fig. 9 depende da fluorescência gerada por esporos em crescimento como indicação de sucesso ou fracasso do processo de esterilização.

[0048] Na realização ilustrada na Fig. 9, o elemento inferior 700 inclui um substrato de fundo 702 no qual serão depositados os elementos ou materiais sobrejacentes. O substrato de fundo 702 pode ser qualquer material impermeável a gás/líquido apropriado, tal como PET (por exemplo, Mylar®), polipropileno, folha de metal ou envernizada ou qualquer poliolefina apropriada conhecidamente útil com um indicador de esterilização pelos técnicos no assunto. É depositada sobre o substrato de fundo 702 uma monocamada hidratante 704. A monocamada hidratante 704 pode ser, por exemplo, poliacrilamida e pode ter adicionadas ligações para esporos ou os esporos podem ser embutidos na monocamada hidratante 704. O elemento inferior 702 será coberto por uma vedação transparente com comprimento de onda de fluorescência permeável para gás/vapor (não exibida), que será aderida ou soldada ao elemento inferior 702. A vedação transparente permitirá o ingresso de meio de esterilização aos esporos do organismo de teste e permitirá a passagem dos comprimentos de onda excitantes e de fluorescência empregados para leitura do indicador de esterilização.

[0049] Na realização ilustrada na Fig. 9, os esporos são aplicados em grades 10x10 706 de “pontos” de esporos. Cada ponto pode conter, por exemplo, cerca de 150 a cerca de 300 esporos. Na realização da Fig. 9, existe uma matriz 8x12 das grades 10x10. Como cada ponto contém cerca de 150 a cerca de 300 esporos, existem 100 pontos em cada um dos 96 elementos da matriz, existem cerca de 1,44 x 106 a cerca de 2,88 x 106 esporos presentes no indicador de esterilização exibido na Fig. 9.

[0050] A realização ilustrada na Fig. 9 inclui adicionalmente uma câmara cheia de fluido 708 que contém, por exemplo, indutor termicamente estável e meios necessários para ativar e sustentar os esporos que gerarão eventos fluorescentes a serem detectados. O recipiente cheio com fluido 708 é fixado ao restante do elemento inferior 700 por uma zona de rompimento destacável 710. Quando a zona de rompimento destacável 710 for partida, o conteúdo do recipiente 708 é fornecido para os esporos nas grades 706.

[0051] O elemento inferior 700 inclui adicionalmente uma linha adesiva de perímetro 712 por meio da qual a cobertura permeável de gás/vapor (não exibida) é fixada de forma vedante ao elemento inferior.

[0052] A Fig. 10 é uma vista frontal esquemática de um leitor eletrônico 1000 para uso com uma versão eletrônica de um indicador de esterilização de acordo com uma realização da presente invenção, em conjunto com vistas frontal e traseira de um exemplo de cartão eletrônico indicador de esterilização, tal como o da Fig. 6. O leitor eletrônico 1000 inclui um painel de visor frontal 1002 para exibir informações relevantes obtidas da sua leitura do cartão indicador biológico. O leitor eletrônico 1000 inclui adicionalmente um painel de acesso frontal 1004 e uma fenda 1006 para inserção de um cartão indicador biológico. A Fig. 10 também inclui uma ilustração de um exemplo de versão eletrônica de um cartão indicador biológico 1008, que inclui os componentes eletrônicos e biológicos descritos acima com relação à Fig. 6, incluindo os conectores elétricos 1010.

[0053] O leitor eletrônico 1000 inclui componentes eletrônicos apropriados para fazer contato com os conectores elétricos 1010 do cartão indicador biológico 1008. O painel de acesso frontal 1004 pode incluir rolos integrados ou similares para ativar um reservatório de fluido e aquecedor para incubação.

[0054] A Fig. 10 exibe uma vista frontal e uma vista traseira do exemplo de cartão eletrônico indicador biológico 1008. Os componentes da vista frontal foram descritos, de forma geral, com relação à realização da Fig. 6. O lado traseiro do cartão indicador 1008 pode incluir, por exemplo, informações relevantes para o tipo específico de indicador biológico, meio de esterilização, parâmetros do processo de esterilização, número de lote, data e resultado do teste indicador biológico. As informações exibidas no cartão indicador 1008 não se limitam a esses exemplos específicos; podem também ser incluídas outras informações que venham a ser consideradas importantes, como se compreenderá. O cartão indicador 1008 pode incluir uma fita magnética 1012 para facilitar a leitura automática e armazenar informações relevantes para o processo de esterilização, resultados de teste etc., como se compreenderá.

[0055] As Figs. 11A e 11B são vistas frontais esquemáticas de um leitor de fluorescência 1100 para uso com uma versão com base em fluorescência de um indicador de esterilização de acordo com uma realização da presente invenção, em posição fechada e aberta, respectivamente. A Fig. 11A exibe o leitor de fluorescência 1100 em posição fechada. O leitor de fluorescência 1100 inclui um painel de visor frontal 1102 para exibir informações relevantes obtidas da sua leitura do cartão indicador biológico. O leitor de fluorescência 1100 inclui adicionalmente um painel de acesso frontal 1104, que pode abrir-se, conforme exibido na Fig. 11B.

[0056] Conforme exibido na Fig. 11B, o painel de acesso frontal 1104 abre-se para fora e inclui uma fenda 1106 na qual pode ser inserido um cartão indicador biológico com base em fluorescência, tal como descrito acima com relação à Fig. 9. Quando um cartão indicador houver sido inserido na fenda 1106, o painel de acesso frontal 1104 é fechado, colocando o cartão indicador em uma câmara leitora 1108, que contém componentes para obtenção de informações do cartão indicador na fenda. Exemplos de componentes apropriados da câmara leitora 1108 são descritos com relação à Fig. 12. O painel de acesso frontal 1104 pode incluir rolos integrados ou similares para ativar um reservatório de fluido e aquecedor para incubação.

[0057] A Fig. 12 é uma vista em perspectiva esquemática de componentes internos de um leitor de fluorescência 1200 tal como o da Fig. 11, em conjunto com vistas frontais e traseiras de um exemplo de cartão indicador de esterilização com base em fluorescência.

[0058] O leitor de fluorescência 1200 inclui componentes apropriados para leitura de um indicador de esterilização com base em fluorescência. Alguns exemplos de componentes são ilustrados na Fig. 12. O leitor 1200 pode incluir um dispositivo de leitura apropriado tal como uma câmera CCD (dispositivo de acoplamento de carga) resfriada e processador de imagens 1202, incluindo hardware e software apropriados para processamento de dados obtidos da câmera CCD. O leitor 1200 pode incluir ótica apropriada 1204, tal como um excitador de LED e detector de fluorescência. O leitor 1200 pode incluir componentes mecânicos apropriados 1206, tais como uma placa de câmera, controle de LED e interface USB. O leitor 1200 pode incluir adicionalmente aparelhos apropriados 1210 para reter o cartão indicador biológico, para alinhar o cartão e mantê-lo na posição registrada para excitação e leitura. O leitor 1200 pode incluir adicionalmente uma porta de varrimento de imagens apropriada 1214.

[0059] A Fig. 12 exibe uma vista frontal e uma vista traseira do exemplo de cartão eletrônico indicador biológico 1208. Os componentes da vista frontal foram descritos de forma geral com relação à realização da Fig. 9. O lado traseiro do cartão indicador 1208 inclui diversas informações relevantes para o tipo específico de indicador biológico, esterilizante, processo de esterilização, número de lote, data, condições de esterilização e resultado do teste indicador biológico. As informações exibidas no cartão indicador 1208 não se limitam a esses exemplos específicos; podem também ser incluídas outras informações que venham a ser consideradas importantes, como se compreenderá. O cartão indicador 1208 pode incluir uma fita magnética 1212 para facilitar a leitura automática e armazenagem de informações relevantes para o processo de esterilização, resultados de teste etc., como se compreenderá.

[0060]A Fig. 13 é uma vista frontal esquemática de um leitor de ampolas 1300 para uso com um indicador biológico autocontido (SCBI) FABI, tal como descrito e exibido com relação à Fig. 3. O leitor de ampolas 1300 inclui um painel de visor frontal 1302 e um painel de acesso frontal 1304, similares aos de realizações com base eletrônica e com base em fluorescência descritas acima. O painel de acesso frontal 1304 inclui uma série de cavidades 1306, nas quais podem ser inseridos SCBIs. O painel de acesso frontal 1304 move-se em pivô para fora, para permitir a inserção ou remoção de SCBIs e pode ser fechado em uma câmara leitora 1308. O leitor de ampolas 1300 pode ser utilizado com um SCBI com base em fluorescência ou com um SCBI com base eletrônica, aplicando os mesmos princípios básicos descritos no presente para leitura dos resultados do processo de esterilização e indicados pelo indicador biológico de acordo com a presente invenção. A Fig. 13 inclui um exemplo de SCBI FABI 1310.

[0061] Com o método de acordo com a presente invenção, pode-se utilizar uma alteração do potencial de membrana de um organismo viável para avaliar a eficácia do processo de esterilização. Este método pode ser utilizado com um indicador de esterilização apropriado ou SCBI conforme conhecido na técnica. Ele pode também ser empregado com uma suspensão de organismos (tais como esporos) em uma ampola. Ele pode também ser utilizado com um indicador de esterilização que compreende um material condutor de eletricidade posicionado sobre um substrato (tal como um circuito de cobre formado ou depositado sobre um substrato não condutor, como silício) com um indicador biológico (tais como esporos bacterianos) posicionado sobre o material condutor, no todo ou em parte. O método de acordo com a presente invenção é suficientemente flexível para uso ao longo de todas as tecnologias de esterilização. O método de acordo com a presente invenção pode ser utilizado para fornecer indicadores biológicas de leitura instantânea ou quase instantânea. O indicador biológico pode ser indicado como indicador biológico de ação rápida.

[0062] Exemplos de materiais de construção são: suportes, separadores e/ou isoladores: vidro, silício, folhas metálicas, papel e outras formas de celulose, poliolefina incluindo polipropileno, policarbonatos ou misturas, acetato de celulose, Mylar e similares. Membranas permeáveis ou semipermeáveis: Glassine, membranas de diálise de origem natural ou sintética, poliolefina porosa e outros materiais plásticos. Condutores: metais, folhas, tintas condutoras, nanotubos, fulerenos e similares. Condutores/isoladores comutáveis ou outros materiais semicondutores como polianilina e similares. Químicas de ligação (tais como SPDP e similares). Organismos: incluem G. stearothermophilus, B. atrophaeus e similares. Fluoroforos e/ou fluorogenes, tais como MUG e iodeto de propídio, fluoresceína, rodamina etc., incluindo todos os que reagem a excitações físicas, como fotoexcitação, indução química e ativação eletrofísica.

[0063] Em uma realização, o potencial de membrana de plasma é o único meio de detecção. Em outra realização, a detecção é realizada por meio de potencial de membrana e por fluorescência com indução elétrica (utilizando, por exemplo, di-4-ANEPPS ou similar). A tintura ANEP (AminoNaftilEtenilPiridínio), di-4-ANEPPS, é uma sonda sensível para detecção de alterações de potencial de membrana abaixo de milissegundos. Neste último caso, o leitor seria um híbrido de leitor com base eletrônica tal como o da Fig. 10 e um leitor com base em fluorescência tal como o da Fig. 12. Em uma realização, a fluorescência de um composto fluorogênico após a indução e a ativação enzimática pode ser o único meio de detecção. Em outra realização, pode também ser utilizado um segundo fluoroforo unido na superfície (tal como WGA vermelho do Texas), que forneceria fluorescência contínua como controle de referência e como meio de garantir que todos os esporos ainda sejam associados ao cartão indicador biológico. Cada fluoroforo pode possuir comprimentos de onda de emissão e excitação separados.

Exemplos

[0064] Os exemplos fornecidos no presente destinam-se apenas a fins ilustrativos. Eles se destinam a fornecer detalhes compostos suficientes para permitir que os técnicos no assunto elaborem e utilizem a presente invenção e fornecem exemplos ilustrativos de métodos e dispositivos apropriados. A realização preferida pode compreender os materiais, componentes, métodos ou aplicações descritas no presente, no todo ou em parte, mas não se limita apenas aos apresentados. Podem ser realizadas substituições simples que podem alterar a lista de componentes ou utilidade de aplicação, mas estas também são contempladas. O dispositivo de produção final pode assumir a forma desta ou daquela das realizações apresentadas, com uma ou mais das opções descritas, mas as configurações exemplificadas não constituem abandono de nenhuma outra variação ou modo de ação que os técnicos no assunto poderão estender para a presente invenção.

Exemplo 1

[0065] A avaliação de alterações de potencial de membrana em esporos de Bacillus atrophaeus vivos/mortos ilustra a correlação entre alterações de potencial de membrana e viabilidade. O potencial de membrana é medido utilizando DiOC6(3) e um fluorômetro Picofluor. Esporos viáveis e não viáveis (em autoclave) são incubados em caldo de soja tríptico e DiOC6(3) a 37 °C por tempos representativos. Nos tempos de incubação indicados, os organismos são removidos e lavados em Tris/EDTA (pH 7,4). São tomadas em seguida medições de fluorescência. Os resultados são exibidos na Fig. 1.

Exemplo 2 Detecção elétrica de esporos de Geobacillus stearothermophilus viáveis sobre uma superfície plana

[0066] Um material metalizado condutor é moldado uniformemente sobre uma folha de Mylar não condutora com o tamanho aproximado de um cartão de crédito. A folha Mylar é impermeável a líquidos e gases. Uma mistura de poliacrilamida e polianilina é moldada sobre a camada metalizada. A mistura de poliacrilamida e polianilina é permeável a gás e vapor. Esporos de Geobacillus stearothermophilus são novamente suspensos em uma mistura de poliacrilamida e polianilina sob concentração de 108 cfu/ml. Esta concentração de esporos fornece um único esporo em cada gota de 10 pl (picolitros) de uma impressora a jato de tinta. Essa mistura de esporos de poliacrilamida e polianilina é depositada sobre o filme de poliacrilamida e polianilina moldado em formato matricial. Um segundo material metalizado condutor é moldado sobre a matriz de esporos. Isso forma o cartão indicador biológico (BI). À medida que os esporos germinam, a condutividade do material começará a aumentar. O fluxo de corrente é detectado por pré-amplificadores de transistores em série, tais como pares de Darlington. Como esses transistores de Darlington são emparelhados, eles permitem a amplificação da corrente. Os transistores de Darlington são conectados a terminais que monitoram a corrente do sistema. Uma barreira contra gases, tal como Mylar, adere-se ao topo do indicador por um adesivo protegido com película até pouco antes do uso. No momento do uso, essa barreira é removida, de tal forma que vapor ou gás possam penetrar no sistema quando colocado em um esterilizador. Na extremidade posterior do indicador, encontra-se uma pequena câmara quebrável que contém meios de incubação que permitirão a germinação de esporos viáveis. Após um processo de esterilização utilizando vapor ou peróxido de hidrogênio vaporoso, o indicador biológico é incubado.

[0067] O cartão BI é inserido no leitor de cartões/fenda de incubador que é integrado a um esterilizador. O leitor/incubador consiste de blocos de aquecimento para manter a temperatura de incubação, conexões elétricas nas quais o cartão BI se conecta, cabeça de impressão para marcar parâmetros de ciclo e ID de carga em forma legível pelo usuário, rolos para orientar o cartão BI para a fenda e ativar automaticamente o BI por meio de quebra da câmara quebrável que contém os meios de incubação e auxiliando na dispersão do meio, um leitor de fita magnética e um leitor de códigos de barra para rastrear os resultados do cartão BI de volta até o ciclo de esterilização e carga do dispositivo.

[0068] O indicador é incubado a 55-60 °C (temperatura ideal para Geobacillus stearothermophilus) e a condução do indicador é monitorada. Pequenas alterações da corrente resultantes da germinação de esporos viáveis são detectadas em questão de minutos, alertando o usuário que o seu processo de esterilização pode não haver sido bem sucedido. Caso o processo de esterilização fosse bem sucedido, não haveria aumento da corrente medida com o tempo de incubação.

Exemplo 3 Detecção da fluorescência de esporos viáveis de Geobacillus stearothermophilus sobre uma superfície plana

[0069] Uma camada de poliacrilamida é moldada sobre um fundo de polipropileno com o tamanho aproximado de um cartão de crédito. A camada de poliacrilamida age como monocamada hidratante. Esporos de Geobacillus stearothermophilus são impressos em seguida em pontos de organismos. Os pontos são impressos em formato de grade ou matriz, em que cada ponto contém de 150 a 300 esporos. Em uma extremidade, encontra-se uma câmara quebrável que contém os meios de incubação com o(s) fluoroforo(s) necessário(s). Ao término do processo de esterilização, o cartão BI é inserido na fenda incubadora/leitora de cartões que é integrada a um esterilizador. O leitor/incubador consiste de blocos de aquecimento para manter a temperatura de incubação, fontes de excitação de LED, fotodiodos para detecção de fluorescência, cabeça de impressão para marcar parâmetros de ciclo e ID de carga em forma legível pelo usuário, rolos para orientar o cartão BI na fenda e ativar automaticamente o BI rompendo a câmara quebrável que contém os meios de incubação e auxiliando na dispersão de meio, um leitor de fita magnética e um leitor de códigos de barra para rastrear os resultados do cartão BI de volta para o ciclo de esterilização e carga do dispositivo.

[0070] O indicador é incubado a 55-60 °C (temperatura ideal para Geobacillus stearothermophilus). Um dispositivo de formação de imagens comercial, tal como LumiSens, pode ser empregado nesse leitor. Isso permitirá a detecção de dois ou mais comprimentos de onda de interesse. Um comprimento de onda medirá os esporos manchados para garantir que todos os controles estejam no lugar e o segundo comprimento de onda medirá o fluoroforo utilizado para detectar organismos viáveis. Caso o processo de esterilização seja bem sucedido, todos os esporos serão inviáveis e o detector detectará apenas o fluoroforo empregado para manchar os organismos. Caso o processo de esterilização não seja bem sucedido, os esporos viáveis serão detectados por dois sinais de fluorescência distintos.

Exemplo 4 Leitor/Incubador Isolado

[0071] O leitor/incubador pode ser uma unidade isolada para qualquer um dos leitores/incubadores descritos no Exemplo 2 e no Exemplo 3. Em uma unidade isolada, todos os circuitos eletrônicos são idênticos aos leitores/incubadores que são integrados aos próprios esterilizadores. Embora a presente invenção tenha sido explicada com relação a realizações específicas, deve-se compreender que diversas de suas modificações tornar-se-ão evidentes para os técnicos no assunto mediante a leitura do presente relatório descritivo. Deve-se compreender, portanto, que a presente invenção aqui descrita destina-se a cobrir as modificações que venham a enquadrar-se dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims

1. Método para produção de um indicador de esterilização caracterizado pelo fato de que compreende: - depósito de material condutor de eletricidade sobre um substrato utilizando uma impressora a jato de tinta; - depósito de um indicador biológico em uma matriz sobre o material condutor de eletricidade, no todo ou em parte, utilizando a impressora a jato de tinta; - fornecimento de circuito elétrico em comunicação elétrica com o material condutor de eletricidade, em que o circuito elétrico é adaptado para detectar alterações da propriedade elétrica do material condutor de eletricidade.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o substrato ser não condutor.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato do circuito elétrico compreender circuito de detecção que detecta mudanças na propriedade elétrica.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de o método ainda compreender a aplicação de uma membrana removível impermeável gás/líquido sobre pelo menos o indicador biológico.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de o indicador biológico compreender células apresentando uma membrana de célula capaz de exibir um potencial de membrana e estar em contato elétrico com o material condutor elétrico.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o indicador biológico compreende esporos.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o indicador biológico compreende: - Geobacilus stearothermophilus, Bacilus atrophaeus, Bacilus subtilis, Bacilus sphaericus, Bacilus anthracis, Bacilus pumilus, Bacilus coagulans, Clostridium sporogenes, Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Bacilus subtilis globigi, Bacilus cereus, Bacilus circulans, Escherichia coli ou uma mistura de dois ou mais destes; ou - Aspergilus niger, Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes, Wangiela dermatitis, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium terrae, Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum, Aeromonas hydrophila, Enterococcus faecalis, Streptococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus pyrogenes, Escherichia coli, Klebsiela pneumoniae, Legionela pneumophila, Methylobacterium, Pseudomonas aeruginosa, Salmonela choleraesuis, Helicobacter pylori, Micrococcus radiodurans, Deinococcus radiodurans, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Stenotrophomonas maltophilia ou uma mistura de dois ou mais destes; ou enterococos resistentes à vancomicina, Staphylococcus aureus resistente à meticilina, Mycobacterium cheloni, ou uma mistura de dois ou mais dos mesmos.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o indicador biológico compreende um indicador biológico geneticamente elaborado que compreende: - pelo menos um organismo de teste e pelo menos um gene relator apropriado para a produção de uma enzima, em que o gene relator é absorvido pelo organismo de teste e, preferencialmente, o gene relator é absorvido pelo organismo de teste utilizando pelo menos um plasmídeo e/ou pelo menos um vírus; e sendo que o indicador biológico geneticamente elaborado compreende adicionalmente pelo menos um gene repressor que inibe a expressão do gene relator até que o gene relator seja exposto a pelo menos um indutor, em que, preferencialmente, o gene relator e o gene repressor são absorvidos pelo organismo de teste utilizando pelo menos um plasmídeo e/ou pelo menos um vírus.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o organismo de teste compreende: - Geobacilus stearothermophilus, Bacilus atrophaeus, Bacilus subtilis, Bacilus sphaericus, Bacilus anthracis, Bacilus pumilus, Bacilus coagulans, Clostridium sporogenes, Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Bacilus subtilis globigi, Bacilus cereus, Bacilus circulans, Escherichia coli ou uma mistura de dois ou mais destes; ou - Aspergilus niger, Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes, Wangiela dermatitis, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium terrae, Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum, Aeromonas hydrophila, Enterococcus faecalis, Streptococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus pyrogenes, Escherichia coli, Klebsiela pneumoniae, Legionela pneumophila, Methylobacterium, Pseudomonas aeruginosa, Salmonela choleraesuis, Helicobacter pylori, Micrococcus radiodurans, Deinococcus radiodurans, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Stenotrophomonas maltophilia ou uma mistura de dois ou mais destes; ou enterococos resistente a vancomicina, Staphylococcus aureus resistente a meticilina, Mycobacterium cheloni ou uma mistura de dois ou mais destes.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o método ainda compreende: - expor o indicador biológico no material condutor elétrico a um meio de esterilização; - incubar o indicador biológico no material condutor elétrico, e determinar qualquer mudança que ocorra na propriedade elétrica do material condutor elétrico durante a incubação.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o meio de esterilização compreende: - pelo menos um esterilizante líquido, de preferência pelo menos um ácido peracético, pelo menos um peróxido, ou uma mistura de dois ou mais destes, ou pelo menos um esterilizante gasoso, de preferência peróxido de hidrogênio ou peróxido de hidrogênio e amônia; ou vapor.