CN103119173B - 监测灭菌处理的方法 - Google Patents

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    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/22Testing for sterility conditions

Abstract

本发明涉及一种用于监测灭菌处理的方法,所述方法包括:(A)在灭菌处理中将待灭菌物品和生物指示剂暴露于灭菌介质,所述生物指示剂包含具有质膜的细胞;和(B)测量所述细胞的膜电位以检测所述细胞的活力。

Description

监测灭菌处理的方法
相关申请的交互引用
本申请与官方申请日为2010年7月20日的美国临时申请61/355,307相关,并根据美国专利法35U.S.C.§119(e)要求其权利,该美国临时申请通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及一种用于监测灭菌处理的方法。更特别地,本发明涉及一种用于监测灭菌处理的方法,其中将包含具有质膜的细胞的生物指示剂暴露于灭菌介质,然后测量所述生物指示剂的膜电位以检测所述细胞的活力。
背景技术
通常,在灭菌处理中采用诸如细菌的生物指示剂来测定待灭菌物品是否已暴露于有效水平的灭菌剂活性成分。生物指示剂可用来确认处理器或所处理的载荷(processed load)本身内灭菌条件已满足。生物指示剂可通过在指示剂内或指示剂上提供极大量的对所述特定处理具有高度抗性的生物体来体现处理系统的最坏情形。通常使用孢子(spore)作为选择的生物体用于监测所述灭菌处理。通常,生物指示剂的使用者根据任何存活生物体繁殖后的可视效果来测定采用生物指示剂的灭菌处理的效力。如果使用该指示剂,此处理可需要数小时至数天才能产生可视的变化,如培养基浑浊或pH指示剂颜色改变。
已提出将孢子外被内存在的内源性(内部来源的,预先存在的)热稳定酶的活性与生物体的实际活力关联起来的生物指示剂。这导致使用荧光计或色度计的生物读取时间为数分钟至数小时。尽管这些生物指示剂提供酶活性与生物体活力之间的关联,但实际获得的结果完全归因于酶活性而与生物体活力无直接联系。
还提出将经重组基因化学诱导产生的外源性(外部来源的,非预先存在的)酶的活性与在灭菌处理事件之后是否存在活的测试生物(test organism)评价为是否携带该重组基因关联起来的生物指示剂。这导致使用荧光计的生物读取时间为数分钟至数小时并且提供与生物体活力的直接联系。
发明内容
这些早期技术的问题涉及一个事实:现有技术主要根据生物体的生长和分裂或酶活性的存在来检测活力。生物体的生长和分裂需要数小时至数天来检测。酶活性需要数分钟至数小时产生足够高的信号以进行荧光或色度检测。因此,需要一种快速获得结果的方法,所述方法的结果确定性与利用生长和分裂技术获得的相同。本发明提供了此问题的解决方案。
本发明涉及一种方法,所述方法包括:(A)在灭菌处理中将待灭菌物品和生物指示剂暴露于灭菌介质,所述生物指示剂包含具有质膜的细胞;和(B)测量经处理的所述细胞的膜电位以检测所述灭菌处理完成后细胞群内的任何剩余活力。此活力可通过与离子流事件或指示剂孢子萌发有关的膜电位改变来例示,但不限于此。
本发明涉及一种灭菌指示剂,所述灭菌指示剂包含安置在基材上的导电材料,和安置在部分或整个导电材料上的生物指示剂(例如,孢子)。
本发明涉及一种用于制备灭菌指示剂的方法,所述方法包括:利用例如喷墨式印刷机将导电材料沉积到基材(例如,利用印刷法,如例示的喷墨印刷,但不限于此)上和将生物指示剂(例如,孢子)沉积到部分或整个所述导电材料上。
附图说明
图1是显示实施例1中测试的孢子膜电位改变的图。
图2是荧光偏振器示意图。
图3是与萌发的电子监测联合作用的生物指示剂的示意图。
图4和5是通过电信号评价膜电位的替代生物指示剂的图解。
图6是本发明灭菌指示剂的一种电学实施方式的底部元件示意图。
图7是诸如图6所示的本发明灭菌指示剂的电学实施方式的顶部元件示意图。
图8是诸如图4-7所示的本发明实施方式所用的顶部密封件层的俯视示意图。
图9是本发明另一种实施方式的底部元件700的俯视示意图,所述实施方式是灭菌指示剂的基于荧光的实施方式。
图10是与一种本发明实施方式的基于电子型的灭菌指示剂一起使用的读取仪的主视示意图,以及例示的电子灭菌指示剂卡的主视图和后视图。
图11A和11B是与本发明一种实施方式的基于荧光型的灭菌指示剂一起使用的读取仪分别处于关闭和打开状态的主视示意图。
图12是如图11所示的荧光读取仪的内部组件的透视示意图,以及例示的基于荧光的灭菌指示剂卡的主视图和后视图。
图13是与FABI自含式生物指示剂一起使用的读取仪的主视示意图。
具体实施方式
术语“灭菌”是指使物质不能繁殖、代谢和/或生长。虽然该术语通常是指活生物体完全不存在,但该术语在本文中是指物质的活生物体丧失达到预先批准或确定为可接受的水平。除非另有说明,术语“灭菌”在本文中还指不如灭菌严格的方法和程序,例如,消毒和卫生处理等。
本文记载的方法和设备可用于卫生保健领域和科研领域等。这些方法和设备还可用于需要灭菌、消毒、卫生处理、排污和清洁等的商业和工业应用中。所述商业和工业应用可包括诸如食品加工、巴氏杀菌、土壤修复和水修复等处理。
使用本发明方法的灭菌处理可包括任何灭菌处理。灭菌处理可包括其中灭菌介质或灭菌剂可包括蒸汽、干热、辐射、等离子体以及一种或多种气体灭菌剂和一种或多种液体灭菌剂等的灭菌处理。所用的基于辐射的处理可包括电子束或任何电磁光谱,所述电磁光谱包括电离辐射、脉冲白光或脉冲紫外线光、和微波等。辐射可包括γ或β辐射。气体灭菌剂可包括环氧乙烷和气体过氧化氢等。液体灭菌剂可包括福尔马林(溶于水的甲醛气体,任选含有甲醇以抑制毒性物质的形成)、戊二醛、过氧乙酸和液体过氧化氢等。可使用生物指示剂来检验灭菌剂针对任何对灭菌处理的抗性小于生物指示剂提供的测试生物的微生物的致命性。这些微生物可包括诸如大肠杆菌(Escherichiacoli)、军团菌(Legionella sp.)、弯曲菌(Campylobacter sp.)和其他肠细菌以及葡萄球菌和链球菌的细菌,和诸如隐孢子虫的其他人致病微生物。生物指示剂可包括一种或多种测试生物。测试生物可包括对目标灭菌处理的抗性大于灭菌处理被设计要破坏的其他生物体的任何具有质膜的细胞。用作生物指示剂的测试生物类型可取决于所用灭菌处理类型例示的各种因素,但不限于此。测试生物可以是微生物。所用株系可为对灭菌所用的处理抗性最大的那些株系。测试微生物可包括细菌。细菌微生物可为形成内生孢子(即,细菌芽孢)的那些微生物。测试生物可包括芽孢杆菌属或梭状芽孢杆菌属的细菌。测试生物可包括嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、枯草芽孢杆菌球形变种(Bacillus subtilis globigii)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、大肠杆菌,或它们中的两种或多种的混合物。
测试生物可包括真菌、分枝杆菌、原生动物、植物细菌、营养细胞(vegetative cell)和/或它们的组成部分等。可使用的真菌实例可包括黑曲霉(Aspergillus niger)、白色念珠菌(Candida albicans)、须毛癣菌(Trichophytonmentagrophytes)和皮炎万氏霉(Wangiella dermatitis)等。可使用的分枝杆菌实例可包括龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonae)、戈氏分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)和地分枝杆菌(Mycobacterium terrae)等。可使用的原生动物实例可包括蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)和微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)等。可使用的植物细菌实例可包括嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、化脓性链球菌(Streptococcus pyrogenes)、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌(Klebsiella (pneumoniae))、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)、甲基营养菌(Methylobacterium)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)等。诸如嗜热脂肪地芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和生孢梭菌等的生物体可用于测定湿热灭菌(高压灭菌)的效力,其中嗜热脂肪地芽孢杆菌特别有用。
测试生物可包括黑曲霉、白色念珠菌、须毛癣菌、皮炎万氏霉、龟分枝杆菌、戈氏分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、地分枝杆菌、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、蓝氏贾第鞭毛虫、微小隐孢子虫、嗜水气单胞菌、粪肠球菌、粪链球菌、屎肠球菌、化脓性链球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜肺军团菌、甲基营养菌、铜绿假单胞菌、猪霍乱沙门氏菌、幽门螺杆菌、耐辐射微球菌(Micrococcus radiodurans)、耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、嗜麦芽窄食单胞菌,或它们中的两种或多种的混合物。
除了基于是否代表最具抗性的生物体(例如,嗜热脂肪地芽孢杆菌和萎缩芽孢杆菌)而选择的测试生物,生物指示剂可进一步包括生物恐怖或生物战的试剂,例如,炭疽芽孢杆菌等。这些抗性生物体可还包括因天然修饰或人工修饰而对先前有效的抗菌处理手段或化学消毒变得有抗性的株系。先前类型的实例可包括VRE(抗万古霉素肠球菌(vancomycin resistant enterococci))、MSRA(抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphyloccusaureus))和龟分枝杆菌(Mycobacterium cheloni)等。这些抗性生物体是所需的,因为VRE和MRSA最近已发展为对治疗对策显抗性(例如,抗生素抗性)而龟分枝杆菌已发展为对某些方式的消毒显抗性(例如,戊二醛抗性),因此提供适合的测试生物作为“最坏情形”的模型。
在诸如细菌的活生物体内,产生跨细胞质膜的电位。此膜电位在诸如产生三磷酸腺苷(ATP)、趋化作用、葡萄糖运输和生物体在低pH下生存的活动所需的生物体质子驱动力中具有至关重要的作用。建立膜电位是当生物体开始萌发或对环境改变作出反应时所发生的首要事件之一。建立膜电位能够使细胞与其环境交流物质/信息。因此,通过测量膜电位,本发明方法提供对细胞活力的即时或快速读取。
在有活力的、活跃代谢的生物体内的膜电位可以是高的,而具有高膜电位的细胞通常被称作是能化态的或超极化的。非活生物体和休眠生物体可显示低至零的膜电位且通常被称作是非能化态的或去极化的。
本发明的方法可依赖于测试生物萌发和生长时发生的膜电位改变作为检测测试生物活力的手段。当活生物体置于有利于萌发和生长的条件下时,生物体的膜电位可能改变。另一方面,如果生物体是非活生物体,则不能萌发且其膜电位不会改变。
生物指示剂可包括基因工程生物指示剂,所述基因工程生物指示剂可进一步包括测试生物(例如,细菌微生物)利用适合的载体(例如,质粒或病毒)所荷载(taken up)的适于提高膜电位的报告基因。阻遏基因可活跃阻断报告基因的表达。报告基因的表达可一直被阻断直至阻遏基因暴露于可存在于恢复介质(recovery medium)中的诱导物。用于基因工程生物指示剂中的测试生物可包括上述任一种测试生物。在一种实施方式中,测试生物直至灭菌处理完全后才暴露于诱导物,因此,在灭菌前或灭菌过程中将不存在指示酶。可暴露于灭菌处理的有测试生物用以存活和生长的多种至关重要的装置,所述装置也用于生成指示酶。这些装置可包括用于细胞生长(和质粒复制)的DNA聚合酶、用于转录测试生物(和携带报告基因的质粒或病毒)代谢必需物的RNA聚合酶和细胞蛋白翻译(以及指示剂酶和/或离子运输机构的表达)需要的核糖体多核糖体。
有两类重要的膜电位荧光染料,每类结合细胞的方法不同。第一类的膜电位染料碳菁(carbocyanine)可积聚在超极化膜上且可迁移到脂质双层中。有用的碳菁是碘代3,3'-二己氧基碳菁[DiOC6(3)]。可使用的第二类膜电位染料包括氧杂菁类(oxonols)。氧杂菁类染料可进入去极化细胞且结合细胞内蛋白或膜。有用的氧杂菁类染料是双(1,3-二丁基巴比妥酸)三次甲基氧杂菁[DiBAC4(3)]。使用碳菁染料时,荧光可随时间和膜电位的增加而增加,而使用氧杂菁染料时,荧光随时间的增加和膜电位的降低而减少。膜电位存在与否则可随时间与荧光正相关。
培养基可称作生长介质或恢复介质。培养基可为固体或液体形式。培养基可包括特别缓冲的水溶液以使生物指示剂对pH变化、氧化还原电位和酶活性等更敏感。
灭菌指示剂可在任何处理中使用,其中灭菌指示剂在灭菌处理中暴露于灭菌介质,然后暴露于恢复和诱导。培养基可包括一种或多种营养源。营养源可用来为经灭菌处理而存活的任何测试生物的生长提供能量。营养源的实例可包括酪蛋白胰酶消化物、大豆粉酶消化物、蔗糖、右旋葡萄糖、酵母提取物、L-胱氨酸,和它们中的两种或多种的混合。在活测试生物存在下改变颜色或天然状态的微生物生长指示剂可与培养基一起使用。
培养基(恢复/诱导介质)可含有例如膜电位染料或电压敏感性染料。使用这些微生物生长指示剂可导致荧光因响应于微生物生长的现象(如pH改变、氧化还原电位、酶活性以及其他生长指标)而改变。
培养基可进一步包括一种或多种pH缓冲液、一种或多种中和剂、一种或多种保持渗透平衡的试剂,或它们中的两种或多种的混合物。pH缓冲液可包括K2HPO4、KH2PO4、(NH4)2HPO4、2,2-双(羟基甲基)-2,2′,2″-次氮基三乙醇(Bis Tris)、1,3-双[三(羟基甲基)-甲基氨基]丙烷(Bis-三丙烷)、4-(2-羟基乙基)哌嗪-乙磺酸(HEPES)、2-氨基-2-(羟基甲基)-l,3-丙二醇(Trizma,Tris碱)、N-[三(羟基甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、二甘氨酸(Gly-Gly)、N,N-双(2-羟基乙基)甘氨酸(Bicine)、N-(2-15乙酰氨基)亚氨基二乙酸(ADA)、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(aces)、1,4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)、对羟基-4-吗啉丙磺酸(MOPSO)、N,N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)、2-[(2-羟基-1,1-双(羟基甲基)乙基)氨基]乙磺酸(TES)、3-[N,N-双(2-羟基乙基)氨基]-2-羟基-1-丙磺酸(DIPSO)、4-(N-吗啉基)丁磺酸(MOBS)、2-羟基-3-[三(羟基甲基)甲基氨基]-1-丙磺酸(TAPSO)、4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-(2-羟基丙磺酸水合物(HEPPSO)、哌嗪-1,4-双(2-羟基丙磺酸)二水合物(POPSO)、4-(2-25羟基乙基)-1-哌嗪丙磺酸(EPPS)、N-(2-羟基乙基)-哌嗪-N′-(4-丁磺酸)(HEPBS)、[(2-羟基-1,1-双(羟基甲基)乙基)氨基]-1-丙磺酸(TAPS)、2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(AMPD)、N-三(羟基甲基)甲基-4-氨基丁磺酸(TABS)、N-(1,1-二甲基-2-羟基乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO)、2-(环己基氨基)乙磺酸(CHES)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)、3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、4-(环己基氨基)-1-丁磺酸(CABS)、2-(N-吗啉基)乙磺酸水合物(MES)、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES),和它们中的两种或多种的混合物。
中和剂可包括但不限于巯基乙酸钠、硫代硫酸钠、过氧化氢酶、硫酸氢钠、亚硫酸氢钠卵磷脂、聚山梨酯20、聚山梨酯80、碳酸氢钙,和它们中的两种或多种的混合物。
用于保持渗透平衡的试剂可包括钠盐、钾盐、镁盐、锰盐、钙盐以及其他试剂(例如,过渡金属盐、氯化钠、氯化钾、硫酸镁、氯化铁),和它们中的两种或多种的混合物。
在一种实施方式中,培养基包括水性组合物,所述水性组合物包含:水;每升水约0.01至约100g(g/l)和在一种实施方式中约0.1至约50g/l的一种或多种营养源;约1.0×10-5至约10g/l和在一种实施方式中约1.0×10-4至约1.0g/l的一种或多种微生物生长指示剂;高达约5000g/l、和在一种实施方式中约0.001至约5000g/l和在一种实施方式中约0.1至约1000g/l的一种或多种pH缓冲液;高达约100g/l、和在一个实施方式中约0.01至约100g/l和在一种实施方式中约0.1至约50g/l的一种或多种中和剂;高达约50g/l、和在一种实施方式中约0.1至约50g/l和在一种实施方式中约0.1至约25g/l的一种或多种保持渗透平衡的试剂。
培养基可包括营养肉汤、D/E中和肉汤、Davis基本培养基、无菌试验肉汤、以及任何基于大豆-酪蛋白消化物或牛肉提取物的培养基。这些可包括大豆-酪蛋白消化物肉汤、流体巯基乙酸盐和右旋葡萄糖胰蛋白胨(DifcoLaboratories,Inc.)的水溶液。可使用无葡萄糖的改良的胰蛋白胨大豆肉汤基础。还可添加膜电位染料或电压敏感性染料。
可使用的培养基实例是BactoTM胰蛋白胨大豆肉汤,其含有酪蛋白胰酶消化物(17.0g/l)、大豆粉酶消化物(3.0g/l)、氯化钠(5.0g/l)、磷酸氢二钾(2.5g/l)和右旋葡萄糖(2.5g/l)。这些成分可分散或溶解于水中。以g/l表示的浓度是指每升水的组分克数。酪蛋白胰酶消化物、大豆粉酶消化物和右旋葡萄糖为微生物的生长提供能量来源。这些可称作营养源。氯化钠可用来保持液体介质内的渗透平衡。磷酸氢二钾可用作pH缓冲液。例如,可将膜电位染料DiOC6(3)(3ug/l)添加到BactoTM胰蛋白胨大豆肉汤配方中。
培养基可包括仅用以强化离子流事件和/或启动孢子萌发的非常基础的配方。该培养基可包含氨基酸、盐和/或糖。氨基酸实例包括L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-乳酸盐、L-苏氨酸、L-酒石酸、叶酸、L-酪氨酸、L-脯氨酸和天冬酰胺。盐的实例是氯化钠和氯化钾。糖的实例包括葡萄糖、蔗糖、果糖和木糖。另外的离子流事件或萌发事件可通过生长的生物体的上清液中发现的组分(如肽聚糖和胞壁肽)来触发。
膜电位染料是荧光染料,因此选择的检测方法必须具有区分来自膜内结合的染料分子的荧光与来自游离染料分子的荧光的能力。特别适合区分这两种来源的荧光发射的两种方法是基于荧光偏振(也称作荧光各向异性)的技术和基于荧光共振能量转移(基于FRET)的技术,包括时间分辨FRET。
荧光偏振是依赖于所检测的荧光分子的表观尺寸变化的检测方法。偏振测量可基于通过偏振光来选择性激发荧光团的原理。荧光团有沿荧光团分子轴的特定取向排列的吸收和发射跃迁矩,优选吸收其电矢量平行于这些跃迁矩排列的光子。在等向性溶液中,荧光团可以随机取向。当用偏振光激发时,可优选激发其吸收跃迁矩偶极平行于激发的电矢量的那些荧光团分子。此选择性激发可产生部分取向的荧光团群并进一步产生部分偏振的荧光发射。也发生光沿荧光团中的固定轴偏振的发射。荧光偏振可用平面偏振光激发分子。于是在初始平面偏振位置和偏离平面偏振光的位置(通常偏离90°)均可测量发射光。例如,如果激发光电矢量是垂直平面偏振的,则可在垂直和水平位置测量发射光。与激发光的电矢量“并排”的荧光团优选吸收光。然后可在水平偏振位置和垂直偏振位置测量发射光。偏振可表示为光强度比,是激发与发射之间的时段中分子旋转程度的量度。小分子可比大分子旋转得较快且具有较小的内在偏振值。另一方面,较大分子可旋转得较慢,因此具有较高的内在偏振值。利用荧光偏振,可以区分结合的膜电位染料与未结合的膜电位染料。
基于荧光偏振的培养器或/读取仪可如图2所示设计。图2是荧光偏振器的示意图。参照图2,提供样品110测试的培养器/读取仪100包括单色光源120、分束器130和偏振器140、150和160。来自单色光源120的单色光经过偏振器140以使所有的激发光偏振。此偏振光优选仅激发样品110中与滤光器在相同偏振状态的分子。当这些分子旋转时,它们移出平面偏振位置。分束器130拆分发射光。分束器拆分光并使约一半的光经过与激发光在相同平面取向的偏振器150,另一半光经过与初始激发光成一个角度取向的偏振器160。测量并比较经过各偏振器150和160的光。
荧光共振能量转移(FRET)是将能量从初始激发的供体荧光团转移至受体荧光团。供体荧光团通常在与受体吸收光谱重叠的较短波长发射。共振能量转移在没有光子出现时就可发生,是供体与受体荧光团之间长程偶极-偶极相互作用的结果。
为了用FRET监测膜电位的改变,需要两种荧光团。FRET供体可以是为受体提供足够的吸收光谱的任何荧光团。受体荧光团是膜电位染料。优选供体荧光团附着或粘附至孢子壁,从而能够紧密接近膜电位染料。另外,所选择的荧光检测(FRET)可用本文其他部分和所提供的实施例中描述的相同类型荧光计来监测。
除了膜电位染料,电压敏感性染料(voltage sensing dye或voltage-sensitivedye)也可利用另一套原理检测生物体膜电位的相同改变。使用电压敏感性染料检测膜电位是基于称为电致变色的物理机制。电压改变导致这些染料的激发和发射光谱显示出显著的位移。光谱中的这些位移起因于反映膜电位改变的电荷重排。最常使用的电压敏感性染料类型是苯乙烯基染料,具体的实例包括二-8-丁基-氨基-萘基-乙烯基-吡啶-丙基-磺酸盐(二-8-ANEPPS)和二-4-丁基-氨基-萘基-乙烯基-吡啶-丙基-磺酸盐(二-4-ANEPPS)。
结合FRET类技术使用电压敏感性染料能容易检测膜电位改变。例如,当萌发的生物体(例如孢子)的膜内发生电荷重排时,电压敏感性染料的发射波长就开始位移。发射波长内的该位移则可通过位于培养基内的第二荧光团检测。该第二波长的发射可通过检测器检测。例如,根据电压/电荷特性,二-8-ANEPPS激发光谱中的峰在450nm和520nm之间位移。这导致发射光谱中在530nm至640nm之间的相应峰位移。可将荧光计/培养器设计成在450nm或520nm处激发二-8-ANEPPS,然后在二-8-ANEPPS的相应发射峰处检测具有激发峰的第二荧光团。
用于检测膜电位改变的替代检测方法是使用电子信号。当生物体(例如孢子)开始萌发时,膜电位增加,使更多电流和更大的电压降,导致离子运输增加,由此观察到因膜电位增加而电流增加。可将电铅(electronic lead)置于介质中或穿过生物指示剂基材或在生物指示剂基材内以电学测量膜电位。图3-5中示出了用于测量电信号的生物指示剂的三种电位设计。参照图3,将生物指示剂200置于容器204内容纳的介质202中。将电铅206和208置于介质202中并使用它们测量膜电位。参照图4,使用电铅210和212测量穿过生物指示剂214的膜电位。参照图5,使用电铅220和222测量生物指示剂224内的膜电位。
灭菌指示剂可包括安置在基材上的导电材料(例如,在诸如硅的非导电性基材上形成铜电路的导电材料)和安置在部分或整个导电材料上的生物指示剂(例如,孢子)。例如,可利用喷墨式印刷机(例如可来自Fuji FilmDimatix材料印刷机DMP-2800)在非导电性基材(例如,硅基材)上沉积生物指示剂(例如,孢子)和电路或包含导电材料(例如,铜)的导电数字图案。可利用任何所需的图案在基材上沉积电子电路或导电数字图案。然后可利用喷墨式印刷机在部分或整个的电子电路或导电数字图案上沉积生物指示剂。生物指示剂可分散于液体载体或介质(例如,水)中,然后以小至约5皮升或约10皮升的小滴沉积在部分或整个电路或数字图案上。通常孢子量为每个孢子约3皮升。
当活生物体(例如,孢子)开始萌发时,可通过监测电压(电位)、电流、电阻和/或阻抗来电学评价生物指示剂。测量方法的选择将决定电子设计。优点包括降低了读取生物指示剂所需的时间。由于检测方法依赖于级联生物体萌发事件中最早步骤之一而不依赖于结果或具体的报告酶,因此检测时间可以大大降低。
图6是诸如图4和5中所示的本发明一种实施方式的电子型灭菌指示剂的底部元件600的示意图。图6更详细显示了灭菌指示剂底部元件600的元件。底部元件600包括安置在非导电基材604上的导电材料602,如单层聚丙烯酰胺/聚苯胺。导电材料602可包括任何适合的材料,只要该材料适于在使用灭菌指示剂的灭菌条件下使用。非导电基材604可为任何适合的气体/液体不可渗透的基底材料(例如PET)或适于在使用灭菌指示剂的灭菌条件中使用的其他适合的材料。如图6所示,安置在导电材料602与604层之间的是导电衬层606,所述导电衬层606与导电材料602和检测电路发生电通讯。检测电路包括电连接至电连接器610和接地器611的一系列连续的晶体管前置放大器608。电连接器610提供从底部元件600至读取设备的电通讯(如下所述)。前置放大器608将经过灭菌指示剂的电流改变逐级放大(详见下文)。由于具有一系列放大器,可适宜放大来自生物指示剂卡的信号而不引入过多噪音。通过接地器611完成电路。
如图6所示,适合的测试生物的孢子612可沉积在导电单层602上或嵌入导电单层602中。孢子612可作为单独的孢子或多个孢子进行沉积。孢子612可沉积在例如聚丙烯酰胺/缓冲混合物中,在这种情况下,认为孢子在缓冲物质的“泡(bubble)”内,该“泡”嵌入诸如聚丙烯酰胺的基质内。可选地,孢子612可直接嵌入例如聚苯胺的层。
现在参照图7,该图是灭菌指示剂的顶部元件614的俯视图,示出了本发明该实施方式的其他细节。图7所示的顶部元件614的面是面向且接触图6所示结构的上层的面。顶部元件614包括可移动气体/液体不可渗透的保护膜616,在其上形成气体/蒸汽可渗透层618。可渗透层618上叠加有导电层620。当灭菌指示剂装配好时,导电层620与孢子612和任何周围的导电材料(如导电单层602)电通讯,并且还经由铅626与连接器622电通讯。如图7所示,连接器622被安置在绝缘垫624下。连接器622经由电线626通过导电层620、孢子612、导电衬层606、前置放大器608和连接器610完成电路。利用经过此电路的电流改变来检测是否任何测试生物经使用灭菌指示剂600的灭菌处理而存活。如图7所示,顶部元件614包括粘附线628,顶部元件614通过该粘附线628紧密附着于底部元件600,由此形成该实施方式的灭菌指示剂。
在使用灭菌指示剂前,气体/液体不可渗透保护膜616将保持不动以防止灭菌指示剂600暴露于环境。在灭菌指示剂用于灭菌处理前立即移走膜616,以使灭菌介质接触灭菌指示剂中的孢子612。
图8是如图4-7中所示的本发明一种实施方式使用的顶部密封层630的俯视示意图。在图8所示的实施方式中,顶部密封件630包括流体填充室632,该流体填充室632包含活化和支撑下面的孢子612的热稳定诱导物和介质。流体填充室632通过易分离的脱离区(break-away zone)634连接至顶部密封件层630的余部(remainder),所述室可通过该易分离的脱离区634从顶部密封件630的余部移除。顶部密封件630进一步包括与顶部元件614的气体/液体可渗透层618相连通的窗口636。顶部密封件630进一步包括用于使顶部密封件630附至顶部元件614的热焊缝(thermal weld)638和可剥离的粘附区640。热焊缝638使所述室632附着至顶部元件630。
图9是本发明另一种实施方式的底部元件700的俯视示意图,所述实施方式是基于荧光的灭菌指示剂的实施方式。图9所示灭菌指示剂依赖生长孢子产生的荧光作为灭菌处理成功或失败的指示。
在图9所示的实施方式中,底部元件700包括沉积有上覆材料或元件的背衬基材702。背衬基材702可为任何适合的气体/液体不可渗透材料,如PET(例如,)、聚丙烯、金属或漆箔(lacquered foil)或本领域技术人员已知的可用于灭菌指示剂的任何适合的聚烯烃。在背衬基材702上沉积有水合单层704。水合单层704可以是例如聚丙烯酰胺,且可具有添加的孢子附着物,或孢子可嵌入水合单层704内。底部元件702覆盖有气体/蒸汽可渗透的荧光波长可透射的密封件(未示出),所述密封件粘附或焊接至底部元件702。可透射密封件使灭菌介质进入测试生物孢子并使得用于读取灭菌指示剂的激发波长和荧光波长通过。
在图9所示的实施方式中,在10×10网格706的孢子“位点(spot)”处供应孢子。每个位点可含有例如,约150至约300个孢子。在图9的实施方式中,有10×10网格的8×12阵列。因为每个位点含有约150至约300个孢子,在阵列96个单元的每个单元中有100个位点,因此在图9所示的灭菌指示剂上存在约1.44×106至约2.88×106个孢子。
在图9所示的实施方式中,进一步包括容纳有例如热稳定诱导物和介质的流体填充室708,所述热稳定诱导物和介质为活化和支撑将产生待检测的荧光事件的孢子所需要的。流体填充容器708通过易分离的脱离区710附着于底部元件700的余部。当易分离的脱离区710断开时,容器708的内容物被提供给网格706内的孢子。
底部元件700进一步包括周界粘附线712,气体/蒸汽可渗透的封盖(未示出)通过该周界粘附线712紧密附着至底部元件。
图10是与根据本发明一种实施方式的基于电子型的灭菌指示剂一起使用的电子读取仪1000的主视示意图,以及诸如图6的例示电子灭菌指示剂卡的主视图和后视图。电子读取仪1000包括显示从所述电子读取仪读取生物指示剂卡获得的相关信息的前显示板1002。电子读取仪1000进一步包括前罩板1004和用于插入生物指示剂卡的狭槽1006。图10还包括例示的电子型生物指示剂卡1008的描述,该卡包括如图6所示的上述生物组件和电子组件,并包括电连接器1010。
电子读取仪1000包括适合的电组件以与生物指示剂卡1008的电连接器1010接触。前罩板1004可包括用来激活流体储存库的整体式辊子类元件和培养用的加热器。
图10显示了例示的电子生物指示剂卡1008的主视图和后视图。图6的实施方式基本已描述主视图组件。指示剂卡1008的背面可包括,例如,关于生物指示剂的具体类型、灭菌介质、灭菌处理参数、批号、日期和生物指示剂测试结果的信息。指示剂卡1008上显示的信息不限于这些具体实例;可以理解的是,认为重要的其他信息也包括在内。可以理解的是,指示剂卡1008可包括便于自动读取和存储灭菌处理、测试结果等相关信息的磁条1012。
图11A和11B是与根据本发明一种实施方式的基于荧光型的灭菌指示剂一起使用的荧光读取仪1100分别处于关闭和打开位置的主视示意图。图11A显示处于关闭位置的荧光读取仪1100。荧光读取仪1100包括显示从所述荧光读取仪读取生物指示剂卡获得的相关信息的前显示板1102。荧光读取仪1100进一步包括如图11B所示的可打开的前罩板1104。
如图11B所示,前罩板1104向外打开,包括可插入如图9所示的上述基于荧光的生物指示剂卡的狭槽1106。当指示剂卡已插入狭槽1106时,前罩板1104关闭,将指示剂卡置入读取仪室1108,所述读取仪室包含从狭槽中的指示剂卡获取信息的组件。作为例示,图12描述了读取仪室1108的适合组件。前罩板1104可包括用来激活流体储存库的整体式辊子类元件和培养用的加热器。
图12是如图11所示的荧光读取仪1200内部组件的透视示意图,以及例示的基于荧光的灭菌指示剂卡的主视图和后视图。
荧光读取仪1200包括用于读取基于荧光的灭菌指示剂的适合的组件。图12描述了一些例示的组件。读取仪1200可包括适合诸如冷却的CCD(电荷耦合器)照相机的读取设备和图像处理器1202,该图像处理器1202包括用于处理从CCD照相机所获得的数据的合适硬件和软件。读取仪1200可包括适合的光学件1204,如LED激发器和荧光检测器。读取仪1200可包括适合的机械组件1206,如照相机板、LED控制器和USB接口。读取仪1200可进一步包括用于支撑生物指示剂卡的适合的设备1210,所述设备1210用于排列该卡并在配准位置支撑该卡以激发和读取。读取仪1200可进一步包括适合的图像扫描口1214。
图12显示了例示的电子生物指示剂卡1208的主视图和后视图。图9实施方式整体描述了主视图的组件。指示剂卡1208的背面包括关于生物指示剂的具体类型、灭菌剂、灭菌处理、批号、日期、灭菌条件和生物指示剂测试结果的各种信息。指示剂卡1208上显示的信息不限于这些具体的实例,可以理解的是,认为重要的其他信息也包括在内。可以理解的是,指示剂卡1208可包括便于自动读取和存储灭菌处理、测试结果等相关信息的磁条1212。
图13是与如图3所述和所示的FABI自含式生物指示剂(SCBI)一起使用的瓶式读取仪1300的主视示意图。瓶式读取仪1300包括前显示板1302和前罩板1304,类似于上述基于电子的和基于荧光的实施方式的那些前显示板和前罩板。前罩板1304包括多个孔1306,SCBI可插入所述孔1306。前罩板1304向外转动以使SCBI插入或移除,而且该前罩板可封闭到读取仪室1308中。瓶式读取仪1300可与基于荧光的SCBI或与基于电子的SCBI一起使用,应用本文公开的相同基本原理读取本发明生物指示剂指示的灭菌处理结果。图13包括例示的FABI SCBI1310。
使用本发明方法,可利用活生物体膜电位的改变来评价灭菌处理的有效性。该技术可与本领域已知的适合的灭菌指示剂或SCBI一起使用。该技术也可与位于安瓿中的生物体(例如,孢子)悬浮液一起使用。该技术还可以与包括安置在基材上的导电材料(例如,形成于或沉积在非导电基材(如硅)上的铜电路)与安置在部分或整个导电性材料上的生物指示剂(例如,细菌孢子)的灭菌指示剂一起使用。本发明方法灵活,足以用于所有的灭菌技术。本发明方法可用来提供即时读取或接近即时读取的生物指示剂。所述生物指示剂可称作快速反应生物指示剂。
构造材料的实例包括如下材料:支撑体、隔板(separator)和/或绝缘体:玻璃、硅、金属箔、纸和其他纤维素形式,包括聚丙烯的聚烯烃、聚碳酸酯类或它们的共混物,醋酸纤维素和Mylar等;半渗透或可渗透的膜:玻璃纸、天然或合成来源的透析膜、多孔聚烯烃和其他塑料材料;导体:金属、箔、导电墨、纳米管和富勒烯等;可转换的导体/绝缘体或其他半导体材料(如聚苯胺等);附着化学物质(例如,SPDP等);生物体:包括嗜热脂肪地芽孢杆菌和萎缩芽孢杆菌等;荧光团和/或荧光发生素,例如,MUG和碘化丙啶、荧光素、若丹明等,包括所有对物理激发(如光致激发)、化学诱导和电物理活化作出反应的物质。
在一种实施方式中,质膜电位是唯一的检测手段。在另一种实施方式中,通过膜电位和电诱导荧光(例如,利用二-4-ANEPPS等)检测。ANEP(氨萘基乙基吡啶)染料二-4-ANEPPS是检测亚毫秒膜电位改变的敏感探针。在该后一种情况下,读取仪是如图10所示的基于电子的读取仪与如图12所示的基于荧光的读取仪的混合。在一种实施方式中,诱导和酶活化后的荧光化合物的荧光可以是唯一的检测手段。在另一种实施方式中,还可使用第二表面结合的荧光团(例如,德克萨斯红WGA),该荧光团提供持续的荧光作为参比对照且作为确保所有孢子仍与生物指示剂卡结合的手段。每个荧光团可具有单独的发射波长和激发波长。
实施例
本文提供的实施例仅出于说明的目的。这些实施例旨在提供充分而复杂的细节以使本领域技术人员能够实施和使用本发明,并且提供适合的设备和方法的说明性实施例。优选的实施方式可包括本文记载的部分或全部材料、组件、方法或应用;但不仅限于所示出的这些。可进行简单的替代,由此可改变组分或应用效力,但这些也都是预期的。最终的生产设备可采取本发明的一种或另一种实施方式的形式,使用一种或多种记载的选择方式,但例示的设置不代表放弃了本领域技术人员可将其延伸到本公开的本发明所作出的任何其它实施变化形式或实施方式。
实施例1
活的/死的萎缩芽孢杆菌芽孢内膜电位改变的评价说明了膜电位改变与活力之间的相关性。利用DiOC6(3)和Picofluor荧光计测量膜电位。在37°C下经代表性的时间于胰蛋白胨大豆肉汤和DiOC6(3)中培养经高压灭菌的活芽孢和非活芽孢。在指明的培养时间下,移除生物体并在Tris/EDTA(pH7.4)中洗涤。然后进行荧光测量。结果如图1所示。
实施例2:平坦表面上活的嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢的电检测
将导电的金属化材料均一浇铸至约信用卡大小的非导电的Mylar片上。Mylar片是气体和液体不可渗透的。将聚丙烯酰胺/聚苯胺混合物浇铸至金属化层顶部。聚丙烯酰胺/聚苯胺混合物对气体和蒸汽是可渗透的。将嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢以108cfu/ml的浓度重悬于聚丙烯酰胺/聚苯胺混合物中。该芽孢浓度相当于喷墨式印刷机的每10pL(皮升)小滴中有一个芽孢。芽孢聚丙烯酰胺/聚苯胺混合物以阵列形式沉积在浇铸的聚丙烯酰胺/聚苯胺膜上。将第二导电的金属化材料浇铸在芽孢阵列上。由此形成了生物指示剂(BI)卡。当芽孢萌发时,材料的导电性开始增加。通过连续晶体管前置放大器(如Darlington对)来检测电流。由于这些Darlington晶体管是成对的,因此它们能够放大电流。将Darlington晶体管连接至监测系统电流的铅。通过可剥离的粘合剂将气体屏障(如mylar)粘附至指示剂顶部直至使用。在使用时,将该屏障移除以使蒸汽或气体在放入灭菌器中时可以渗透系统。指示剂的远端是容纳有能使活芽孢萌发的培养基的易分离小室。在利用蒸汽或蒸气过氧化氢进行灭菌处理后,培养生物指示剂。
将BI卡插入整合至灭菌器中的卡读取仪/培养器狭槽中。读取仪/培养器由以下组件组成:保持培养温度的加热块、其中连接有BI卡的电连接、以用户可读取形式标记循环参数和载荷标识(Load ID)的印刷头、引导BI卡进入狭槽并通过断开容纳有培养基的易分离室和帮助培养基分散而自动激活BI的辊子、磁条扫描器和将BI卡的结果送回设备载荷和灭菌循环的条码读取仪。
在55-60°C(嗜热脂肪地芽孢杆菌的最佳温度)下培养指示剂并监测指示剂的电导率。以分钟的方式检测到由萌发的活芽孢引起的电流小改变,这提醒用户他们的灭菌处理可能不成功。如果灭菌处理成功,则随培养时间测量的电流不会增长。
实施例3:平坦表面上活的嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢的荧光检测
将聚丙烯酰胺层浇铸至约信用卡大小的聚丙烯背衬上。聚丙烯酰胺层作为水合单层。然后将嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢印刷到生物体的位点内。以阵列或网格形式印刷所述位点,每个位点容纳150-300个芽孢。一端是容纳有带所需荧光团的培养基的易分离室。在灭菌处理完成时,将BI卡插入整合至灭菌器中的卡读取仪/培养器狭槽中。读取仪/培养器由以下组件组成:保持培养温度的加热器、LED激发源、用于荧光检测的光电二极管、以用户可读取形式标记循环参数和载荷标识的印刷头、引导BI卡进入狭槽并通过断开容纳有培养基的易分离室和帮助培养基分散而自动活化BI的辊子、磁条扫描器和将BI卡的结果送回设备载荷和灭菌循环的条码读取仪。
在55-60°C(嗜热脂肪地芽孢杆菌的最佳温度)下培养指示剂。可在该读取仪中采用非订制的成像仪,如LumiSens。这样能够进行两个或多个感兴趣的波长的检测。其中一个波长将测量染色的芽孢以确保所有对照均在适当位置,另一个波长将测量用于检测活生物体的荧光团。如果灭菌处理成功,则所有的芽孢是非活芽孢,检测器将仅检测到用于对生物体染色的荧光团。如果灭菌处理不成功,则能通过两种截然不同的荧光信号检测到活芽孢。
实施例4:独立的读取仪/培养器
实施例2和实施例3中所记载的任一种读取仪/培养器可以是独立的单元。在独立的单元中,所有的电子件与它们本身整合至灭菌器中的读取仪/培养器相同。
尽管以具体实施方式解释了本发明,但是可以理解的是,对于本领域技术人员来说,在阅读本说明书后具体实施方式的各种修改都是显而易见的。因此,可以理解的是,本文公开的发明旨在涵盖落入所附权利要求范围内的这样的修改。

Claims (40)

1.一种用于监测灭菌处理的效力的方法,所述方法包括:
(A)在灭菌处理中将待灭菌物品和生物指示剂暴露于灭菌介质,所述生物指示剂包含具有质膜的孢子;和
(B)测量萌发孢子的膜电位以检测所述孢子的活力,
其中当测量膜电位时,膜电位不改变表示灭菌处理有效力,而膜电位改变表示灭菌处理失败。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,在步骤(A)之后但在步骤(B)之前在培养基中培养所述生物指示剂。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述灭菌介质包括至少一种液体灭菌剂。
4.根据权利要求3所述的方法,其中,所述液体灭菌剂包括一种过氧化物或两种或多种过氧化物的混合物。
5.根据权利要求4所述的方法,其中,所述混合物包含过氧乙酸。
6.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述灭菌介质包括至少一种气体灭菌剂。
7.根据权利要求6所述的方法,其中,所述气体灭菌剂包括过氧化氢。
8.根据权利要求7所述的方法,其中,所述气体灭菌剂还包括氨气。
9.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述灭菌介质包括蒸汽。
10.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述生物指示剂包括芽孢杆菌属(Bacillus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或梭状芽孢杆菌属(Clostridia)的细菌。
11.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述生物指示剂包括嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、枯草芽孢杆菌球形变种(Bacillus subtilis globigii)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、大肠杆菌(Escherichiacoli),或它们中的两种或多种的混合物。
12.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述生物指示剂还包括真菌、分枝杆菌、原生动物、植物细菌,或它们中的两种或多种的混合物。
13.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述生物指示剂包括黑曲霉(Aspergillus niger)、白色念珠菌(Candida albicans)、须毛癣菌(Trichophytonmentagrophytes)、皮炎万氏霉(Wangiella dermatitis)、龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonae)、戈氏分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、地分枝杆菌(Mycobacterium terrae)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)、微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、化脓性链球菌(Streptococcus pyrogenes)、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌(Klebsiella(pneumoniae))、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)、甲基营养菌(Methylobacterium)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、耐辐射微球菌(Micrococcus radiodurans)、耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia),或它们中的两种或多种的混合物。
14.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述生物指示剂包括嗜热脂肪地芽孢杆菌。
15.根据权利要求1所述的方法,其中,所述生物指示剂包括基因工程生物指示剂,所述基因工程生物指示剂包含:至少一种测试生物和至少一种适于产酶的报告基因,所述测试生物荷载所述报告基因。
16.根据权利要求15所述的方法,其中,所述测试生物利用至少一种质粒和/或至少一种病毒荷载所述报告基因。
17.根据权利要求15所述的方法,其中,所述基因工程生物指示剂进一步包含至少一种阻遏基因,所述阻遏基因抑制所述报告基因的表达直至所述报告基因暴露于至少一种诱导物。
18.根据权利要求17所述的方法,其中,所述测试生物利用至少一种质粒和/或至少一种病毒荷载所述报告基因和所述阻遏基因。
19.根据权利要求15所述的方法,其中,所述测试生物还包括一种或多种细菌、植物生物体、病毒、非自我复制因子、亚细胞组分或细胞产物。
20.根据权利要求15所述的方法,其中,所述测试生物包括芽孢杆菌属、地芽孢杆菌属或梭状芽孢杆菌属的细菌。
21.根据权利要求15所述的方法,其中,所述测试生物包括嗜热脂肪地芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、生孢梭菌、艰难梭菌、肉毒梭菌、枯草芽孢杆菌球形变种、蜡状芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、大肠杆菌,或它们中的两种或多种的混合物。
22.根据权利要求15所述的方法,其中,所述测试生物还包括真菌、分枝杆菌、原生动物、植物细菌,或它们中的两种或多种的混合物。
23.根据权利要求15所述的方法,其中,所述测试生物包括黑曲霉、白色念珠菌、须毛癣菌、皮炎万氏霉、龟分枝杆菌、戈氏分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、地分枝杆菌、牛分枝杆菌、结核分枝杆菌、蓝氏贾第鞭毛虫、微小隐孢子虫、嗜水气单胞菌、粪肠球菌、粪链球菌、屎肠球菌、化脓性链球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜肺军团菌、甲基营养菌、铜绿假单胞菌、猪霍乱沙门氏菌、幽门螺杆菌、耐辐射微球菌、耐辐射奇球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、嗜麦芽窄食单胞菌,或它们中的两种或多种的混合物。
24.根据权利要求15所述的方法,其中,所述测试生物还包括植物细菌、营养细胞和/或它们的组成部分。
25.根据权利要求15所述的方法,其中,所述测试生物包括抗万古霉素肠球菌、抗甲氧西林金黄色葡萄球菌、龟分枝杆菌,或它们中的两种或多种的混合物。
26.根据权利要求2所述的方法,其中,所述培养基包含一种或多种营养源和一种或多种微生物恢复、诱导或生长指示剂。
27.根据权利要求26所述的方法,其中,所述培养基还包含一种或多种pH缓冲液、一种或多种保持渗透平衡的试剂、一种或多种中和剂,或它们中的两种或多种的混合物。
28.根据权利要求1、2或15所述的方法,其中,在培养基中培养所述生物指示剂,且在膜电位荧光染料存在下培养所述生物指示剂。
29.根据权利要求28所述的方法,其中,所述染料是羰菁。
30.根据权利要求28所述的方法,其中,所述染料是氧杂菁。
31.根据权利要求28所述的方法,其中,所述染料是碘代3,3'-二己氧基羰菁或双(1,3-二丁基巴比妥酸)三次甲基氧杂菁。
32.根据权利要求1、2或15所述的方法,其中,利用荧光偏振测量所述膜电位。
33.根据权利要求1、2或15所述的方法,其中,利用荧光共振能量转移测量所述膜电位。
34.根据权利要求1、2或15所述的方法,其中,在电压敏感性染料存在下培养所述生物指示剂。
35.根据权利要求34所述的方法,其中,所述电压敏感性染料是苯乙烯基染料。
36.根据权利要求34所述的方法,其中,所述电压敏感性染料是二-8-丁基-氨基萘基-乙烯基-吡啶-丙基-磺酸盐或二-4-丁基-氨基萘基-乙烯基-吡啶-丙基-磺酸盐。
37.根据权利要求34所述的方法,其中,利用荧光共振能量转移测量所述膜电位。
38.根据权利要求1、2或15所述的方法,其中,将所述生物指示剂安置在导电材料上。
39.根据权利要求1、2或15所述的方法,其中,在步骤(B)中将所述生物指示剂置于介质中且使用介质中的电铅测量所述膜电位。
40.根据权利要求1、2或15所述的方法,其中,利用被放置穿过所述生物指示剂或在所述生物指示剂内的电铅测量所述膜电位。
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