DE102013217359A1

DE102013217359A1 - Biosensor

Info

Publication number: DE102013217359A1
Application number: DE102013217359.8A
Authority: DE
Inventors: Michael J. Schöning; Patrick Kichner; Jan Oberländer
Original assignee: Fachhochschule Aachen
Current assignee: Fachhochschule Aachen
Priority date: 2013-08-30
Filing date: 2013-08-30
Publication date: 2015-03-05

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Biosensor, wobei der Biosensor einen ersten Sensorabschnitt mit einem ersten Leiterabschnitt und einem zweiten Leiterabschnitt aufweist. Weiterhin weist der Biosensor einen zweiten Sensorabschnitt mit einem dritten Leiterabschnitt und einem vierten Leiterabschnitt auf. Zwischen dem dritten Leiterabschnitt und dem vierten Leiterabschnitt ist ein immobilisierter Mikroorganismus oder sind mehrere immobilisierte Mikroorganismen aufgebracht. Zwischen dem ersten Leiterabschnitt und dem zweiten Leiterabschnitt und zwischen dem dritten und dem vierten Leiterabschnitt ist eine elektrische Messgröße feststellbar. Der Mikroorganismus oder die Mikroorganismen werden durch Einwirkung eines Sterilisationsprozesses zumindest abschnittsweise abgetötet und/oder abgelöst. Durch den Sterilisationsprozess ist eine Änderung der elektrischen Messgröße zwischen dem dritten Leiterabschnitt und dem vierten Leiterabschnitt feststellbar.

Description

Die Erfindung betrifft einen Biosensor.
Hintergrund der Erfindung
In vielen Bereichen besteht ein Bedarf zur Entkeimung. Dabei werden unterschiedliche Systeme zur Entkeimung, sogenannte Aseptikanlagen, verwandt. Allen Systemen ist gemeinsam, dass der Wirkungsgrad der Entkeimung in aller Regel überprüft werden muss.
Gegenwärtig werden industriell zwei Verfahren zur Bestimmung des Wirkungsgrades von Entkeimungsprozessen, insbesondere zur Überprüfung des Wirkungsgrades der Packstoffsterilisation, eingesetzt. Eines der Verfahren ist der sog. „Keimreduktions-Test“. Das andere Verfahren ist der sogenannte „Endpunkt-Test“.
Beide Verfahren weisen jedoch wesentliche Nachteile für den Betreiber von Aseptikanlagen auf. Zum einen sind die Verfahren sehr arbeitsintensiv und erfordern eine hohe Expertise, speziell zur mikrobiologischen Untersuchung des Entkeimungsprozesses. Zum anderen benötigt die Inkubation/Auszählung innerhalb der Prüfverfahren ein mikrobiologisches Labor mit umfangreicher Ausstattung, wobei die Durchführung der Verfahren einen hohen zeitlichen und damit kostenintensiven Aufwand darstellen. Zudem kann eine Aussage über den Wirkungsgrad der Sterilisation in der Regel erst nach einigen Tagen, in aller Regel erst nach fünf Tagen getroffen werden. Insofern ist eine zeitnahe Optimierung/Steuerung des Sterilisationsprozesses in Aseptikanlagen mit den existierenden Prüfverfahren nicht möglich.
Neben den beschriebenen Verfahren werden vereinzelt chemische und biologische Indikatoren zur Überprüfung der Effizienz von Sterilisationsprozessen eingesetzt.
Chemische Indikatoren sind in verschiedenen Ausführungen erhältlich, welche den Wirkungsgrad der Sterilisation durch eine Farbveränderung oder den Übergang von der flüssigen in die feste Phase anzeigen. Diese Indikatoren zeigen zwar direkt ein Ergebnis nach dem Sterilisationsprozess an, beruhen jedoch nur darauf, dass eine bestimmte Prozesstemperatur/Konzentration des Keimreduktionsmediums erreicht worden ist.
Hierdurch kann aber der Sterilisationsprozess nur unzureichend abgebildet werden, da z.B. die Einwirkungszeit in Bezug auf die Temperatur nicht berücksichtigt werden kann.
Daneben existieren Farbbioindikatoren, die während der Inkubationsphase nach dem Auskeimen von Testsporen, die dem Sterilisationsprozess ausgesetzt worden sind, auf Stoffwechselprodukte der Bakterien reagieren und bereits nach 24 Stunden Wachstum einen Farbwechsel anzeigen.
Zwar könnte somit eine Verminderung der Zeit, bis eine Aussage über den Wirkungsgrad der Packstoffsterilisation getroffen werden kann, ermöglicht werden, dennoch weist das Verfahren die bereits o.g. Nachteile auf, d.h. es ist immer noch sehr zeit- und arbeitsintensiv.
Bei enzymbasierten Indikatoren wird die Enzymaktivität mit der Lebensfähigkeit von zumindest einem Mikroorganismus korreliert, der üblicherweise verwendet wird, um die Effizienz eines Sterilisationsprozesses zu bestimmen. Im Falle einer erfolgreichen Entkeimung wird das Enzym deaktiviert. Ist dies nicht der Fall, behält das Enzym seine Aktivität bei und kann mit einem Substrat reagieren und durch Fluoreszenz- oder Farbänderung detektiert werden.
Enzymindikatoren liefern zwar schnellere Ergebnisse, oftmals schon nach wenigen Stunden, jedoch zeigen die verwendeten Enzyme i.d.R. eine deutlich geringere Resistenz gegenüber dem Sterilisationsmittel als die zu untersuchenden Sporen.
Ein weiterer Nachteil der Bioindikatoren besteht darin, dass lediglich eine binäre „Ja/Nein“-Aussage über den Erfolg der Sterilisation getroffen werden kann.
Werden die Testsporen/das Enzym vollständig deaktiviert, zeigt der Indikator ein negatives Ergebnis. Befinden sich noch intakte Testsporen/Enzyme in der Probe, fällt der Test positiv aus. Eine Aussage über den Grad der Entkeimung kann nicht getroffen werden.
Es bleibt festzuhalten, dass die o.g. Indikatoren für die quantitative Bestimmung des Wirkungsgrads eines Sterilisationsprozesses nicht geeignet sind.
An dieser Stelle sei erwähnt, dass auch Impedanz-Analysatoren für mikrobiologische Untersuchungen (Zell-/Bakterienwachstum) kommerziell vertrieben werden, die allerdings auf dem Detektionsansatz, dem Nachweis von Stoffwechselprodukten (Ionenkonzentrationen) während der Inkubationsphase von Zellen/Bakterien, beruhen.
Diese Geräte können jedoch bakterielle Sporen nicht direkt nachweisen. Sie dienen lediglich dazu, Bakterienwachstum in Nährmedien nach dem Auskeimen der Sporen über Stoffwechselprodukte zu erfassen und können damit nicht unmittelbar nach dem Sterilisationsprozess eine Aussage über den Wirkungsgrad der Packstoffsterilisation liefern. Sie sind sehr aufwändig, eine quantitative Aussage über die vorliegende Keimreduktionsrate kann frühestens nach 36 Stunden getroffen werden.
Ein weiterer biologischer Indikator wird in der Patentanmeldung US 2012 0021 406 vorgestellt. Bei diesem wird die Impedanz-Analyse zur Erfassung des Membran-Potentials genutzt, um Sterilisationsprozesse zu evaluieren. Jedoch erfolgt in diesem Verfahren ebenfalls zunächst das langwierige Auskeimen der Sporen in einem Nährmedium.
Im US Patent 7,008,524 wird ein impedimetrischer Biosensor, basierend auf Interdigital-Elektroden, zur Detektion von pathogenen Stoffen in der Luft vorgestellt. Hierin werden Enzyme als Bioindikatoren in leitfähige Polymere immobilisiert. Die Enzyme reagieren in Anwesenheit von Pathogenen mit einer morphologischen Veränderung, wodurch eine Leitfähigkeitsänderung der Polymerschicht hervorgerufen wird und somit die Pathogene in der Luft nachgewiesen werden. Dieser Biosensor weist jedoch erhebliche Nachteile für die Überwachung von Sterilisationsprozessen auf: Zum einen weisen die Enzyme nicht die erforderlichen hohen Resistenzen gegenüber den Sterilisationsmedien auf (Temperatur und/oder hohe H₂O₂-Konzentration); darüber hinaus wird der Einfluss des Sterilisationsmediums durch das Einbetten in eine Polymerschicht gehemmt. Zudem ist der im Patent vorgestellte Detektor lediglich auf eine Detektion von pathogenen Stoffen in der Luft geeignet, wohingegen er für die Detektion der mikrobiologischen Wirksamkeit von Sterilisationsprozessen nicht geeignet ist.
Ausgehend von dieser Situation ist es Aufgabe der Erfindung einen Biosensor zur Verfügung zu stellen, der eine direkte und zeitnahe Messung des Wirkungsgrades des Sterilisationsprozesses ermöglicht.
Die Aufgabe wird gelöst, durch eine Vorrichtung gemäß Anspruch 1. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen sind insbesondere Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
Nachfolgend wird die Erfindung näher unter Bezug auf die Figuren erläutert. In diesen zeigt:
1 eine exemplarische schematisierte Ausführungsform der Erfindung in perspektivischer Darstellung,
2 eine Teilansicht einer exemplarisch schematisierten Ausführungsform der Erfindung in einem Zustand vor der Sterilisation,
3 eine Teilansicht einer exemplarisch schematisierten Ausführungsform der Erfindung in einem Zustand während oder nach der Sterilisation,
4 ein Bode-Diagramm in Bezug auf eine Messung mit einer Ausführungsform der Erfindung,
5 ein Blockdiagramm eines Online-Mess-Systems unter Verwendung der Erfindung.
Bereits seit über 100 Jahren wird flüssige H₂O₂-Lösung zu Sterilisations- und Desinfektionszwecken verwendet. Seitdem bekannt wurde, dass die keimtötende Wirkung von gasförmigem H₂O₂ gegenüber der Flüssigphase um ein Vielfaches höher ist, findet H₂O₂ als Sterilisationsmittel vorwiegend in der Gasphase Verwendung.
Zur Untersuchung des Wirkungsgrades von Entkeimungsprozessen werden vorzugsweise Bakteriensporen (genauer Endosporen) verwendet, da sie eine höhere Resistenz gegenüber chemischen und physikalischen Entkeimungsverfahren aufweisen, als beispielsweise die Bakterien selbst.
Dabei ist anzumerken, dass unterschiedliche Quellen belegen, dass nicht ein einziger Mechanismus für die Inaktivierung von Mikroorganismen/Sporen verantwortlich ist, sondern der Wirkungsmechanismus wird durch mehrere Faktoren beeinflusst, wie z.B. die H₂O₂-Konzentration, Gastemperatur, Luftfeuchte, Druck und Behandlungsdauer.
Ein beispielhafter Biosensor BS ist z.B. ein impedimetrischer Biosensor.
Ein erfindungsgemäßer impedimetrischer Biosensor BS weist einer Differenzanordnung von zwei elektrodenartig ausgelegten Strukturen (z.B. Interdigital-Elektroden), wie in 1 beispielhaft dargestellt, auf. Dabei bilden die Leiterabschnitte L1 und L2 einen ersten Sensorabschnitt S1 und die Leiterabschnitte L3 und L4 einen zweiten Sensorabschnitt S2.
Auf dem zweiten Sensorabschnitt S2 ist zum Nachweis der Sterilisationswirkung ein Bakterien- bzw. Sporenrasen als biologische Rezeptorschicht immobilisiert, wobei die immobilisierten Mikroorganismen bevorzugt eine erhöhte Resistenz gegenüber dem Sterilisationsprozess aufweisen.
Der erste Sensorabschnitt S1 kann zum Ausgleich von Prozesseinflüssen wie Druck, Temperatur sowie der chemischen Einflüsse, welche durch den Sterilisationsprozess hervorgerufen werden können, dienen.
Als Maß für die Keimreduktion wird das Impedanz-Differenzsignal der beiden Sensorabschnitte S1 und S2 ermittelt.
Die Impedanz-Bestimmung kann z.B. durch Einprägen einer bekannten Wechselspannung (Amplitude, Frequenz und Phase) erfolgen, welche ein elektrisches Feld an der Sensorabschnittsoberfläche erzeugt. Dies resultiert in einem erfassbaren Wechselstrom (Amplitude, Frequenz und Phase), wie durch die Messgeräte und die hierdurch erfassten Messsignale M1 und M2 angezeigt. Dies ist für den Zustand vor dem Sterilisationsprozess in 2 gezeigt.
Aus den beiden Größen Spannung, Strom lässt sich durch Verhältnisbildung die Impedanz nach Betrag und Phase des jeweiligen Sensorabschnitts bestimmen.
Im Falle der Elektrode mit immobilisierten Mikroorganismen wird das elektrische Feld und somit der resultierende Wechselstrom beeinflusst, so dass zunächst die Detektion der immobilisierten Mikroorganismen anhand der Impedanz möglich wird.
Aufgrund der Wechselwirkungen zwischen dem Sterilisationsprozess und den Mikroorganismen wird das elektrische Impedanzverhalten der Mikroorganismen derart verändert, dass über die Bildung eines Impedanz-Differenzsignals der beiden Elektrodenstrukturen eine Detektion der hervorgerufenen Keimreduktion ermöglicht wird. Dies ist für den Zustand während und nach dem Sterilisationsprozess in 3 gezeigt.
Das Auslesen der Sensoren kann unmittelbar erfolgen. Hierdurch ergibt sich ein erheblicher Zeit- und Kostenvorteil. Zudem erlauben der erfindungsgemäße Biosensor und das erfindungsgemäße Verfahren eine qualitative Bestimmung der Sterilisation.
Ohne weiteres kann der Biosensor auch auf andere Messgrößen M1 und M2, wie z.B. kapazitives und/oder induktives Verhalten hin, ausgelegt sein. D.h. die erste und zweite elektrische Messgröße M1, M2 kann eine Widerstands-, eine Spannungs- oder Stromänderung, eine Impedanz- oder eine Kapazitätsänderung sein.
In der allgemeinsten Form weist ein erfindungsgemäßer Biosensor einen ersten Sensorabschnitt S1 mit einem ersten Leiterabschnitt L1 und einem zweiten Leiterabschnitt L2 auf. Weiterhin weist der Biosensor einen zweiten Sensorabschnitt S2 mit einem dritten Leiterabschnitt L3 und einem vierten Leiterabschnitt L4 auf. Zwischen dem dritten Leiterabschnitt L3 und dem vierten Leiterabschnitt L4 ist ein immobilisierter Mikroorganismus oder sind mehrere immobilisierte Mikroorganismen MO aufgebracht. Zwischen dem ersten Leiterabschnitt L1 und dem zweiten Leiterabschnitt L2 ist eine erste elektrische Messgröße M1 und zwischen dem dritten Leiterbschnitt L3 und dem vierten Leiterabschnitt L4 eine zweite Messgröße M2 feststellbar. Der Mikroorganismus MO oder die Mikroorganismen MO werden durch Einwirkung eines Sterilisationsprozesses zumindest abschnittsweise abgetötet und/oder abgelöst. Hierdurch ist bedingt, dass durch den Sterilisationsprozess zumindest eine Änderung der zweiten elektrischen Messgröße M2 zwischen dem dritten Leiterabschnitt L3 und dem vierten Leiterabschnitt L4 feststellbar ist.
In einer vorteilhaften Ausführungsform weist der Biosensor BS weiterhin eine Übertragungseinrichtung (ES) zur Einkopplung von Energie und zur Abgabe eines Messsignals oder eines Messergebnisses auf. Hierdurch kann der Biosensor auch an schwer zugänglichen Stellen platziert werden und erlaubt zudem eine direkte Messwerterfassung, ohne dass der Biosensor erst mit einer Messwerterfassungseinheit MEE verkabelt werden muss. Zudem wird in einer drahtlosen Anordnung auch eine einfache Möglichkeit geboten, eine online-Überwachung eines Sterilisationsprozesses durchzuführen, sodass die Prozesszeiten entsprechend angepasst werden können.
In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann der zweite Leiterabschnitt L2 und der dritte Leiterabschnitt L3 kombiniert ausgeführt sein. Hierdurch kommt dem kombinierten Leiterabschnitt eine Doppelfunktion zu und es bietet sich an, diesen kombiniert ausgeführten Leiterabschnitt als Speise-Elektrode auszuführen. Durch die kombinierte Ausführung können Fehler durch unterschiedliche Kontakte zu den Leiterabschnitten vermieden werden und zudem kann die Strukturgröße des Biosensors weiter reduziert werden. Zudem führt eine verkleinerte Strukturgröße zu einem Kostenvorteil in der Herstellung des Biosensors.
Je nach Einsatzzweck kann ein geeigneter Mikroorgansimus MO bzw. können geeignete Mikroorgansimen MO ausgewählt sein. Bevorzugt ist der Mikroorganismus oder sind die Mikroorganismen ausgewählt aus einer Gruppe aufweisend Geobacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus coagulans, Clostridium sporogenes, Bacillus subtilis globigii, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Aspergillus niger, Bacillus atrophaeus, oder einer Kombination dergleichen, und/oder Sporen dergleichen. Insbesondere die resistenten Dauerformen und/oder Sporen der vorgenannten Mikroorgansimen können dabei zum Einsatz kommen, um so eine sichere Aussage über das Sterilisationsverhalten gewinnen zu können.
Um eine besonders gute Wechselwirkung zu erzielen, können die Leiterabschnitte L1, L2, L3, L4 als Elektrodenstrukturen, z.B. in Form von Interdigitalelektroden, ausgebildet sein.
Bevorzugt ist der Biosensor BS auf einem Halbleitersubstrat oder einem Polymer-basierten Substrat aufgebaut. Hierdurch können die Biosensoren in großer Stückzahl hergestellt werden, wodurch ihr Einsatz deutlich kostengünstiger wird.
In entsprechender Weise betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Validierung eines Sterilisationsprozesses mittels eines Biosensors BS. Dabei wird in einem ersten Schritt ein erstes Messsignal in Bezug auf einen ersten Leiterabschnitt L1 des Biosensors und einen zweiten Leiterabschnitt L2 des Biosensors gemessen. In einem weiteren Schritt wird ein zweites Messsignal in Bezug auf einen dritten Leiterabschnitt L3 des Biosensors und einen vierten Leiterabschnitt L4 des Biosensors gemessen. Offensichtlich können diese beide Schritte auch kombiniert ausgeführt sein.
Anschließend wird der Biosensor BS einem Sterilisationsprozess ausgesetzt.
In einem nachfolgenden Schritt kann ein drittes Messsignal in Bezug auf den ersten Leiterabschnitt L1 des Biosensors und den zweiten Leiterabschnitt L2 des Biosensors gemessen werden, um so eine Aussage über einen eventuellen Abtrag/Veränderung des Sensorabschnittes S1 zu erhalten.
In einem weiteren nachfolgenden Schritt wird ein viertes Messsigsnal in Bezug auf den dritten Leiterabschnitt L3 des Biosensors und den vierten Leiterabschnitt L4 des Biosensors gemessen.
Anschließend werden die gemessenen Messsignale bewertet.
Insbesondere kann vorgesehen sein, dass aus dem Unterschied eines Verhältnisses des ersten Messsignals zum zweiten Messsignal zu einem Verhältnis des dritten Messsignals zum vierten Messsignal die Bewertung bereitgestellt wird. Hierdurch kann auf besonders einfache Weise die Veränderung sowohl des Sensorabschnittes S1 als auch des Sensorabschnittes S2 und der Anteil in Bezug auf die Sterilisation ermittelt werden.
Die Erfindung betrifft auch ein neuartiges (impedimetrisches) Online-Messsystem zur Validierung von Sterilisationsprozessen.
Ein entsprechendes erfindungsgemäßes Messsystem zur Validierung von Sterilisationsprozessen weist eine Messwerterfassungseinheit MEE und einen (impedimetrischen) Biosensor BS auf.
Zum Beispiel kann der Biosensor BS, wie in 5 gezeigt, mittels einer Messwerterfassungseinheit MEE direkt an der zu validierenden Sterilisationsanlage ausgelesen werden. Die Messwerterfassungseinheit MEE weist neben einer Übertragungseinrichtung ES auch eine entsprechende Auswertelogik CPU auf mittels der die Impedanz-Analyse und Signalerfassung und -auswertung vorgenommen werden kann. Beispielsweise kann die Auswertelogik CPU auch weitere Module aufweisen, z.B. eine Oszillatorschaltung zur Erzeugung einer Sinusspannung mit definierter Frequenz und Amplitude (z.B. „Direct Digital Synthesis“-Bauelement); einen Multiplexer zum Umschalten zwischen den beiden Sensorabschnitten sowie einen Transimpedanzverstärker. Wird eine Sinusspannung an die Impedanzstruktur angelegt, so kann mit dem Transimpedanzverstärker der resultierende Strom in eine messbare Spannung transformiert und mit einem Analog-Digital-Umsetzer digitalisiert werden. Die Signalerzeugung und -erfassung werden gleichzeitig durch ein Triggersignal gestartet, um eine genaue Ermittlung der Phasenverschiebung zuzulassen. Mittels diskreter Fourier-Transformation auf dem eingesetzten µ-Prozessor (oder separater Signalprozessor) kann der komplexe Strom für eine Anregungsfrequenz berechnet und mit der Anregungsamplitude die Impedanz bestimmt werden. Durch sequentielle Änderung der Anregungsfrequenz kann dann das jeweilige Impedanzspektrum der impedimetrischen Transducerstrukturen eines Sensorchips ermittelt werden. Weiterhin wird die Bestimmung des Differenzsignals der beiden Elektrodenstrukturen ermöglicht und die erfolgte Keimreduktion basierend auf hinterlegten Kalibrationsdaten ermittelt. Mittels einer Ein/Ausgabeeinheit I/O wird die ermittelte Keimreduktion entsprechend bereitgestellt.
Die Kopplung der Sensorabschnitte S1 und S2 mit der Messwerterfassungseinheit MEE kann einerseits „Drahtgebunden“ mit entsprechenden, unter Umständen geschirmten, Kabeln oder mittels einer drahtlosen Schnittstelle (z.B. ZigBee, RFID, Bluetooth) erfolgen.
Somit ist es möglich, den Sterilisationsprozess direkt in einer Prozessstraße oder in einer Umverpackung, wie diese bei Medizinprodukten eingesetzt werden, zu evaluieren.
Der impedimetrische Biosensor kann zur Überwachung der Keimanzahl in Sterilisationsprozessen jeglicher Art eingesetzt werden, in denen eine impedimetrisch erfassbare Strukturveränderung der Mikroorganismen hervorgerufen wird, wie chemischen Sterilisationsverfahren in der Gasphase mit Wasserstoffperoxid, Ethylenoxid, oder Formaldehyde, bei der Vakuumsterilisation mit Peroxyessigsäure und Wasserstoffperoxid, bei Plasmasterilisationsverfahren, Strahlungssterilisation mit UV-Strahlung oder Ionenstrahlung, sowie bei der Dampfsterilisation z.B. Autoklavieren.
Der impedimetrische Biosensor kann zur Validierung von Sterilisationsprozessen in der Lebensmitteltechnik, z.B. Verpackungs- sowie Anlagensterilisation, für die Sterilisation von medizinischen Geräten oder Medizinprodukten nach der Fertigung oder bei wiederverwendbaren Artikeln in Krankenhäusern sowie für die Sterilisation in der Pharmaindustrie, z.B. Verpackungs- und Anlagensterilisation eingesetzt werden.
Als biologische Rezeptorschicht auf der impedimetrischen Sensorplattform können je nach zu validierendem Sterilisationsprozess zugeschnittene/resistente Mikroorganismen MO, wie Sporen, immobilisiert sein; durch Anpassung der entsprechenden Ausgangskeimanzahl können unterschiedliche Log-Raten nachgewiesen werden. Mikroorganismen, die aufgrund ihrer Resistenz gegenüber den Sterilisationsprozessen üblicherweise zum Nachweis der Sterilisationswirkung eingesetzt werden, sind die Typen Bacillus, Geobacillus oder Clostridia. Diese können entsprechend als biologische Rezeptorschicht auf dem impedimetrischen Biosensor zum Einsatz kommen. Als Beispiel seien die folgenden Typen mit nachgewiesener Resistenz genannt: Geobacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus coagulans, Clostridium sporogenes, Bacillus subtilis globigii, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus atrophaeus. Hierunter vorrangig die entsprechenden höher resistenten Sporen der jeweiligen Art.
Eine exemplarische Messung mit einem solchen impedimetrischen Biosensor ist in gezeigt.
Zunächst erfolgte eine Nullmessung ohne Mikroorganismen zur Ermittlung der Grundimpedanz der Interdigital-Elektroden. Anschließend wurde eine Messung mit den immobilisierten Mikroorganismen zur Bestimmung der Impedanz der intakten Mikroorganismen durchgeführt. Nach erfolgter Sterilisation, mit Wasserstoffperoxid (4 Vol.-%) in der Gasphase, erfolgte eine weitere Impedanz-Messung. Die charakteristische Verschiebung des resultierenden Messsignals, im Bode-Diagramm, weißt eine morphologische Veränderung der Mikroorganismen nach. Als Mikroorganismen wurden in dieser exemplarischen Messung Sporen des Typs Bacillus atrophaeus auf der Sensoroberfläche immobilisiert, diese weisen eine erhöhte Resistenz gegenüber Wasserstoffperoxid auf.
Der erfindungsgemäße Biosensor BS ermöglicht eine direkte Überwachung des Sterilisationsprozesses und weist somit keine Verzögerung in der Produktfreigabe, durch beispielsweise das Einhalten von Inkubationszeiten der Bakteriensporen, auf.
Durch den erfindungsgemäßen Biosensor BS entfallen die labor- und zeitintensive Durchführung von mikrobiologischen Arbeitsschritten (Ansetzen von Verdünnungsreihen, ausplattieren der Mikroorganismen sowie Auszählung nach erfolgter Inkubation).
Zudem ermöglicht es der erfindungsgemäße Biosensor BS die biologische Rezeptorschicht MO, auf den zu validierenden Sterilisationsprozess anzupassen (durch Variation der Mikroorganismen hinsichtlich der Resistenz gegenüber dem Verfahren sowie durch Anpassung der Ausgangskeimzahl).
Weiterhin werden mittels der erfindungsgemäßen Biosensoren BS nicht nur einzelne Prozessparameter wie Druck, Temperatur oder chemische Konzentration erfasst, sondern es wird unmittelbar eine Strukturveränderung der Mikroorganismen MO detektiert. Das Detektionsprinzip ermöglicht somit eine Evaluation des gesamten Sterilisationsprozesses.
Der erfindungsgemäße Biosensor kann mittels Dünnschichttechnologie hergestellt werden. Hierzu werden auf einem geeigneten Substrat (in 2 und 3 schräg schraffiert) bzw. einer entsprechend vorbereiteten Oberfläche hiervon (in 2 und 3 eine Siliziumoxidschicht OX) zwei impedimetrische Transducerstrukturen, d.h. die Sensorabschnitte S1 und S2, als Differenz-Anordnung aufgebracht (in 2 und 3 schwarz dargestellt), d.h. eine „aktive“ Struktur mit immobilisierten Sporen und eine Referenzstruktur ohne Sporen, aufgebracht. Die beiden impedimetrischen Transducerstrukturen können jeweils aus zwei Interdigital-Elektroden-Anordnungen (z.B. Platin), abgeschieden auf einem siliziumbasierten Substrat, bestehen. Für unterschiedliche Größenordnungen der Impedanz können unterschiedliche Layouts der Strukturen verwendet werden, die auf die erforderliche Empfindlichkeit bzw. Nachweisgrenzen angepasst sind. So kann durch entsprechende Anzahl und Ausgestaltung der Elektrodenanordnungen (Fingergeometrien, Abstände, Anzahl der Finger) das Impedanzverhalten der Sensoranordnung optimiert werden. Durch die Differenzanordnung können störende Umgebungseinflüsse (z.B. Temperatur, Gasstrom, Feuchtigkeit, mögliche Kondensation des Prozessgases auf der Sensoroberfläche) minimiert und somit die Messgenauigkeit erhöht werden.
Zusätzlich können bestimmte Areale auf der Chipoberfläche mit Poren bzw. Kavitäten strukturiert werden (Kompartimentierung mittels chemischer Ätzprozesse (z.B. RIE) oder zusätzlicher Schichten (z.B. SU-8)), um eine gezielte Sporenimmobilisierung zu ermöglichen und die Sporen gegenüber Abräsionseffekten durch den Gasstrom zu schützen.
Zur Erhöhung der Sensorstabilität können zusätzliche Passivierungsschichten (z.B. Ta₂O₅, ONO, Polyimid) verwendet werden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 20120021406 [0017]
US 7008524 [0018]

Claims

Biosensor, wobei der Biosensor aufweist • einen ersten Sensorabschnitt (S1) aufweisend – einen ersten Leiterabschnitt (L1) und – einen zweiten Leiterabschnitt (L2), • und einen zweiten Sensorabschnitt (S2) aufweisend – einen dritten Leiterabschnitt (L3) und – einen vierten Leiterabschnitt (L4), • wobei zwischen dem dritten Leiterabschnitt (L3) und dem vierten Leiterabschnitt (L4) ein immobilisierter Mikroorganismus oder mehrere immobilisierte Mikroorganismen (MO) aufgebracht sind, • wobei zwischen dem ersten Leiterabschnitt (L1) und dem zweiten Leiterabschnitt (L2) eine erste elektrische Messgröße (M1) bzw. ein zweite Messgröße (M2) und zwischen dem dritten Leiterbschnitt (L3) und dem vierten Leiterabschnitt (L4) eine zweite Messgröße (M2) feststellbar ist, • wobei der Mikroorganismus (MO) oder die Mikroorganismen (MO) durch Einwirkung eines Sterilisationsprozesses zumindest abschnittsweise abgetötet und/oder abgelöst werden, • wobei durch den Sterilisationsprozess eine Änderung der zweiten elektrischen Messgröße (M2) zwischen dem dritten Leiterabschnitt (L3) und dem vierten Leiterabschnitt (L4) feststellbar ist.
Biosensor gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Biosensor weiterhin eine Übertragungseinrichtung (ES) zur Einkopplung von Energie und zur Abgabe eines Messsignals oder eines Messergebnisses aufweist.
Biosensor gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die erste und zweite elektrische Messgröße (M1, M2)) eine Widerstands-, eine Spannungs- oder Stromänderung, eine Impedanz- oder eine Kapazitätsänderung ist.
Biosensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Leiterabschnitt (L2) und der dritte Leiterabschnitt (L3) kombiniert ausgeführt sind.
Biosensor, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus oder die Mikroorganismen ausgewählt sind aus einer Gruppe aufweisend Geobacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus coagulans, Clostridium sporogenes, Bacillus subtilis globigii, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Aspergillus niger, Bacillus atrophaeus Bacillus subtilis, oder einer Kombination dergleichen, und/oder Sporen dergleichen.
Biosensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Leiterabschnitte (L1, L2, L3, L4) als Elektrodenstrukturen, z.B. in Form von Interdigitalelektroden, ausgebildet sind.
Biosensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Biosensor ein impedimetrischer Biosensor und die elektrische Messgröße (M1, M2) der Widerstand/die Impedanz/die Kapazität ist.
Biosensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Biosensor auf einem Halbleitersubstrat oder einem Polymer-basierten Substrat aufgebaut ist.
Messsystem zur Validierung von Sterilisationsprozessen, aufweisend eine Messwerterfassungseinheit (MEE) und einen impedimetrischen Biosensor (BS) gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche.
Verwendung einer Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche zur Kontrolle der Sterilisation in der Lebensmittelindustrie und/oder von medizinischen Geräten/Produkten.
Verfahren zur Validierung eines Sterilisationsprozesses mittels eines Biosensors gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 8, aufweisend die Schritte: • Messen eines ersten Messsignals in Bezug auf einen ersten Leiterabschnitt (L1) des Biosensors und einen zweiten Leiterabschnitt (L2) des Biosensors, • Messen eines zweiten Messsignals in Bezug auf einen dritten Leiterabschnitt (L3) des Biosensors und einen vierten Leiterabschnitt (L4) des Biosensors, • Aussetzen des Biosensors gegenüber eines Sterilisationsprozesses, • Messen eines dritten Messsignals in Bezug auf den ersten Leiterabschnitt (L1) des Biosensors und den zweiten Leiterabschnitt (L2) des Biosensors, • Messen eines vierten Messsigsnals in Bezug auf den dritten Leiterabschnitt (L3) des Biosensors und den vierten Leiterabschnitt (L4) des Biosensors, • Bewerten der gemessenen Messsignale.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei aus dem Unterschied eines Verhältnisses des ersten Messsignals zum zweiten Messsignal zu einem Verhältnis des dritten Messsignals zum vierten Messsignals die Bewertung bereitgestellt wird.