CN102686739B - 检测微生物的方法和其套件 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种检测试验样本中微生物的方法。所述方法包括以下步骤：a)用生长培养基培育所述试验样本以形成培育样本，其中所述生长培养基包括酶底物并且所述酶底物包括酶可水解基团和荧光基团，其中所述试验样本中存在的微生物包括从所述荧光基团上水解所述可水解基团以形成荧光可检测产物的酶，其中所述荧光可检测产物具有酸性形式和碱性形式；b)用波长Exλiso的光激发所述荧光可检测产物历时足以使所述荧光可检测产物发射光的时间，其中Exλiso为所述荧光可检测产物的吸光度等吸光点；和c)检测在波长Emλ1处发射的光。

Description

检测微生物的方法和其套件
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求提交于2009年12月22日的美国临时专利申请No.61/288,883的权益，该专利的公开内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及利用荧光底物化合物检测微生物的方法。
背景技术
7-羟基香豆素-基染料（也称为伞形酮）和其衍生物广泛用作酶活性的指示剂。伞形酮的一个例子为4-甲基伞形酮（称为4-MU），其用于检测大肠杆菌等等。从碱性形式观察到4-MU（和其他伞形酮）的最高荧光，因此这种检测必须在pH 8到10下进行。
发明内容
存在许多需要在较低pH值下检测响应的情况。例如，酸性磷酸酶的动力学研究需要实时检测酸性培养基中的酶活性。在酸性pH下观察荧光的能力还将消除方案中的必要步骤，从而使得分析更快更容易。因为期望进行低pH荧光分析，所以仍然需要可不顾pH而进行的分析方法。
本文所公开的是一种检测试验样本中的微生物的方法，该方法包括以下步骤：a)用酶底物培育试验样本以形成培育样本，其中该酶底物包括酶可水解基团和荧光基团，其中试验样本中存在的微生物包括从荧光基团上水解可水解基团以形成荧光可检测产物的酶，其中所述荧光可检测产物具有酸性形式和碱性形式；b)用波长Exλiso的光激发该荧光可检测产物历时足以使荧光可检测产物发射光的时间，其中Exλiso为荧光可检测产物的吸光度等吸光点；和c)检测在波长Emλ1处发射的光。
本发明还公开了一种检测试验样本中的微生物的方法，该方法包括以下步骤：a)用酶底物培育试验样本，其中所述酶底物包括酶可水解基团和荧光基团，其中试验样本中存在的微生物包括从所述荧光基团上水解所述可水解基团以形成荧光可检测产物的酶，其中所述荧光可检测产物具有酸性形式和碱性形式；b)用波长为Exλiso的光激发所述荧光可检测产物历时足以使所述荧光可检测产物发射光的时间，其中Exλiso为所述荧光可检测产物的等吸光点；c)检测由于用波长Exλiso的光激发而在波长Emλ1处发射的光；d)用波长为Exλ2的光激发所述荧光可检测产物历时所述荧光可检测产物足以发射光的时间，其中Exλ2为所述荧光可检测产物的碱性形式的吸收最大值或所述荧光可检测产物的酸性形式的吸收最大值；e)检测由于用波长Exλ2的光激发而在波长Emλ1处发射的光；和f)计算基于由于Exλiso激发光而发射的光与由于Exλ2激发光而发射的光的比率，其中所述比率表征所述试验样本中存在的微生物的量。
本发明还公开了一种用于测试试验样本中微生物的存在的套件，所述套件包括：包括酶可水解基团和荧光基团的酶底物，其中所述试验样本中存在的微生物包括从所述荧光基团上水解所述可水解基团以形成荧光可检测产物的酶，其中所述荧光可检测产物具有酸性形式和碱性形式；和能够提供波长为Exλiso的光的光源，其中Exλiso为所述荧光可检测产物的等吸光点，并且其中用波长Exλiso的光激发所述荧光可检测产物导致所述荧光可检测产物发射光。
附图说明
参照以下结合附图对本发明的多个实施例的详细说明，可更全面地理解本发明，其中：
附图未必按比例绘制。在附图中使用的相同的标号表示相同的部件。然而，应当理解，在给定附图中使用标号指示部件并非意图限制另一个附图中用相同标号标记的部件。
图1A、图1B和图1C为针对不同pH值的4-甲基伞形酮(4-MU)的吸收光谱（图1A），针对两个不同激发波长的随pH变化的发射（激发455nm）（图1B），和针对不同pH值的400nm至500的发射光谱（图1C）；
图2为描述本文所公开的示例性方法的流程图；
图3为描述本文所公开的示例性方法的流程图；
图4为描述本文所公开的示例性方法的流程图；
图5A、图5B和图5C为随pH变化的发射光谱(375nm)（图5A），在三个不同激发波长下随pH变化的发射光谱(455nm)（图5B），和在不同波长下激发的峰发射的比率的图线（图5C）；
图6为随pH变化的7-羟基香豆素-3-羧酸乙酯(EHC)的发射(450nm)光谱；
图7A、图7B和图7C为针对不同pH值的3-(2-噻吩基)伞形酮(TU)的吸收光谱（图7A），随pH变化的在380nm处激发后的发射（图7B），和随pH变化的在405nm处激发后的发射（在500nm处）和随pH变化的在380nm处激发后的发射（在490nm处）（图7C）；
图8A和图8B为针对4-MU和在存在和不存在β-D-半乳糖苷酶的情况下的4-MUG的随pH变化的在335nm处激发后的发射（在455nm处）（图8A），以及4-MU和在存在和不存在β-D-半乳糖苷酶的情况下的4-MUG的随pH变化的在360nm处激发后的发射（在455nm处）（图8B）；
图9为在存在和不存在β-D-半乳糖苷酶的情况下的MHCgal的随pH变化的在445nm处（激发370nm或400nm）的发射；和
图10为在存在和不存在β-D-半乳糖苷酶的情况下的3-(2-噻吩基)伞形酮-β-D-吡喃半乳糖苷(TUgal)的随pH变化的在380nm处激发后于490nm处的发射，以及在存在和不存在β-D-半乳糖苷酶的情况下的TUgal的随pH变化的在410nm处激发后于500nm处的发射；
具体实施方式
在下面的说明中，结合作为本文一部分的附图进行描述，并且其中通过举例说明示出了若干具体实施例。应当理解的是，在不脱离本发明的范围或精神的情况下，设想到并可作出其他的实施例。因此，以下的具体实施方式不应被理解成具有限制性意义。
除非另外指明，本发明所用的所有科技术语具有在本领域中通常使用的含义。本文给出的定义旨在便于理解本文频繁使用的一些术语，并无限制本发明范围之意。
除非另外指明，在所有情况下，说明书和权利要求书中用来表述特征尺寸、量和物理特性的所有数字均应理解为由术语“约”来修饰。因此，除非另外指明，上述说明书和所附权利要求书中给出的数值参数均为近似值，利用本发明公开内容的教导，本领域技术人员根据所需获得的特性，这些近似值可有所不同。
以端值表述的数值范围包括归入该范围内的所有数值（例如1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4和5）以及该范围内的任何范围。
如本说明书和所附权利要求中所使用，单数形式“一种”、“一个”和“所述”均涵盖具有多个指代物的实施例，除非该内容明确地表示其他含义。如本说明书和所附权利要求中所使用，术语“或”的含义一般来讲包括“和/或”，除非该内容明确地表示其他含义。
本文所公开的是用于检测样本中的微生物的方法和套件。在实施例中，方法通常可以包括以下步骤：用酶底物培育所述试验样本、用第一波长照射培育样本，并且检测从样本发射的光。酶底物为可被微生物的酶裂解而形成荧光可检测产物的化合物。然后以荧光可检测产物的等吸光点的波长照射荧光可检测产物。在激发荧光可检测产物之后，荧光可检测产物将发射光，其随后可被检测到以确认试验样本中微生物的存在。
在实施例中，可使用本文所公开的方法和套件检测到的微生物可以包括例如细菌和真菌。示例性真菌包括例如酵母（包括例如酿酒酵母、新型隐球菌、白色念珠菌、热带念珠菌、类星形念珠菌、光滑念珠菌、克鲁斯念珠菌、近平滑念珠菌、高里念珠菌、维斯念珠菌、葡萄牙念珠菌和胶红酵母）和霉菌（包括例如支顶孢菌、曲霉菌、分枝孢子菌、镰刀菌、毛霉菌、青霉菌、酒曲菌、葡萄穗霉和木霉菌）。示例性细菌包括以下微生物：亲水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、温和气单胞菌、蜡状芽孢杆菌、嗜热脂肪芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、脆弱拟杆菌、中间型类杆菌、弗氏柠檬细菌、产气荚膜梭状芽孢杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、乳酸乳球菌、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、无害李斯特菌、偶发分枝杆菌、淋病奈瑟氏菌、摩氏摩根菌(Organella morganii)、厌氧消化链球菌、大消化球菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、液化沙雷氏菌、粘质沙雷氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、模仿葡萄球菌、无乳链球菌B、咽峡炎链球菌、星座链球菌、粪链球菌D、变异链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和嗜麦芽黄单胞菌。
可使用本文所公开的方法和套件测试的样本（其可称为“试验样本”）的类型通常无限制。样本的示例性类型包括临床样本、环境样本、食物样本、化妆品、饮料样本、水样本和土壤样本。或者，样本可以例如通过冲洗制品以形成待测试水样本而从该制品制备。在利用公开方法和套件来检测微生物之前，可将诸如食物样本和土壤样本之类的样本消化或进行其他处理。还可进行过滤处理、提取处理等等。在其中用酶底物而非生长培养基培育试验样本的实施例中，样本的预处理可包括用生长培养基培育样本并随后将所得溶液（作为试验样本）加入酶底物。
可以用酶底物培育试验样本。酶底物可以例如在生长培养基中提供或者与生长培养基一起提供。生长培养基通常为设计成支持微生物生长的液体或凝胶。示例性生长培养基包括营养肉汤和琼脂板。生长培养基可以作为例如液体（冷凝或脱水液体）或凝胶提供。提供经由水合使用的生长培养基的产品的例子为3MTM PetrifilmTM 板(3M Co.,St.Paul,MN)。
用酶底物（或酶底物和生长培养基）培育试验样本可以通过以下方式实现：简单将两者混合；混合所述两者并使混合物静置；混合所述两者并搅拌所述混合物；混合所述两者并加热所述混合物；或混合所述两者，搅拌所述混合物并加热所述混合物。培育步骤可以进行任何时间量。在实施例中，使试验样本和酶底物在高温下培养，直到已发生至少一次细胞分裂过程。
在实施例中，可以混合试验样本和酶底物（或酶底物和生长培养基）并随后使用任何常用机械搅拌方法搅拌。可以混合试验样本和酶底物并随后使用任何常用加热方法加热。在实施例中，可以混合试验样本和生长培养基并使用常用方法搅拌。例如，可以使用3MTMPetrifilmTM板检测微生物。将PetrifilmTM板（其含有脱水生长培养基和酶底物）用含有所关注微生物的试验样本再水化。在添加试验样本之后，可以在合适条件下培育再水化的PetrifilmTM板以允许检测微生物（例如，对于有氧计数，可以将3MTM PetrifilmTM板在37℃的培养箱中放置24-48小时；或对于酵母/霉菌，可以将3MTMPetrifilmTM板在25℃至28℃的培养箱中放置3至5天）。
本文所用酶底物为当裂解时可由酶选择性水解以生成荧光可检测产物的材料。酶底物通常包含两个部分，即酶可水解基团（其可以为但并非必须为生物分子）和荧光基团。酶底物可以通过下式I来图示：
可水解基团-------------荧光基团（式I）
在式I中，“-----------”表示的部分可以称为可酶解连接。可酶解连接是指可容易由酶、特别是由所关注微生物产生的酶裂解的连接或键。
荧光基团一旦从酶底物中裂解出，则可以荧光方式检测到该基团。还应该指出的是，酶底物可以在荧光基团从其中裂解出之前以荧光方式检测（或换句话说，荧光基团可以在酶底物内以荧光方式检测或从酶底物中裂解出而被检测）。在实施例中，酶底物可以包括与如下部分连接的荧光染料，所述部分可被由所关注微生物产生的酶裂解。
酶底物中所含的可水解基团可以包括例如糖基、糖基磷酸酯、酯、氨基酸或肽、磷酸酯、或硫酸酯。
示例性糖基或糖基磷酸酯包括α-D-吡喃半乳糖基和β-D-吡喃半乳糖基、α-D-吡喃葡萄糖基和β-D-吡喃葡萄糖基、N-乙酰基-α-D-氨基半乳糖基和N-乙酰基-β-D-氨基半乳糖基；N-乙酰基-α-葡萄糖胺基和N-乙酰基-β-葡萄糖胺基；β-D-葡糖苷酸基、α-L-吡喃阿拉伯糖基、α-L-呋喃阿拉伯糖基、β-D-吡喃岩藻糖基、α-L-吡喃岩藻糖基和β-L-吡喃岩藻糖基、α-D-吡喃甘露糖基、β-D-吡喃木糖基、α-D-麦芽糖基、β-D-吡喃乳糖基、β-D-纤维二糖基、α-D-N-乙酰神经氨酰基和肌醇-1-基磷酸酯。在实施例中，可水解基团可以包括α-D-吡喃半乳糖基和β-D-吡喃半乳糖基、α-D-吡喃葡萄糖基和β-D-吡喃葡萄糖基、或β-D-葡糖苷酸基。在实施例中，可水解基团包括β-D-半乳糖基或β-D-糖基。
示例性酯包括丁酸酯、戊酸酯、己酸酯、辛酸酯(caprylate)、辛酸酯(octanoate)、壬酸酯和棕榈酸酯。示例性酯可以包括伞形酮的长链酯，例如4-甲基伞形基棕榈酸酯、4-甲基伞形基月桂酸酯、4-甲基伞形基辛酸酯，它们是市售的（这种可水解基团可用于检测酯酶或palmitase）。此外，还可以利用可由脂肪酶、酯酶、酰化酶和环氧化物酶水解的酶底物，包括Sicart等人在Biotechnology Journal,20072(2),221-231中提及的那些。
示例性氨基酸可以包括羧基端连接的氨基酸或其酸加成盐。这种氨基酸可以包括N-乙酰基-L-赖氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、N-α-苄氧羰基-L-精氨酸、L-瓜氨酸、γ-L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-组氨酸、L-羟基脯氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-鸟氨酸、L-苯基丙氨酸、L-脯氨酸、L-焦谷氨酸、L-丝氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸。示例性肽可以包括具有1至4个氨基酸的羧基端连接的肽或其加成盐。这种肽可以包括L-精氨酰基-L-精氨酸、N-苄氧羰基-甘氨酰基-L-脯氨酸、L-戊二酰基-甘氨酰基-精氨酸、甘氨酰基-甘氨酸、甘氨酰基-L-苯基丙氨酸、甘氨酰基-L-脯氨酸和L-丝氨酰基-L-酪氨酸。在实施例中，可水解基团为具有1至4个氨基酸的末端连接的肽（其中游离氨基任选地具有保护性基团）或其酸加成盐。
可以在本文所用酶底物中利用具有pH依赖性吸收和等吸光点的任何荧光染料（或其荧光底物部分）。示例性荧光染料包括氧杂蒽衍生物（例如荧光素、若丹明和其衍生物）、花菁衍生物（例如花菁、吲哚碳菁、氧碳菁，硫碳菁和份菁和它们的衍生物）、萘衍生物、香豆素衍生物、噁二唑衍生物、嵌二萘衍生物、噁嗪衍生物、吖啶衍生物、芳基甲川衍生物和四吡咯衍生物。
在实施例中，香豆素衍生物可以用于酶底物中。示例性香豆素衍生物包括7-羟基香豆素（伞形酮）衍生物。具体的7-羟基香豆素衍生物包括4-甲基-7-羟基香豆素（4-甲基伞形酮或4-MU）、3-氰基-7-羟基香豆素（3-氰基伞形酮或CyU）和7-羟基香豆素-3-羧酸酯例如7-羟基香豆素-3-羧酸乙酯(EHC)、7-羟基香豆素-3-羧酸甲酯(MHC)、3-氰基-4-甲基伞形酮、3-(4-咪唑基)伞形酮和6,8-二氟-4-甲基伞形酮。诸如在3-位上含有5元杂环的那些7-羟基香豆素衍生物也可以用于本文的荧光底物化合物中。这种7-羟基香豆素衍生物在美国专利No.6,566,508（Bentsen等人）中举例说明，该专利的公开内容以引用方式并入本文中。此类衍生物的具体实例为3-(2-噻吩基)伞形酮(TU)。
示例性酶底物包括（但不限于）4-甲基伞形酮-β-D-吡喃半乳糖苷(MUG)、3-氰基伞形酮-β-D-吡喃半乳糖苷、7-羟基香豆素-3-羧酸乙酯-β-D-吡喃半乳糖苷、7-羟基香豆素-3-羧酸甲酯-β-D-吡喃半乳糖苷、3-(2-噻吩基)伞形酮-β-D-吡喃半乳糖苷、4-甲基伞形基磷酸酯、3-氰基伞形基磷酸酯、乙基伞形酮-3-羧基磷酸酯、甲基伞形酮-3-羧基磷酸酯、3-(2-噻吩基)伞形基磷酸酯、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)、ELF 97乙酸酯(Invitrogen,Carlsbad,CA)、ELF 97βD葡糖苷酸(Invitrogen,Carlsbad,CA)和ELF 97βD吡喃半乳糖苷(Invitrogen,Carlsbad,CA)。
荧光可检测产物具有酸性形式和碱性形式。通常，荧光可检测产物的酸性形式为可以向溶液中另一组分贡献氢离子(H+)的化合物；而荧光可检测产物的碱性形式为可以从溶液中另一组分接受氢离子(H+)的化合物。在实施例中，荧光可检测产物具有为中性的酸性形式和为阴离子的碱性形式。在实施例中，荧光可检测产物具有为阳离子的酸性形式和为中性的碱性形式。
荧光可检测产物的酸性和碱性形式可以不同方式吸收光（在吸能的量、波长、或这两方面均不同），可以不同方式发射光（在强度、发射波长或这两方面均不同）或可以不同方式吸收和发射光。图1A示出在2.5至8.0的pH下4-甲基伞形酮(4-MU)的溶液的吸光度光谱。如其中可见，吸光度在监测波长范围（260纳米至440纳米）内显著变化。在约332纳米(nm)的波长下，吸光度在整个pH范围内未显著变化。该波长（对于4-MU是332nm）在本文中称为激发等吸光点。激发等吸光点为荧光可检测产物的酸性和碱性形式的吸光度基本上相同的波长。荧光可检测产物的激发等吸光点在本文中也称为Exλiso。
在激发等吸光点(Exλiso)处激发含有荧光可检测产物的溶液可以提供pH非依赖性荧光响应。在实施例中，培育样本可以用波长为Exλiso的光照射。在实施例中，波长为Exλiso的光可以是指峰值波长为Exλiso±10nm的光。在实施例中，波长为Exλiso的光可以是指峰值波长为Exλiso±5nm的光。在实施例中，波长为Exλiso的光可以是指峰值波长为Exλiso±2nm的光。
可以用波长为Exλiso的光照射培育样本历时足以使荧光可检测产物发射光的时间量。在实施例中，可以用波长为Exλiso的光照射培育样本并历时零点几秒至数十秒。在实施例中，可以用波长为Exλiso的光照射培育样本并历时约一秒至数十秒。在可以采用3MTMAttestTM生物监测系统(3M Co.,St.Paul,MN)的实施例中，可以照射样本约一秒，该时间可足以获得稳定激发样本并累积发射强度。在可以采用3MTMPetrifilmTM板系统(3M Co.,St.Paul,MN)的实施例中，可以照射样本数十秒，该时间可足以累积发射强度以获得高于背景噪声的可检测信号。
在用波长为Exλiso的光照射培育样本足够时间之后，荧光可检测产物将发射光。用荧光可检测产物吸收的波长的光来照射该荧光可检测产物可以称为激发。在除Exλiso以外的波长处激发导致酸性和碱性形式吸收不同，并且因此所发射的光也将不同。该表现产生来自大多数荧光可检测产物的pH敏感荧光响应。该现象的实例可以参见图1B。标示140的线条示出在2.5至8.0的不同pH下于360nm处激发的4-甲基伞形酮(4-MU)的荧光（在455nm处）。如其中所示，荧光在该pH范围内显著变化。在pH 6处开始，荧光开始显著增加。为此，通常接受的是，应当在碱性pH（通常为pH 8至10）下用约360nm的激发波长进行4-MU的荧光测定以便获得最大荧光信号。
图1B中标示130的线条示出在2.5至8.0的不同pH下于330nm处激发的4-MU的荧光（在455nm处）。如其中所示，荧光在该pH范围内几乎恒定不变。结合图1A的结果（表明4-MU的激发等吸光点(Exλiso)为约332nm）；以及图1B的结果（表明荧光（在455nm处）在pH 2.5至8.0的范围内基本上是恒定的），表明在激发等吸光点(Exλiso)处激发样本可以提供pH非依赖性荧光响应。
图1C示出在330nm处激发之后对pH 2.5至8.0下的4-MU溶液的发射扫描（400nm至500nm）。如图1C所示，荧光响应也与pH无关，因为发射波长也不随pH变化。这一现象可能是由于：中性物质（就4-MU而言，为酸性形式）光致解离，然后质子转移至溶剂从而产生光生阴离子（就4-MU而言，为碱性形式），其随后以其特征波长发射。
某些示例性荧光可检测产物和其激发等吸光点如下：4-甲基伞形酮(4-MU)的激发等吸光点(Exλiso)为约330nm；3-氰基-7-羟基香豆素(CyU)的激发等吸光点(Exλiso)为约375nm；7-羟基香豆素-3-羧酸乙酯(EHC)的激发等吸光点(Exλiso)为约370nm；7-羟基香豆素-3-羧酸甲酯(MHC)的激发等吸光点(Exλiso)为约370nm；以及3-(2-噻吩基)伞形酮(TU)的激发等吸光点(Exλiso)为约380nm。
使用4-MU作为例子，当从pH 8下降至pH 5时，将激发频率从常用的360nm变为约330nm(Exλiso)可以消除荧光强度20至30倍的降低。该强度降低可以以所公开方法消除，而不需要其他步骤（如pH调整）。
pH非依赖性荧光响应可以在各种分析方法中提供优点。例如，可以消除将待分析的试验样本的pH调整到pH 8至10的步骤（该步骤在许多此前所利用方法中是必要的）。这可以使得分析更容易，更有效，并且更节省成本。例如，各种类型的细菌（包括例如大肠杆菌、乳酸杆菌和醋酸杆菌）在其生长时生成酸，pH非依赖性响应将确保结果不受此类酸的影响。例如，可以测试具有不同酸度的样本，而无需在测试前“中和”它们。例如，激发波长和发射波长之间相对较大的差值可以允许使用低成本滤光器（例如，相对于成本更高的窄带干涉滤光器的吸收过滤器）。例如，由于较大的斯托克斯频移(Stokes shift)和相关的尾部交叉(tails crossing)，可以提供较高信噪比。
可以使用能够提供合适波长（如Exλiso）的光的任何光源来实现培育样本的激发。示例性光源可以包括可见激光二极管、可见发光二极管(LED)、白炽光灯丝、或任何其他合适光源。该光源还可以与各种过滤器和常用的其他光学器件组合。
在实施例中，可以选择光源使得在发射检测波长处存在相对不显著量的光。这可以是有利的，因为其可以使由于激发源带来的被检测光的量最小化。或者，可以使用光学器件过滤掉来自激发光源的光的一部分。在实施例中，选择激发光源、光学器件、检测波长、检测器、或它们的某种组合，使得基本上无来自激发光源的光被检测到和/或归因于来自荧光可检测产物的发射。
一旦已用波长Exλiso的光将荧光可检测产物激发了足以使荧光可检测产物发射光的时间，则检测所发射的光。在实施例中，所发射光可以在激发所述荧光可检测产物的至少约几分钟内被检测到。在实施例中，所发射光可以在激发所述荧光可检测产物的至少约一分钟内被检测到。在利用硅基传感器（针对最高至1000nm的NIR范围的通用选择）的实施例中，如果使用单级热电冷却(TEC)来将该传感器冷却至约低于环境温度30°，则累积时间可以为约一分钟。
对激发的荧光可检测产物发射的光的检测可以如通常所知那样实现。可以利用例如光电倍增管、雪崩光电二极管、电荷耦合装置(CCD)、光电二极管、或其他有源器件之类的检测器。该检测器还可以与各种过滤器和常用的其他光学器件组合。
待检测的发射光的波长可以至少部分依赖于某些荧光可检测产物。如图1C中所见，荧光可检测产物（例如4-MU）在宽泛的波长范围内以不同量发射光。在实施例中，该发射可以在接近于最大发射的波长处检测到。或者，可以监测其他波长（除了或替代最大发射的波长）以便检测到所发射光。Emλ1可以是任何所需波长，并且可以部分基于不同波长下发射的强度、可以利用的具体检测器（成本等）、来自样本中其他组分（例如酶底物）的干涉作用、或它们的组合来选择。在实施例中，Emλ1可以是荧光可检测产物具有其最大强度发射的波长。这种Emλ1可用于最小化可能的来自背景信号的干涉作用、降低检测极限、或它们的组合。无论选择任何波长来监测发射，本文中均可将其称为发射波长或Emλ1。
在实施例中，可以选择这样的酶底物，其Exλiso和最大发射（其可以用作Emλ1）就波长（纳米）而言相隔较远。在实施例中，可以选择这样的酶底物，其Exλiso和最大发射(Emλ1)相隔至少约20nm。在实施例中，可以选择这样的酶底物，其Exλiso和最大发射(Emλ1)相隔至少约30nm。在实施例中，可以选择这样的酶底物，其Exλiso和最大发射(Emλ1)相隔至少约40nm。
监测发射的具体波长(Emλ1)也可以部分基于酶底物的发射来选择。例如，在实施例中（其中酶底物在等吸光点处吸收但却具有不同于荧光可检测产物的发射光谱），在Exλiso处激发并在Emλ1处检测，其中选择Emλ1使得酶底物不发射（或基本上不发射）可能是有利的。此类情形允许荧光可检测产物而非酶底物的pH非依赖性检测。不同荧光可检测产物（和/或不同酶底物）可以使得不同波长更有利于用作Emλ1。在实施例中，4-甲基伞形酮β-D-吡喃半乳糖苷(4-MUG)、7-羟基香豆素-3-羧酸甲酯-β-D-吡喃半乳糖苷(MHCgal)、或7-羟基香豆素-3-羧酸乙酯-β-D-吡喃半乳糖苷(EHCgal)可以在Exλiso处被激发，并且荧光可检测产物可以在常用波长(455nm)处被检测(Emλ1)而不需实质检测酶底物。
一旦已检测到所发射光（在Emλ1处），则可任选地进行各种附加步骤。一个任选步骤为可以定量所发射光以便估计试验样本中的微生物量。这可以通过将来自试验样本的发射光的累积强度与来自具有已知数量微生物的一个或多个标准样本的发射光（在相同条件下）的累积强度比较而实现。还可以进行相对比较，例如在两个不同时间（例如在消毒程序之前和之后）比较荧光强度。
可以任选进行的另一个附加步骤是形成检测光的图像。在实施例中，具有多个可单独寻址的光敏检测器元件的CCD（或其他检测器）可以允许逐个像素地从传感器或传感器阵列收集荧光数据。这种阵列可以与照明源和适当的收集光学器件联合使用以获得（例如）在包含本文所公开酶底物的接种二维平面（例如3MTM PetrifilmTM板）上的生长微生物菌落的位点的图像。所得电子图像可以传输到处理器组件，在其中可以使用图象分析软件提高图像对比度并自动地计算荧光斑点数量（或用户可以手动计算斑点数量）。
图2示出本文所公开的方法的示例性实施例。所公开方法的实施例可以包括：步骤201，用酶底物培育试验样本；步骤203，用波长Exλiso的光激发培育试验样本内的荧光可检测产物；和步骤205，在Emλ1处检测发射光。
可以在步骤201之前向这种方法增加任选步骤，即步骤207。步骤207包括处理样本以形成试验样本；如上所述，这种处理可以包括过滤、消化、提取等等。
可在步骤205之后向这种方法增加另一个任选步骤，即步骤209。步骤209包括定量试验样本中的微生物；如上所述，这种定量可以包括例如使用已知浓度的微生物样本，或可以是相对的比较（即，获得更多或更少的结果）。
可在步骤205之后向这种方法增加另一个任选步骤，即步骤211。步骤211包括形成发射光的图像；如上所述，形成图像可以包括使用可寻址的检测器和收集光学器件。在其中进行步骤211的实施例中，所述方法还可以包括步骤213，其可以在步骤211之后进行。步骤213包括从图像中计算微生物菌落；如上所述，这种菌落计算可以通过与图像形成电子器件连接的处理器自动地完成或可以由用户手动完成。
还应该指出的是，在本文所公开方法中可以进行上述步骤的任何组合。此外，可以使用不同试验样本（或相同试验样本）重复所述步骤的任何组合。
本文所公开方法还可以包括以除Exλiso之外的波长照射培育样本的步骤。一个这种例子包括以波长Exλ2照射培育样本历时足以使荧光可检测产物发射光的时间。本文称为Exλ2的波长可以是荧光可检测产物的碱性形式的吸收最大值，荧光可检测产物的酸性形式的吸收最大值，或某些其他波长。例如，荧光可检测产物4-MU在约360nm处具有碱性形式的吸收最大值，并在约320nm处具有酸性形式的吸收最大值；荧光可检测产物CyU在约405nm处具有碱性形式的吸收最大值，并在约355nm处具有酸性形式的吸收最大值。
在Exλiso和Exλ2处激发足以使荧光标记产物发射光的时间可以引起相同波长的发射（还应该指出的是还可能发生不同波长的发射）。在实施例中，在Exλiso和Exλ2处的激发不是在相同时间进行，而是在时间上分隔进行。对独立发射光（在Exλiso和Exλ2处激发所致）的检测也可以在时间上分隔进行。一旦检测到分隔发射（在Exλiso和Exλ2处激发所致），则可以以各种不同方式来利用它们。在实施例中，两次发射可以以相同方式利用，作为双重检查结果的方法。
在实施例中，可以利用两次发射来确定无量纲数，所述无量纲数可以用于提供不依赖于测量绝对荧光强度的响应。这可以通过确定比率即Exλiso所致发射与Exλ2所致发射之比而实现。分子和分母选择无关紧要；然而如果所述选择维持恒定，则所述比率可以用于比较不同样本的结果。
在实施例中，可以利用另一个相对方法，凭借该相对方法激发强度(Exλiso)的变化可以通过监测激发强度同时累积发射信号(Emλ1)来补偿。这种实施例可以与3MTM AttestTM生物监测系统一起使用。在与3MTM AttestTM生物监测系统一起使用的这种方法的实施例中，可以在3MTM Rapid AttestTM AutoreaderTM(3M Co.,St.Paul,MN)中的微处理器内数学处理两组数据。
在实施例中，在两个不同激发波长（Exλiso和Exλ2）处激发培育样本不仅可以用于测定试验样本中的微生物量，还可以用于监测随时间推移的培育样本的pH。情况就是这样，因为Exλ2实质上监测随时间变化的酸性或碱性形式的量（假设将这两种形式中的至少一种吸收的波长用作Exλ2）。监测所述pH可以为监测微生物生长、代谢活性、或它们的组合的另一种方法。
图3示出本文所公开的方法的示例性实施例。所公开方法的实施例可以包括：步骤301，用酶底物培育试验样本；步骤303，用波长Exλiso的光激发培育试验样本内的荧光可检测产物；步骤305，检测由于Exλiso而发射的光(Emλ1)；步骤307，用波长Exλ2的光激发培育试验样本内的荧光可检测产物；和步骤309，检测由于Exλ2而发射的光(Emλ1)。在实施例中，步骤307和步骤309可以在步骤303和305之前执行。
可在步骤309之后向这种方法增加任选步骤，即步骤311。步骤311包括测定由Exλiso所致发射和由Exλ2所致发射的比率。这种比率可以起到提供非基于荧光强度的无量纲数的用途。例如上文相对于图2所述的那些任选步骤也可以包括在例如图3中举例说明的那些方法中。还应该指出的是，在本文所公开方法中可以进行上述步骤的任何组合。此外，可以使用不同试验样本（或相同试验样本）重复所述步骤的任何组合。
在实施例中，在Exλiso和Exλ2处的发射的比率可以指示除了样本中生物体量之外的情况。在其中酶底物在Exλiso处激发时强烈发射的实施例中（例如TUgal），在Exλiso和Exλ2处的发射的比率可以指示存在的生物体量，因为所述比率将很大程度上不随酶活性变化（不像在阴离子最大值附近的激发）。在其中在任一激发频率（Exλiso和Exλ2）处来自酶底物的干涉作用最小的实施例中，来自Exλiso和Exλ2的发射的比率可以指示pH水平。对于产生酸的某些生物体，pH变化指示其存在。
本文所公开的方法还可以包括检测不同发射波长的任选步骤。如上所述，一旦用波长Exλiso的光照射样本，则荧光可检测产物将发射光。如在图1C中所见，例如，荧光可检测产物可以在宽泛的波长范围内发射光。本文所公开的方法包括检测波长为Emλ1的发射光的步骤，这种方法可以任选地包括在第二、不同波长处检测发射光的其他步骤。可以被检测的发射光的其他波长在本文中称为Emλ2。
Emλ2可以是任何所需波长，并且可以部分基于不同波长下发射的强度、可以利用的具体检测器（成本等）、来自样本中其他组分（例如酶底物）的干涉作用、Emλ1的波长或它们的组合来选择。在实施例中，Emλ2可以是荧光可检测产物具有其最大强度发射的波长（如果这种波长未用作Emλ1）。这种Emλ2可用于最小化可能的来自背景信号的干涉作用、降低检测极限、或它们的组合。在实施例中，Emλ2可以是荧光可检测产物的发射与pH无关的波长，或换句话说是等吸光发射点(Emλiso)。这种Emλ2可以用于补偿具有来自酸性和碱性形式的大量发射的弱光酸，其会以其他方式提供pH依赖性响应。
在实施例中，选择Emλ2使得由荧光可检测产物发射的光量至少大于由酶底物发射的光量。在实施例中，选择Emλ2使得由荧光可检测产物发射的光量显著大于由酶底物发射的光量。这种Emλ2可以用于最小化来自尚未被微生物体内的酶裂解的酶底物的背景干涉。
在实施例中，在Emλ1和Emλ2处的检测并非同时进行，而是在时间上分隔进行。荧光可检测产物的激发（例如通过Exλiso）也可以在时间上分隔进行。在Emλ1和Emλ2处的发射可以以各种不同方式利用。在实施例中，两次发射可以以相同方式利用，作为双重检查结果的方法。
在实施例中，可以利用两次发射来确定无量纲数，所述无量纲数可以用于提供不依赖于测量绝对荧光强度的响应。这可以通过测定比率即Emλ1处的发射和Emλ2处的发射的比率而实现。分子和分母选择无关紧要；然而如果所述选择维持恒定，则所述比率可以用于比较不同样本的结果。
图4示出本文所公开的方法的示例性实施例。所公开方法的实施例可以包括：步骤401，用酶底物培育试验样本；步骤403，用波长Exλiso的光激发培育试验样本内的荧光可检测产物；步骤405，检测由于Exλiso而在Emλ1处发射的光；步骤407，用波长Exλiso的光激发培育试验样本内的荧光可检测产物；和步骤409，检测由于Exλiso而在Emλ2处发射的光。
可在步骤409之后向这种方法增加任选步骤，即步骤411。步骤411包括测定Emλ1和Emλ2的比率。例如上文相对于图2所述的那些任选步骤也可以包括在例如图4中举例说明的那些方法中。还应该指出的是，可以在本文所公开的方法中进行上述步骤的任何组合。此外，可以使用不同试验样本（或相同试验样本）重复所述步骤的任何组合。
本文还公开了套件。本文所公开的的套件可以包括酶底物，和光源。上述酶底物可以包括在所公开套件中。通常，酶底物包含酶可水解基团和荧光基团，其中所述试验样本中存在的微生物包括从所述荧光基团上水解所述可水解基团以形成荧光可检测产物的酶，其中所述荧光可检测产物具有酸性形式和碱性形式。在实施例中，所述酶底物可以更具体地如上文所定义。在实施例中，所述酶底物可以作为生长培养基的组分而被包括，所述生长培养基也可被包括在所公开套件中。
本文所公开的套件还包括光源。所述光源至少能够提供波长Exλiso的光。示例性光源可以包括可见激光二极管、可见发光二极管(LED)、白炽光灯丝、有机发光二极管(OLED)、或任何其他合适的光源。在实施例中，可以在所公开套件中将低成本LED用作光源。光源还可以与常用的各种过滤器和光学器件结合或组合使用。
套件中包括的光源也可以能够提供波长为Exλ2的光，其中Exλ2可以为荧光可检测产物的碱性形式的吸收最大值，荧光可检测产物的酸性形式的吸收最大值，或某些其他波长。或者，能够提供波长为Exλ2的光的第二光源可以包括在所公开套件中。在随后的实施例中，套件可包括至少两个光源，一个能够提供波长Exλiso的光；且第二个能够提供波长Exλ2的光，其中Exλ2可以为荧光可检测产物的碱性形式的吸收最大值，荧光可检测产物的酸性形式的吸收最大值，或某些其他波长。
本文所公开的套件还可以包括被构造用于混合至少所述酶底物和所述待测试样本的容器。在实施例中，任选容器可以用酶底物预加载；或在实施例中，任选容器可以用含有酶底物的生长培养基预加载。可以用含有酶底物的生长培养基预加载的容器的例子为3MTM PetrifilmTM板(3M Co.,St.Paul,MN)。可以用含有酶底物的生长培养基预加载的容器的另一个例子为3MTM AttestTM生物监测系统(3M Co.,St.Paul,MN)。或者，容器可以任选地与独立包装的酶底物一起提供，无论所述酶底物是否与生长培养基混合。
所公开套件也可以任选地包括检测器。可以利用例如光电倍增管、雪崩光电二极管、电荷耦合装置(CCD)、光电二极管、或其他有源器件之类的检测器。检测器还可以与常用的各种过滤器和光学器件结合或组合使用。可以任选包括在所公开套件中的检测器可以能够检测一种或多种波长的发射光。或者，可以任选包括不止一个检测器。
所公开套件还可以任选地包括其他部件，包括例如成像部件（例如，用于成像所检测发射光）、处理器、或样本收集或制备辅助器。在实施例中，一个或多个处理器可以被利用或被构造用于处理来自成像部件的图像，以整理图像或自动地计算菌落；以提供指示在试验样本中存在或不存在微生物的输出；以控制光源、检测器、任选部件、或它们的某种组合；或它们的某种组合。
所公开套件可以被构造成与目前所用系统协同工作或者可以与目前所用系统包含在一起，所述目前所用系统例如3MTM PetrifilmTM产品系列，3MTM AttestTM生物监测系统，SPECTRA MAX M5(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)，和3MTM Clean-TraceTM系统(3M Co.,St.Paul,MN)。
在所公开套件的实施例中，荧光可检测产物可以为香豆素衍生物。在实施例中，荧光可检测产物可以为4-甲基伞形酮并且Exλiso（光源能够产生的波长）可以为约330nm。在实施例中，荧光可检测产物可以为3-氰基-7-羟基香豆素并且Exλiso（光源能够产生的波长）可以为约375nm。在实施例中，荧光可检测产物可以为7-羟基香豆素-3-羧酸酯并且Exλiso（光源能够产生的波长）可以为约370nm。在实施例中，荧光可检测产物可以为3-(2-噻吩基)伞形酮并且Exλiso（光源能够产生的波长）可以为约380nm。
实例
材料和方法
除非另外指明，所有的化学品均购自Aldrich公司，并且不经进一步纯化就使用。
除非另外指明，否则实例中的所有份数、百分数、比率等均按重量计。除非以不同方式明确指明，否则所用溶剂和其他试剂均购自Sigma-Aldrich Chemical Company(Milwaukee,WI)。
材料
根据Chilvers等人，J.Appl.Microbiology 2001,91,1118-1130，制备7-羟基香豆素-3-羧酸乙酯(EHC)。
如美国专利No.6,372,895（Bentsen等人）中那样制备3-(2-噻吩基)伞形酮(TU)。
如美国专利No.6,372,895（Bentsen等人）中那样制备3-(2-噻吩基)伞形酮半乳糖苷(TUgal)。
β-D-半乳糖苷酶得自EMD Biosciences,Inc.(San Diego,CA)。
实例1
将4-甲基伞形酮(4-MU)以1mg/mL的浓度溶解于二甲基亚砜(DMSO)中。制备96孔板，各孔含有pH值范围从8.0低至2.5的100μL的100mmolar磷酸盐缓冲液。将10μL的4-MU溶液加入各孔。还制备一组10倍稀释的孔以消除由于高浓度荧光团的自猝灭所致的假象。10倍稀释孔通过以下方式制备：用DMSO将1mg/mL溶液稀释至0.1mg/mL并随后将10μL的此溶液加入各孔中的100μL的100mmolar磷酸盐缓冲液中。
使用SPECTRAMAX M5（得自Molecular Devices(Sunnyvale,CA)）荧光读板仪记录250nm至500nm的吸收光谱。吸收光谱的结果示于图1A中。这些结果表明，中性4-MU物质（低pH下形成）的吸收在阴离子（高pH下形成）的吸收最大值附近的波长下较低。中性4-MU的吸收最大值发生于约320nm处，并且在约330nm处存在等吸光点（其中吸光度不随组成而变化）。
也用SPECTRAMAX M5荧光读板仪测量不同波长的发射。图1C示出针对331nm激发波长和不同pH值而随发射波长变化的10倍稀释样本的所得发射。这些结果表明，等吸光点（约330nm）附近的激发提供在研究范围（2.5至8）内很大程度上不随pH值变化的荧光响应。最大发射发生于波长450nm处。
为了比较，还针对360nm激发波长测量随pH值变化的发射，所述360nm激发波长在阴离子的最大吸收波长附近。图1B示出针对360nm和331nm（大致在等吸光点处）激发波长随pH变化的在约450nm处的发射。
实例2
如实例1中那样制备96-孔板，但采用3-氰基-7-羟基香豆素(CyU)替代4-MU。吸收和发射光谱如实例1那样测量。
获得不同pH值下的CyU吸收光谱（未示出）。在不同pH值下对处于三个不同激发波长的CyU测定发射光谱，所述三个不同激发波长对应于中性形式的最大吸光度(355nm)、等吸光点(375nm)（图5A所示）或阴离子吸光度最大值(405nm)。当激发波长为375nm时，最大发射波长为约455nm。图5B示出针对激发波长355nm、375nm（大致在等吸光点处）和405nm随pH值变化的在波长455nm处的发射。当激发位于等吸光点时，荧光大致与pH值无关。
确定在不同激发波长处记录的峰值发射强度的比率。如图5C所示，这得到敏感地依赖于pH的无量纲数。这提供不依赖于测量绝对荧光强度的敏感pH响应。
实例3
将7-羟基香豆素-3-羧酸乙酯(EHC)以1mg/mL的浓度溶解于二甲基亚砜(DMSO)中。制备96-孔板，各孔含有pH值范围从8.0低至2.5的100μL的100mmolar磷酸盐缓冲液。将10μL的EHC溶液加入各孔。10倍稀释孔通过以下方式制备：取10μL的以初始浓度制备的孔中液，并将其加入90μL合适浓度的缓冲液中。如实例1那样测量吸收和发射光谱。
获得不同pH值下的EHC吸收光谱（未示出）。发现等吸光点发生于约370nm处。采用激发波长370nm和用于比较的激发波长400nm（阴离子最大吸光度），在图6中示出10倍稀释EHC样本的随pH变化的荧光。当在等吸光点激发时所述荧光大致恒定。
实例4
如实例1中那样制备96-孔板，但采用3-(2-噻吩基)伞形酮(TU)替代4-MU。TU描述在美国专利No.6,372,895（Bensten等人）和No.6,566,508（Bensten等人）中，所述专利据此以引用方式并入本文中。如实例1、2和3那样测量吸收和发射光谱。
不同pH值的10倍TU样本的吸收光谱示于图7A中。发现等吸光点发生于约380nm处。相较于CyU和EHC，吸收峰通常红移5-10nm。
获得处于三个不同激发波长即405nm（阴离子最大值，用于比较）、380nm（等吸光点-图7B所示）和365nm（中性形式最大值，用于比较）的TU在不同pH值的发射光谱。相较于实例1和2的455nm，阴离子发射带红移40nm至约495nm。阴离子形式的斯托克斯频移经确定为大约90nm。
当低pH的样本在405nm处（阴离子最大吸光度）激发时，495nm处发射减弱并且峰最大值蓝移约30nm至465nm。当激发波长设定为等吸光点（380nm，图7B）或中性形式最大值(365nm)时，蓝移更明显。这些结果表明，在低pH值下，除了来自光生阴离子的发射外，存在来自激发态的中性TU的显著发射。
虽然当TU在针对吸收的等吸光点处激发时，随不同pH值，发射光谱存在变化，但存在其中发射不依赖于pH的针对发射的等吸光点（约490nm，见图7B）。针对激发波长380nm和405nm和针对发射波长490nm和500nm，在图7C中示出TU样本随pH变化的荧光。当在吸收等吸光点(380nm)处激发并在发射等吸光点(490nm)处测量时，所述荧光大致与pH无关。
实例5
将4-甲基伞形酮磷酸二钠盐(4-MUP)以浓度1mg/mL溶解于水中。制备96-孔板，各孔含有pH值范围从8.0低至2.5的100μL的100mmolar磷酸盐缓冲液。将10μL的MUP溶液加入各孔。还制备一组10倍稀释孔以消除由于高浓度荧光团的自猝灭所致的假象。10倍稀释孔通过以下方式制备：用水将1mg/mL溶液稀释至0.1mg/mL并随后将10μL的此溶液加入各孔中的100μL的100mmolar磷酸盐缓冲液中。如实例1那样测量吸收和发射光谱。
据发现，4-MUP在4-MU染料的等吸光点（约330nm）处具有显著吸收，但在阴离子最大值（约360nm）处具有最小吸收。MUP吸收光谱表现出极小的pH-依赖性并且在等吸光点处的吸收为游离染料的仅约1/4至1/3。
对于所考虑pH值的范围，最大发射发生于约390nm处。所述发射在4-MU的特征发射波长(455nm)处十分小。这意味着，当测量4-MU的存在时，未反应的4-MUP的存在将不会显著提高背景信号。
实例6
将4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷(4-MUG)以0.1mg/mL的浓度溶解于二甲基亚砜(DMSO)中。制备96-孔板，各孔含有pH值范围从2.5（第1列）高至8.0（第12列）的100μL的100mmolar磷酸盐缓冲液。将10μL的4-MUG溶液加入前四行中的各孔内。将这些行中的两行进一步用含有巯基乙醇(1.4%v/v)、MgCl2(2%w/w)和β-D-半乳糖苷酶(80μg/mL)的10μL的试剂溶液处理。将4-MU于DMSO中的10μL的0.1mg/mL溶液加入另外两行用于比较。如实例1那样测量吸收和发射光谱。
获得具有和不具有半乳糖苷酶的4-MUG的吸收光谱。不存在添加的β-D-半乳糖苷酶的情况下，4-MUG的光谱表现出极小的pH依赖性并且类似于酸溶液中的4-MU的光谱，即：中性4-MU的光谱。因此，4-MUG在4-MU染料的等吸光点（约330nm）处吸收强烈，但在阴离子最大值（约360nm）处吸收最小。
还针对2.5至8的pH值，获得不存在和存在β-D-半乳糖苷酶的情况下的4-MUG的发射光谱（335nm激发）。在不存在酶的情况下，最大发射较低并发生于约390nm处，并且在4-MU的特征发射波长(455nm)处的强度极小。在存在β-D-半乳糖苷酶酶的情况下，对应于来自游离4-MU阴离子的发射的455nm处观察到发射峰。
图8A中示出4-MU、以及在不存在和存在β-D-半乳糖苷酶的情况下的4-MUG的随pH变化的在455nm处的发射（在355nm的等吸光波长处激发）。4-MUG+β-D-半乳糖苷酶的发射在pH 7以下缓慢下降，与报道的酶活性一致(Sungur and Akbulut,J.Chem.Tech Biotechnol.1994,59,303-306)。然而，在至少低至pH 5时观察到可用强度。为了比较，图8B中示出在阴离子最大值（约360nm）处激发所致的发射。在这种情况下，发射在酸性pH值下极低并且在pH 7以上时迅速提高。
该实例展示了如下能力：使用MUG在宽泛的pH值范围内有效检测β-D-半乳糖苷酶而不需要通过在染料的等吸光点处激发来调整激发或发射频率。
实例7
7-羟基香豆素-3-羧酸甲酯半乳糖苷(MHCgal)通过以下方式制备：使EHC与α-乙酰溴-D-半乳糖反应并随后用甲醇钠水解受保护的半乳糖苷，如Chilvers(J.Appl.Microbiology 2001,91,1118-1130)中所述。将MHCgal以1.0mg/mL的浓度溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，并随后将10μL放置于96-孔板的各孔中，所述96-孔板经制备其孔含有pH水平范围从8.0低至2.5的100μL的100mmolar磷酸盐缓冲液。将这些行中的一半进一步用含有巯基乙醇(1.4%v/v)、MgCl2(2%w/w)和β-D-半乳糖苷酶(80μg/mL)的10μL的试剂溶液处理。然后将来自该板各孔的10μL加入另一个板的对应孔中，所述另一个板在各孔中含有100μL的具有适当pH的磷酸盐缓冲液，从而产生10倍稀释板。如实例1那样测量吸收和发射光谱。
获得具有和不具有β-D-半乳糖苷酶的MHCgal的吸收光谱。不存在添加的β-D-半乳糖苷酶的情况下的MHCgal的光谱表明在测试的pH范围内无pH依赖性，并示出在约340nm处具有最大吸光度。在添加β-D-半乳糖苷酶的情况下，对于pH 5-6，吸收转移至350nm，而对于碱性值，转移至400nm。这些与中性和阴离子EHC物质的吸收最大值相符。
针对2.5至8的pH值，获得在不存在和存在β-D-半乳糖苷酶的情况下的MHCgal的发射光谱（激发波长为370nm）。无酶情况下发射很低，并且在简单香豆素类的特征发射波长（约450nm）处极少发射。在存在β-D-半乳糖苷酶酶的情况下，对应于来自游离MHC阴离子的发射的445nm处观察到强烈发射峰。
图9中示出在不存在和存在β-D-半乳糖苷酶的情况下，MHCgal在445nm处随pH变化的发射（在370nm等吸光点处的激发，和用于比较，在阴离子最大值处400nm的激发）。在存在β-D-半乳糖苷酶的情况下，当在370nm处激发时，MHCgal的发射在pH为约5和以上时是显著并且恒定的。相比之下，阴离子最大值处的激发导致发射在低pH值下极低但从pH 6陡然增加。
该实例展示了如下能力：使用MHCgal在宽泛的pH值范围内有效检测β-D-半乳糖苷酶而不需要通过在染料的等吸光点处激发来调整激发或发射频率。
比较例8
将3-(2-噻吩基)伞形酮半乳糖苷(TUgal)以0.1mg/mL的浓度溶解于二甲基亚砜(DMSO)中。制备96孔板，各孔含有pH水平范围从8.0低至2.5的100μL的100mmolar磷酸盐缓冲液。将10μL的TUgal溶液加入各孔，随后将所述行的一半进一步用含有巯基乙醇(1.4%v/v)、MgCl2(2%w/w)和β-半乳糖苷酶(80μg/mL)的10μL的试剂溶液处理。如实例1那样测量吸收和发射光谱。
图10中示出在存在和不存在β-D-半乳糖苷酶的情况下，TUgal在490nm处（380nm激发）和500nm处（410nm激发）的随pH变化的发射。当在TU的等吸光频率处测量时（380ex,490em；见实例4），TUgal具有与TU（其产物荧光团自身）类似的发射。因此，在存在或不存在酶的情况下发射之间的差异极小。在阴离子最大值附近（ex410nm,em 500nm）的荧光的测量将酶底物孔的发射降低到阴离子的发射以下并且使得可以使用TUgal作为β-D-半乳糖苷酶底物。
如本实例中所见，导致酶底物以与游离荧光团相同的频率强烈发射的情况下，在等吸光激发频率处的照射可能效率较低。
因此，公开了检测微生物的方法和其套件的实施例。本领域技术人员将会知道，可采取不同于所公开的实施例来实施本发明。所给出的公开实施例的目的在于举例说明而非限制，并且本发明只受随后的权利要求书限制。

Claims (20)

1.一种检测试验样本中微生物的方法，所述方法用于非治疗目的，所述方法包括以下步骤：
a)用酶底物培育所述试验样本以形成培育样本，其中所述酶底物包含酶可水解基团和荧光基团，其中所述试验样本中存在的微生物包括从所述荧光基团上水解所述可水解基团以形成荧光可检测产物的酶，其中所述荧光可检测产物是7-羟基香豆素衍生物，其中所述荧光可检测产物具有酸性形式和碱性形式，并且其中所述荧光可检测产物的酸性形式为可以向溶液中另一组分贡献氢离子的化合物；而所述荧光可检测产物的碱性形式为可以从溶液中另一组分接受氢离子的化合物；
b)用波长为Exλiso的光激发所述荧光可检测产物历时足以使所述荧光可检测产物发射光的时间，其中Exλiso为所述荧光可检测产物的激发等吸光点，其中所述激发等吸光点为所述荧光可检测产物的酸性和碱性形式的吸光度基本上相同的波长；和
c)检测由于用波长Exλiso的光激发而在波长Emλ1处发射的光。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述激发步骤和检测步骤之前未调整所述培育样本的pH。
3.根据权利要求1所述的方法，该方法还包括定量所述发射光以测定所述试验样本中存在的微生物的量。
4.根据权利要求1所述的方法，该方法还包括用波长为Exλ2的光激发所述荧光可检测产物历时足以使所述荧光可检测产物发射光的时间，其中Exλ2为所述荧光可检测产物的碱性形式的吸收最大值或所述荧光可检测产物的酸性形式的吸收最大值。
5.根据权利要求4所述的方法，该方法还包括测定在Exλiso处激发所致的发射光与在Exλ2处激发所致的发射光的比率。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述荧光可检测产物为4-甲基伞形酮并且Exλiso为约330nm。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述荧光可检测产物为3-氰基-7-羟基香豆素并且Exλiso为约375nm；所述荧光可检测产物为7-羟基香豆素-3-羧酸乙酯并且Exλiso为约370nm；或所述荧光可检测产物为7-羟基香豆素-3-羧酸甲酯并且Exλiso为约370nm。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述荧光可检测产物为3-(2-噻吩基)伞形酮并且Exλiso为约380nm。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中用所述酶底物培育所述试验样本的步骤包括将呈液体形式的所述样本添加到含有所述酶底物的脱水生长培养基中。
10.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，该方法还包括形成所述被检测光的图像。
11.根据权利要求10所述的方法，该方法还包括从所述图像中计算菌落。
12.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中Emλ1为在所述荧光可检测产物的最大荧光处的波长。
13.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，该方法还包括定量在波长Emλ2附近发射的所述光，Emλ2为由于用波长Exλiso的光激发而发射的光的波长，其中Emλ1和Emλ2为不同的波长。
14.根据权利要求13所述的方法，该方法还包括测定在Emλ1处发射的所述光与在Emλ2处发射的所述光的比率。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述波长Emλ2为所述等吸光发射点的波长。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述荧光可检测产物在所述波长Emλ2附近发射的光的量显著大于所述酶底物在所述波长Emλ2附近发射的任何光的量。
17.根据权利要求1所述的方法，该方法还包括：
d)用波长为Exλ2的光激发所述荧光可检测产物历时足以使所述荧光可检测产物发射光的时间，其中Exλ2为所述荧光可检测产物的所述碱性形式的吸收最大值或所述荧光可检测产物的所述酸性形式的吸收最大值；
e)检测由于用波长Exλ2的光的所述激发而在波长Emλ1处发射的光；和
f)计算基于由于所述Exλiso激发光而在波长Emλ1处发射的所述光与由于所述Exλ2激发光而发射的所述光的比率，其中所述比率指示所述试验样本中存在的微生物的量。
18.根据权利要求17所述的方法，其中Exλ2为所述荧光可检测产物的所述酸性形式的吸收最大值。
19.根据权利要求17或18中任一项所述的方法，其中所述比率可用于监测随时间推移的所述培育样本的pH。
20.一种用于测试试验样本中微生物的存在的套件，所述测试用于非治疗目的，所述套件包括：
包含酶可水解基团和荧光基团的酶底物，其中所述试验样本中存在的微生物包括从所述荧光基团上水解所述可水解基团以形成荧光可检测产物的酶，其中所述荧光可检测产物是7-羟基香豆素衍生物，其中所述荧光可检测产物具有酸性形式和碱性形式，并且其中所述荧光可检测产物的酸性形式为可以向溶液中另一组分贡献氢离子的化合物；而所述荧光可检测产物的碱性形式为可以从溶液中另一组分接受氢离子的化合物；和
能够提供波长Exλiso的光的光源，其中Exλiso为所述荧光可检测产物的激发等吸光点，其中所述激发等吸光点为所述荧光可检测产物的酸性和碱性形式的吸光度基本上相同的波长，并且其中用波长Exλiso的光激发所述荧光可检测产物导致所述荧光可检测产物发射波长Emλ1的光。
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