CN102245782A - 用于监测灭菌过程的生物组合物、制品和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种灭菌状况指示组合物，其包含：多个能抵抗灭菌过程的孢子；包含亚致死量的至少一种能透过细胞、能与核酸发生相互作用的荧光染料和至少一种供所述孢子萌发的营养物的萌发培养基；其中所述至少一种能透过细胞的荧光染料能与所述多个孢子在其萌发期间或在其萌发和长出期间存在的和产生的核酸发生相互作用，以产生荧光强度的增加，表明有活孢子存在，且其中所述能透过细胞的荧光染料至少在用于温育所述孢子以产生荧光强度的增加的温度下足够稳定。本发明还提供一种包含所述组合物的灭菌过程指示器以及用所述组合物和指示器确定灭菌过程的有效性的方法。

Description

用于监测灭菌过程的生物组合物、制品和方法
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2008年10月17日提交的美国临时申请号61/196,415的权利，该临时申请以引用方式全文并入本文。
背景技术
监测用以对器材(如医疗器械、仪器和其他非一次性制品)进行灭菌的过程的有效性，这在卫生保健以及各种行业情景中都日常进行。有效的灭菌过程预期能完全破坏所有的活微生物，包括诸如病毒和孢子的结构在内。作为测试灭菌过程的致死率的标准规范，医院会将灭菌状况指示器与一批待灭菌的物品放在一起。生物灭菌指示器和化学灭菌状况指示器都曾被用过。
标准类型的生物灭菌指示器包括已知数量的试验微生物，例如嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)(以前称脂肪嗜热芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus))或萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)(以前称枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))孢子，这些孢子对灭菌过程的抵抗力比大多数污染性生物强许多倍。在指示器暴露于灭菌过程后，将孢子在营养物培养基中进行温育，以确定是否有任何孢子经历了该灭菌过程而存活下来，如有孢子长出则表明灭菌过程不足以破坏所有的微生物。在另一个例子中，在进行了灭菌过程后，测定可与孢子存活力相关联的酶的活性。尽管这方面已取得了进展，但确切地确定灭菌过程是否有效所需的时间可能过长而不合需要。
现有的化学灭菌状况指示器可在灭菌过程结束时立即进行读数。但是，结果仅表明存在某种特定条件，例如表明某种特定化学药品或某个温度存在一定的时间。
通常认为，活生物对所有实际存在的条件的反应，是检验灭菌过程能多么有效地实现灭菌的更直接可靠的试验。因此，对于能指示灭菌过程的有效性而在灭菌过程完成后又没有过长的延迟时间的生物灭菌指示器，一直存在着需求。
发明内容
本发明提供生物灭菌指示器组合物、包含该组合物的灭菌状况指示器以及用该指示器确定灭菌过程的有效性的方法。该组合物包含能抵抗灭菌过程的孢子和亚致死量的至少一种能透过细胞、能与核酸发生相互作用的荧光染料与至少一种营养物的组合。如果任何孢子经历灭菌过程而存活下来，该染料能与至少在孢子的萌发期间(例如在萌发期间或在萌发和长出期间)存在的核酸发生相互作用，从而产生荧光强度的增加。在某些实施例中，可在一段短的温育时间期间或之后检测到核酸含量(如果存在的话)的增加及伴随的荧光强度的增加。在某些实施例中，这种温育可在孢子与含有荧光染料和至少一种营养物的组合的萌发培养基接触的情况下进行。能透过细胞、能与核酸发生相互作用的荧光染料至少在用于温育孢子以产生荧光强度的增加的温度下足够稳定。在某些实施例中，另外地，能透过细胞、能与核酸发生相互作用的荧光染料在生物灭菌指示器所常规碰到的灭菌过程条件下是稳定的。
因此，在一个实施例中，提供一种灭菌状况指示组合物，其包含：
多个能抵抗灭菌过程的孢子；
包含亚致死量的至少一种能透过细胞、能与核酸发生相互作用的荧光染料和至少一种供所述孢子萌发的营养物的萌发培养基；
其中该至少一种能透过细胞的荧光染料能与该多个孢子在其萌发期间或在其萌发和长出期间存在的和产生的核酸发生相互作用，以产生荧光强度与所述孢子萌发之前的荧光强度相比增加，表明有活孢子存在，且其中该能透过细胞的荧光染料至少在用于温育所述孢子以产生荧光强度的增加的温度下足够稳定。
在另一个实施例中，提供灭菌过程指示器，其包含：
承载多个能抵抗灭菌过程的孢子的载体；
不能透过微生物且不能透过灭菌剂的容器，该容器含有包括亚致死量的至少一种能透过细胞、能与核酸发生相互作用的荧光染料和至少一种供所述孢子萌发的营养物的萌发培养基；
其中该至少一种能透过细胞的荧光染料能与该多个孢子在其萌发期间或在其萌发和长出期间存在的和产生的核酸发生相互作用，以产生荧光强度与所述孢子萌发之前的荧光强度相比增加，表明有活孢子存在，且其中该能透过细胞的荧光染料至少在用于温育所述孢子以产生荧光强度的增加的温度下足够稳定。
其中该载体靠近该容器且与该萌发培养基隔开。
在又一个实施例中，提供一种确定灭菌过程的有效性的方法，该方法包括：
提供灭菌过程指示器，其包含：
承载多个能抵抗灭菌过程的孢子的载体；
不能透过微生物且不能透过灭菌剂的容器，该容器含有包括亚致死量的至少一种能透过细胞、能与核酸发生相互作用的荧光染料和至少一种供所述孢子萌发的营养物的萌发培养基；
其中该至少一种能透过细胞的荧光染料能与该多个孢子在其萌发期间或在其萌发和长出期间存在的和产生的核酸发生相互作用，以产生荧光强度与所述孢子萌发之前的荧光强度相比增加，从而表明有活孢子存在，且其中该能透过细胞的荧光染料至少在用于温育所述孢子以产生荧光强度的增加的温度下足够稳定；和
其中该载体靠近该容器且与该萌发培养基隔开；
将该灭菌过程指示器放置在灭菌箱中；
将该灭菌过程指示器暴露于灭菌剂；
将该多个能抵抗灭菌过程的孢子和该萌发培养基进行组合；
用该萌发培养基温育所述孢子；
和
如果存在的话，测量该荧光强度的增加。
定义
术语“亚致死量”是指能透过细胞、能与核酸发生相互作用的荧光染料的这样的量(例如浓度)，该量(浓度)使得能够产生足够的荧光信号，而又不会不利地影响所述孢子、萌发中的孢子或营养细胞的存活力。有足够的荧光信号，就可检测到该荧光强度增加(如果存在的话)。
术语“能透过细胞”是指这样的染料，其被进行被动转运或主动转运或者能够充分地穿过芽孢外被和/或细胞膜以接触所述孢子、萌发中的孢子或营养细胞中的核酸，而无需任何用以使孢子外被和/或细胞膜更能透过该染料分子的试剂的帮助。
数字E5、E6和E7在本文中分别可与105、106和107互换使用。
在说明书和权利要求书中出现的术语“包括”及其变型(如包含、含有等)没有限制意义。
如本文所用，除非上下文另行明确指出，否则“一个”、“所述”、“至少一个”和“一个或多个”可互换地使用。
另外在本文中，以端点表示的数值范围包括该范围内所包含的任何数值(例如550-7000nm包括500、530、551、575、583、592、600、620、650、700等)。
本发明的上述发明内容并非意图描述本发明每一个公开的实施例或每种实施方式。以下“具体实施方式”更具体地举例说明了示例性实施例。
附图说明
图1是本发明的灭菌状况指示器的一个实施例的截面图，其中盖26没有示出。
图2是图1的灭菌状况指示器的分解透视图，其中包括盖26。
具体实施方式
如上所指出，现提供了生物灭菌指示器组合物，其使用亚致死量的至少一种能透过细胞、能与核酸发生相互作用的荧光染料和至少一种供孢子萌发的营养物，能在孢子萌发期间或者在萌发和长出期间检测活孢子。该染料至少在用于温育所述孢子的温度下是稳定的。当用包含该至少一种能透过细胞、能与核酸发生相互作用的荧光染料和该至少一种营养物的该萌发培养基温育所述孢子时，会遇到这种温度。对于某些实施例，优选地，该染料在可比用于温育所述孢子的温度显著高得多的灭菌温度下是稳定的。
所述生物灭菌指示器组合物可有利地用于生物灭菌指示器，如本文中所述的那些。所述组合物和含有所述组合物的指示器可用于确定灭菌过程的有效性，如用于本文所述的确定灭菌过程的有效性的方法中。
对于某些实施例，包括本文所述的组合物、指示器或方法实施例中的任何一个在内，该至少一种能透过细胞的荧光染料能与该多个孢子在其萌发期间存在的和产生的核酸发生相互作用，以产生荧光强度的增加。该染料与萌发期间的核酸的相互作用可提供关于活孢子(如果存在的话)的及早指示。
对于某些实施例，包括本文所述的组合物、指示器或方法实施例中的任何一个在内，该至少一种能透过细胞的荧光染料能与该多个孢子在其萌发和长出期间存在的和产生的核酸发生相互作用，以产生荧光强度的增加。该染料与也在所述孢子长出期间存在的核酸的相互作用，由于例如当活孢子存在时能提供更大的荧光增加，也可以是有用的。
目前有多种已知和通用的灭菌过程，包括例如暴露于蒸汽、干热、气态或液态化学品(如环氧乙烷、过氧化氢、过氧乙酸和臭氧)和辐射。该多个能抵抗灭菌过程的孢子可根据所要用的灭菌过程来选择。可使用任何孢子，只要它们对灭菌过程条件具有足够抵抗力，使得它们比自然污染中遇到的大多数微生物更能抵抗灭菌过程条件。例如，对于蒸汽灭菌过程，可使用嗜热脂肪地芽孢杆菌(以前称嗜热脂肪芽孢杆菌)。在另一个例子中，对于环氧乙烷灭菌过程，可使用萎缩芽孢杆菌(以前称枯草芽孢杆菌)。对于某些实施例，包括上述组合物、指示器和方法实施例中的任何一个在内，该多个能抵抗灭菌过程的孢子选自嗜热脂肪地芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)以及它们的组合。对于这些实施例中的某些，该多个能抵抗灭菌过程的孢子选自嗜热脂肪地芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌以及它们的组合。
仅以举例方式来说，本发明将用于生物灭菌指示器的微生物描述为“孢子”，但是应理解，要对用于生物灭菌指示器的具体实施例的微生物类型(例如孢子)加以选择，使其对所设想的具体灭菌过程具有高度的抵抗力。因此，本发明的不同实施例可使用不同的微生物，这取决于具体实施例所意图的灭菌过程。
使用能透过细胞、能与核酸发生相互作用的荧光染料，本发明的组合物、指示器和方法能检测所述孢子内的核酸的存在以及当所述孢子内的核酸含量出现增加时检测这一增加。在所述孢子萌发期间，所述孢子的代谢状态从休眠转向生长要求核酸含量伴随增加。
能透过细胞的荧光染料已知对微生物是有毒性或诱变性的。但是，现已发现，可以以这样的量来使用能透过细胞的荧光染料，该量对于微生物是亚致死量，但又能在所述微生物萌发期间或者萌发和长出期间提供荧光的增加。对于某些实施例，包括上述组合物、指示器和方法实施例中的任何一个在内，该能透过细胞的荧光染料在该培养基中的浓度不超过0.10mM、0.05mM或0.01mM。对于这些实施例中的某些，该染料的浓度不小于0.0001mM、0.0005mM或0.001mM。
在通用的灭菌过程中的一些(如果不是全部的话)中，在过程中包括或者可能遇到高温，例如50℃、100℃、121℃、132℃、134℃等。因此，对于某些实施例，包括上述组合物、指示器和方法实施例中的任何一个在内，该能透过细胞、能与核酸发生相互作用的荧光染料在灭菌温度下是稳定的。
对于某些实施例，包括上述组合物、指示器和方法实施例中的任何一个在内，该能透过细胞、能与核酸发生相互作用的荧光染料在高达至少121℃的温度下是稳定的。对于这些实施例中的某些，该能透过细胞、能与核酸发生相互作用的荧光染料在高达至少132℃的温度下是稳定的。对于这些实施例中的某些，该能透过细胞、能与核酸发生相互作用的荧光染料在高达至少134℃的温度下是稳定的。
对于某些实施例，包括上述组合物、指示器或方法实施例中的任何一个在内，该培养基在用来检测荧光强度的增加的发射和激发波长处基本上无任何背景荧光。这可在活孢子(如果存在的话)萌发期间或者萌发和长出期间提供改进的灵敏度，因为任何在和与核酸发生相互作用的该染料的发射和激发相同的波长处出现的背景荧光水平都被减至最低。
对于某些实施例，包括上述组合物、指示器或方法实施例中的任何一个在内，该培养基基本上不含该多个孢子存在的和产生的核酸以外的任何核酸。这可在活孢子(如果存在的话)萌发期间或者萌发和长出期间提供改进的灵敏度，因为任何由该染料与任何非该多个孢子产生的核酸的相互作用所产生的基线荧光水平都被减至最低。
该能透过细胞的染料当不与核酸发生相互作用时在发射波长处(或波长范围内)具有较低的荧光水平，而当与核酸发生相互作用时在此波长处具有较高的荧光水平。例如，在某些实施例中，当不与核酸发生相互作用时，该能透过细胞的染料的荧光量子产率小于0.1，优选地小于0.05，更优选地不超过0.01。在这些实施例中的某些中，当与核酸发生相互作用时，该能透过细胞的染料的荧光量子产率为至少0.1，优选地至少0.2，更优选地至少0.4。
对于某些实施例，包括上述组合物、指示器或方法实施例中的任何一个在内，该能透过细胞的荧光染料是能与DNA、RNA发生相互作用或者同时与DNA和RNA发生相互作用的染料。该染料与DNA和RNA的相互作用可相同或不同。该染料与DNA发生相互作用时的最大激发和/或发射，可不同于其与RNA发生相互作用时的最大激发和/或发射。
对于某些实施例，包括上述组合物、指示器或方法实施例中的任何一个在内，该能透过细胞的荧光染料是能以多种本领域公知的方式与核酸发生相互作用的染料，所述方式包括插入、静电吸引、电荷相互作用、亲水-疏水相互作用或者它们的组合。如上所指出，该染料与核酸(包括总细胞核酸，如DNA、RNA(mRNA，rRNA，tRNA)和染色体外核酸)的这一相互作用或结合，会引起来自该染料的荧光的相对较大的增加。对于这些实施例中的某些，该能透过细胞的荧光染料选自吖啶橙、被取代的不对称花菁染料以及它们的组合。结合于DNA的吖啶橙在约490nm处有最大激发，在约520nm处有最大发射，但当结合于RNA时分别为约530nm和620nm。参见MacInnes，J.W和McClintock，M.，Differences in Fluorescence Spectra of AcridineOrange-DNA Complexes Related-DNA Base Composition(与DNA碱基组成相关联的吖啶橙-DNA复合物荧光光谱的差异)，Biopolymers.致编辑的信，第9卷，第1407-1411页(1970)。对于某些实施例，结合于RNA的该染料的最大发射处的荧光可用来指示活孢子的萌发。当在萌发中的孢子中RNA的量增加得比DNA的量更快时，这会是有用的，可以更早地确定是否有活孢子存在。
被取代的不对称花菁染料的合适例子包括以商品名SYTO(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)出售的染料。各种SYTO染料能透过许多(如果不是所有的话)细胞膜，但它们互相之间例如在以下方面可能存在差异：细胞透过性的程度、当结合于核酸时荧光强度的增加量、最大激发和发射、与DNA和RNA结合的选择性以及与DNA和RNA的结合亲和力。参见Tarnok，Cytometry Part A，73A，477-479(2008)。对于某些实施例，优选的是，被取代的不对称花菁染料是SYTO 24或SYTO 64。SYTO 24在490nm处有最大激发，在515nm处有最大发射。SYTO 64在599nm处有最大激发，在619nm处有最大发射。
对于某些实施例，包括上述组合物、指示器和方法实施例中的任何一个在内，优选的是，荧光强度的增加是在500nm-700nm、优选地500nm-675nm的波长处。这个波长范围会是有利的，因为这种荧光不会被通常在较短波长(如小于500nm或小于400nm的波长)处出现的该萌发培养基其他成分的吸光度或荧光所遮掩，或者被遮掩的程度会明显低得多。
该至少一种营养物可诱导孢子(如果是活的话)的萌发且还可使孢子长出，而核酸同时产生。此外，已发现该至少一种营养物与该染料一起存在可降低该染料对孢子的有效毒性。该营养物包括一种或多种糖类，例如葡萄糖、果糖、纤维二糖等。该营养物还可包括盐，如氯化钾、氯化钙等。该营养物还包括至少一种氨基酸，例如甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸中的至少一者。该萌发培养基还可包含一种或多种伴随该营养物的其他材料。可以使用这种营养物和材料以及本领域公知用于诱导所述能抵抗灭菌过程的孢子的萌发和初始长出的其他营养物的数量。培养基成分和浓度是已知的，在例如WO 99/05310(Tautvydas)以及Zechman等人，J.Food Sci.，56，5，第1408-1411页(1991)(也称为Zechman和Pflug，1991)中有描述。
对于某些实施例，包括本文所述的组合物、指示器或方法实施例中的任何一个在内，该萌发培养基还包含碰撞猝灭成分。这种成分能通过碰撞猝灭降低处于游离状态的(未结合于核酸的)能透过细胞的染料的背景荧光信号。已知能碰撞猝灭荧光的物质的例子包括有机化合物如嘌呤、嘧啶、脂族胺以及硝基氧、某些离子如硝酸根阴离子和溶解的金属离子。其他已知能碰撞猝灭荧光的物质在例如Principles ofFluorescence Spectroscopy，第9章，Joseph R.Lakowicz，Plenum Press，1983中有描述。
对于某些实施例，包括本文所述的组合物、指示器或方法实施例中的任何一个在内，该萌发培养基还包含至少一种参比染料。参比染料不会结合核酸，但与能透过细胞的染料一样能响应温度变化或者由孢子萌发和长出所引起的培养基变化，例如pH、离子强度的升降或者会改变荧光信号的代谢副产物的浓度变化。通过监测参比染料，可将由能透过细胞的染料结合于核酸所产生的信号与由温度变化或培养基变化所产生的信号区分开来。参比染料优选地在与能透过细胞的染料不同的波长下发荧光。
使该萌发培养基和该能抵抗灭菌过程的孢子保持隔开但又互相紧靠，以便在需要时容易将该培养基与所述孢子进行组合，例如在暴露于灭菌过程后进行组合然后进行温育以确定是否存在任何活孢子(由荧光强度的增加指示出)，或者在暴露于灭菌过程后进行组合但不进行温育以确定基线或背景荧光强度。例如，可测量某一特定波长处的荧光背景水平。因此，对于某些实施例，包括上述组合物、指示器和方法实施例中的任何一个在内，该多个能抵抗灭菌过程的孢子和所述萌发培养基相互隔开又相互接近。
对于某些实施例，包括上述组合物、指示器和方法实施例中的任何一个在内，所述萌发培养基是含水溶液或悬浮液。可将该至少一种能透过细胞、能与核酸发生相互作用的荧光染料和该至少一种供所述孢子萌发的营养物溶解或悬浮于该含水培养基中。该至少一种能透过细胞、能与核酸发生相互作用的荧光染料在该培养基中的浓度，取决于为在所述孢子萌发期间或者在萌发和长出期间提供荧光强度的增加所需的最小水平，和取决于所述孢子能承受而不对所述孢子的萌发有显著不利影响的最大水平。可以使用的染料浓度的例子在上文中以及下文实例中有描述。当存在活孢子时，荧光强度的增加可在小于1小时、优选地小于30分钟、更优选地小于15分钟时出现。
或者，对于某些实施例，所述萌发培养基为干燥的形式。该至少一种能透过细胞、能与核酸发生相互作用的荧光染料和该至少一种营养物可一起进行干燥或分别进行干燥，以在支撑膜上或在载体材料上形成膜或层，任选地按所需的形状来形成，或者一起进行复合或分别进行复合而成为干燥固体，以形成片剂、胶囊形片剂或胶囊剂。可将任何这些形式保持接近孢子，并可在适当的时间加入水或含水缓冲液，以用所产生的培养基悬浮液或溶液温育孢子。当重悬或溶解时，所产生的培养基可为液体或凝胶。可用于本文描述的组合物、指示器和方法实施例中的干燥形式的培养基的另外实施例，在2008年10月17日提交的、标题为《生物灭菌指示器、系统及其使用方法》的共同待审的美国专利申请系列号61/196,438(Chandrapati等人)中有描述。
当用该萌发培养基温育所述孢子时，可使用高于室温的温育温度。对于某些实施例，温育温度为至少37℃。对于某些实施例，优选地温育温度为至少50℃。对于某些实施例，温育温度为50-60℃。
如上所指出，本发明提供的灭菌过程指示器包括承载多个能抵抗灭菌过程的孢子的载体。对于某些实施例，该载体是片状材料如纸张、织造布、非织造布、塑料、聚合物材料、微孔聚合物材料、金属箔、玻璃、瓷器、陶瓷等或者它们的组合。对于某些实施例，片状材料可吸水或可被湿润，以有助于在适当的时间快速地使该萌发培养基与所述孢子紧密接触。
该灭菌过程指示器还包括容器，其含有该萌发培养基而又不让灭菌剂或任何微生物进入其中。如上所指出，该载体接近该容器，以便在要开始温育时容易使该载体所承载的所述孢子与该萌发培养基接触。该容器可容易地通过移除塞子、将其压破或刺穿等方式来打开，以使所述孢子与该培养基接触。该容器可装配有塞子，或者该容器的至少一部分可以是易破材料如玻璃(例如玻璃安瓿)，或者是其他的可通过物理压力破坏但又足够坚韧以在制造、保藏、运输和灭菌条件中保持完整的材料。
已知的生物灭菌过程指示器构造，如美国专利号5,073,488(Matner等人)中所描述的那些构造，可用于上述的组合物。也可使用其他的指示器构造，如2008年10月17日提交的、标题为《生物灭菌指示器、系统及其使用方法》的美国专利申请系列号61/196,438(Chandrapati等人)中所描述的那些构造。本文描述的灭菌过程指示器的一个实施例在图1和2中示出。该指示器包括具有开放腔14的壳体10，该开放腔由不透气体和液体的壁12所界定。这些结构的另选实施例在2008年10月17日提交的、标题为《生物灭菌指示器、系统及其使用方法》的美国专利申请系列号61/196,438(Chandrapati等人)中示出。该壳体示出为圆形管，但也可使用其他已知的构形。壁优选是透明的，或者是半透明的，只要在某一特定波长处的荧光强度可测量到。壁的合适材料可包括玻璃、聚碳酸酯、聚丙烯、聚酯等。对于某些实施例，该壳体的至少一个壁能透射至少500-700nm、优选地至少500-675nm的波长范围内的入射光的至少90％。该腔包含载体16，例如纸张、玻璃或聚合物片材，该载体承载着预定数量的能抵抗灭菌过程的活孢子。
图中示出容器18在腔14内，该容器装着萌发培养基20。或者，容器18可设置在腔14外部并邻近该腔。密封的容器18可以是易破的安瓿，或者也可以是装有塞子或其他当被触发时能让萌发培养基20接触载体16及其上所承载的孢子的机构的容器。容器18示出为细长的安瓿，但也可使用其他已知的构形。
图中示出载体16在容器18和壳体10的壁12之间，以便容易透过壁12确定荧光强度的变化。或者，壁12的一部分可用作载体16。可以采用载体16的其他布置方式，例如可采用靠近底壁12A布置的方式。可基于壳体10的形状将载体16成形为适合此布置方式，或者底壁12A本身可用作载体16。对于某些实施例，载体16能透射至少500-700nm、优选地至少500-675nm的波长范围内的入射光的至少90％。腔14的开口15提供有透气但不透过微生物的闭合构件22，其可通过粘合剂、热密封等粘附到壳体10。或者，可用具有孔口28的盖26将闭合构件22保持在开口15上。在暴露于灭菌剂期间，灭菌剂穿过闭合构件22进入腔14而与载体16上的孢子接触。这些结构的另选实施例在2008年10月17日提交的、标题为《生物灭菌指示器、系统及其使用方法》的美国专利申请系列号61/196,438(Chandrapati等人)中示出。
本文所提供的确定灭菌过程的有效性的方法，包括提供灭菌过程指示器的上述实施例中的任何一个并将该灭菌过程指示器放置在灭菌箱中。灭菌器(许多是可市售获得的)包括这样灭菌箱，其尺寸通常被设置成可容纳多个待灭菌的制品，并装配有用以将空气和/或其他气体从其中排出并将灭菌剂加入其中的装置。该生物灭菌指示器可放在该灭菌器中的最困难的部位(例如在排水管上方)。或者，该生物灭菌指示器当放在该灭菌箱中时可邻近待灭菌的制品放置。另外，可将该生物灭菌指示器装到常规使用的过程挑战装置(process challengedevice)中再放在灭菌器中。
该方法包括将该灭菌过程指示器暴露于灭菌剂。可在将灭菌箱中存在的任何空气或其他气体的至少一部分排出灭菌箱后，将灭菌剂加到灭菌箱。或者，可不对灭菌箱进行排气就将灭菌剂加入灭菌箱。通常采用一系列的排气步骤，以确保灭菌剂达到灭菌箱内的所有区域并接触待灭菌的制品的所有区域。当将灭菌剂加到灭菌箱时，在灭菌剂达到灭菌箱内的所有区域的条件下灭菌剂还接触到孢子。
该方法还包括将该多个能抵抗灭菌的孢子和该萌发培养基进行组合，从而使孢子和萌发培养基互相接触。这可在灭菌过程完成后进行，也就是说在提供了这样的条件后进行，所述条件使得灭菌剂达到灭菌箱内的所有区域并在一定温度下保持一定的时间，该温度和时间据认为足以杀灭灭菌箱内存在的任何微生物。可将含有能透过细胞的荧光染料的培养基与所述孢子进行组合，并将组合的孢子和培养基进行温育，这两方面都如上所述。可在用该萌发培养基温育所述孢子的同时，连续地或间歇地监测和测量荧光强度。
对于某些实施例，包括上述方法实施例中的任何一个在内外，该方法还包括通过在用该萌发培养基温育所述孢子，并且如果存在的话，测定荧光强度的增加速度的同时，如果存在的话，测量荧光强度的增加，来确定在将所述灭菌过程指示器暴露于灭菌剂之后是否有活孢子存在。对于某些实施例，当温育期间中的至少一部分时间里的荧光强度的速率增加时，可检测到能抵抗灭菌的孢子的萌发。相对于温育时间，这个速率可以是线性速率、指数速率等。可计算出速率常数并用作孢子的萌发的指标，从而用作活孢子的存在的指标。
活孢子(如果存在的话)一旦接触培养基和温育条件，会发生一系列的变化，包括DNA、RNA和其他额外的染色体核酸的从头产生。可通过测量某一特定波长处的光学性质如荧光强度的变化，来测量与核酸发生相互作用的染料中所产生的可检测变化。这种测量可便利地使用已知的仪器如荧光计、发光计等来进行。对于某些实施例，优选地通过测量某一特定波长处的荧光强度来测量可检测变化。
或者，温育步骤的一部分或全部可在测量荧光强度的任何增加之前进行。对于某些实施例，包括上述方法实施例中的任何一个在内，除测定荧光强度的增加速率之外，该方法还包括通过测量用所述萌发培养基温育所述孢子之后的如果存在的话，荧光强度的增加，与用所述萌发培养基温育所述孢子之前相比较，来确定在将所述灭菌过程指示器暴露于灭菌剂之后是否有活孢子存在。
再者，可在能透过细胞、能与核酸发生相互作用的染料和至少一种营养物分开的情况下进行温育，其中孢子与含有该至少一种营养物的培养基一起温育，随后将含有该染料的培养基加到温育过的孢子。然后可测量任何在阈值以上的荧光强度增加。
在上述方法实施例中，任选地，刚将孢子和萌发培养基进行组合后该组合的荧光强度可当作基线荧光或阈值，随后的荧光强度测量值可与该基线荧光或阈值作比较。在将该组合进行温育期间或之后比该基线荧光强的荧光强度可表明有活孢子存在。对于某些实施例，比该基线荧光强至少10％、优选至少5％的荧光强度表明有活孢子存在。
对于某些实施例，包括上述方法实施例中的任何一个在内，确定是否存在少至100个活孢子，并且其中温育进行至多8小时。对于这些实施例中的某些，优选地温育进行至多1小时。对于这些实施例中的某些，更优选地温育进行至多30分钟。对于这些实施例中的某些，甚至更优选地温育进行至多15分钟。
或者，对于某些实施例，该方法还包括通过测量可检测变化(如果存在的话)的速率，如荧光强度变化的速率，来确定在将该灭菌过程指示器暴露于灭菌剂之后是否有活孢子存在。例如，在将孢子和萌发培养基进行组合并开始温育步骤之后，可在温育期间连续地或间歇地测量可检测变化，从而确定可检测变化的速率。对于某些实施例，当温育期间信号速率增加时，可检测到能抵抗灭菌的孢子的萌发。相对于温育时间，这个速率可以是线性速率、指数速率等。速率常数可用作孢子的萌发的指标。
或者，对于某些实施例，该方法还包括通过在指定的时间获取最终荧光测量值，来确定在将灭菌过程指示器暴露于灭菌剂后是否有活孢子存在，从而如果比此前对该产品确立的基线荧光高的话，则表明存在活孢子。比基线值高可以是高出至多10％或高出至多5％。例如，在将孢子与萌发培养基进行组合并开始温育步骤后，可在温育结束时测量最终荧光并用作孢子萌发或无萌发的指标。
因此，使用上述组合物和指示器的本发明方法可对活孢子的存在足够灵敏，以在短时间内提供关于孢子的指示。另外，即使当存在的活孢子数目相对较低时，也能提供该指示。
对于某些实施例，包括上述方法实施例中的任何一个在内，该方法还包括将待灭菌的制品随该灭菌过程指示器一起放置在该灭菌箱中。对于这些实施例中的某些，该方法还包括确定该灭菌过程对于该制品的灭菌是否有效。无活孢子的指示结果可用来确定该灭菌过程对于该制品的灭菌是有效的，而活孢子的指示结果可用来确定该过程不是有效的。因此，使用上述的组合物、指示器和方法实施例，通过直接测量任何活孢子中核酸的产生，可在相对较短时间内作出有关经历了灭菌过程的制品的灭菌状况的评估。
示例性实施例
1.一种指示灭菌状况的组合物，其包含：
多个能抵抗灭菌过程的孢子；
包含亚致死量的至少一种能透过细胞、能与核酸发生相互作用的荧光染料和至少一种供所述孢子萌发的营养物的萌发培养基；
其中该至少一种能透过细胞的荧光染料能与该多个孢子在其萌发期间或在其萌发和长出期间存在的和产生的核酸发生相互作用，以产生荧光强度的增加，表明有活孢子存在，且其中该能透过细胞的荧光染料至少在用于温育所述孢子以产生荧光强度的增加的温度下足够稳定。
2.根据实施例1所述的组合物，其中该能透过细胞的荧光染料的浓度为至多0.10mM。
3.根据实施例1或实施例2所述的组合物，其中该能透过细胞的荧光染料在灭菌温度下足够稳定。
4.根据实施例1、2和3中任一项所述的组合物，其中该能透过细胞的荧光染料在高达至少121℃的温度下足够稳定。
5.根据实施例4所述的组合物，其中该能透过细胞的荧光染料在高达至少132℃的温度下足够稳定。
6.根据实施例1-5中任一项所述的组合物，其中该培养基在用来检测荧光强度的增加的发射和激发波长处基本上无任何背景荧光。
7.根据实施例1-6中任一项所述的组合物，其中该培养基基本上不含该多个孢子存在的和产生的核酸以外的任何核酸。
8.根据实施例1-7中任一项所述的组合物，其中该能透过细胞的荧光染料是能与DNA、RNA发生相互作用或者同时与DNA和RNA发生相互作用的染料。
9.根据实施例1-8中任一项所述的组合物，其中该能透过细胞的荧光染料是通过插入、静电吸引、电荷相互作用、疏水-亲水相互作用或者它们的组合与所述核酸发生相互作用的染料。
10.根据实施例9所述的组合物，其中该能透过细胞的荧光染料选自吖啶橙、被取代的不对称花菁染料以及它们的组合。
11.根据实施例1-10中任一项所述的组合物，其中该荧光强度的增加是在500-675nm的波长处。
12.根据实施例1-11中任一项所述的组合物，其中该营养物包含至少一种糖。
13.根据实施例1-12中任一项所述的组合物，其中该营养物包含至少一种氨基酸。
14.根据实施例1-13中任一项所述的组合物，其中该营养物包含至少一种盐。
15.根据实施例1-14中任一项所述的组合物，其中该萌发培养基还包含碰撞猝灭成分。
16.根据实施例1-15中任一项所述的组合物，其中所述萌发培养基还包含至少一种参比染料。
17.根据实施例1-16中任一项所述的组合物，其中该多个能抵抗灭菌过程的孢子选自嗜热脂肪地芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)以及它们的组合。
18.根据实施例1-17中任一项所述的组合物，其中该多个能抵抗灭菌过程的孢子和该萌发培养基相互隔开又相互接近。
19.根据实施例1-18中任一项所述的组合物，其中该萌发培养基是含水溶液或悬浮液。
20.根据实施例1-18中任一项所述的组合物，其中该萌发培养基为干燥的形式。
21.一种灭菌过程指示器，其包括：
承载多个能抵抗灭菌过程的孢子的载体；
不能透过微生物且不能透过灭菌剂的容器，该容器含有包括亚致死量的至少一种能透过细胞、能与核酸发生相互作用的荧光染料和至少一种供所述孢子萌发的营养物的萌发培养基；
其中该至少一种能透过细胞的荧光染料能与该多个孢子在其萌发期间或在其萌发和长出期间存在的和产生的核酸发生相互作用，以产生荧光强度的增加，表明有活孢子存在，且其中该能透过细胞的荧光染料至少在用于温育所述孢子以产生荧光强度的增加的温度下足够稳定。
其中该载体靠近该容器且与该萌发培养基隔开。
22.根据实施例21所述的指示器，其中该能透过细胞的荧光染料的浓度为至多0.10mM。
23.根据实施例21或实施例22所述的指示器，其中该能透过细胞的荧光染料在灭菌温度下足够稳定。
24.根据实施例21、22和23中任一项所述的指示器，其中该能透过细胞的荧光染料在高达至少121℃的温度下足够稳定。
25.根据实施例20所述的指示器，其中该能透过细胞的荧光染料在高达至少132℃的温度下足够稳定。
26.根据实施例21-25中任一项所述的指示器，其中该培养基在用来检测荧光强度的增加的发射和激发波长处基本上无任何背景荧光。
27.根据实施例21-26中任一项所述的指示器，其中该培养基基本上不含该多个孢子存在的和产生的核酸以外的任何核酸。
28.根据实施例21-27中任一项所述的指示器，其中该能透过细胞的荧光染料是能与DNA、RNA发生相互作用或者同时与DNA和RNA发生相互作用的染料。
29.根据实施例21-28中任一项所述的指示器，其中该能透过细胞的荧光染料是通过插入、静电吸引、电荷相互作用、疏水-亲水相互作用或者它们的组合与所述核酸发生相互作用的染料。
30.根据实施例29所述的指示器，其中该能透过细胞的荧光染料选自吖啶橙、被取代的不对称花菁染料以及它们的组合。
31.根据实施例21-30中任一项所述的指示器，其中该荧光强度的增加是在500-675nm的波长处。
32.根据实施例21-31中任一项所述的指示器，其中该营养物包含至少一种糖。
33.根据实施例21-32中任一项所述的指示器，其中该营养物包含至少一种氨基酸。
34.根据实施例21-33中任一项所述的指示器，其中该营养物包含至少一种盐。
35.根据实施例21-34中任一项所述的指示器，其中该萌发培养基还包含碰撞猝灭成分。
36.根据实施例21-35中任一项所述的指示器，其中该萌发培养基还包含至少一种参比染料。
37.根据实施例21-36中任一项所述的指示器，其中该多个能抵抗灭菌过程的孢子选自嗜热脂肪地芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、生孢梭菌、凝结芽孢杆菌以及它们的组合。
38.根据实施例21-37中任一项所述的指示器，其中该萌发培养基是含水溶液或悬浮液。
39.根据实施例21-37中任一项所述的指示器，其中该萌发培养基为干燥的形式。
40.一种确定灭菌过程的有效性的方法，该方法包括：
提供灭菌过程指示器，其包含：
承载多个能抵抗灭菌过程的孢子的载体；
不能透过微生物且不能透过灭菌剂的容器，该容器含有包括亚致死量的至少一种能透过细胞、能与核酸发生相互作用的荧光染料和至少一种供所述孢子萌发的营养物的萌发培养基；
其中该至少一种能透过细胞的荧光染料能与该多个孢子在其萌发期间或在其萌发和长出期间存在的和产生的核酸发生相互作用，以产生荧光强度的增加，表明有活孢子存在，且其中该能透过细胞的荧光染料至少在用于温育所述孢子以产生荧光强度的增加的温度下足够稳定；和
其中该载体靠近该容器且与该萌发培养基隔开；
将该灭菌过程指示器放置在灭菌箱中；
将该灭菌过程指示器暴露于灭菌剂；
将该多个能抵抗灭菌过程的孢子和该萌发培养基进行组合；
用该萌发培养基温育所述孢子；
和
测量该荧光强度的增加，如果存在的话。
41.根据实施例40所述的方法，其还包括通过在用该萌发培养基温育所述孢子，并且如果存在的话，测定荧光强度的增加速度的同时，如果存在的话，测量荧光强度的增加，来确定在将所述灭菌过程指示器暴露于灭菌剂之后是否有活孢子存在。
42.根据实施例40所述的方法，其还包括通过测量用所述萌发培养基温育所述孢子之后的如果存在的话，荧光强度的增加，与用所述萌发培养基温育所述孢子之前相比较，来确定在将所述灭菌过程指示器暴露于灭菌剂之后是否有活孢子存在。
43.根据实施例41或实施例42所述的方法，其中确定是否存在少至100个活孢子，并且其中温育进行至多8小时。
44.根据实施例43所述的方法，其中温育进行至多1小时。
45.根据实施例44所述的方法，其中温育进行至多30分钟。
46.根据实施例40-45中任一项所述的方法，其还包括将待灭菌的制品随该灭菌过程指示器一起放置在该灭菌箱中。
47.根据实施例46所述的方法，其还包括确定该灭菌过程对于该制品的灭菌是否有效。
48.根据实施例40-47中任一项所述的方法，其中该能透过细胞的荧光染料的浓度为至多0.10mM。
49.根据实施例40-48中任一项所述的方法，其中该能透过细胞的荧光染料在灭菌温度下足够稳定。
50.根据实施例40-49中任一项所述的方法，其中该能透过细胞的荧光染料在高达至少121℃的温度下足够稳定。
51.根据实施例50所述的方法，其中该能透过细胞的荧光染料在高达至少132℃的温度下足够稳定。
52.根据实施例40-51中任一项所述的方法，其中该培养基在用来检测荧光强度的增加的发射和激发波长处基本上无任何背景荧光。
53.根据实施例40-52中任一项所述的方法，其中该培养基基本上无该多个孢子存在的和产生的核酸以外的任何核酸。
54.根据实施例40-53中任一项所述的方法，其中该能透过细胞的荧光染料是能与DNA、RNA发生相互作用或者同时与DNA和RNA发生相互作用的染料。
55.根据实施例40-54中任一项所述的方法，其中该能透过细胞的荧光染料是通过插入、静电吸引、电荷相互作用、疏水-亲水相互作用或者它们的组合与所述核酸发生相互作用的染料。
56.根据实施例55所述的方法，其中该能透过细胞的荧光染料选自吖啶橙、被取代的不对称花菁染料以及它们的组合。
57.根据实施例40-56中任一项所述的方法，其中该荧光强度的增加是在500-675nm的波长处。
58.根据实施例40-57中任一项所述的方法，其中该营养物包含至少一种糖。
59.根据实施例40-58中任一项所述的方法，其中该营养物包含至少一种氨基酸。
60.根据实施例40-59中任一项所述的方法，其中该营养物包含至少一种盐。
61.根据实施例40-60中任一项所述的方法，其中该萌发培养基还包含碰撞猝灭成分。
62.根据实施例40-61中任一项所述的方法，其中该萌发培养基还包含至少一种参比染料。
63.根据实施例40-62中任一项所述的方法，其中该多个能抵抗灭菌过程的孢子选自嗜热脂肪地芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、生孢梭菌、凝结芽孢杆菌以及它们的组合。
64.根据实施例40-63中任一项所述的方法，其中该萌发培养基是含水溶液或悬浮液。
65.根据实施例40-63中任一项所述的方法，其中该萌发培养基为干燥的形式。
下面的实例进一步说明本发明的目的和优点，但这些实例中列举的具体材料及其量以及其他条件和细节不应被解释为是对本发明的不当限制。
实例
孢子悬浮液
嗜热脂肪地芽孢杆菌(也称为嗜热脂肪芽孢杆菌)的孢子悬浮液按已知的方法来制备，如美国专利号5,418,167(Matner等人)的实例1中所述的方法。这些方法和本领域技术人员知道的另选方法的修改方案，也可用于制备这些悬浮液。
实例1
能透过细胞、能与核酸发生相互作用的荧光染料检测出孢子萌发
将来自以下类别的代表性的能透过细胞的染料与嗜热脂肪地芽孢杆菌的孢子一起试验：绿色荧光核酸染液、红色荧光核酸染液和吖啶橙。具体而言，将上述孢子悬浮液100微升和该染料与无菌冲洗用水(Baxter，Deerfield，IL)或者与营养物即葡萄糖、果糖和氯化钾水溶液(分别为1mg/mL、1mg/mL和3.3mg/mL)、0.2M缬氨酸、0.04M异亮氨酸、0.2M甲硫氨酸、4mg/ml肌苷及0.4M丙氨酸的1∶5000稀释液200微升进行组合。在50℃的温育温度下，用下述染料在以下指定浓度下及激发和发射波长处，检测每个所得的悬浮液的荧光强度：
SYTO 24：1.0μM(微摩尔)；485nm处激发，530nm处发射；
吖啶橙：6.6μM；485nm处激发，530nm处发射；
SYTO 64：1.0μM；530nm处激发，620nm处发射。
以上染料可获自Invitrogen(Carlsbad，CA)。在Biotek FL600荧光计或Biotek Synergy 4读板机(Biotek，Winooski，VT)中监测荧光。结果示于表1中。
表1.孢子悬浮液与染料及与染料和营养物在不同时间的荧光强 度。
发现每种上述染料在孢子与营养物存在下都出现荧光强度的增加。
实例2
能透过细胞、能与核酸发生相互作用的荧光染料在暴露于灭菌温度后，保持其在孢子内DNA和/或RNA的存在下产生荧光的能力。
将以上所述的嗜热脂肪地芽孢杆菌孢子悬浮液的稀释液在80℃下进行热冲击处理10分钟。稀释液是用无菌冲洗用水(Baxter，Deerfield，IL)制备，并以1×106个孢子和0个孢子的最终群体进行试验。将孢子稀释液(100微升)与200微升的由吖啶橙和如实例1中所述的营养物组成的培养基进行组合，该培养基事先在AMSCO Scientific SG-120Eagle/Century Series蒸汽灭菌器(Steris，Mentor，OH)中进行了15分钟121℃(250℉)真空辅助循环。然后将每个所得的混合物加到板的孔。未经高压灭菌处理的培养基用作对照。随后将板放在50℃预热的读板机(BioTek Synergy 4读板机，Winooski，VT)中并温育60分钟，在此过程中采用485nm处激发和530nm处发射读取荧光强度读数。用经热冲击的孢子和不经热冲击的孢子都进行了实验。归一化的数据的汇总在以下表2a-2c中列出。
表2a.吖啶橙与经热冲击的嗜热脂肪地芽孢杆菌孢子。
Figure BPA00001387879700241
表2b.吖啶橙与不经热冲击的嗜热脂肪地芽孢杆菌孢子。
Figure BPA00001387879700251
表2c.SYTO 24与不经热冲击的嗜热脂肪地芽孢杆菌孢子。
Figure BPA00001387879700252
发现SYTO 24即使在暴露于灭菌过程之后也保持其产生荧光的能力。
实例3
能透过细胞、能与核酸发生相互作用的荧光染料当经历了刚好足以将至少1xE6个孢子的群体降低到零个的灭菌过程时只具有背景水平的荧光。
将装有1mL的上述1x E7嗜热脂肪地芽孢杆菌孢子悬浮液的玻璃小瓶和装有1mL的含有如实例1中所述的能透过细胞的荧光染料的玻璃小瓶放在灭菌器中，在AMSCO Scientific SG-120Eagle/Century Series蒸汽灭菌器(Steris，Mentor，OH)中进行15分钟121℃(250℉)真空辅助循环，随后对100微升的所得经高压灭菌处理的孢子悬浮液和培养基进行了试验。在80℃下进行了热冲击处理10分钟的未经高压灭菌处理的孢子悬浮液，作为对照同时进行了试验。将孢子悬浮液(100微升)与200微升的由吖啶橙染料和实例1中所述的营养物组成的培养基进行组合，该培养基经历了与孢子相同的蒸汽灭菌循环。然后将每个所得混合物加到板的孔。随后将板放在50℃预热的读板机(Synergy 4，BioTek，Winooski，VT)中并温育180分钟，在此过程中采用分别为520和580的激发和发射波长读取荧光强度读数，共读取了19个读数。归一化的数据的汇总在表3中列出。
表3.含活的和死的(经灭菌的)孢子的孢子悬浮液与用相同灭菌 条件处理的吖啶橙染料和营养物培养基在不同时间的荧光强度。
结果表明，灭菌过程造成的死孢子在能透过细胞的荧光染料的存在下没有可检测水平的荧光。另一方面，活孢子在能透过细胞的荧光染料的存在下能够产生大量的所测得的荧光。
实例4
在将嗜热脂肪地芽孢杆菌孢子暴露于亚致死的灭菌循环后，检测到基于能透过细胞、能与核酸发生相互作用的荧光染料的荧光。
通过将浓度为1x E5的嗜热脂肪地芽孢杆菌孢子悬浮液涂布在聚丙烯载体上，制备了八个生物指示器。在37℃下干燥20分钟后，将这些生物指示器暴露于如下表4a、4b和4c中所述的常用灭菌条件。在灭菌后，将生物指示器用被暴露于与孢子相同的灭菌条件的、含有以下成分的培养基进行活化：吖啶橙的1∶5000稀释液以及葡萄糖、果糖和氯化钾水溶液(分别为1mg/mL、1mg/mL和3.3mg/mL)、0.02M丙氨酸、0.01M缬氨酸、0.002M异亮氨酸、0.2mg/ml肌苷和少量的溴甲酚紫。将该培养基与载体上的孢子(经历了表4a-4c中所示的致死和亚致死灭菌过程)的组合在50℃下温育60分钟，采用485nm处激发和530nm处发射在30分钟和60分钟时读取荧光强度读数。进行归一化后，荧光的变化值的汇总列于表4a-4c中。
表4a.在Joslyn蒸汽生物指示器材抗力检测器(Joslyn Steam  Biological Indicator Evaluator Resistometer，BIER)容器(Steris，Mentor  OH)中进行132℃(270℉)真空辅助循环1或3分钟后，在30分钟和 60分钟时基于吖啶橙的荧光(485/530nm)的变化。
  在灭菌器中的时间   在30分钟时荧光的平均变化   在60分钟时荧光的平均变化
  1分钟   2607   2762
  3分钟   279   386
表4b.在AMSCO EAGLE 2013型蒸汽灭菌器(Steris，Mentor，OH) 中进行132℃(270℉)重力循环1或3分钟后，在30分钟和60分钟时 基于吖啶橙的荧光(485/530nm)的变化。
  在BIER容器中的时间   在30分钟时荧光的平均变化   在60分钟时荧光的平均变化
  1分钟   1462   1808
  3分钟   201   22
表4c.在Joslyn蒸汽生物指示器材抗力检测器(BIER)容器(Steris， Mentor OH)中进行121℃(250℉)真空辅助循环5或15分钟后，在30 分钟和60分钟时基于吖啶橙的荧光(485/530nm)的变化。
  在BIER容器中的时间   在30分钟时荧光的平均变化   在60分钟时荧光的平均变化
  5分钟   2774   3347
  15分钟   383   353
所有经历了亚致死灭菌条件(例如132℃下1分钟，121℃下5分钟)的样品都显示出荧光强度的显著增加并使紫色培养基变成黄色，表明存在生长和产酸，这提供了活孢子的独立证据。
实例5
能透过细胞、能与核酸发生相互作用的荧光染料在溶液中一系列染料浓度下呈现活性。
用无菌冲洗用水(Baxter，Deerfield，IL)制备稀释液，并以1×106个孢子和0个孢子的最终群体进行试验。将孢子稀释液100微升与由吖啶橙和如实例1中所述的营养物组成的培养基200微升进行组合，其中吖啶橙浓度为1∶5000(0.0066mM)、1∶1000(0.033mM)和1∶500(0.066mM)。将每个所得的混合物加到板的孔。随后将板放在50℃预热的读板机(BioTek Synergy 4读板机，Winooski，VT)中并温育60分钟，在此过程中采用485nm处激发和530nm处发射读取荧光强度读数。归一化的数据的汇总在以下表5a-5c中列出。
表5a.吖啶橙浓度为0.0066mM，孢子浓度递减。
  时间   0   E3   E4   E5   E6
  0:00:00   0   0   0   0   0
  0:15:00   711   2033   3754.5   5224   12024.5
  0:30:00   886.5   2271.5   4088   5364   15320
  0:45:00   1027   2396   4174   5373   16514.5
  1:00:00   1147.5   2484.5   4268   5406   17130.5
表5b.吖啶橙浓度为0.033mM，孢子浓度递减。
  时间   0   E3   E4   E5   E6
  0:00:00   0   0   0   0   0
  0:15:00   740   2022.5   3467   5012   14427.5
  0:30:00   958   2281   3640.5   5029   19073.5
  0:45:00   1143.5   2437   3724   4999   20802.5
  1:00:00   1280   2558.5   3810.5   5068   21688
表5c.吖啶橙浓度为0.066mM，孢子浓度递减。
  时间   0   E3   E4   E5   E6
  0:00:00   0.0   0.0   0.0   0.0   0.0
  0:15:00   815.5   3420.0   3261.5   3422.5   13727.5
  0:30:00   1026.0   3716.0   3464.0   3533.0   15331.5
  0:45:00   1184.5   3902.5   3586.5   3606.0   15529.5
  1:00:00   1287.5   4000.5   3626.5   3616.0   15629.0
在所有吖啶橙浓度下，都显示出E3孢子得到检测。所用的吖啶橙浓度越高，信号越强。
在不脱离本发明的范围和精神的前提下，本发明的各种修改和更改对本领域的技术人员而言将是显而易见的。应理解，本发明并不意图受本文给出的说明性实施例和实例的不当限制，这些实例和实施例仅以举例的方式给出，本发明的范围仅意图受本文给出的权利要求书的限定。
本文引述的专利、专利文件和出版物的全部公开内容以其整体或者其各自的被指定的部分通过引用并入本文，犹如各自都单独地并入本文。

Claims (20)

1.一种灭菌状况指示组合物，其包含：
多个能抵抗灭菌过程的孢子；
包含亚致死量的至少一种能透过细胞、能与核酸发生相互作用的荧光染料和至少一种供所述孢子萌发的营养物的萌发培养基；
其中所述至少一种能透过细胞的荧光染料能与所述多个孢子在其萌发期间或在其萌发和长出期间存在的和产生的核酸发生相互作用，以产生荧光强度的增加，表明有活孢子存在，且其中所述能透过细胞的荧光染料至少在用于温育所述孢子以产生荧光强度的增加的温度下足够稳定。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述能透过细胞的荧光染料的浓度为至多0.10mM。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述能透过细胞的荧光染料在灭菌温度下足够稳定。
4.根据权利要求1-3任一项所述的组合物，其中所述培养基在用来检测荧光强度的增加的发射和激发波长处基本上无任何背景荧光。
5.根据权利要求1-4任一项所述的组合物，其中所述培养基基本上不含所述多个孢子存在的和产生的核酸以外的任何核酸。
6.根据权利要求1-5任一项所述的组合物，其中所述能透过细胞的荧光染料是通过插入、静电吸引、电荷相互作用、疏水-亲水相互作用或者它们的组合与所述核酸发生相互作用的染料。
7.根据权利要求1-6任一项所述的组合物，其中所述荧光强度的增加是在500-675nm的波长处。
8.根据权利要求1-7任一项所述的组合物，其中所述萌发培养基还包含碰撞猝灭成分。
9.根据权利要求1-8任一项所述的组合物，其中所述萌发培养基还包含至少一种参比染料。
10.一种灭菌过程指示器，其包括：
承载多个能抵抗灭菌过程的孢子的载体；
不能透过微生物且不能透过灭菌剂的容器，所述容器含有包括亚致死量的至少一种能透过细胞、能与核酸发生相互作用的荧光染料和至少一种供所述孢子萌发的营养物的萌发培养基；
其中所述至少一种能透过细胞的荧光染料能与所述多个孢子在其萌发期间或在其萌发和长出期间存在的和产生的核酸发生相互作用，以产生荧光强度的增加，表明有活孢子存在，且其中所述能透过细胞的荧光染料至少在用于温育所述孢子以产生荧光强度的增加的温度下足够稳定。
其中所述载体靠近所述容器且与所述萌发培养基隔开。
11.根据权利要求10所述的指示器，其中所述能透过细胞的荧光染料的浓度为至多0.10mM。
12.根据权利要求10或权利要求11所述的指示器，其中所述能透过细胞的荧光染料在灭菌温度下足够稳定。
13.根据权利要求10-12任一项所述的指示器，其中所述能透过细胞的荧光染料是通过插入、静电吸引、电荷相互作用、疏水-亲水相互作用或者它们的组合与所述核酸发生相互作用的染料。
14.根据权利要求10-13任一项所述的指示器，其中所述荧光强度的增加是在500-675nm的波长处。
15.根据权利要求10-14任一项所述的指示器，其中所述萌发培养基还包含碰撞猝灭成分。
16.根据权利要求10-15任一项所述的指示器，其中所述萌发培养基还包含至少一种参比染料。
17.一种确定灭菌过程的有效性的方法，所述方法包括：
提供灭菌过程指示器，其包含：
承载多个能抵抗灭菌过程的孢子的载体；
不能透过微生物且不能透过灭菌剂的容器，所述容器含有包括亚致死量的至少一种能透过细胞、能与核酸发生相互作用的荧光染料和至少一种供所述孢子萌发的营养物的萌发培养基；
其中所述至少一种能透过细胞的荧光染料能与所述多个孢子在其萌发期间或在其萌发和长出期间存在的和产生的核酸发生相互作用，以产生荧光强度的增加，表明有活孢子存在，且其中所述能透过细胞的荧光染料至少在用于温育所述孢子以产生荧光强度的增加的温度下足够稳定；和
其中所述载体靠近所述容器且与所述萌发培养基隔开；
将所述灭菌过程指示器放置在灭菌箱中；
将所述灭菌过程指示器暴露于灭菌剂；
将所述多个能抵抗灭菌过程的孢子和所述萌发培养基进行组合；
用所述萌发培养基温育所述孢子；
和
如果存在的话，测量所述荧光强度的增加。
18.根据权利要求17所述的方法，其还包括通过在用该萌发培养基温育所述孢子，并且如果存在的话，测定荧光强度的增加速度的同时，如果存在的话，测量荧光强度的增加，来确定在将所述灭菌过程指示器暴露于灭菌剂之后是否有活孢子存在。
19.根据权利要求17所述的方法，其还包括通过测量用所述萌发培养基温育所述孢子之后的如果存在的话，荧光强度的增加，与用所述萌发培养基温育所述孢子之前相比较，来确定在将所述灭菌过程指示器暴露于灭菌剂之后是否有活孢子存在。
20.根据权利要求17-19任一项所述的方法，其中所述能透过细胞的荧光染料的浓度为至多0.10mM。
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