CN106434846A - 一种油性基质灭菌d值的检测方法 - Google Patents

一种油性基质灭菌d值的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种油性基质灭菌D值的检测方法，步骤是：A、生物指示剂的使用：将枯草芽孢杆菌接种至芽孢培养基进行培养形成芽孢，离心洗涤收集芽孢，将芽孢冷冻干燥粉碎成活性芽孢粉；B、油性基质加热灭菌操作：将装于玻璃或不锈钢容器中的油性基质置于油浴锅中，搅拌，油性基质升温并稳定到预定灭菌温度后，取枯草芽孢杆菌冻干芽孢粉加入到油性基质中，灭菌处理；C、油性基质中残存活体芽孢数的检测：将枯草芽孢杆菌冻干芽孢粉加入到油性基质中后，搅拌，从油性基质中取无菌Tween‑80混合，再加入无菌稀释液，静置，取下层乳液进行不同梯度稀释，培养，计算出油性基质加热灭菌的D值。方法易行，操作简便，检测结果有效、可靠、稳定。

Description

一种油性基质灭菌D值的检测方法
技术领域
本发明属于A61L 2/04材料消毒或灭菌的技术领域，更具体涉及一种油性基质灭菌D值的检测方法，它适用于一种油性基质加热灭菌过程中的检测。
背景技术
药品生产过程中，为防止微生物污染对人体健康产生影响，往往对最终产品或包装材料和原材料进行灭菌处理。为确保灭菌工艺过程能将污染的微生物尽可能或全部杀灭，通常要求灭菌工艺的无菌保证水平或残存概率小于10-6。无菌保证水平或残存概率与产品(或原材料)中污染微生物的初始数量(浓度)以及污染微生物在特定灭菌温度下的耐热性参数(D值)密切相关。因此，检测特定灭菌方法和工艺条件下相关微生物的耐热性参数(D值)，可用来验证现有灭菌工艺和条件能否达到所预期的无菌保证水平或残存概率(≤10-6)，也可用来设计开发新的灭菌工艺条件。
将微生物杀灭的灭菌法，其基本原理都是使细胞内的蛋白质或核酸发生不可逆的凝固或破坏，使微生物死亡。因此，各种灭菌方法使微生物死亡的速度都符合一级动力学方程，即在特定灭菌温度下，某种微生物孢子的死亡速度仅与某个时刻残存孢子的浓度有关。用数学模型可表示为：
lgN＝lgN0-kt
N—产品内微生物的残存数；
N0—灭菌开始时产品内微生物数；
t—累计灭菌时间；
k—常数，与微生物耐热性、灭菌温度相关。
微生物的耐热参数，简称D值，是指在特定灭菌条件下，使微生物数量下降一个对数单位或杀灭90％所需的时间(分钟)。
目前，国内有部分制药企业对水性(水溶液性)的产品或原材料及固态的产品、原材料或包装材料的加热灭菌工艺过程进行灭菌D值的检测或工艺验证，也建立起了相应的生物指示剂使用方法、加热灭菌操作方法及残存生物指示剂数量检测方法。但目前国内还没有制药企业对油性的产品或原材料的加热灭菌工艺过程进行灭菌D值的检测或工艺验证，也没有相应的检测标准或技术手段。而现有水性产品或原材料的加热灭菌D值检测方法难以直接用于油性产品或原材料的加热灭菌D值检测，且检测过程与实际的油性产品或原材料的加热灭菌工艺过程有一定的差异性。如现在的水性产品或原材料及固态的产品、原材料或包装材料均采用湿热灭菌或干热灭菌法，而油性产品或原材料则采用直接电加热或蒸汽间接加热灭菌，与湿热灭菌和干热灭菌法均有差异。水性产品或原材料的加热灭菌D值检测过程中，生物指示剂采用的是芽孢悬浮液或含芽孢的纸片。芽孢悬浮液加入到高温(﹥100℃)的油性基质中，会剧烈沸腾，并产生大量的泡沫，对灭菌效果及后面的残存活体芽孢数量检测都会产生不利影响。芽孢纸片灭菌过程很方便，但灭菌过的纸片被油性基质浸润后，纸片上残存的活体芽孢数量很难以准确检测。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种油性基质灭菌D值的检测方法，该方法不仅填补了国内关于油性基质加热灭菌过程中灭菌D值检测方法的空白，方法易行，操作简便，检测结果有效、可靠、稳定。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
一种油性基质灭菌D值的检测方法，其步骤是：
A、生物指示剂的使用：使用枯草芽孢杆菌(CMCC(B)63501)的冻干芽孢粉作为生物指示剂。将枯草芽孢杆菌接种至芽孢培养基(见具体实施例1)进行培养形成芽孢，离心洗涤收集芽孢，将芽孢冷冻干燥粉碎成活性芽孢粉；
B、油性基质加热灭菌操作：将装于玻璃或不锈钢容器中的油性基质置于油浴锅中，开启电动搅拌器进行快速搅拌，待油性基质升温(110℃-150℃)并稳定到预定灭菌温度(110℃-150℃)后，取适量(0.1g-0.5g)的枯草芽孢杆菌冻干芽孢粉加入到油性基质(见具体实施例1)中，立即计时，进行不同时间(3-5分钟)的加热(110℃-150℃)灭菌处理。
C、油性基质中残存活体芽孢数的检测：将枯草芽孢杆菌冻干芽孢粉加入到油性基质中后，立即计时，并用电动搅拌器进行快速搅拌使芽孢粉尽可能分散均匀。每隔一定的时间(3-5分钟)从油性基质中取适量(1-5毫升)的样品与适量(2-10毫升)的无菌Tween-80快速混合，再加入适量(10-50毫升)体积的无菌稀释液(见具体实施例1)，充分震荡使其分散成乳浊液，静置，取下层乳液用无菌稀释液进行10倍梯度稀释，取适量(0.1-0.5毫升)稀释乳液涂布于平板培养基(见具体实施例1)上进行培养，根据平板上长出的单菌落数计算经过不同灭菌时间后的油性基质中残存的芽孢数量。以灭菌时间对残存芽孢数的对数作图，由此可计算出油性基质加热灭菌的D值(请见实施例1)。灭菌D值可用来验证现有灭菌工艺和条件能否达到所预期的无菌保证水平或残存概率(≤10-6)，也可用来设计开发新的灭菌工艺条件。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
以枯草芽孢杆菌冻干芽孢粉作生物指示剂，同现有的以芽孢悬浮液作生物指示剂相比，其耐热性更强，也更接近生产实践过程，检测出来的灭菌D值进行的灭菌工艺验证更可靠。冻干芽孢粉加入到高温的油性基质中，避免了芽孢悬浮液加入到高温的油性基质中容易剧烈沸腾、飞溅以及产生大量泡沫等危险及结果不准确等操作上的缺陷性。本发明的油性基质中残存活体芽孢数量的检测方法比现有技术操作更方便，结果更准确和可靠。
利用本发明很方便、准确地检测出了油性基质—凡士林在130℃和150℃温度下加热灭菌的平均D值分别为11.94分钟和3.95分钟。
附图说明
图1为一种累计灭菌时间与残存活体芽孢数量对数关系曲线(第一次实验结果)示意图。
为以枯草芽孢杆菌(CMCC(B)63501)的冻干芽孢粉作为生物指示剂，凡士林基质在130℃温度下第一次加热灭菌时，累计灭菌时间与残存活体芽孢数量的对数之间的关系图。
图2为一种累计灭菌时间与残存活体芽孢数量对数关系曲线(第二次实验结果)示意图。
为以枯草芽孢杆菌(CMCC(B)63501)的冻干芽孢粉作为生物指示剂，凡士林基质在130℃温度下第二次加热灭菌时，累计灭菌时间与残存活体芽孢数量的对数之间的关系图。
图3为一种累计灭菌时间与残存活体芽孢数量对数关系曲线(第三次实验结果)示意图。
为以枯草芽孢杆菌(CMCC(B)63501)的冻干芽孢粉作为生物指示剂，凡士林基质在130℃温度下第三次加热灭菌时，累计灭菌时间与残存活体芽孢数量的对数之间的关系图。
从以上三个附图可以看出，累计灭菌时间与残存活体芽孢数量的对数之间具有较好的线性关系，符合数学模型lgN＝lgN0-kt，同时三次平行实施结果的D值(直线斜率的绝对值)也非常接近，说明本发明方法检测结果真实可靠，重现性好。
具体实施方式
实施例1：
下面以凡士林基质在130℃温度下加热灭菌D值的检测为例详细说明本发明的具体实施方法。
生物指示剂菌种：枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501。
枯草芽孢杆菌芽孢培养用液体培养基：改进胰酪大豆胨液体培养基(在胰酪大豆胨液体培养基中加入0.05g/100ml硫酸锰和0.15g/100ml硫酸镁)。胰酪大豆胨液体培养基组成见《中国药典》2015版第136页。
稀释液：含0.5％(ml/ml)Tween-80的pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液(组成见《中国药典》2015版第137页)。
残留芽孢检测用平板培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基(组成见《中国药典》2015版第136页。
一种油性基质灭菌D值的检测方法，其步骤是：
A、枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501冻干芽孢粉的制备：取4℃保藏菌种接种至新鲜的胰酪大豆胨琼脂斜面培养基，35℃培养3天，得活化菌种。挑取一环活化菌种接种至胰酪大豆胨液体培养基中(100ml/250ml三角瓶)，35℃、200rpm摇瓶培养12h，得种子液。按5％的接种量(v/v)将新鲜的种子液接种至芽孢培养用液体培养基中(100ml/250ml三角瓶，35℃、200rpm摇瓶培养72h。取芽孢培养液在4℃、8000rpm、10min的条件下离心收集芽孢，并用稀释液离心洗涤芽孢两次。将收集的芽孢悬浮在适宜体积(10ml)的稀释液中，注入到90mm无菌培养皿中，置于冷冻干燥机中冻干12h(样品冷冻4h，抽干8h)。从培养皿中刮下冻干的芽孢片，置于无菌研钵中轻轻研磨成粉，得到冻干芽孢粉。
B、凡士林基质在130℃温度下加热灭菌操作：称取300克的凡士林基质，置于500ml烧杯中。将烧杯放入油浴锅中，开启油浴锅，设定温度135℃。待烧杯中基质全部液化后，开启电动搅拌器至500rpm转速。用两支以上水银温度计检测烧杯中基质的温度。调节油浴锅的温度，使烧杯中基质的温度稳定在130℃。称取0.3或0.4g冻干芽孢粉加入到烧杯基质中，立即开始计时。
C、凡士林基质中残存活体芽孢数的检测：将冻干芽孢粉加入到凡士林基质中后，立即计时，每隔3min或5min，用2ml的无菌玻璃移液管(管口塞脱脂棉)取2ml基质样液加入到装有4ml预热为55℃(水浴锅加热)的Tween-80无菌试管中，立即在涡旋混合器上震荡20秒，再加入14ml预热为55℃的稀释液，迅速放在涡旋混合器上充分震荡形成分散均匀的乳化液(间歇震荡共10min，中间将样品置于55℃的水浴中保温)，得1：10的供试液。共取5个样。
D、将供试液从水浴中取出，静置分层。取下面的乳化水溶液用稀释液进行10倍梯度稀释。分别从各稀释样品液中取0.1ml涂布在胰酪大豆胨琼脂平板上，每个样涂2个平皿，35℃倒置培养24h。选取单菌落分离效果好，且菌落数在30个至300个之间的平皿进行计数。根据平皿上的菌落数，结合稀释倍数及平皿上涂布样品液的体积计算出累计灭菌的不同时间点基质中残存的活体芽孢数量(个/ml)。以累计灭菌时间为纵坐标，以对应的残存活体芽孢数量的对数为横坐标作图。直线斜率的绝对值即为130℃下的D值。
检测结果如下：
a.第一次实验结果
取0.3g的芽孢粉加入到300ml的基质中进行实验，结果如下：
注：10-1样品即为1:10的供试液。菌落数取两个平行平皿的平均数。“-”为菌落数异常，不可取。后面的表格相同。
b.第二次实验结果
取0.4g的芽孢粉加入到300ml的基质中进行实验，结果如下：
c.第三次实验结果
取0.4g的芽孢粉加入到300ml的基质中进行实验，结果如下：
从上面三次实验结果可以看出，尽管加入到基质中的芽孢数量不一样，累计灭菌时间(取样点时间)不一样，但测算出的D值确是非常接近，这充分证明了D值主要与温度有关，而与初始芽孢浓度和累计灭菌时间(取样点时间)无关。同时也说明三次的实验结果是可信的。取三次实验结果测算出的D值的平均值，得凡士林基质在130℃温度下加热灭菌的D值为：
D值＝(11.91+11.55+12.36)/3＝11.94(min)
说明：11.91为第一次实验；11.55为第二次实验；12.36为第三次实验。

Claims (1)

1.一种油性基质灭菌D值的检测方法，其步骤是：
A、生物指示剂的使用：使用枯草芽孢杆菌的冻干芽孢粉作为生物指示剂，将枯草芽孢杆菌接种至芽孢培养基进行培养形成芽孢，离心洗涤收集芽孢，将芽孢冷冻干燥粉碎成活性芽孢粉；
B、油性基质加热灭菌操作：将装于玻璃或不锈钢容器中的油性基质置于油浴锅中，开启电动搅拌器进行搅拌，油性基质升温110℃-150℃并稳定到预定灭菌温度110℃-150℃后，取适量的枯草芽孢杆菌冻干芽孢粉加入到油性基质中，立即计时，进行不同时间的加热110℃-150℃灭菌处理；
C、油性基质中残存活体芽孢数的检测：将枯草芽孢杆菌冻干芽孢粉加入到油性基质中后，计时，并用电动搅拌器进行搅拌使芽孢粉尽可能分散均匀，每隔一定的时间从油性基质中取适量的样品与适量的无菌Tween-80混合，再加入适量体积的无菌稀释液，充分震荡使其分散成乳浊液，静置，取下层乳液进行不同梯度稀释，取适量稀释乳液涂布于平板培养基上进行培养，根据平板上长出的单菌落数计算经过不同灭菌时间后的油性基质中残存的芽孢数量，以灭菌时间对残存芽孢数的对数作图，计算出油性基质加热灭菌的D值。
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