JP2013514809A - 微生物を検出する方法及びそのためのキット - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1A
Description
本出願は、2009年12月22日に出願された米国特許仮出願第61/288,883号の利益を主張し、その開示内容の全体を参照として本明細書に援用する。
本発明は、蛍光性化合物を利用して、微生物を検出する方法に関する。
図面は、必ずしも一定の比率の縮尺ではない。図中で用いられる類似の数字は、類似の構成要素を示す。しかし、所与の図中の構成要素を意味する数字の使用は、同一数字で表示した別の図中の構成要素を制約するものではないことは理解されよう。
加水分解性基−−−−−−−−−−−−−蛍光基(式I)
式Iにおいて、「−−−−−−−−−−−」で表される部分は、酵素加水分解性連鎖として称され得る。酵素加水分解性連鎖は、酵素、特に対象とする微生物によって生産される酵素によって容易に開裂され得る連鎖又は固着を指す。
特に言及されない限り、全ての化学物質は、アルドリッチ(Aldrich)から入手され、更に精製することなく使用された。
7−ヒドロキシクマリン−3−カルボン酸エチルエステル(EHC)は、Chilvers et.al.J.Appl.Microbiology 2001,91,1118〜1130にしたがって調製された。
3−(2−チエニル)ウンベリフェロン(TU)は、米国特許第6,372,895号(Bentsen et al.)にあるように調製された。
3−(2−チエニル)ウンベリフェロンガラクトシド(TUgal)は、米国特許第6,372,895号(Bentsen et al.)にあるように調製された。
β−D−ガラクトシダーゼは、EMD Biosciences,Inc.(San Diego,CA)から入手された。
4−メチルウンベリフェロン(4−MU)は、1mg/mLの濃度でジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解された。96ウェルプレートは、各ウェルが、8.0〜2.5までの範囲のpH値で100μLの100mmolarリン酸緩衝液を含有する状態で、調製された。10μLの4−MU溶液が、ウェルのそれぞれに添加された。1セットの10倍希釈ウェルがまた、高濃度での蛍光色素分子の自己消滅によるアーティファクトを排除するために調製された。10倍希釈ウェルは、DMSOを用いて1mg/mL溶液を0.1mg/mLに希釈し、次いで、ウェルのそれぞれにおいて100μLの100mmolarリン酸緩衝液にこの溶液の10μLを添加することによって調製された。
96ウェルプレートが、実施例1にあるように、しかし4−MUの替わりに3−シアノ−7−ヒドロキシクマリン(CyU)を用いて調製された。吸収及び放出スペクトルは、実施例1にあるように測定された。
7−ヒドロキシクマリン−3−カルボン酸エチルエステル(EHC)が、ジメチルスルホキシド(DMSO)に1mg/mLの濃度で溶解された。96ウェルプレートは、各ウェルが、8.0〜2.5までの範囲のpH値で100μLの100mmolarリン酸緩衝液を含有する状態で、調製された。10μLのEHC溶液が、ウェルのそれぞれに添加された。10倍希釈ウェルが、初期濃度で調製されたウェルの10μLを取り、それを適正な濃度で90μLの緩衝液に添加することによって、調製された。吸収及び放出スペクトルは、実施例1にあるように測定された。
96ウェルプレートは、実施例1にあるように、しかし4−MUの替わりに3−(2−チエニル)ウンベリフェロン(TU)を用いて調製された。TUは、米国特許第6,372,895号(Bensten et al.)及び同第6,566,508号(Bensten et al.)において記述され、本明細書に参照によって組み込まれる。吸収及び放出スペクトルは、実施例1〜3にあるように測定された。
リン酸4−メチルウンベリフェロン二ナトリウム塩(4−MUP)が1mg/mLの濃度で水に溶解された。96ウェルプレートは、各ウェルが、8.0〜2.5までの範囲のpH値で100μLの100mmolarリン酸緩衝液を含有する状態で、調製された。10μLのMUP溶液が、ウェルのそれぞれに添加された。1セットの10倍希釈ウェルがまた、高濃度での蛍光色素分子の自己消滅によるアーティファクトを排除するために調製された。10倍希釈ウェルは、DMSOを用いて1mg/mL溶液を0.1mg/mLに希釈し、次いでウェルのそれぞれおいて100μLの100mmolarリン酸緩衝液にこの溶液の10μLを添加することによって調製された。吸収及び放出スペクトルは、実施例1にあるように測定された。
4−メチルウンベリフェロン−β−D−ガラクトシド(4−MUG)は、0.1mg/mLの濃度で、ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解された。96ウェルプレートは、各プレートが、2.5(縦列1)〜8.0(縦列12)までの範囲のpH値で100μLの100mmolarのリン酸緩衝液を含有するように調製された。10μLの4−MUG溶液が、最初の4行の各ウェルに添加された。これらの行の2つは、メルカプトエタノール(1.4% v/v)、MgCl2(2% w/w)及びβ−D−ガラクトシダーゼ(80μg/mL)を含有する10μLの試薬溶液で更に処理された。DMSO中の4−MUの0.1mg/mL溶液10μLが、比較のために更に2つの行に添加された。吸収及び放出スペクトルは、実施例1にあるように測定された。
メチル7−ヒドロキシクマリン−3−カルボン酸ガラクトシド(MHCgal)が、α−アセトブロモ−D−ガラクトースを用いてEHCを反応させることによって調製され、次いで、Chilvers(J.Appl.Microbiology 2001,91,1118〜1130)に記載のように、ナトリウムメトキシドを用いて保護ガラクトシドを加水分解した。MHCgalは、1.0mg/mLの濃度でジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解され、次いで10μLが、ウェルが8.0〜2.5の範囲のpHレベルで100μLの100mmolarリン酸緩衝液を含有するように調製された96ウェルプレートの各ウェルに加えられた。行の半分は、メルカプトエタノール(1.4% v/v)、MgCl2(2% w/w)、及びβ−D−ガラクトシダーゼ(80μg/mL)を含有する10μLの試薬溶液で更に処理された。このプレートの各ウェルから10μLが、次いでウェル内で適正なpHの100μLのリン酸緩衝液を含有する別のプレートの対応するウェルに添加され、10倍希釈プレートを作製した。吸収及び放出スペクトルは、実施例1にあるように測定された。
3−(2−チエニル)ウンベリフェロンガラクトシド(TUgal)は、0.1mg/mLの濃度でジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解された。96ウェルプレートは、各プレートが、8.0〜2.5の範囲のpHレベルで100μLの100mmolarのリン酸緩衝液を含有する状態で調製された。10μLのTUgal溶液が、ウェルのそれぞれに添加され、次いで、行の半分が、メルカプトエタノール(1.4% v/v)、MgCl2(2% w/w)、及びβ−ガラクトシダーゼ(80μg/mL)を含有する10μLの試薬溶液を用いて更に処理された。吸収及び放出スペクトルは、実施例1にあるように測定された。
Claims (31)
- 試験サンプル内の微生物を検出する方法であって、
a)培養サンプルを形成するために酵素基質を用いて試験サンプルを培養する工程であって、前記酵素基質が酵素加水分解性基及び蛍光基を含み、前記試験サンプル内に存在する微生物が、前記加水分解性基を前記蛍光基から加水分解し、蛍光検出可能な生成物を形成する酵素を含み、前記蛍光検出可能な生成物が酸性種及び塩基種の両方を有する、工程と、
b)前記蛍光検出可能な生成物が光を放出するために十分な時間、Exλisoの波長を有する光を用いて前記蛍光検出可能な生成物を励起する工程であって、Exλisoが前記蛍光検出可能な生成物の吸光度等吸収点である、工程と、
c)Emλ1の波長で放出される光を検出する工程と、を含む、方法。 - 前記培養サンプルのpHが、前記励起及び検出工程の前に調整されない、請求項1に記載の方法。
- 前記試験サンプル内に存在する微生物の量を判定するために前記放出された光を定量化する工程を更に含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記蛍光検出可能な生成物が光を放出するために十分な時間、Exλ2の波長を有する光を用いて前記蛍光検出可能な生成物を励起する工程であって、Exλ2が、前記蛍光検出可能な生成物の前記塩基種の吸収極大、又は前記蛍光検出可能な生成物の前記酸性種の吸収極大である、工程を更に含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- Exλisoでの励起によって生じる放出と、Exλ2での励起によって生じる放出との比率を判定する工程を更に含む、請求項4に記載の方法。
- 前記蛍光検出可能な生成物が、クマリン誘導体である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記蛍光検出可能な生成物が、4−メチルウンベリフェロンであり、Exλisoが約330nmである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記蛍光検出可能な生成物が、3−シアノ−7−ヒドロキシクマリンであり、Exλisoが約375nmであるか、前記蛍光検出可能な生成物が7−ヒドロキシクマリン−3−カルボン酸エチルエステルであり、Exλisoが約370nmであるか、又は前記蛍光検出可能な生成物が7−ヒドロキシクマリン−3−カルボン酸メチルエステルであり、Exλisoが約370nmである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記蛍光検出可能な生成物が、3−(2−チエニル)ウンベリフェロンであり、Exλisoが約380nmである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵素基質を用いて前記試験サンプルを培養する前記工程が、液状の前記サンプルを、前記酵素基質を含有する脱水された増殖培地に添加する工程を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出された光の画像を形成する工程を更に含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記画像からコロニーを計数する工程を更に含む、請求項11に記載の方法。
- Emλ1が、前記蛍光検出可能な生成物の最大蛍光における波長である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 波長Emλ2付近で放出される光を定量化する工程を更に含み、Emλ1及びEmλ2が異なる波長である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 波長Emλ1で放出される光と、波長Emλ2で放出される光との比率を判定する工程を更に含む、請求項14に記載の方法。
- 前記波長Emλ2が、前記等吸収放出点の波長である、請求項14に記載の方法。
- 前記波長Emλ2付近で前記蛍光検出可能な生成物によって放出される光の量が、前記波長Emλ2付近で前記酵素基質によって放出されるいずれの光の量をも実質的に超える、請求項14に記載の方法。
- 試験サンプル内の微生物を検出する方法であって、
a)培養サンプルを形成するために酵素基質を用いて前記試験サンプルを培養する工程であって、前記酵素基質が酵素加水分解性基及び蛍光基を含み、前記試験サンプル内に存在する微生物が、前記加水分解性基を前記蛍光基から加水分解し、蛍光検出可能な生成物を形成する酵素を含み、前記蛍光検出可能な生成物が、酸性種及び塩基種の両方を有する、工程と、
b)前記蛍光検出可能な生成物が光を放出するために十分な時間、Exλisoの波長を有する光を用いて前記蛍光検出可能な生成物を励起する工程であって、Exλisoが前記蛍光検出可能な生成物の等吸収点である、工程と、
c)Exλisoの波長を有する光を用いた前記励起の結果として、Emλ1の波長で放出される光を検出する工程と、
d)前記蛍光検出可能な生成物が光を放出するために十分な時間、Exλ2の波長を有する光を用いて前記蛍光検出可能な生成物を励起する工程であって、Exλ2が、前記蛍光検出可能な生成物の前記塩基種の吸収極大、又は前記蛍光検出可能な生成物の前記酸性種の吸収極大である、工程と、
e)Exλ2の波長を有する光を用いた前記励起の結果として、Emλ1の波長で放出される光を検出する工程と、
f)前記Exλisoの励起光の結果としてEmλ1の波長で放出される光、及び前記Exλ2励起光の結果として放出される光に基づいて、比率を計算する工程であって、前記比率が前記試験サンプル内に存在する微生物の量を示す、工程と、を含む、方法。 - Exλ2が、前記蛍光検出可能な生成物の前記酸性種の吸収極大である、請求項18に記載の方法。
- 前記比率が、前記培養サンプルのpHを経時的に監視するために利用し得る、請求項18又は19に記載の方法。
- 試験サンプル内の微生物の存在を試験するためのキットであって、
酵素加水分解性基及び蛍光基を含む酵素基質であって、前記試験サンプル内に存在する微生物が、前記加水分解性基を前記蛍光基から加水分解し、蛍光検出可能な生成物を形成する酵素を含み、前記蛍光検出可能な生成物が、酸性種及び塩基種の両方を有する、酵素基質と、
Exλisoの波長を有する光を提供することができる光源であって、Exλisoが、前記蛍光検出可能な生成物の等吸収点であり、Exλisoの波長を有する光を用いた前記蛍光検出可能な生成物の励起が、前記蛍光検出可能な生成物にEmλ1の波長で光を放出させる、光源と、を備える、キット。 - 少なくとも前記酵素基質と、試験される前記サンプルとを混合するように構成される容器を更に備える、請求項21に記載のキット。
- 前記酵素基質が、増殖培地の構成成分として提供される、請求項21又は22に記載のキット。
- 前記蛍光検出可能な生成物から、Emλ1の波長で放出される光を検出することができる検出器を更に備える、請求項21〜23のいずれか一項に記載のキット。
- 前記検出器から信号を受信し、前記サンプル内の微生物の存否を示す出力を提供することができる、処理装置を更に備える、請求項21〜24のいずれか一項に記載のキット。
- 前記光源が、Exλ2の波長を有する光を提供することもでき、Exλ2が、前記蛍光検出可能な生成物の前記塩基種の吸収極大、又は前記蛍光検出可能な生成物の前記酸性種の吸収極大である、請求項21〜25のいずれか一項に記載のキット。
- Exλ2の波長を有する光を提供することができる第2の光源を更に備え、Exλ2が前記蛍光検出可能な生成物の前記塩基種の吸収極大、又は前記蛍光検出可能な生成物の前記酸性種の吸収極大である、請求項21〜25のいずれか一項に記載のキット。
- 前記蛍光検出可能な生成物がクマリン誘導体である、請求項21〜27のいずれか一項に記載のキット。
- 前記蛍光検出可能な生成物が、4−メチルウンベリフェロンであり、Exλisoが約330nmである、請求項21〜28のいずれか一項に記載のキット。
- 蛍光検出可能な生成物が、3−シアノ−7−ヒドロキシクマリンであり、Exλisoが約375nmであるか、又は前記蛍光検出可能な生成物が、7−ヒドロキシクマリン−3−カルボン酸エステルであり、Exλisoが約370nmである、請求項21〜28のいずれか一項に記載のキット。
- 前記蛍光検出可能な生成物が、3−(2−チエニル)ウンベリフェロンであり、Exλisoが約380nmである、請求項21〜28のいずれか一項に記載のキット。
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