CN1140470A - 快速读出生物指示剂 - Google Patents

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K·J·陶茨福伊德斯
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Minnesota Mining and Manufacturing Co
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Abstract

本说明书描述了一种确定灭菌过程有效性的方法。它包括步骤：i)将待灭菌样品和含有微生物孢子的指示剂与灭菌剂接触，得到暴露处理过的孢子，ii)将暴露处理过的孢子与选定用于使孢子发芽的培养基接触，iii)测定暴露处理过的孢子的发芽率以确定灭菌方法的有效性。用分光光度技术，染色或不染色发芽孢子，可方便地确定暴露过的孢子的发芽率。本方法可用于不同类型的已知灭菌剂或方法。还描述了使用该方法的生物指示剂系统。

Description

快速读出生物指示剂
本发明一般涉及用生物指示剂来鉴定或确定灭菌方法有效性的设备和方法，更具体地，涉及一种通过微生物孢子发芽率(germination rate)的测量值与孢子存活率的相关性而确定灭菌方法有效性的快速方法。
技术背景
生物指示剂已被用于测试和/或确定灭菌方法的有效性。典型地，将含有微生物孢子的生物指示剂暴露于某种选定的灭菌剂或灭菌方法，然后将暴露处理过的孢子置于能够维持孢子发芽和微生物生长的环境中，从而确定暴露处理过的孢子的存活率。因为与绝大多数其他类型的微生物相比，微生物孢子被认为更耐灭菌过程，因此可以假设，能够杀死微生物孢子的灭菌方法同样可杀死其他任何污染微生物。参见，例如，Disinfection，Sterilization，and Preservation，Fourth Edition，ed.Block，Seymour S.，Lea&Febiger，Chapter6(1991)，该书报道了分析或评估灭菌方法所需的通用标准。
一般使用的生物指示剂，由于需要有足够的时间让孢子生长，通常都需要一段较长的孵育时间后才能评估灭菌方法的有效性。例如，一些市售的指示剂需要1-2天的孵育时间，然后才能评估灭菌方法的有效性。这些类型生物指示剂的可靠性取决于这些指示剂提供的数据与在生长7天之后观察到的孢子存活数目的相关性。
对快速检测的需求导致了一些能够在较短时间内指示灭菌有效性的设备和方法。例如，美国专利5,073,488和5,252,484分别公开了在数小时内测定灭菌方法有效性的方法和设备，它们是测试与孢子或细胞存活率相关的微生物酶活性。在另一个例子中，美国专利5,366,872报道了一种对生物指示剂中某些微生物酶的分析方法，该分析产生有颜色的、可肉眼观察的、并且与经过灭菌观察处理后样品中存活的细菌或微生物相关的信号。
如上所述，尽管在暴露于各种灭菌剂和/或灭菌方法之后的细胞存活率是灭菌过程有效性的一种传统衡量办法，但是对于这些灭菌剂或灭菌方法对其他类型的微生物活性方面的影响也进行了研究。已经用酶活性来确定灭菌过程的有效性。此外，微生物孢子的存活即细胞的存活，其表现的首先步骤是孢子发芽。孢子发芽是微生物孢子暴露于能支持微生物生长的条件下之后最初20-30分钟内发生的一系列不可逆的、复杂的生化事件。具体地说，人们相信，发芽是由环境中存在特定的发芽剂(germinants)所引发的。参见例如，Foster et al.，Molec.Biol.，4：137-141(1990)和Umeda et al.，J.Gen.Microbiol.，118：215-221(1980)。
作为特征，当孢子发芽时，它们吸收水分，并且在含孢子的悬浮液中对光散射的能力下降。该特性使得发芽过程可以用分光光度法测量光吸收的减少或光散射的减少而进行跟踪。具体而言，Dadd等人(Journal of Applied Bacteriolo-gy，60：42-433(1986))已经研究了环氧乙烷灭菌过程对枯草杆菌孢子发芽的影响。Dadd等人报道，暴露于致死剂量环氧乙烷的杆菌属孢子，在存在特定的发芽剂情况下不会停止发芽，尽管来自这些暴露处理孢子的杆菌属细菌并不生长。此外，这些研究者注意到，不同类型的培养基会产生发芽孢子的百分比不同。他们还发现，暴露于环氧乙烷的孢子会丧失发芽能力，但是这种丧失的速率低于细胞活丧失的速率。该报道表明，暴露于环氧乙烷会影响发芽孢子的数目以及存活孢子的数目。
因此，需要有一种能够在非常短时间内评估或指示灭菌方法有效性的生物指示剂。较佳的是，这种生物指示剂应能直接衡量孢子或细胞活力的丧失，或者应与孢子或细胞活力的丧失相关。能够快速评估灭菌方法的有效性，便能使灭菌方法的用户更有效、更可靠地工作。
发明概述
本发明提供了一种新的评估或确定灭菌方法有效性的方法。根据本发明，该方法包括下列步骤：i)将含有微生物孢子的指示剂与灭菌剂接触，得到经暴露处理的孢子，ii)将暴露处理过的孢子与选定用于使孢子发芽的培养基接触，iii)测定暴露处理过的孢子的发芽率以评估或确定灭菌方法的有效性。
本方法可与常规使用的各种灭菌设备和技术一起使用。例如，可用该方法监测已知灭菌剂或灭菌方法的灭菌有效性，例如蒸气、环氧乙烷、辐射、热、次氯酸钠、聚乙烯吡咯烷酮-碘、二氯氰尿酸钠、低温蒸气-甲醛、戊二醛和过氧化氢、过氧化氢等离子体或这些灭菌剂或方法的组合。
在一个优选实施方案中，本发明提供了一种确定环氧乙烷灭菌有效性的方法。在该例子中，在灭菌负荷中加入枯草杆菌(ATCC编号9372)的细菌孢子，经常规的环氧乙烷灭菌暴露处理。在暴露处理之后，在选定用于增加暴露处理孢子发芽机会的培养基中于大约37℃条件下孵育孢子。在过了数分钟的延迟之后，计算线性反应速度(linear reaction velocity，LRV)，该LRV是反应曲线上下降最陡部分的衡量(在该例子中，LRV是选定样品的最大发芽速率。)，这项计算通常是在孵育约4-20分钟(较佳地5-7分钟)之后进行，温度约为20-45℃，较佳地约为37-40℃。
在本发明的这个实施方案中，用暴露处理过的孢子在介质中的光密度测量值的变化(在约480nm光波长处的吸光度，简称ABS或abs)除以在这些测量值之间的时间(分)，得出LRV。线性反应速度与活孢子或细胞的存活率呈线性相关。简而言之，LRV越低，则经过一定灭菌方法处理的给定生物负荷中有菌单元的概率(probability of non-sterile units，PNSU)越低。
用已知的光散射技术，让光通过悬浮在合适透明容器中的发芽培养基可以轻易地测定线性反应速度。例如，可用吸收分光光度计(基于光吸收)或悬浮体散射仪(基于光散射)，根据悬浮孢子的光散射行为确定孢子的发芽率。或者，培养基也可含有已知的指示剂，它们在存在发芽孢子时会产生可检测的应答，然后便可用由孢子发芽所引起的指示剂变化的测量值来确定LRV。合适的指示剂包括四唑盐，如氯化2，3，5-三苯基四唑、氮蓝四唑、氯化2-(对-碘苯基)-3-(对-硝基苯基)-5-苯基四唑、氯化氰基二甲苯基四唑或其他用于分析或测量微生物酶活性的氧化还原染料或指示剂。
在另一实施方案中，本发明提供了一种确定灭菌方法有效性的生物指示剂系统。一个优选的系统包括容器装置，它用于盛装微生物孢子，以便使微生物孢子可暴露于灭菌剂，也可使暴露处理过的孢子接触发芽培养基；发芽装置，它用于使孢子与培养基接触并孵育孢子；检测装置，它用于测量孵育孢子的发芽率，计算经暴露处理和孵育后孢子的LRV，并且根据计算的LRV指示灭菌过程的有效性。
一种优选的生物系统包括枯草杆菌(ATCC编号9372)的细菌孢子，它盛装在聚(甲基丙烯酸甲酯)的样品槽(cuvette)中；含有养分、离子和发芽剂的发芽培养基；和配有温度控制与能记录和计算LRV的计算机的吸收分光光度计。
附图简述
图1和图2分别是测得的枯草杆菌孢子和嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillusstearothermophilus)孢子的发芽速率或发芽动力学图。
图3是经环氧乙烷暴露处理的枯草杆菌孢子(其D值为2.7分钟)的存活曲线图以及观测到的该类型细菌孢子的LRV曲线。
图4-10是枯草杆菌孢子暴露于环氧乙烷后，处于不同培养基或存在不同发芽剂条件下孢子的线性反应速度图。
图11是两批不同枯草杆菌孢子的线性反应速度图。
详细描述
本说明书描述了一种非常快速地评估或确定灭菌方法有效性的方法。本发明利用了孢子发芽对灭菌环境极其敏感和孢子发芽率的测量值与暴露于灭菌剂或灭菌方法后细胞活力或孢子存活率直接相关的现象。换言之，孢子发芽率的测量值与一定生物负荷(bioburden)的样品经灭菌方法处理后，存活微生物的杀灭曲线相关。
上面提及的基于生长或基于酶的生物指示剂(biological indicator，BI)，只有在每单元有一个或多个活孢子存活并且生长到形成足以检测的细胞群时，才是有效的。为了检测给定负荷中更低的存活率，必须增加BI的数量。例如，为了检测每单元0.01活微生物的存活率或灭菌终点，需要至少485个BI。如此多数目的BI对于监测灭菌方法是不切实际的。因此，目前的BI不能指示在灭菌过程中是否达到所需的灭菌终点例如每单元10-6微生物。此外，如果测试结果为阳性，这些BI显示每单元存活着一个或多个活孢子。因此，需要一种BI，它能为10-6或更少微生物的PNSU灭菌终点提供数值。
具体地说，由与含有选定发芽剂的发芽培养基一起孵育数分钟之内的孢子发芽速率，便可预测出有活力的存活孢子的数目。简单地说，由发芽过程的敏感性和发芽率与活力的直接关系，便可从细菌孢子的发芽速率非常快速地得出灭菌方法的灭菌终点为PNSU10-6或甚至更低的有效性。
在本发明的一个方面，使用与含有特定发芽剂的发芽培养基接触的细菌孢子便可获得发芽速率或发芽动力学。尽管可以使用在较宽光波长范围的测得的发芽的速率或动力学，但是已发现，在最佳温度约37-40℃时，发芽速率在约460-520纳米范围最快和最有重复性。此外，对于给定浓度的孢子，在400-700纳米的吸光度的下降是不对称的。即低于480纳米时，吸光度开始陡峭地上升，而大于480纳米时，它逐步下降，因而在大于480纳米的波长情况下，在某种程度上需要使用更高浓度的孢子。
暴露处理过的孢子的最大发芽速率即LRV(反应曲线的下降最陡部分)，用分光光度法或光散射技术(采用或不采用发芽孢子的染色)，用本领域已知的设备和方法可以方便地测定。用样品光吸收或光散射的变化除以时间，可方便地得出给定样品的LRV。当用吸光度来衡量光密度(光密度是溶液中发芽孢子数目的度量)时，给定样品的LRV由下式给出：
                LRV＝吸光度的改变/时间(分钟)在常用的光波长约400-600纳米，较佳约480纳米条件下方便地算出吸光度。吸光度测量的较佳时间间隔约为4-20分钟，最佳约为5-7分钟。
已经发现，由于外部因素例如环氧乙烷灭菌剂(ETO)而造成的群落中微生物的死亡，用一级过程动力学进行描述最为适合，因为这些微生物数目的减少是对数式的。参见，例如，Pflug，I.J.and R.G.Holcomb，"Principles of the ther-mal destruction of microorganisms"，Disinfection，Sterilization，and Preser-vation，Fourth Edition，S.S.Block，ed.，Lea and Febiger，(1991)。这样，在时间逐渐增长地暴露于灭菌或杀灭处理的条件如ETO之后，每单元存活的微生物数目可通过下列线性回归方程，然后在半对数图纸上作图而得出。
                   log N＝-U/D+log N0其中N等于暴露于ETO一段时间U后，每单元中残留的微生物数目。U为暴露于ETO时间的分钟数目。D是十进制减少时间(具体地，即杀灭一个对数的孢子或细胞所需的时间)，它对于给定的条件和给定批号的孢子或细胞是一个常数。因此，D是直线死亡曲线的斜率的负倒数。N0等于在灭菌过程开始时每单元的孢子或细胞数目。
图3显示了LRV应答曲线与ETO暴露处理时间的线性关系，还显示了试验测得的LRV数据与枯草杆菌孢子计算存活曲线的相关关系。对于图3所示的数据，测得的D值为2.7分钟，而N0为4.2×106个孢子/单元(3M 1264 AT-TEST Biological Indicator，lot#211，3M，St.Paul，MN)。随D值不同，存活曲线的斜率不同。结果，暴露于灭菌条件如气体之后，存活枯草杆菌孢子的LRV与在受灭菌处理的生物负荷即材料中可发现的生物体细胞的存活情况相关。因此，在灭菌过程之后，用分析孢子存活情况的这个LRV方法，就可以第一次使用生物指示剂来获得任何微生物的预期存活的直接定量衡量，这些微生物包括最不耐灭菌和最耐灭菌的种类。此外，使用本LRV方法，可以评估低达10-16活力微生物/单元的灭菌有效性。
在本发明的一个优选实施方案中，将装有含细菌孢子的生物指示剂的负荷批料与灭菌剂接触，得到经暴露处理的孢子。可用于本发明的合适孢子，包括常用于监测各种灭菌方法(如用蒸气、干热、γ射线、环氧乙烷)的那些孢子。适用的孢子包括杆菌属和梭状芽胞杆菌属物种的孢子。在生物指示剂中可适用的其它微生物孢子可见美国专利661,717。枯草杆菌孢子，例如市售的枯草杆菌孢子ATCC9372(美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)可优选用于监测使用环氧乙烷的灭菌过程，而嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)孢子，例如市售的嗜热脂肪芽胞杆菌孢子ATCC8005或ATCC7953(美国典型培养物保藏中心)或嗜热脂肪芽胞杆菌孢子DV296(可从School of Pharmacy andPharmacology，University of Bath，Bath，U.K.的培养物中心获得)可优选用于监测使用蒸气或低温蒸气甲醛灭菌的过程。如果需要，在本发明中还可以使用其他对灭菌过程有适当耐受性的微生物。如果需要，在本发明方法中可组合使用一种或多种类型的孢子，以便监测一种以上的灭菌方法。
为了实施本发明，选定的孢子最好根据已知的方法制备，然后将校正数目的孢子加入容器，该容器适合在灭菌过程之中或之后盛装孢子。孢子一般以水悬浮液形式加入容器，然后干燥；也可以在加入容器之前干燥。孢子可以用几种不同的已知方法干燥，而且可在水溶凝胶或在孢子暴露于灭菌过程之后对干燥孢子在发芽培养基中再悬浮有促进作用的试剂存在条件下进行干燥。参见，例如Hanlon et al.，Letters in Applied Microbiology，17：171-173(1993)，该文献报道将孢子掺入冻干的褐藻胶珠中，以便用于生物指示剂中。
用于盛装合适孢子的容器可以是各种形状的，并且可以用各种不同材料制成。合适的容器要使灭菌剂便于与容器中的孢子相接触。此外，如果发芽率是用分光光度法测量的，合适的容器应对选定频率的光透明，并且不会干扰检测方法。最后，合适的容器还应能防止孢子在发芽阶段之前和/或之后受到污染。本领域的技术人员知道，用石英玻璃或各种聚合物材料如聚(甲基丙烯酸甲酯)或聚苯乙烯等制得的各种形状的容器都可用于实施本发明。
所用的容器最好可使所装的孢子与选定的灭菌剂接触，并且也可与合适的发芽培养基接触。经干燥的孢子可用数种不同的方法再悬浮于发芽培养基中。用于孢子发芽的培养基可用数种不同的方法加入，如用注射器或移液管手工加入，或者以自动方式加入，作为自动读取设备中编程方法的一部分。该设备可经设计特别用来处理和分析灭菌结果，用的是下面实施例中所述的分光光度法。
为了使本发明读取数据的时间极快，即小于约10-15分钟，可配制发芽培养基使其含有养分、离子和其他促进经暴露处理的孢子快速发芽的组份。根据浓度/应答曲线，确定了适合作为枯草杆菌孢子发芽剂的16种氨基酸的KM和Vmax，以便确定这些氨基酸在培养基中的使暴露于ETO的孢子发芽的适用浓度。经测试，有3种氨基酸直至其各自溶解度的任何浓度下都不能起发芽剂的作用。对最有效的几种氨基酸发芽剂，如下列实施例6中所述测定了其ETO应答曲线。只有对L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺，观察到LRV的线性下降。当孢子发芽是用其他试用的氨基酸进行激活时，ETO的影响显得非常小，因为LRV应答下降很小或者不下降。例如，由L-丙氨酸和L-缬氨酸激活的LRV应答仅在暴露于ETO处理约40分钟后才有明显的下降。因此，已经发现，L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺是测量ETO对枯草杆菌孢子的杀灭效应最有用的氨基酸。
此外，观察到D-氨基酸看来对L-氨基酸与孢子位点结合从而引发孢子发芽起着竞争性抑制剂的作用。参见，例如，Woese，C.R.；Morowitz，H.J.；and Hutchinoson III，C.A.；"Analysis of action of L-alanine analogues inspore germination"，J.Bacteriol.，76：578-588(1958)。L-氨基酸发芽剂的一个有力抑制剂是D-丙氨酸。在测量对应于L-天冬酰胺的孢子发芽的竞争性抑制的试验中，结果表示对D-丙氨酸和L-天冬酰胺有2个结合位点，一个在D-丙氨酸浓度约为0.3-10微克/毫升时，另一个在D-丙氨酸浓度约为10-100毫克/毫升时。因为L-天冬酰胺的有效浓度为1-15毫克/毫升，因此似乎L-天冬酰胺主要与低亲和性位点结合。因此，L-氨基酸发芽剂的低亲和性结合位点必然是对ETO失活作用敏感的位点，而高亲和性结合位点必然是对ETO失活作用不敏感，或至少是较不敏感的位点。所以，通过用非常低浓度的D-丙氨酸抑制L-天冬酰胺与高亲和性位点的结合，可以消除ETO不敏感系统对由L-天冬酰胺激活的孢子发芽应答LRV的影响，从而获得所需的更陡峭的LRV应答曲线。
当使用杆菌属孢子时，本发明的优选培养基含有下列组分：0.01-0.2M(较佳0.05M)磷酸缓冲液(等量KH2PO4和Na2HPO4)，0.15g/l葡萄糖，0.15g/l果糖，3.0g/l NaCl，5.0g/l乙酸钾，3-15g/l(较佳10g/l)L-天冬酰胺，且pH约为6.8-7.8，较佳约为7.25。或者，可用L-谷氨酰胺作为发芽剂，其浓度约为10.0-20.0g/l，较佳约为10.0g/l。
已经观察到，杆菌孢子的发芽速率对灭菌环境、孢子的操作条件以及发芽培养基都是敏感的。具体地说，已发现湿度或发芽培养基的细微变化会对孢子发芽产生可观察到的影响。还发现，在发芽速率成为线性之前有一个短的滞后时期。该滞后时期一般非常短，但是与暴露过的孢子所经的操作和灭菌环境有关。例如，当孢子在约37℃干燥时，该滞后时期约为8-9分钟，而当孢子在约45-55℃干燥时，该滞后时期约为4.5-5分钟。然而，在最初的滞后时期之后，可在短于约10分钟的时间内方便地测定LRV。
当灭菌剂是环氧乙烷，且细菌孢子是枯草杆菌孢子ATCC编号9372时，本方法显示，当对于每个样品槽含有约108个孢子的特定孢子样品计算出的LRV等于被灭菌处理的批料的生物负荷中预期耐性最强的微生物的预计灭菌终点时，则灭菌方法是有效的。因此，对于D值为2.7分钟的枯草杆菌孢子，如图3所示，0.01吸光度单位/分钟的线性反应速度表明，达到了PNSU为10-6的灭菌终点。较高的LRV表示灭菌有效性较低，而较低的LRV表示灭菌有效性较高。
本方法可用于多种已知的灭菌剂，包括(但并不限于)蒸气、环氧乙烷、辐射、热、次氯酸钠、聚乙烯吡咯烷酮-碘、二氯氰尿酸钠、低温蒸气-甲醛、戊二醛、过氧化氢、过氧化氢等离子体或这些灭菌剂或方法的组合。在下列实施例中提供的结果表明，线性反应速度的测定是表征孢子存活的一种非常灵敏和非常快速的衡量。它比任何已知的或目前市场上的生物指示剂更快速，而且预期使用该生物指示剂系统和本发明的方法可以快速地，通常在少于约15分钟时间内，确定包括例如蒸气、热、化学灭菌及其组合(例如低温蒸气-甲醛和过氧化氢等离子体灭菌)等各种方法的有效性。
下列实施例用于进一步阐述本发明的实施。这些实施例不应理解为用于限制本发明的范围。本发明的范围由所附的权利要求书限定。实施例实施例1-孢子发芽条件
使用枯草杆菌孢子，ATCC9372，它是装在透明的聚(甲基丙烯酸甲酯)样品槽内培养基中的，浓度约为每毫升2×108个孢子。使用下述的Cary13/Varian分光光度计测量，该浓度的孢子在480纳米的最初吸光度约为0.4500光密度(OD)单位。可以使用的孢子浓度范围为每2毫升1.5×108-6×108个孢子。
所用的标准发芽(SG)培养基含有用KH2PO4和Na2HPO4(各3.475g/l)配成的0.05M磷酸盐缓冲液，22℃，pH为7.0；还含有0.1M NaCl；5g/l葡萄糖1，10g/l L-天冬酰胺。
使用Cary13/Varian分光光度计通过测量吸光度来测定发芽动力学，该分光光度计配有控制温度的样品槽架。发芽动力学可在400-600纳米范围内的任何光波长下测量。最好使用可见光范围内的波长。发芽动力学在37℃测量。
LRV，即每个选定的孢子样品的最大发芽速率的测量值，是从计算的发芽曲线的线性部分确定的。LRV通常是从发芽反应开始后4-10分钟间隔处的发芽曲线的负斜率得出。当L-丙氨酸是培养基中的发芽剂时，最大LRV在4.5-6.5分钟间隔获得，当L-天冬酰胺用作培养基中的发芽剂时，最大LRV在4.5-6.5分钟间隔获得。L-丙氨酸用作培养基中的发芽剂时，其优选浓度是0.4g/l。实施例2-LRV和经ETO暴露处理后孢子存活率的相关性
将几份约14微升的枯草杆菌ATCC9372孢子悬浮液加入聚(甲基丙烯酸甲酯)样品槽中，每样品槽含2×108个孢子。将各份孢子在54℃干燥过夜(16小时)。将一套装有干燥孢子的小样品槽和3M1264ATTEST生物指示剂装置(1264BI装置，在美国专利3,661,717中有一般性描述，可从3M公司，St.Paul，MN购得)置于Joslyn-B.I.E.R.ETO容器的内部，暴露于ETO不同时间。ETO暴露过程包括在54℃和相对湿度60％条件下预湿化处理30分钟，然后释放ETO至浓度为600毫克/每升空气，随后将ETO排空，再通空气1分钟。
在ETO暴露处理之后，将1264BI装置内部安瓿中的生长培养基通过打碎指管(vial)释放出来，将装置置于37℃的保温器中，让存活的孢子生长7天。对各个ETO暴露处理时间，都使用160个1264 BI装置。每个装置含有5.4×106个孢子组成的孢子带。
对样品槽中经ETO暴露处理的孢子，测定其发芽动力学的过程如下。将1毫升实施例1中所述的SG培养基(但不含发芽剂)加入各样品槽中，振荡使孢子再次悬浮。将搅拌棒放入样品槽中，然后将样品槽置于分光光度计的控制温度的槽架上，在37℃搅拌10分钟从而完成孢子的再悬浮(通过在Vortex混合器上剧烈晃动1分钟也可使孢子再悬浮于2毫升完全SG培养基中，如在随后的实验中所做的那样。)。接着，将1毫升含有20毫克L-天冬酰胺的SG培养基加入样品槽，记录发芽动力学数据，并将测得的480纳米吸光度变化除以时间计算出LRV。各个ETO暴露是在LRV在4.5-6.5分钟的时间间隔内确定的。表I表示测得的结果。LRV是四次结果的平均值。
                        表I
 ETO暴露处理时间  LRVOD单位/分钟  ％标准偏差  孢子生长％阳性BI
 0  0.0299  10.0  100.0*
 10  0.0185  4.2  100.0*
 20  0.0106  5.6  94.0
 30  0.0065  4.6  0.0
 40  0.0047  6.4  0.0
 60  0.0031  11.3  0.0
*预期值，不是实验中测量的。
这些结果表明，在LRV和显示孢子生长和存活的市售1264BI装置的百分比之间存在相关性，即LRV直接正比于因存活孢子的生长而显示阳性颜色变化的1264BI装置的百分比。为了获得最佳的相关结果，在灭菌过程中应将装有干燥孢子的的样品槽置于灭菌器负荷中靠近1264BI装置的地方。在该实施例中，在所列的条件下，0.005OD单元/分钟或更低的LRV表示灭菌充分。0.005-0.008OD单元/分钟表示灭菌勉强及格。大于0.008OD单元/分钟表示完全的灭菌失败。
此外，这些结果表示，孢子核心细胞的活力即其生长和复制的能力，对ETO的敏感程度远大于发芽率对ETO的敏感程度。实施例3-LRV和经ETO暴露处理后孢子存活率的相关性
本实施例的步骤与上面实施例1相同，不同的是样品槽中孢子在37℃干燥过夜(16小时)，而且孢子再悬浮于样品槽中是在加入2毫升完全MG培养基之后在Vortex混合器上剧烈振荡1分钟来实现的。各个ETO暴露处理条件的LRV，是发芽曲线的5-7分钟范围确定的，这是为了补偿当干孢子是在Vortex混合器上进行再悬浮条件下发生的发芽之前有稍长的滞后时间。未暴露于ETO(0分钟ETO)的孢子发芽的LRV上在发芽曲线的8-11分钟范围确定，因为孢子是在37℃而不是55℃进行干燥，所以在孢子发芽前有更长的滞后时期。经过于ETO暴露处理的孢子，发芽没有这么长的滞后时期，因为它们在Joslyn-B.I.E.R.容器的ETO灭菌过程中是处于较高的温度。这种温度对孢子发芽的影响是众所周知的现象。
                          表II
 ETO暴露处理时间  LRVOD单位/分钟  ％标准偏差  孢子生长％阳性BI
 0  0.0241  3.3  100.0*
 10  0.0115  6.1  100.0*
 20  0.0078  7.7  99.4
 25  0.0105  7.6  55.0
 30  0.0057  10.6  0.0
 60  0.0021  14.3  0.0*
*预期值，不是实验中测量的。
这个实验的结果与上一个实验基本相同，即LRV直接正比于因暴露于ETO后存活孢子的生长而显示阳性颜色变化的BI装置的百分比。
在这个实验中，LRV较低是由于干燥孢子的方法不同，而不是因为在分光光度法测量之前将孢子再悬浮于样品槽中方法的不同。在37℃干燥的孢子预期会比在55℃干燥的孢子保留更多的水分。在孢子的ETO灭菌领域中，人们熟知孢子死亡率与孢子的水分含量是成正比的。
暴露于25分钟ETO灭菌过程的孢子，其发芽LRV高于预期值。这种与在所有其他实验中大多观察到的在LRV和孢子存活之间线性关系的偏离是由于在灭菌过程中在样品槽上紧盖着铝箔的缘故。因此，在样品槽中的干孢子接受ETO灭菌处理的程度低于所期望的程度。然而，即使存在这种偏离正常情况的现象，此处测定的LRV和经ETO暴露处理的枯草杆菌孢子存活之间的相关性仍然正确。实施例4-LRV和经ETO暴露处理后活孢子存活率的相关性
步骤与上面实施例1-3相同，除了有下述的不同。将悬浮于去离子水中浓度约为7.5×109/毫升的枯草杆菌孢子悬浮液加热处理2-6小时(较佳4小时)，以获得最大的发芽率。为了减少每样品槽中所用的孢子数目，但仍能使起始光密度(OD)维持在约0.45-0.5单位的优选测量范围内，使用半微量聚(甲基丙烯酸甲酯)样品槽。将约16微升处理过的孢子悬浮液加于各样品槽中，使得当再悬浮于1.2毫升发芽培养基中时起始OD约为0.45-0.5。将装有孢子悬浮液的样品槽置于保温器中，在45-50℃干燥过夜(约16小时)，这是通过试验确定的孢子最大发芽率所需的最佳温度范围。干燥过夜后，将孢子储藏在室温下，此时不会丧失发芽活性。对每个暴露处理时间使用4个样品槽。
按上面实施例中所述的方法，将装孢子的样品槽和3M 1264 ATTEST生物指示剂(BI)装置(批号263，D＝2.7分钟，4.8×106个孢子/BI)置于Joslyn-B.I.E.R.容器中经受ETO暴露处理。不同点在于，在60％相对湿度停留30分钟之前和样品槽接受完整的ETO暴露处理之前，增加15分钟在54℃的预处理。这种预处理是为了消除孢子对ETO应答的差异性。如果容器中的负荷在湿化处理的步骤之前没有平衡到适当的温度，那么将达不到正确的含水量。因此，取决于负荷材料的多少，给定ETO暴露时间的灭菌有效性就会变化。这可能是造成上表II在25分钟ETO暴露中数据偏离的最可能原因。在ETO暴露过程之后，对样品槽和1264BI装置在室温下通空气20-24小时，然后再引发生长并测定发芽率。
发芽率的测量与上述方法基本相同，不同的是孢子再悬浮于1.2毫升发芽培养基是通过在Vortex Genie II混合器上在最大速度下振荡30-45秒实现的。在再悬浮好孢子后，在样品槽中不放置搅拌棒，因为孢子在发芽过程中仍在悬浮液中。发芽培养基含有0.05M磷酸盐缓冲液(等量KH2PO4和Na2HPO4)、0.15g/l葡萄糖、0.15g/l果糖、3.0g/l NaCl、5.0g/l乙酸钾和10g/l L-天冬酰胺，其pH为7.25。发芽培养基经过孔径0.2微米的尼龙膜的过滤灭菌处理。对每个数据点有4个重复实验。
                      表III
 ETO暴露处理时间  LRVOD单位/分钟  ％标准偏差  孢子生长％阳性BI
 0  0.0301  2.8  -
 5  0.0253  4.1  -
 15  0.0187  3.8  100
 20  *0.0155  1.3  98.8
 30  0.0120  2.2  0.6
 45  0.0073  4.4  0.0
 60  0.0048  10.5  -
*LRV得自线性ETO应答曲线。
结果表明，在LRV和用BI装置确定的活力细胞的存活百分比之间存在直接的相关关系。如本实施例中所述，随着实验步骤和发芽培养基的改善，观察到的线性反应速度的差异降至1-11％之间，平均为4.5％。活力存活孢子百分比的差异稍高，这是由于存活曲线陡峭造成的(参见，例如图3)。实施例5-LRV和预期的活孢子存活率的相关性
在下表IV中所列的数据是用在图3中解释的线性回归方程产生的。在该方程中，N0为4.2×106个孢子每个BI(组#211，3M1264ATTEST BI)，D值为2.7分钟。LRV值来自实施例4中的表III。数据表明，LRV的测量值可用来评估大群活孢子在灭菌过程中存活情况，而且该存活率远低于用常规的孢子或细胞生长生物指示剂所确定的存活率。
                                    表IV
 ETO暴露处理时间 U/D -U/D+log N0  N(活孢子/单元)  LRV(表3)
 5  1.8518  4.7714  5.9×104  0.0253
 10  3.7037  2.9195  8.3×102  -
 15  5.5555  1.0677  1.2×101  0.0187
 20  7.4074  -0.7842  1.6×10-1  0.0155
 25  9.2593  -2.6361  2.3×10-3  -
 30  11.1111  -4.4879  3.3×10-5  0.0120
 35  12.9630  -6.3398  4.6×10-7  -
 40  14.8148  -8.1916  6.4×10-9  -
 45  16.6666  -10.0434  9.1×10-11  0.0073
 50  18.5185  -11.8953  1.3×10-12  -
 55  20.3704  -13.7472  1.8×10-14  -
 60  22.2222  -15.5990  2.5×10-16  0.0048
由于一群微生物死亡量随时间的变化呈对数形式，因此不可能达到完全无菌。所以，通常可接受的灭菌终点是有菌单元概率(PNSU)为10-6。这个灭菌终点表示，在一百万个受灭菌处理的单元中只有一个单元被一个活孢子污染(Pfulg，I.F.，"Charpter 4-Description，establishment，and statistical char-acteristic of the endpoint of a microbial preservation process"，Microbiologyand Engineering of Sterilization Processes，Seventh Eidition.由Environmen-tal Sterilization Laboratory，Minneapolis，MN(1990)出版)。实际上不可能确定PNSU低于10-3的活孢子存活率，因为即使在这种灭菌终点下，人们需要的最小样品大小就达到4603个BI单元(Spicher，G.，"Sterilization-DieMikrobiologie zwischem Anspruch und Wirklichkeit，"Zbl.Hyg.，194：223-235(1993))。此外，就使用BI来监测灭菌方法而言，每批负荷灭菌实际上时不可能使用超过100个BI，因此实际上就将灭菌保证度限制于PNSU为10-1。
结果，目前的基于读出生长或基于酶分析的BI仅能显示阳性或阴性结果，不能显示所需的10-6灭菌终点PNSU是否的确达到。对于常用的BI，阳性结果意味着每个单元存活着了多于0.1个活孢子，因而灭菌过程是无效的。然而，阴性结果仅表示每个单元存活的活孢子小于0.1个。
LRV法使得可以第一次评估灭菌过程中条件是否达到所需的灭菌终点即PNSU为10-6或更低。LRV应答对灭菌过程中灭菌容器中条件的波动非常灵敏。实施例6-经ETO暴露处理后孢子对氨基酸发芽剂的应答
如上面诸实施例一样，将枯草杆菌孢子暴露于ETO。按实施例4所述的方法确定发芽动力学和LRV。在图4-9中某些氨基酸所用的缩写如下：L-GLN为L-谷氨酰胺；L-LEU为L-亮氨酸；L-THR为L-苏氨酸；GABA为γ氨基丁酸；L-VAL为L-缬氨酸。每个数据点是四次重复的平均值。在图中代表使用L-GLN时的发芽结果的测量数据，对于各个所示的暴露处理时间是用经受该时间的ETO暴露处理的孢子测得的。
这些数据表明，在据信存在于枯草杆菌孢子中的两种假设孢子发芽系统中，由L-ASN和L-GLN激活的系统对ETO是灵敏的，而由L-ALA(L-丙氨酸)和其他氨基酸激活的系统对ETO不灵敏或者至少很不灵敏。Dadd和Rum-below(J.appl.Bacter.，60：425-433(1986))推测，由L-ALA激活和由L-ASN激活的两种发芽系统可能对ETO灵敏度不同，尽管他们的数据并不能区分这两种假设的系统。Dadd和Rumbelow在孢子接受ETO暴露处理后，之所以不能根据不同发芽剂的应答区分这两种孢子发芽系统，可能是因为他们在孢子发芽激活后2小时或更久后才测量孢子发芽百分比，用的是在显微镜中计数相暗(发芽)孢子的个数，但是没有测量发芽率。另一方面，在此处报道的工作中，测量的应答是激活后25分钟内的孢子发芽率。此外，Dadd和Rumbelow声称，L-LEU和L-THR不能使暴露过ETO的孢子发芽。此处所示的结果清楚地表明，暴露过ETO的孢子的确因这些氨基酸的存在而发芽了。这又一次说明了本发明的成果出乎意外。实施例7-D-丙氨酸(D-ALA)对经ETO暴露处理后孢子LRV应答的影响
实验步骤与实施例4相同，不同的是用D-ALA加入到发芽培养基中。D-ALA的有用浓度是每毫升发芽培养基0.5-1.2微克。优选的D-ALA浓度约为0.8-1.0微克/毫升。
如图10所示，加入非常低浓度的D-ALA会增加LRV应答曲线的斜率26％，这在某些情况下是有利的。这种结果的最可能的解释是，在低浓度下，D-ALA对于L-ASN与对ETO相对较不灵敏的发芽系统的控制激活的位点的结合起抑制作用。因此，只有对ETO灵敏的系统才由L-ASN激活。
此外，如实施例6所示，这些结果显示，大多数活性氨基酸可能不同程度地结合于枯草杆菌孢子中存在的所有发芽系统(两个或更多)的所有位点。然而某些氨基酸如L-LEU、L-THR和GABA主要结合并激活高亲和性的位点(相对于L-ALA和D-ALA的结合而言)，而其他氨基酸如L-ALA、L-VAL与低亲和性位点和高亲和性位点都能结合。因此，与GABA、L-THR或L-LEU相比，L-ALA和L-VAL有更陡峭的应答ETO处理的LRV曲线，在较长时间的ETO暴露处理范围尤其如此。
对于某些灭菌情况，更陡峭的LRV应答曲线可能是有利的，因为灵敏度更高。因而，向发芽培养基中添加少量D-ALA可提供这种所需的效果。实施例8-在枯草杆菌孢子LRV应答方面各批之间的差别
实验步骤与实施例4相同。将装有来自两个不同孢子批号的孢子的样品槽同时接受ETO暴露处理。每个数据点作四次重复。发芽培养基与实施例4中的相同。
                              表V
 ETO暴露处理时间  批号3/93LRV  ％标准偏差  批号#26LRV  ％标准偏差
 0  0.0335  2.6  0.0307  5.8
 2  0.0309  3.8  0.0279  4.7
 15  0.0189  13.6  0.0197  5.2
 40  0.0080  16.6  0.0062  10.6
 60  0.0037  16.6  0.0038  5.7
在暴露于ETO之前或之后的LRV应答中，在两批收获时间相差一年的孢子之间基本上没有差别或只有很小差别。对于最后3个ETO暴露处理的时间，3/93批号的标准偏差比通常情况要大。在这3个ETO暴露处理时间中，#26批号的LRV应答稍微低些。这可能是因为与3/93批号相比，#26批号是曾经储存在稀释度更大的悬浮液中，因此必须通过离心方法将孢子浓度浓缩至与3/93批号相同的浓度。在用#26批号的其他试验中，LRV应答始终稍低于3/93批号。然而，所有其他的LRV特征对两种批号的孢子都是相同的。这些结果示于图11。实施例9-过氧化氢等离子体灭菌过程对枯草杆菌孢子LRV应答的影响
如实施例4那样，准备8个装有枯草杆菌孢子的半微量样品槽。将4个样品槽置于3M STERI-LOK多孔膜的袋(3M，St.Paul，MN)中，然后用胶带密封，将其余4个样品槽放在旁边作为不灭菌的对照。
将袋中的4个样品槽和一批医疗器械负荷一起在STERRAD-100过氧化氢等离子体灭菌器中进行标准的灭菌处理。该处理过程包括：真空阶段压力-290毫乇(mtorr)；注射阶段压力-7.23乇；扩散阶段压力-8.93乇；等离子体阶段压力-502毫乇。过程的经过时间为1∶10∶20小时。
暴露于这些灭菌条件后，用实施例4中所述的步骤和发芽基确定所有这8个样品槽中孢子的LRV。获得下列结果。数据是每种处理的4个样品槽的平均值。
    未灭菌对照的LRV＝0.0443±0.001189(2.7％)
    灭菌孢子的LRV＝0.0048±0.000374(3.7％)这个结果表明，灭菌条件是成功的，而且使用枯草杆菌孢子的LRV法可用来监测过氧化氢等离子体灭菌过程的有效性。实施例10-确定嗜热脂肪芽胞杆菌孢子的发芽速率
这些试验的目的是为了测定是否可以确定嗜热脂肪芽胞杆菌孢子的发芽速率，从而确定用枯草杆菌所示的LRV法是否可用于监测采用其他措施的灭菌有效性，在这些灭菌过程中杀灭微生物是通过使用高温和高压蒸气(压热釜)、热或低温蒸气甲醛(LTSF)而实现的。对于这些方法选择的微生物是嗜热脂肪芽胞杆菌，因为它是嗜热的，最佳生长温度为55-65℃。
发芽动力学是在480纳米光波长处用分光光度法确定，发芽速率根据吸光度的下降，用多项式回归方程y＝A0＋A1x＋A2x2＋…确定的。在该方程中，A1是回归线的斜率，即孢子的发芽速率。
将0.1毫升嗜热脂肪芽胞杆菌菌株DV296(可从School of Pharmacy andPharmacology，University of Bath，Bath，U.K.的培养物中心获得)的孢子悬浮液加至已在分光光度计中预热至60℃的石英样品槽中的2.9毫升化学成分限定的生长(CDG)培养基中。每毫升CDG培养基含有：0.444mg L-谷氨酰胺、1.35mg D-葡萄糖、0.497mg NH4Cl、0.0027mg FeCl3·6H2O、0.0019mgMnCl2·4H2O、0.1016mg MgCl2·6H2O、0.011mg CaCl2；0.01mg Na2SO4、1/15摩尔磷酸盐缓冲液，pH调至7.0。孢子悬浮储存液含有16-22×108个孢子/毫升，其中16-21％发芽和存活。
表VI显示了不同氨基酸发芽剂的效果。所有使用的氨基酸都是L型异构体。这些结果表明，可以确定这些孢子的发芽率，预期LRV法可用于监测灭菌有效性。
                         表VI
发芽培养基         发芽速率(吸光度单位/分)(×103)
 CDG      4.4，6.4，7.5
 CDG加谷氨酸，加天冬酰胺           3.8
 CDG加谷氨酸，加丙氨酸           5.9
 CDG加丙氨酸         5.5，8.9

Claims (6)

1.一种确定灭菌方法有效性的方法，其特征在于，包括步骤：
i)将含有微生物孢子的指示剂与灭菌剂接触，得到暴露处理过的孢子，
ii)将暴露处理过的孢子与选定用于使孢子发芽的培养基接触，
iii)测定暴露处理过的孢子的发芽率以确定灭菌方法的有效性。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，灭菌剂选自下组：蒸气、环氧乙烷、辐射、热、次氯酸钠、聚乙烯吡咯烷酮-碘、二氯氰尿酸钠、低温蒸气-甲醛、戊二醛和过氧化氢、过氧化氢等离子体及其组合。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该灭菌剂是环氧乙烷，细菌孢子是枯草杆菌孢子。
4.一种确定灭菌方法有效性的方法，其特征在于，包括步骤：
i)将含有微生物孢子的指示剂与灭菌剂接触，得到暴露处理过的孢子，
ii)将暴露处理过的孢子与选定用于促使孢子发芽的培养基接触，
iii)将发芽的孢子与底物接触，该底物被选定与发芽孢子的微生物代谢产物反应以提供可检测的指示剂，
iii)检测可检测指示剂的存在与否，从而确定灭菌方法的有效性。
5.一种确定灭菌方法有效性的生物指示剂系统，其特征在于，含有
i)容器装置，它用于盛装微生物孢子，并便于使微生物孢子暴露于灭菌剂，且可使暴露处理过的孢子接触发芽培养基，
ii)发芽装置，它用于使孢子与培养基接触和在较高的温度下孵育孢子，
iii)检测装置，它用于测量孵育孢子的发芽率，确定孵育孢子的LRV，并且得出灭菌过程的有效性。
6.如权利要求5所述的生物指示剂系统，其特征在于，孢子是枯草杆菌的细菌孢子，容器装置是用玻璃或选自聚(甲基丙烯酸甲酯)和聚苯乙烯的聚合物制成的并且对光是透明的，发芽装置中盛有培养基，该培养基含有养分、离子和选自L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺的一种发芽剂，检测装置是一台测量吸光度的分光光度计或散射仪。
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